一種生產(chǎn)檸檬酸的菌株及其發(fā)酵制備檸檬酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)檸檬酸的菌株，其分類命名為黑曲霉（Aspergillus?niger），已于2013年10月18日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)：CGMCC?No.8368。本發(fā)明還提供該菌株的獲取方法及其生產(chǎn)檸檬酸的方法。通過(guò)對(duì)黑曲霉進(jìn)行選育馴化，篩選出具有較強(qiáng)的中和廢水耐受力，且不影響正常發(fā)酵產(chǎn)酸能力的菌株，并利用其特性在檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中使用中和廢水替換自來(lái)水，在保證其產(chǎn)酸水平的前提下，達(dá)到降低生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染的目的。
【專利說(shuō)明】一種生產(chǎn)檸檬酸的菌株及其發(fā)酵制備檸檬酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)檸檬酸的菌株及其發(fā)酵制備檸檬酸的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]檸檬酸是有機(jī)酸中第一大酸，由于物理、化學(xué)等方面的優(yōu)異性能，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化學(xué)、電子、紡織、石油、皮革、建筑、攝影、塑料、鑄造和陶瓷等工業(yè)領(lǐng)域。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，檸檬酸普遍采用鈣鹽提取法從檸檬酸發(fā)酵液中獲得。然而，由于檸檬酸生產(chǎn)工藝固有的特點(diǎn)，生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的高濃度廢水巳成為該行業(yè)發(fā)展的制約因素。檸檬酸生產(chǎn)過(guò)程排放的高濃度廢水主要來(lái)自中和、洗糖以及離子交換劑再生工段，其中中和廢水排放量最大。行業(yè)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，每生產(chǎn)I噸檸檬酸，中和廢水的排放量達(dá)10-15m3，這給環(huán)境帶來(lái)污染，并提高了環(huán)保費(fèi)用。因此，如何利用這些中和廢水，成為目前檸檬酸生產(chǎn)企業(yè)急需解決問(wèn)題之一。
[0004]目前，檸檬酸中和廢水的回收利用主要采取堿沉淀和酸中和預(yù)處理措施后，直接用于發(fā)酵配料。但其中色素物質(zhì)脫除難度大，成本高，其結(jié)果始終不是十分理想，因此，尋找一種簡(jiǎn)單方便，成本低廉的檸檬酸中和廢水利用方法，對(duì)檸檬酸企業(yè)具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的 是通過(guò)對(duì)現(xiàn)有黑曲霉進(jìn)行馴化，獲得一種更耐檸檬酸中和廢水的新的菌株，并利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。
[0007]—種生產(chǎn)檸檬酸的菌株,其分類命名為黑曲霉(Aspergillus niger),已于2013年10月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)=CGMCCN0.8368。
[0008]本發(fā)明還提供了上述生產(chǎn)檸檬酸的菌株的篩選方法，具體步驟如下:
[0009](I)菌種分離純化:以黑曲霉(Aspergillus niger,保藏號(hào)CGMCC N0.6465)作為出發(fā)菌株，將其稀釋分離，涂布到平板培養(yǎng)基上，于36°C ±1°C培養(yǎng)36~48h ；
[0010](2)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng):將步驟(1)分離純化后的單菌落分別接種于試管斜面培養(yǎng)基，于36°C ±1°C培養(yǎng)4~6d;
[0011](3)菌種發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(2)中試管斜面培養(yǎng)好的單菌落用接種環(huán)勾取I~2環(huán)成熟孢子接入發(fā)酵搖瓶，于36 °C ±1°C，搖床轉(zhuǎn)速300~350rpm/min，培養(yǎng)80~IOOh;
[0012](4)初篩:將步驟(3)搖瓶發(fā)酵液過(guò)濾，用0.1429mol/l的NaOH對(duì)濾液進(jìn)行滴定，通過(guò)測(cè)得發(fā)酵液產(chǎn)酸水平，初篩檸檬酸產(chǎn)量高的菌株進(jìn)行復(fù)篩；
[0013](5)復(fù)篩:將步驟(4)篩選出的菌株重復(fù)步驟(1)~(4)的過(guò)程，直至篩選得到產(chǎn)酸量達(dá)到14%的菌株。
[0014]在上述篩選方法中，步驟(1)所述平板培養(yǎng)基和步驟(2 )所述斜面培養(yǎng)基均為PDA土豆培養(yǎng)基，其質(zhì)量百分?jǐn)?shù)組分為:土豆汁10%~15%、葡萄糖1%~5%、瓊脂1.5%~2.5%，且使用未經(jīng)任何處理過(guò)的中和廢水配制。
