一種基因工程技術(shù)制備共表達重組酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于雙酶共表達【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及的是定點突變的葡萄糖異構(gòu)酶和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶共表達；本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種對葡萄糖異構(gòu)酶146位氨基酸定點突變，并與D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶共表達的方法，具體為：將定點突變后的葡萄糖異構(gòu)酶的核苷酸序列與D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列分別進行PCR擴增、純化、克?。粚⒖寺〉玫降碾p酶核苷酸序列分別與pCDFDuet-1載體進行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達得到重組菌，收集重組菌超聲破碎得到含有雙酶的粗酶液。
【專利說明】一種基因工程技術(shù)制備共表達重組酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于雙酶共表達【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及的是定點突變的葡萄糖異構(gòu)酶和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶共表達。
【背景技術(shù)】
[0002]木糖異構(gòu)酶(xyloseisomerase, Xiase, EC 5.3.1.5),又稱葡萄糖異構(gòu)酶(glucose isomerase, GIase),在胞外可以催化D-葡萄糖至D-果糖的異構(gòu)化反應(yīng),是食品工業(yè)生產(chǎn)上以淀粉為原料制備果葡糖漿的關(guān)鍵酶之一。
[0003]D-阿洛酮糖3_差向異構(gòu)酶(D-psicose 3_epimerase,縮寫為DPE)是目前能實現(xiàn)D-果糖到D-阿洛酮糖之間生物轉(zhuǎn)化的一種主要酶，屬于酮糖3-差向異構(gòu)酶家族，最適底物為D-阿洛酮糖。因此，應(yīng)用基因工程技術(shù)制備葡萄糖異構(gòu)酶和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的重組酶，可以有效地將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-果糖、再由D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖。
[0004]應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組細胞并通過重組細胞培養(yǎng)，令其超量合成其他生物體內(nèi)含量極微但卻具有很高經(jīng)濟價值重組蛋白是現(xiàn)代生物技術(shù)中最活躍的研究方向之一。中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院獨家承擔國家科委863項目“葡萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程”，經(jīng)十五年科技攻關(guān)目前已完成葡萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程改造，獲得性質(zhì)改良的基因重組葡萄糖異構(gòu)酶；并利用基因工程方法構(gòu)建表達量極高的基因重組鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株，已具備將基因重組葡萄糖異構(gòu)酶產(chǎn)業(yè)化的成熟的科技條件。一些研究者從菊芋假單胞菌(Pseudomonas cichorH )中分離純化得到D-塔格糖3_差向異構(gòu)酶(DTE),用重組表達的酶固定化制成的生物反應(yīng)器以60%(w/v)的果糖為底物，轉(zhuǎn)化率達到25% ;研究者也將根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶類似蛋白的基因重組表達得到D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(D-psicose 3-epimerase);另外,一些研究者從土壤中篩選得到根瘤菌i^inorhiZobium sp.)，其滲透化細胞以70%的D-果糖為底物，15h反應(yīng)后D-阿洛酮糖濃度達到37mg/mL。目前并沒有公開將葡萄糖異構(gòu)酶和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶共表達來同時得到兩種酶的文獻，也沒有對葡萄糖異構(gòu)酶對146位氨基酸定點突變的公開內(nèi)容。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種對葡萄糖異構(gòu)酶146位氨基酸定點突變，并與D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶共表達的方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種基因工程技術(shù)制備共表達重組酶的方法，包括以下步驟:
