紫花苜蓿逆境響應(yīng)基因MsNAC3及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種紫花苜蓿逆境響應(yīng)基因MsNAC3及其應(yīng)用。本發(fā)明應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從紫花苜?；蚪M中克隆并鑒定了一個新的NAC家族相關(guān)基因，命名為MsNAC3，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.11所示，并構(gòu)建了含有加強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因的融合表達(dá)載體。本發(fā)明應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)分析了MsNAC3基因在紫花苜蓿中的表達(dá)模式，以及該基因與逆境脅迫（冷害，鹽害，干旱）之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)該基因在煙草中過表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗寒、抗旱和耐鹽性，該基因可用于其他單雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化，提高其抗逆性。
【專利說明】紫花苜蓿逆境響應(yīng)基因MsNAC3及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及紫花苜蓿逆境響應(yīng)基因MsNAC3及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]NAC轉(zhuǎn)錄因子(包括NAM、ATAFl/2和⑶C2)是植物特有的一種具有多種調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在與陸生植物中，這類轉(zhuǎn)錄因子的主要結(jié)構(gòu)特點是N端為保守的大約150個氨基酸殘基的NAC結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合DNA和其他蛋白，可以分成從A~E5個保守區(qū)；C端則為高度多樣性的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控區(qū)，富含絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、谷氨酸等，研究發(fā)現(xiàn)有些NAC蛋白的C-端具有蛋白結(jié)合活性。目前已有研究表明NAC家族的一些成員在逆境應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中起作用。擬南芥中ANAC019、ANAC055和ANAC072受到干旱、高鹽以及脫落酸(ABA)的誘導(dǎo)表達(dá)，它們能顯著提高植株的耐旱能力(Tran et al.，2004)。擬南芥LOVl基因能增強植株的抗凍能力(Yoo et al.，2007)。來自水稻的 SNACl/2 (stress-responsive NAC2)基因受到干旱、高鹽、低溫、傷以及ABA的誘導(dǎo)表達(dá)，其過表達(dá)植株耐冷、抗鹽并能抵御干旱(Hu et al., 2008) ?過量表達(dá)0sNAC6基因的水稻雖然生長慢、產(chǎn)量低，但卻顯示出對干旱、高鹽以及枯萎病的較強抗性(Nakashima et al.，2007)。盡管NAC基因的功能還有待深入研究，但它們在植 物遺傳工程方面已展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供紫花苜蓿逆境響應(yīng)基因MsNAC3及其應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明提供紫花苜蓿逆境響應(yīng)基因MsNAC3，其具有:
[0005]I) SEQ ID N0.11所示的核苷酸序列；或
[0006]2) SEQ ID N0.11所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸；或
[0007]3)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
[0008]本發(fā)明提供了含有上述基因MsNAC3的表達(dá)載體。
[0009]在本發(fā)明的一個實施例中，得到的含有基因MsNAC3的表達(dá)載體為pBIGFP-MsNAC3。
[0010]該表達(dá)載體的構(gòu)建方法為:以紫花苜蓿葉的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，上游引物序列如SEQ ID N0.7所示，下游引物序列如SEQ ID N0.8所示；
[0011]將RT-PCR擴增產(chǎn)物回收后連接在PMD18-T載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株，選取陽性克隆進(jìn)行測序，用XbaI和KpnI進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，連接到含有eGFP植物表達(dá)載體pBIGFP的XbaI和KpnI位點中，構(gòu)建得到pBIGFP_MsNAC3。
