一株抗Bt小菜蛾有活性的蘇云金芽孢桿菌HLJ-66及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一株抗Bt小菜蛾有活性的蘇云金芽孢桿菌HLJ-66及其應(yīng)用。本發(fā)明菌株為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus?thuringiensis）HLJ-66，簡(jiǎn)稱HLJ-66，保藏號(hào)：CGMCCNo.8445，保藏日期為2013年11月08日，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。所述菌株經(jīng)毒力生物測(cè)定篩選對(duì)抗Cry1Ac殺蟲晶體蛋白及Btk小菜蛾有毒力的菌株。利用該菌株生產(chǎn)高效、廣譜的殺蟲劑，用于防治鱗翅目重要害蟲小菜蛾，同時(shí)對(duì)抗性害蟲具有很好的效果，有利于田間抗性小菜蛾的防治，提高了應(yīng)用價(jià)值，且對(duì)人、畜及其他動(dòng)物無害，對(duì)環(huán)境無污染，具有良好生態(tài)效益，及極佳的應(yīng)用推廣前景。
【專利說明】一株抗Bt小菜蛾有活性的蘇云金芽孢桿菌HLJ-66及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株對(duì)抗Btk小菜蛾有活性的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis) HLJ-66菌株，以及在制備殺蟲劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt),是土壤中的一種能夠產(chǎn)生芽孢的需氧型革蘭氏陽性細(xì)菌。1901年Ishiwate等首次從患病的家蠶(Bombyx morl)幼蟲當(dāng)中分離出一種能夠在其芽孢的形成階段，產(chǎn)生晶體蛋白的細(xì)菌，1915年Berliner等在地中海粉螟(Epetia kuhniella)中也成功分離出這種細(xì)菌，同時(shí)將其命名作蘇云金芽孢桿菌-Bt.thuringiensis。蘇云金芽孢桿菌在其芽孢的形成過程當(dāng)中，能夠產(chǎn)生一種殺蟲晶體毒素蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, δ -內(nèi)毒素)，這種晶體蛋白對(duì)鱗翅目(Lepidoptera)昆蟲、同翅目(Homoptera)昆蟲、鞘翅目(Coleoptera)昆蟲、雙翅目(Diptera)昆蟲、膜翅目(Hymenoptera)昆蟲、直翅目(Orthoptera)昆蟲等多個(gè)目的昆蟲，同時(shí)包括對(duì)原生動(dòng)物、螨類以及線蟲等都具有特異性地殺蟲活性，由于這種晶體蛋白對(duì)害蟲高效、對(duì)非靶標(biāo)生物安全以及對(duì)環(huán)境友好，因此在整個(gè)世界范圍內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用。該菌菌劑作為噴灑型殺蟲劑主要成分的使用時(shí)間已經(jīng)超過50年，是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲劑，占微生物殺蟲劑總量的90%-95%。
[0003]蘇云金芽孢桿 菌的不同殺蟲毒素由不同種類的cry基因控制，各種cry基因已經(jīng)被成功克隆，并根據(jù)不同需要，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入到不同作物中，用于害蟲等有害生物的防治。自1996年轉(zhuǎn)Btcry基因作物的種植開始，轉(zhuǎn)Bt基因作物在世界范圍內(nèi)被廣泛種植，種植面積逐年增長(zhǎng)。據(jù)2008年的統(tǒng)計(jì)顯示，轉(zhuǎn)Bt基因作物的種植面積已增長(zhǎng)至4，600萬公頃。
[0004]但隨著其長(zhǎng)期使用及轉(zhuǎn)Bt作物的迅速推廣，害蟲對(duì)Bt毒素的抗性已成為不容忽視的問題。隨著Bt毒素的大量長(zhǎng)期使用以及轉(zhuǎn)Bt作物的廣泛種植，昆蟲長(zhǎng)期處于選擇壓之下，從而導(dǎo)致了昆蟲都Bt的抗性發(fā)展。通過室內(nèi)篩選，發(fā)現(xiàn)許多昆蟲對(duì)Bt毒素產(chǎn)生了抗性，例如印度谷螟Plodia interpunctella、煙姆夜蛾Heliothis virescens、小菜蛾P(guān)lutella xylostella、甜菜夜蛾Spodoptera exigua、歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis、棉紅鈴蟲 Pectinophora gossypiella、棉鈴蟲 Helicoverpa armigera。1990 年，Tabashnik等報(bào)道田間小菜蛾對(duì)Bt制劑產(chǎn)生了抗性，這是第一例關(guān)于害蟲在田間對(duì)Bt制劑產(chǎn)生抗性的報(bào)道Janmaat等于2003年報(bào)道，加拿大不列顛哥倫比亞商業(yè)化大棚里的粉紋夜蛾對(duì)Bt制劑Dipel和Abbott產(chǎn)生了抗性。Tabashnik等于1989年檢測(cè)到田間種群對(duì)Bt制劑(kurstaki亞種)產(chǎn)生了 25倍的抗藥性，首次報(bào)道了田間小菜蛾對(duì)Bt殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性。