第一步，獲得目的基因
將葡萄糖異構(gòu)酶氨 基酸序列的146位的精氨酸定點突變?yōu)楦彼?，然后將突變后的葡萄糖異?gòu)酶的核苷酸序列與D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列分別進行PCR擴增；將擴增后的所述定點突變的葡萄糖異構(gòu)酶的核苷酸序列與D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列分別純化后，分別克隆所述定點突變的葡萄糖異構(gòu)酶核苷酸序列和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列；
第二步，重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
將上述得到的定點突變的葡萄糖異構(gòu)酶核苷酸序列及pCDFDuet-Ι載體分別用及? HI和治7/7 I進行雙酶切，將D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列與pCDFDuet-Ι載體分別用Bgl II琳Hind JJJ進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，用T4連接酶于16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化疋cWi DH5a感受態(tài)細胞，鏈霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，分別用PCR和雙酶切法進行鑒定，并挑取陽性轉(zhuǎn)化子進行測序；產(chǎn)物再將陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌中誘導(dǎo)表達得到重組菌；
第三步，將重組菌經(jīng)離心收集，并超聲破碎，再次離心即得到定點突變的葡萄糖異構(gòu)酶和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶共表達的粗酶液。
[0007]所述第一步中定點突變的步驟為:
以pET-28a-GI為模板，設(shè)計完全互補配對的上、下游突變引物；按以下程序進行PCR反應(yīng):95°C 3 min ；94 °C 30s, 60°C 30 s，68°C 6min，共 16 個循環(huán)；68°C IOmin ;PCR 產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化后，轉(zhuǎn)化疋coli DH5 α感受態(tài)細胞，涂布于含10%卡那霉素的LB平板；挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)并測序，若測序發(fā)現(xiàn)未正確突變，則重新挑取單菌落測序或重新突變后測序，直至突變成功；
所述上、下游突變引 物為:
F-AACTTATTTACCCATCCTCGCTTTGTCCATGGC
R-GCCATGGACAAAGCGAGGATGGGTAAATAAGTT。
[0008]所述第一步定點突變后的葡萄糖異構(gòu)酶核苷酸序列與D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列進行PCR擴增的條件為:
突變葡萄糖異構(gòu)酶核苷酸序列引物:
上游引物:5' -GAAGATCTCATGCCTTATTTTGACAACATCAGCA-3'
下游引物:5, -GGGGTACCTTAACGGGCTGCGCAAACTT-3'
D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列引物:
上游引物:5' -CGGGATCCGATGAAATATGGTATTTATTACGCT-3'
下游引物:5' -CCCAAGCTTGACTTCAAATACATGTTTTACA-3'
PCR反應(yīng)體系(50μυ為:10\了&9緩沖溶液541^，模板0嫩141^，濃度為IOMmol七1的引物 2μ?，濃度為 2.Smmol*^1 的 dNTPs 4μ?, TaqDNA 聚合酶 0.3μ?,超純水 35.?μΙ,混勻；反應(yīng)條件:95°C 5min ；94°C 45s, 53°C 45s, 72°C 2min，32 個循環(huán)；72°C IOmin0
[0009]所述第二步中，所述定點突變的葡萄糖異構(gòu)酶核苷酸序列與pCDFDuet-Ι載體的雙酶切用酶為及麗和治w I;所述D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列與P⑶FDuet-1載體的雙酶切用酶為汝./ IIMHind III。