[0015]本發(fā)明所述中和廢水為鈣鹽法提取檸檬酸發(fā)酵工藝中，檸檬酸發(fā)酵液經(jīng)過(guò)板框壓濾進(jìn)入中和工段進(jìn)行中和反應(yīng)后所產(chǎn)生的中和廢水，其中含有:Ca離子200~500ppm、K離子 600 ~lOOOppm、Mg 離子 100 ~200ppm、Fe 離子 10 ~30ppm、Na 離子 30 ~60ppm、Zn 離子10~30ppm、硫酸根離子200~500ppm、氯離子30~60ppm、NH4離子10~40ppm ;以及少量的檸檬酸和無(wú)機(jī)氮源，pH為4.5~5.5。
[0016]在步驟(3)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基是由淀粉質(zhì)原料調(diào)漿至粉漿比15-30%，加入α -淀粉酶，經(jīng)液化，過(guò)濾，以濾液為基料，利用檸檬酸中和廢水配制總糖含量為0.13g/ml~
0.18g/ml的培養(yǎng)基；
[0017]其中，所述淀粉質(zhì)原料包括玉米、木薯或高粱中一種或兩種以上。為了獲得更好的菌株，還可以在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加常規(guī)氮源，所述氮源優(yōu)選為無(wú)機(jī)氮源，如硫酸銨和或尿素
坐寸ο
[0018]經(jīng)過(guò)上述方法獲取的菌株能夠?qū)χ泻蛷U水產(chǎn)生足夠的耐受力而不影響檸檬酸產(chǎn)量。
[0019]本發(fā)明還提供了上述生產(chǎn)檸檬酸的菌株生產(chǎn)檸檬酸的方法，具體步驟如下:
[0020](I)擴(kuò)大培養(yǎng):將上述方法獲得的菌株接入傳代試管斜面進(jìn)行第一次擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為36°C ±1°C，培養(yǎng)`時(shí)間4~6d ;將培養(yǎng)好的斜面孢子接入麩曲瓶進(jìn)行第二次擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為36°C ±1°C，培養(yǎng)時(shí)間5~8d ;
[0021](2)孢子懸液的制備:將步驟(1)培養(yǎng)好的孢子沖洗配成懸浮液，每克麩曲所含孢子數(shù)為2 X 101°~5 X 101(1，無(wú)菌條件下將孢子懸液倒入鋼瓶備用；
[0022](3)種子罐培養(yǎng):將步驟(2)中所得到的孢子懸液接入檸檬酸種子罐進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:36°C ±1°C、通風(fēng)比為1:0.6~1.2、罐壓0.3~0.6MPa、攪拌轉(zhuǎn)速100~400rpm/min，培養(yǎng)周期為18~30h ；
[0023](4)發(fā)酵罐培養(yǎng):將步驟(3)種子液按接種量5-10%接入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:36°C ±1°C、通風(fēng)比為1:0.6~1.2、罐壓0.3~0.6MPa、攪拌轉(zhuǎn)速80~500rpm/min，培養(yǎng)周期為72~96h。
[0024]上述生產(chǎn)檸檬酸方法中，所述種子罐培養(yǎng)基是先將淀粉質(zhì)原料調(diào)漿至粉漿比為15%~30%，加入α -淀粉酶液化，再利用檸檬酸制備過(guò)程中的中和廢水配制成培養(yǎng)基；
[0025]所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基是先將淀粉質(zhì)原料調(diào)漿至粉漿比為15%~30%，加入α -淀粉酶液化，經(jīng)液化，過(guò)濾，再以所得濾液為基料，利用檸檬酸制備過(guò)程中的中和廢水配制成培養(yǎng)基。
[0026]其中，所述淀粉質(zhì)原料選自玉米、木薯或高粱中一種或兩種以上；種子罐培養(yǎng)基中總糖含量為0.05~0.lg/mL ;發(fā)酵罐培養(yǎng)基中總糖含量為0.12~0.20g/mL。
[0027]本發(fā)明通過(guò)對(duì)檸檬酸生產(chǎn)菌種進(jìn)行選育馴化，篩選出具有較強(qiáng)的中和廢水耐受力，且不影響正常發(fā)酵產(chǎn)酸能力的菌株，并利用其特性在檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中使用中和廢水替換自來(lái)水，在保證其產(chǎn)酸水平的前提下，達(dá)到降低生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染的目的。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0028]圖1實(shí)施例1所得菌株在50L發(fā)酵罐中發(fā)酵液液相圖譜。
[0029]圖2黑曲霉在50L發(fā)酵罐中發(fā)酵液液相圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0030]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中涉及到的百分號(hào)“％”，是指質(zhì)量百分比；但溶液的百分比，除另有規(guī)定外，是指100ml溶液中含有溶質(zhì)的克數(shù)。