[0012]含有上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0013]本發(fā)明還提供了含有基因MsNAC3的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
[0014]本發(fā)明提供了 MsNAC3基因在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0015]優(yōu)選地，所述的植物為擬南芥、煙草、洋蔥、水稻、小麥、玉米、苜蓿、大豆或棉花。[0016]本發(fā)明提供了 MsNAC3基因在提高植物抗逆性方面的應(yīng)用。
[0017]所述的抗逆性是指抗寒、抗旱或耐鹽性。
[0018]本發(fā)明還提供了克隆紫花苜蓿逆境響應(yīng)基因MsNAC3的方法，包括以下步驟:
[0019](I)以紫花苜蓿總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；
[0020](2)以步驟(1)的cDNA為模板進(jìn)行PCR，回收產(chǎn)物，測序正確的為紫花苜蓿逆境響應(yīng)基因MsNAC3。
[0021 ] 其中，步驟(1)將紫花苜蓿幼苗放于4°C進(jìn)行冷脅迫處理之后，取提取紫花苜?？俁NA,以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)合成cDNA第一鏈。
[0022]其中，步驟(2)的PCR方法中，所用引物序列中上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，下游序列如SEQ ID N0.2所示。
[0023]步驟(2)的PCR 反應(yīng)程序為 940C 3min ；94°C 10s，55。。20s, 72°C lmin，31 個循環(huán)；72°C IOmin。
[0024]步驟(2)中，回收擴增產(chǎn)物并將其連接在PMD18-T載體上進(jìn)行測序。最后用DNAMAN5.2軟件分析，MsNAC3基因長度為1041bp，編碼331aa。將這個序列輸入NCBIblastp中發(fā)現(xiàn)，這個基因編碼的氨基酸序列與其他NAC家族基因結(jié)構(gòu)高度相似，其N端含有NAC保守結(jié)構(gòu)域，包括A、B、C、D、E5個保守的亞結(jié)構(gòu)域，蛋白C端高度變異。為進(jìn)一步分析該基因的結(jié)構(gòu)，應(yīng)用在線軟件SOPMA來推測其蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明這種蛋白是以無規(guī)則卷曲為主，同時含有18.43%的α -螺旋，3.02%的β -轉(zhuǎn)角和14.20%的延伸鏈等結(jié)構(gòu)。應(yīng)用ProtScale在線軟件來預(yù)測其蛋白氨基酸序列的疏水性/親水性，結(jié)果表明，該蛋白為親水性蛋白。這些數(shù)據(jù)表明，該基因是一個`新鑒定的NAC家族的基因，本發(fā)明將其命名為MsNAC3。
[0025]本發(fā)明具有下列優(yōu)點及有益效果:
[0026]本發(fā)明提供了紫花苜蓿逆境響應(yīng)基因MsNAC3 (核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示)及其在作物育種中的應(yīng)用。該基因不僅受低溫和高鹽誘導(dǎo)高表達(dá)，而且還受干旱和ABA脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。洋蔥表皮亞細(xì)胞定位研究表明MsNAC3為核定位基因。先前報道的抗逆基因在功能方面多數(shù)具有單一性，而研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明MsNAC3基因在提高轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗寒、抗旱和耐鹽性等方面均據(jù)有較明顯的功效。該基因可用于其他單雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化，顯著提高其抗逆性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為RT-PCR方法獲得MsNAC3的電泳圖片，其中M為2000bp Marker，1、2為PCR產(chǎn)物。
[0028]圖2為融合表達(dá)載體pBIGFP_MsNAC3結(jié)構(gòu)示意圖。
[0029]圖3為MsNAC3在脅迫誘導(dǎo)后的相對表達(dá)。其中，A圖為250mMNaCl、10%PEG6000、100 μ mo I.L4ABA和4°C脅迫處理下MsNAC3在葉片中的相對表達(dá)量。B圖為250mM NaCl,10%PEG6000、100 μ mo I.L4ABA和4°C脅迫處理下MsNAC3在根中的相對表達(dá)量。
[0030]圖4為MsNAC3基因亞細(xì)胞定位照片。其中，A:含MsNAC3_GFP融合基因的轉(zhuǎn)基因煙草在白光下的圖片含MsNAC3-GFP融合基因的轉(zhuǎn)基因煙草在紫外光下的圖片；C:對照組只含GFP綠色熒光蛋白基因的轉(zhuǎn)基因煙草在白光下的圖片；D:對照組只含GFP綠色熒光蛋白基因的轉(zhuǎn)基因煙草在紫外光下的圖片。