[0010]所述第二步中誘導(dǎo)表達的條件為:將構(gòu)建好的重組菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于37°C水浴振蕩培養(yǎng)過夜，按1%的接種量轉(zhuǎn)接于裝有30mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6~0.8時，加入IPTG終濃度為1πιπιο1.?Λ 20°C誘導(dǎo)表達。
[0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有以下有益效果。
[0012]1、芽孢桿菌來源的葡萄糖異構(gòu)酶146位氨基酸為精氨酸(Arg)，在高溫下，精氨酸容易發(fā)生脫氨反應(yīng)。Arg位于2個β折疊中間的α轉(zhuǎn)角處,Pro相對于Arg具備一定的剛性結(jié)構(gòu)，形成的轉(zhuǎn)角活動度小，可能影響GI的熱穩(wěn)定性。經(jīng)定點突變后146位氨基酸精氨酸(Arg)變?yōu)楦彼?Ρι.ο)，Pro屬于亞氨基酸，位于芽孢桿菌葡萄糖異構(gòu)酶β轉(zhuǎn)角的第2個氨基酸，有增強蛋白的熱穩(wěn)定性的作用。
[0013]2、離子半徑越大，其水合離子半徑越小，越有利于它鉆入到凹陷的區(qū)域。對于Mg2+、Co2+和Mn2+等離子半徑小于0.08 nm的激活離子，當離子和酶結(jié)合后，使活性部位(疏水區(qū))外露，以便和底物結(jié)合。Ca2+等離子半徑大于0.08 nm的抑制劑，水合半徑更小，更易鉆入活性口袋和酶緊密結(jié)合，使疏水區(qū)減少，反而有抑制酶活的作用。定點突變后，葡萄糖異構(gòu)酶146位氨基酸精氨酸(Arg)變?yōu)楦彼帷４税被崽幱?個β折疊中間的α轉(zhuǎn)角處，Pro相對于Arg具備一定的剛性結(jié)構(gòu)，形成的轉(zhuǎn)角活動度小。146位氨基酸接近GI的活性中心，GI空間構(gòu)象發(fā)生微小變化，Ca2+不易鉆入活性口袋，和酶活性中心結(jié)合松散，減小了干擾，提聞了果糖廣率。
[0014]3、基因工程技術(shù)制備重組酶:自然界存在的葡萄糖異構(gòu)酶、D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶含量少，活力低，野生菌株培養(yǎng)不易(厭氧)以及酶制備較困難(產(chǎn)酶水平低)，大規(guī)模生產(chǎn)純化工藝較為復(fù)雜，限制了其擴大應(yīng)用。因此，通過基因重組技術(shù)構(gòu)建工程菌，分泌表達高活性葡萄糖苷酶對其實現(xiàn)工業(yè)化具有重要意義。
[0015]4、菌種的選擇:經(jīng)篩選后，來源于芽孢桿菌屬OfeciBm sp.)的葡萄糖異構(gòu)酶活力與其它菌種來源相比活力最高；來源于沿--iflococciAs sp.的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶與來源于其它菌種的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶、D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶相比，熱穩(wěn)定性最好，D-果糖轉(zhuǎn)化生成D-阿洛酮糖的效率最高，更適合D-果糖生成D-阿洛酮糖的工業(yè)生產(chǎn)。
[0016]5、質(zhì)粒的選擇:本發(fā)明需同時表達葡萄糖異構(gòu)酶與D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶兩種酶，選擇的pCDFDuet-Ι為原核共表達質(zhì)粒，含兩個T7啟動子，包括兩個多基因結(jié)合位點，可共表達兩個靶蛋白，克服了兩個質(zhì)粒`在同一宿主中的不相容性。
[0017]6、重組酶的酶學(xué)性質(zhì):異源表達產(chǎn)物(重組酶)的性質(zhì)常常因為分子操作和所采用的表達宿主細胞的生理特征而發(fā)生改變，本研究結(jié)果顯示，重組酶葡萄糖異構(gòu)酶(GI)和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(DPE)的主要酶學(xué)性質(zhì)與天然酶相比，沒有本質(zhì)上的改變。其中，最適作用溫度、最適作用pH、熱穩(wěn)定性與天然酶相似；在金屬離子依賴性方面，兩酶共表達時除對Mg2+依賴性有所改變外，無顯著改變。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為含有定點突變的酶葡萄糖異構(gòu)酶的粗酶液熱穩(wěn)定。
[0019]圖2為含有定點突變的酶葡萄糖異構(gòu)酶的粗酶液和未突變酶葡萄糖異構(gòu)酶粗酶液在80 V時的熱穩(wěn)定性對比圖。
[0020]圖3為密碼子優(yōu)化后的定點突變的酶葡萄糖異構(gòu)酶(Linel)和未突變的酶葡萄糖異構(gòu)酶(Line2)的SDS-PAGE對比圖。
[0021]圖4為P⑶FDuet-1質(zhì)粒載體圖譜。
[0022]圖5為蛋白質(zhì)表達SDS-PAGE分析圖。
[0023]圖6為溫度、pH值對阿洛酮糖生成量的影響折線圖?！揪唧w實施方式】
[0024]以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0025]本發(fā)明采用芽孢桿菌作為葡萄糖異構(gòu)酶的酶源，大腸桿菌作為重組酶核苷酸序列宿主菌。