[0031]實(shí)施例1菌株的篩選
[0032](I)菌種分離純化:以黑曲霉(Aspergillus niger,保藏號(hào)CGMCC N0.6465)為出發(fā)菌種，在無(wú)菌操作條件下，將其稀釋分離，涂布到平板培養(yǎng)基上，于36°C ±1°C培養(yǎng)40h ；
[0033]所述平板培養(yǎng)基為PDA 土豆培養(yǎng)基，其中土豆汁12%、葡萄糖3%、瓊脂2%，使用中和廢水替代自來(lái)水配制；
[0034](2)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng):待平板單菌落培養(yǎng)好，再?gòu)呐囵B(yǎng)好的平板中挑選生長(zhǎng)好的幾組單菌落分別接種于試管斜面培養(yǎng)基，于36°C ±1°C培養(yǎng)5d ；
[0035]所述平板培養(yǎng)基為PDA 土豆培養(yǎng)基，其中土豆汁13%、葡萄糖2%、瓊脂2%，使用中和廢水替代自來(lái)水配制；
[0036](3)菌種發(fā)酵培養(yǎng):使用接種針將試管斜面所培養(yǎng)好的單菌落用接種環(huán)勾取I~2環(huán)成熟孢子接入發(fā)酵搖瓶，于36°C ± 1°C，搖床轉(zhuǎn)速320rpm/min，培養(yǎng)90h ；
[0037]所述發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基為玉米粉原料經(jīng)過(guò)液化處理后所得到液化濾液，液化過(guò)程加入α-淀粉酶；培養(yǎng)基使用中和廢水配制，其中總糖含量為0.15g/ml ；
[0038](4)初篩:使用濾紙過(guò)濾步驟(3)搖瓶發(fā)酵液，除去菌絲體和培養(yǎng)基等雜質(zhì)，用
0.1429mol/l的NaOH對(duì)濾液進(jìn)行滴定，通過(guò)測(cè)得發(fā)酵液產(chǎn)酸水平，初篩檸檬酸產(chǎn)量高的菌株進(jìn)行復(fù)篩；
[0039](5)復(fù)篩:將步驟(4)篩選出的菌株重復(fù)步驟(1)~(4)的過(guò)程，直至篩選得到產(chǎn)酸量達(dá)到14%的菌株。
[0040]實(shí)驗(yàn)例I在不同搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中產(chǎn)酸水平的考察
[0041]I)不同溶液配制的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)菌株產(chǎn)酸水平的影響
[0042]黑曲霉(Aspergillus niger,保藏號(hào)CGMCC N0.6465)與實(shí)施例1所得菌株分別在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基1、2中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)，具體結(jié)果見(jiàn)表1。
[0043]其中，搖瓶發(fā)酵條件:36°C ±1°C，搖床轉(zhuǎn)速320rpm/min，培養(yǎng)96h ；
[0044]所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基1:玉米粉原料調(diào)漿至粉漿比20%，加入α -淀粉酶，經(jīng)液化，過(guò)濾，以所得濾液為基料，使用自來(lái)水配制而成，其中滅菌前ΡΗ6.02，滅菌后ρΗ5.59，總糖
0.1585g/ml。
[0045]所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基2:與培養(yǎng)基I的制備方法相同，區(qū)別在于使用中和廢水配制，其中滅菌前pH4.77，滅菌后pH4.72，總糖0.1585g/ml。
[0046]表1黑曲霉與實(shí)施例1菌株在不同溶液配制的培養(yǎng)基中產(chǎn)酸水平
[0047]
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)檸檬酸的菌株，其特征在于，其分類命名為黑曲霉(Aspergillus niger),已于2013年10月18日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào):CGMCC N0.8368。
2.—種權(quán)利要求1所述菌株的獲取方法，其特征在于，具體步驟如下: (1)菌種分離純化:以黑曲霉(Aspergillusniger,保藏號(hào)CGMCC N0.6465)作為出發(fā)菌株，將其稀釋分離，涂布到平板培養(yǎng)基上，于36°C ± 1°C培養(yǎng)36~48h ； (2)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng):將步驟(1)分離純化后的單菌落分別接種于試管斜面培養(yǎng)基，于36 0C ±1°C 培養(yǎng) 4 ~6d ； (3)菌種發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(2)中試管斜面培養(yǎng)好的單菌落用接種環(huán)勾取I~2環(huán)成熟孢子接入發(fā)酵搖瓶，于36°C ±1°C，搖床轉(zhuǎn)速300~350rpm/min，培養(yǎng)80~IOOh; (4)初篩:將步驟(3)搖瓶發(fā)酵液過(guò)濾，用NaOH對(duì)濾液進(jìn)行滴定，通過(guò)測(cè)得發(fā)酵液產(chǎn)酸水平，初篩檸檬酸產(chǎn)量高的菌株進(jìn)行復(fù)篩； (5)復(fù)篩:將步驟(4)篩選出的菌株重復(fù)步驟(1)~(4)的過(guò)程，直至篩選得到產(chǎn)酸量達(dá)到14%的菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的獲取方法，其特征在于，步驟(1)中所述平板培養(yǎng)基和步驟(2)所述斜面培養(yǎng)基均為PDA 土豆培養(yǎng)基，其質(zhì)量百分?jǐn)?shù)組分為:土豆汁10%~15%、葡萄糖1%~5%、瓊脂1.5%~2.5%，由檸檬酸生產(chǎn)的中和廢水配制。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的獲取方法，其特征在于，所述中和廢水為鈣鹽法提取檸檬酸發(fā)酵工藝中，檸檬酸發(fā)酵液經(jīng)過(guò)板框壓濾進(jìn)入中和工段進(jìn)行中和反應(yīng)后所產(chǎn)生的中和廢水，其中含有:Ca離子200~500ppm、K離子600~lOOOppm、Mg離子100~200ppm、Fe離子10~30ppm、Na離子30~60ppm、Zn離子10~30ppm、硫酸根離子200~500ppm、氯離子 30 ~60ppm、NH4 離子 10 ~40ppm, pH 為 4.5 ~5.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的獲取方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基是由淀粉質(zhì)原料調(diào)漿至粉漿比15-30%，加入α-淀粉酶，經(jīng)液化，過(guò)濾，以濾液為基料，利用檸檬酸中和廢水配制總糖含量為0.13g/ml~0.18g/ml的培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的獲取方法，其特征在于，所述淀粉質(zhì)原料包括玉米、木薯或高粱中一種或兩種以上。
7.—種權(quán)利要求1所述菌株生產(chǎn)檸檬酸的方法，其特征在于，包括步驟如下: (1)擴(kuò)大培養(yǎng):將上述權(quán)利要求1-6任一所述菌株接入傳代試管斜面進(jìn)行第一次擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為36°C ± 1°C，培養(yǎng)時(shí)間4~6d ;將培養(yǎng)好的斜面孢子接入麩曲瓶進(jìn)行第二次擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為36°C ± 1°C，培養(yǎng)時(shí)間5~8d ; (2)孢子懸液的制備:將步驟(1)培養(yǎng)好的孢子沖洗配成懸浮液，每克麩曲所含孢子數(shù)為2 X 101°~5 X 101(1，無(wú)菌條件下將孢子懸液倒入鋼瓶備用； (3)種子罐培養(yǎng):將步驟(2)中所得到的孢子懸液接入檸檬酸種子罐進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:36°C ±1°C、通風(fēng)比為1:0.6~1.2、罐壓0.3~0.6MPa、攪拌轉(zhuǎn)速100~400rpm/min，培養(yǎng)周期為18~30h ； (4)發(fā)酵罐培養(yǎng):將步驟(3)種子液按接種量5-10%接入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:36°C ±1°C、通風(fēng)比為 1:0.6— 1.2、罐壓 0.3 ~0.6MPa、攪拌轉(zhuǎn)速 80 ~500rpm/min，培養(yǎng)周期為72~96h。
8.根據(jù)權(quán)利要求7上述方法，其特征在于，所述種子罐培養(yǎng)基是先將淀粉質(zhì)原料調(diào)漿至粉漿比為15%~30%，加入α-淀粉酶液化，再利用檸檬酸制備過(guò)程中的中和廢水配制成培養(yǎng)基；所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基是先將淀粉質(zhì)原料調(diào)漿至粉漿比為15%~30%，加入α-淀粉酶液化，經(jīng)液化，過(guò)濾，再以所得濾液為基料，利用檸檬酸制備過(guò)程中的中和廢水配制成培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求8上述方法，其特征在于，所述淀粉質(zhì)原料選自玉米、木薯或高粱中一種或兩種以上。
10.根據(jù)權(quán)利要求7上述方法，其特征在于，所述種子罐培養(yǎng)基中總糖含量為0.05~·0.lg/mL ;發(fā)酵罐 培養(yǎng)基中總糖含量為0.12~0.20g/mL。
【文檔編號(hào)】C12P7/48GK103695319SQ201310721972
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】李榮杰, 尚海濤, 楊為華, 鄧遠(yuǎn)德, 徐斌, 穆曉玲, 李維理, 紀(jì)傳俠 申請(qǐng)人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司