[0031]圖5為逆境脅迫下轉(zhuǎn)MsNAC3基因煙草生長情況，250mM NaCl處理20d后，轉(zhuǎn)基因煙草長勢良好，而野生型煙草葉片幾乎全部失綠，變?yōu)榈S色。
[0032]圖6為逆境脅迫下轉(zhuǎn)MsNAC3基因煙草生長情況，10%PEG處理20d后，轉(zhuǎn)基因煙草長勢良好，而野生型煙草葉片幾乎全部變?yōu)樗疂睢?br> [0033]圖7為逆境脅迫下轉(zhuǎn)MsNAC3基因煙草生長情況，4°C處理6d后再進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)IOd后，轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片要明顯大于野生型，根系也比野生型發(fā)達(dá)。
【具體實施方式】
[0034]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0035]若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；若未特別指明，實施例中所用試劑均為市售。
[0036]實施例1紫花苜蓿逆境響應(yīng)基因MsNAC3的獲得
[0037]1、基因克隆
[0038]本發(fā)明根據(jù)紫花苜蓿MsNACl (JN099384)序列設(shè)計同源引物:
[0039]上游引物:5'— ATGGAAAGAACTCACTTCAATATC — 3' (SEQ ID N0.1)
[0040]下游引物:5'— GAAAAGGTTTTGGGCAAGTAC — 3' (SEQ ID N0.2)
[0041]實驗前4h將苜蓿幼 苗放在4°C進(jìn)行冷脅迫處理。取幼嫩紫花苜蓿葉片，提取總RNA,總RNA的提取用的是TaKaRa RNAiso Plus，然后以紫花苜?？俁NA為模板，以O(shè)ligod(T)為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)體系如下:
【權(quán)利要求】
1.一種紫花苜蓿逆境響應(yīng)基因，其為MSNAC3，具有: 1)SEQ ID N0.11所示的核苷酸序列；或 2)SEQ ID N0.11所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸；或 3)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體。
3.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其為pBIGFP-MsNAC3。
4.權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，以紫花苜蓿葉的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，上游引物序列如SEQ ID N0.7所示，下游引物序列如SEQ ID N0.8 所示； 將RT-PCR擴增產(chǎn)物回收后連接在pMD18-T載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株，選取陽性克隆進(jìn)行測序，用XbaI和KpnI進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，連接到含有eGFP植物表達(dá)載體pBIGFP的XbaI和KpnI位點中， 構(gòu)建得到pBIGFP_MsNAC3。
5.含有權(quán)利要求2或3所述載體的宿主細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1所述的基因在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的基因在提高植物抗逆性方面的應(yīng)用。
8.一種獲得權(quán)利要求1所述紫花苜蓿逆境響應(yīng)基因MsNAC3的方法，其特征在于，包括以下步驟: (O以紫花苜?？俁NA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈； (2)以步驟(1)的cDNA為模板進(jìn)行PCR，回收產(chǎn)物，測序正確的為紫花苜蓿逆境響應(yīng)基因 MsNAC3。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(1)將紫花苜蓿幼苗放于4°C進(jìn)行冷脅迫處理之后，取提取紫花苜?？俁NA，以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)合成cDNA第一鏈。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(2)的PCR方法中，所用弓丨物序列中上游引物序列如SEQ ID N0.1所示,下游序列如SEQ ID N0.2所示。
【文檔編號】C12N5/10GK103740731SQ201310718228
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】申玉華, 徐振軍, 黃文婕, 唐立紅, 林景衛(wèi), 李望豐 申請人:申玉華, 徐振軍, 黃文婕, 唐立紅, 林景衛(wèi), 李望豐