[0026]本發(fā)明前三步采用基因工程技術(shù)制備共表達重組酶的具體流程為:
國種篩選..-- GI定點突變?載體選擇犾得目的基因..--重組表達質(zhì)粒構(gòu)建目的蛋白的誘導(dǎo)表達SDS-PAGE ?分析鑒定?酶學(xué)性質(zhì)分析。
[0027]一、酶基因來源:
經(jīng)初篩與復(fù)篩、分子鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究篩選出葡萄糖異構(gòu)酶活性最高的菌株，利用NCBI中的BLAST軟件對活性最高菌株進行16SrDNA序列分析發(fā)現(xiàn)，該菌株與芽孢桿菌屬{Bacillus sp.)同源性最近。又根據(jù)同源序列搜索，并且下載一些相關(guān)菌種的16SrDNA序列，利用MEGA4.0軟件來構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，進一步探索該菌株與芽孢桿菌UaciBm sp.)的親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)該菌株與sp.進化距 離最短,這與BLAST比對的結(jié)果一致。
[0028]D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(D-psicose 3-epimerase),根據(jù)根癌農(nóng)桿菌的DPE的序列在NCBI上BLAST發(fā)現(xiàn)，根據(jù)Takara Bio Inc公司提供“保守假定蛋白”(ZP_04858451)的序列合成sp.DPE基因的全部核苷酸序列。
[0029]對葡萄糖異構(gòu)酶定點突變位點的選擇
對不同來源的葡萄糖異構(gòu)酶進行蛋白質(zhì)序列比對，并通過DS軟件對不同嗜熱細菌葡萄糖異構(gòu)酶三維結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)來源于嗜熱細菌葡萄糖異構(gòu)酶的146位氨基酸為脯氨酸(Pro)，而此芽孢桿菌來源的葡萄糖異構(gòu)酶均為精氨酸(Arg)。在高溫下，精氨酸容易發(fā)生脫氨反應(yīng)，此氨基酸處于2個β折疊中間的α轉(zhuǎn)角處，Ρι.ο相對于Arg具備一定的剛性結(jié)構(gòu)，形成的轉(zhuǎn)角活動度小，可能影響GI的熱穩(wěn)定性。因此選擇位點R146P進行定點誘變。
[0030]對葡萄糖異構(gòu)酶的定點突變
弓丨物:F-AACTTATTTACCCATCCTCGCTTTGTCCATGGC
R-GCCATGGACAAAGCGAGGATGGGTAAATAAGTT
載體:pET28a-GI
采用擴增質(zhì)粒的方法，以pET-28a-GI為模板，設(shè)計完全互補配對的上下游突變引物。按以下程序進行 PCR 反應(yīng):95°C 3min ；94 V 30s, 60 °C 30s, 68°C 6min，共 16 個循環(huán)；68°C IOmin0 PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化后，轉(zhuǎn)化疋co7i DH5 α感受態(tài)，涂布于含10%卡那霉素的LB (LB-Kana)平板。挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)并送至金唯智生物科技有限公司測序。若測序發(fā)現(xiàn)未正確突變，則重新挑取單菌落測序或重新突變后測序，直至突變成功。
[0031]同時對突變的葡萄糖異構(gòu)酶進行了熱穩(wěn)定性測定:
突變型粗酶液在緩沖體系于60、70、80、90°C水浴中保溫處理，每隔一定時間取樣，測定葡萄糖異構(gòu)酶酶活，殘留酶活變化結(jié)果見圖1。圖1結(jié)果顯示，60°C時，保溫24h，還能保留90%的酶活；70°C和80°C在保溫24h后分別能保留78%和50%酶活，在90°C超高溫下，也能保持4h的穩(wěn)定性。而在圖2中可以看出，野生型粗酶液在80°C保溫24h只有35%的酶活，相比突變型菌株來講，降低了 15%。說明突變成Pro后，增強了此葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性。這一結(jié)果暗示葡萄糖異構(gòu)酶146位的Pro對維持其熱穩(wěn)定性影響起到至關(guān)重要的作用。Pro由于其結(jié)構(gòu)熵比其它氨基酸小而更易折疊，且一旦折疊則需要很高的能量才能解折疊，這樣在不影響其高級結(jié)構(gòu)的前提下，Pro的替代可以提高整個蛋白質(zhì)分子的熱穩(wěn)定性。Pro屬于亞氨基酸，一般認為，當Pro在α螺旋的N末端或者在2個β折疊中間時，有增強蛋白的熱穩(wěn)定性的作用。將芽孢桿菌葡萄糖異構(gòu)酶的146位氨基酸突變?yōu)镻ro,處于β轉(zhuǎn)角的第2個氨基酸，分析認為146位的Pro，對維持其熱穩(wěn)定性有很大的作用。
[0032]還對葡萄糖異構(gòu)酶密碼子進行優(yōu)化以增加在大腸桿菌中的高效表達:將重組型葡萄糖異構(gòu)酶送去金唯智公司進行密碼子優(yōu)化，此葡萄糖異構(gòu)酶蛋白含量的測定以野生型葡萄糖異構(gòu)酶為對照，用凝膠成像儀檢測計算得到，野生型菌株以及其經(jīng)過密碼子優(yōu)化的重組菌株，其葡萄糖異構(gòu)酶蛋白含量分別約占可溶性蛋白的15%和25%，如圖3所示。
[0033]二、基因載體的選擇:
pCDFDuet-Ι質(zhì)粒(如圖4所示)含兩個開放閱讀框，包括兩個多基因結(jié)合位點，每個位點前都有一個T77ac啟動子和一個核糖體結(jié)合位點，可共表達兩個靶蛋白；也可與pACYCDuet ? -1 (Cat.N0.71147-3)，pRSFDuet ? -1 (Cat.N0.71341-3)，pETDuet ? -1(Cat.N0.71146-3)相結(jié)合在一個適當?shù)乃拗骶曛泄脖磉_ 1~8個靶蛋白。本發(fā)明選擇pCDFDuet-Ι質(zhì)粒對葡萄糖異構(gòu)酶與D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶兩種酶共表達。
[0034]三、獲得目的基因:
(I)引物設(shè)計及目的片段的擴增:
根據(jù)GenBank上熱芽孢桿菌(feci77w5.sp.)葡萄糖異構(gòu)酶的核苷酸保守設(shè)計引物。上游引物:5' ~GAAGATCTCATGCCTTATTTTGACAACATCAGCA~3/ (下劃線部分為汝./ II 酶切位點)，下游引物:5' -GGG GTACCTTAACGGGCTGCGCAAACTT-3'(下劃線部分為治/酶切位點)。依據(jù)NCBI上沿sp.的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(DPE)的核苷酸保守設(shè)計上游引物:5' ~CGGGATCCGATGAAATATGGTATTTATTACGCT~3/ (下劃線部分為及麗Y /酶切位點)，下游引物:5' ~CCCAAGCTTGACTTCAAATACATGTTTTACA~3/ (下劃線部分為歷III酶切位點)。
[0035]PCR反應(yīng)體系(50μυ為:10 X Taq緩沖溶液5μ?，模板DNAlPL，濃度為IOMmol噸4的引物2PL，dNTPs (2.SmmoPr1MPUTaqDNA聚合酶0.3μ?，超純水35.7μ?，混勻。反應(yīng)條件:95°C 5min ；94°C 45s, 53°C 45s, 72°C 2min，32 個循環(huán)；72°C IOmin0
[0036](2)基因的克隆及序列分析:
將PCR擴增產(chǎn)物純化后連接到P⑶FDuet-1質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化疋colimb α感受態(tài)細胞。篩選獲得含辦e和#以基因陽性克隆，經(jīng)測序后在NCBI與已有葡萄糖異構(gòu)酶序列、D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶序列進行比對分析。
[0037]四、重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
將上述得到的葡萄糖異構(gòu)酶突變基因及P⑶FDuet-1分別用BatnHI和Kpn I進行雙酶切，將D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因與pCDFDuet-Ι分別用Bgl II _ind III進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，用T4連接酶于16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化E.co/iDH5a感受態(tài)細胞，鏈霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，分別用PCR和雙酶切法進行鑒定，并挑取陽性轉(zhuǎn)化子進行測序。產(chǎn)物再將陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達宿主菌中誘導(dǎo)表達。
[0038]五、目的蛋白的誘導(dǎo)表達
將構(gòu)建好的重組工程菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于37°C水浴振蕩培養(yǎng)過夜，按1%的接種量轉(zhuǎn)接于裝有30mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD6tltl為0.6^0.8時，加入IPTG終濃度為(lmmoPL-1)，20°C誘導(dǎo)表達。16h后，^OOrmirT1冷凍離心收集菌體，將菌體懸于pH值
7.0的磷酸緩沖溶液中，冰浴超聲。超聲波功率為200W，每超聲5s間隔8s，共70次。
[0039]六、SDS-PAGE分析鑒定 將用超聲波破碎后的細胞高溫處理后離心，收集上清液，即為粗酶液。分別取上清和全菌體進行SDS-PAGE，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%，考馬斯亮藍R-250染色，圖5為檢測的蛋白質(zhì)表達情況。
[0040]經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，從圖5可看出在相對分子質(zhì)量為43kD處表達一條明顯的蛋白條帶，與報道的葡萄糖異構(gòu)酶大小一樣。在相對分子質(zhì)量33kD處有一條明顯的蛋白條帶，表明RDPE表達成功。在此條件下重組蛋白均以可溶性形式存在。
[0041]七、葡萄糖異構(gòu)酶和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的酶學(xué)性質(zhì)分析
對上述的重組蛋白葡萄糖異構(gòu)酶(GI)和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(DPE)進行酶學(xué)性質(zhì)分析。
[0042]( 1)溫度、pH值以及金屬離子對阿洛酮糖生成量的影響以及熱穩(wěn)定性
BGI的葡萄糖異構(gòu)酶和RDPE的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活性以其異構(gòu)化果糖為D-阿洛酮糖的速率確定。反應(yīng)體系為ImL (lmol/L葡萄糖；100mmol/L PIPES緩沖液，pH7.0 ；lmmol/L MgCl2)0異構(gòu)化反應(yīng)在65°C下進行30min。所形成的果糖用分光光度計測定、阿洛酮糖用HPLC測定。異構(gòu)酶活力定義:在檢測條件下每分鐘生成Img果糖所需要的酶量為I個葡萄糖異構(gòu)酶活力單位；每分鐘生成Img阿洛酮糖所需酶量為一個D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活力單位。
[0043]①研究BGI和RDPE共表達的最適作用溫度、最適作用pH和金屬離子依賴性。圖6為溫度、pH值對阿洛酮糖生成量的影響折線圖。
[0044]在不同溫度下測定BGI和RDPE的酶活，以65 °C下測得的酶活作為參照(記為100%)，結(jié)果如圖6所示:BGI和RDPE共表達的最適作用溫度為60°C~70°C ;在不同pH條件下測定BGI和RDPE的酶活，以pH7.0下測得的酶活作為參照(記為100 %)，結(jié)果如圖6所示:BTGI和RDPE共表達的最適作用pH為7.0 ;不同離子下測定BGI和RDPE的酶活，以10 mmol/L CoCl2存在下測得的酶活作為參照(記為100 %)，結(jié)果表明BTGI和RDPE共表達的活性依賴Mg2+。
[0045]綜上所述，雙酶共表達后最適溫度65° C，最適pH值為7.0，加入Mg2+對生成阿洛酮糖有很強的促進的作用。
[0046]②熱穩(wěn)定性測定在20mmol/L PBS緩沖液(ρΗ7.0) lmmol/L MgCl2中進行；pH穩(wěn)定性測定在適應(yīng)的緩沖液(pH5.(Til.0)中進行。
[0047]將BGI和RDPE置于pH7.0緩沖液中，于不同溫度下溫浴不同時間，然后測定殘存酶活，熱穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，BTGI和RDPE在70°C，65°C，55°C下的酶活半衰期分別為4h，8h和24h。70° C時，保溫4h后幾乎沒有阿洛酮糖轉(zhuǎn)化能力，65° C時，保溫8h后失去阿洛酮糖轉(zhuǎn)化能力，55° C，保溫24h以后，還能保持80%的活性。
[0048]將BGI和RDPE在不同pH緩沖液中于65°C下溫浴10 min,冰浴中冷卻后，測定殘存酶活，結(jié)果表明BTGI和RDPE在ρΗ7.0-8.0之間具有較好的穩(wěn)定性。
[0049]本發(fā)明可用其他的不違背本發(fā)明的精神或主要特征的具體形式來概述。因此，無論從那一點來看，本發(fā)明的上述實施方案都只能認為是對本發(fā)明的說明而不能限制發(fā)明，權(quán)利要求書指出了本發(fā)明的范圍，而上述的說明并未指出本發(fā)明的范圍，因此，在與本發(fā)明的權(quán)利要求書相當?shù)暮x 和范圍內(nèi)的任何變化，都應(yīng)認為是包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種基因工程技術(shù)制備共表達重組酶的方法，其特征在于包括以下步驟: 第一步，獲得目的基因 將葡萄糖異構(gòu)酶氨基酸序列的146位的精氨酸定點突變?yōu)楦彼幔缓髮⑼蛔兒蟮钠咸烟钱悩?gòu)酶的核苷酸序列與D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列分別進行PCR擴增；將擴增后的所述定點突變的葡萄糖異構(gòu)酶的核苷酸序列與D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列分別純化后，分別克隆所述定點突變的葡萄糖異構(gòu)酶核苷酸序列和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列； 第二步，重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將上述得到的定點突變的葡萄糖異構(gòu)酶核苷酸序列及pCDFDuet-Ι載體分別用及? HI和治7/7 I進行雙酶切，將D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列與pCDFDuet-Ι載體分別用Bgl II琳Hind JJJ進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，用T4連接酶于16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化疋cWi DH5a感受態(tài)細胞，鏈霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，分別用PCR和雙酶切法進行鑒定，并挑取陽性轉(zhuǎn)化子進行測序；產(chǎn)物再將陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌中誘導(dǎo)表達得到重組菌； 第三步，將重組菌經(jīng)離心收集，并超聲破碎，再次離心即得到定點突變的葡萄糖異構(gòu)酶和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶共表達的粗酶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一 種基因工程技術(shù)制備共表達重組酶的方法，其特征在于所述第一步中定點突變的步驟為: 以pET-28a-GI為模板，設(shè)計完全互補配對的上、下游突變引物；按以下程序進行PCR反應(yīng):95°C 3 min ；94 °C 30s, 60°C 30 s，68°C 6min，共 16 個循環(huán)；68°C IOmin ;PCR 產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化后，轉(zhuǎn)化疋coli DH5 α感受態(tài)細胞，涂布于含10%卡那霉素的LB平板；挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)并測序，若測序發(fā)現(xiàn)未正確突變，則重新挑取單菌落測序或重新突變后測序，直至突變成功； 所述上、下游突變引物為:
F-AACTTATTTACCCATCCTCGCTTTGTCCATGGC
R-GCCATGGACAAAGCGAGGATGGGTAAATAAGTT。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因工程技術(shù)制備共表達重組酶的方法，其特征在于所述第一步定點突變后的葡萄糖異構(gòu)酶核苷酸序列與D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列進行PCR擴增的條件為: 突變葡萄糖異構(gòu)酶核苷酸序列引物: 上游引物:5' -GAAGATCTCATGCCTTATTTTGACAACATCAGCA-3' 下游引物:5, -GGGGTACCTTAACGGGCTGCGCAAACTT-3' D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列引物: 上游引物:5' -CGGGATCCGATGAAATATGGTATTTATTACGCT-3' 下游引物:5' -CCCAAGCTTGACTTCAAATACATGTTTTACA-3' PCR反應(yīng)體系(50μυ為:10\了&9緩沖溶液541^，模板0嫩141^，濃度為IOMmol七1的引物 2μ?，濃度為 2.Smmol*^1 的 dNTPs 4μ?, TaqDNA 聚合酶 0.3μ?,超純水 35.?μΙ,混勻；反應(yīng)條件:95°C 5min ；94°C 45s, 53°C 45s, 72°C 2min，32 個循環(huán)；72°C IOmin0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因工程技術(shù)制備共表達重組酶的方法，其特征在于:所述第二步中，所述定點突變的葡萄糖異構(gòu)酶核苷酸序列與pCDFDuet-Ι載體的雙酶切用酶為BamHI和Kpn I;所述D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列與p⑶FDuet-1載體的雙酶切用酶為汝./ II琳Hind III。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因工程技術(shù)制備共表達重組酶的方法，其特征在于所述第二步中誘導(dǎo)表達的條件為:將構(gòu)建好的重組菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于37°C水浴振蕩培養(yǎng)過夜，按1%的接種量轉(zhuǎn)接于裝有30mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)至0D_為·0.6^0.8時，加入IPTG終·濃度為1mmol.ΙΛ20?誘導(dǎo)表達。
【文檔編號】C12N15/61GK103710329SQ201310720225
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】王曉艷, 門燕, 馮俊敏, 孫媛霞, 張佩舜, 朱玥明, 康振奎, 鞏晉龍, 鄭麗萍, 王小鵬, 李奠礎(chǔ) 申請人:山西天驕食業(yè)有限公司, 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所, 山西天驕生物集團有限公司