Tang等測(cè)定弗羅里達(dá)州田間小菜蛾對(duì)Bt制劑(BtKNRD12)的抗藥性大于1500倍。Wright等報(bào)道馬來西亞田間小菜蛾種群在室內(nèi)篩選飼養(yǎng)7代后對(duì)BtA和BtK制劑的抗藥性分別為330倍和160倍。此外，日本、中美洲、墨西哥和印度等國(guó)家和地區(qū)也有抗Bt小菜蛾的報(bào)道。2000年Zhao等報(bào)道從美國(guó)南卡羅尼那州田間采集的對(duì)CrylC有31倍抗性的小菜蛾抗性品系，在實(shí)驗(yàn)室先用CrylC原毒素繼續(xù)汰選，然后用表達(dá)高劑量的CrylC毒素的轉(zhuǎn)基因花椰菜汰選，26代后，該品系對(duì)CrylC毒素抗性高達(dá)63100倍(2齡幼蟲)。國(guó)內(nèi)，馮夏等報(bào)道深圳、東莞地區(qū)等供港菜區(qū)小菜蛾對(duì)Bt的抗藥性為17.2-30.2倍。李建洪等通過對(duì)深圳、東莞和廣州菜區(qū)的田間小菜蛾種群檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)小菜蛾對(duì)蘇云金芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)品Cs3ab-1991的抗藥性倍數(shù)分別為8.9,6.5,2.1倍。周程愛等報(bào)道長(zhǎng)沙地區(qū)的小菜蛾對(duì)Bt的抗藥性由1997-1999年的敏感性由1.1-4.1倍發(fā)展到2000年的6.2倍的低水平抗藥性。余德億等報(bào)道福建地區(qū)田間種群的小菜蛾對(duì)湖北Bt和福建Bt的抗藥性分別由1997年的2.1倍和3.1倍上升到1999年的8.2倍和10.1倍。郭世儉等報(bào)道浙江省杭州、蕭山、金華、溫州四地的小菜蛾對(duì)Bt制劑還沒有產(chǎn)生抗藥性。王崇利等報(bào)道廣東惠州田間小菜蛾種群對(duì)CrylAb和CrylAc的抗性達(dá)到了高抗水平；對(duì)Btk制劑的抗性達(dá)到了中抗水平；對(duì)CrylAa和Cry2Aa具有低水平抗性；福建福州、浙江杭州和江蘇南京田間小菜蛾種群對(duì)CrylAb、CrylAc具有低至中等水平抗性(8-28倍)JfBtk制劑具有低水平抗性(3.5-7倍)。
[0005]以上可以看出，小菜蛾對(duì)Bt產(chǎn)生的抗性問題已經(jīng)十分突出，因此篩選到對(duì)抗Bt小菜蛾高活性的菌株，用于防治抗Bt害蟲已迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的在于提供一株抗Bt小菜蛾有活性的蘇云金芽孢桿菌HLJ-66及其應(yīng)用，該菌株對(duì)鱗翅目害蟲、抗Btk鱗翅目害蟲及抗CrylAc殺蟲晶體蛋白鱗翅目害蟲具有毒殺作用，利用該菌株能開發(fā)一種廣譜、高效且對(duì)抗Bt害蟲有效的Bt殺蟲劑。
[0007]本發(fā)明的一株抗Bt小菜蛾有活性的蘇云金芽孢桿菌HLJ-66,它為蘇云金芽孢桿菌(BaciIIus thuringiensis)HLJ-66,保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2013年11月08日，保藏號(hào)為 CGMCCN0.8445。
[0008]本發(fā)明的一株抗Bt小菜蛾有活性的蘇云金芽孢桿菌HLJ-66是作為制備防治鱗翅目及抗Bt鱗翅目害蟲的殺蟲劑中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的一種防治鱗翅目及抗Bt鱗翅目害蟲的殺蟲劑，包含上面所述的蘇云金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis) HLJ-66。
[0010]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果:
[0011]本發(fā)明選擇了鱗翅目主要害蟲(小菜蛾)為靶標(biāo)昆蟲，同時(shí)汰選得到了對(duì)Bt(Kurstaki亞種)粉劑具有高抗的抗Btk小菜蛾種群和對(duì)CrylAc殺蟲晶體蛋白具有高抗的抗CrylAc殺蟲晶體蛋白小菜蛾種群，作為祀標(biāo)昆蟲，蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis) HLJ-66同時(shí)對(duì)上述鱗翅目主要害蟲敏感及抗Btk及CrylAc殺蟲晶體蛋白害蟲，均具有較強(qiáng)的毒殺作用。利用該菌株生產(chǎn)高效、廣譜的殺蟲劑，用于防止鱗翅目重要害蟲小菜蛾，同時(shí)對(duì)抗性害蟲具有很好的效果，有利于田間抗性小菜蛾的防治，提高了經(jīng)濟(jì)價(jià)值，且對(duì)人、畜及其他動(dòng)物無害，不污染環(huán)境，具有良好經(jīng)濟(jì)、生態(tài)效益，具有良好的應(yīng)用推廣前景。由于Bt粉劑及轉(zhuǎn)Bt基因作物的廣泛種植，小菜蛾對(duì)Bt抗性嚴(yán)重，對(duì)抗Bt小菜蛾有效的Bt殺蟲劑產(chǎn)品鮮為報(bào)道，而采用本發(fā)明得到的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis) HLJ-66卻能很好的解決這一問題?！揪唧w實(shí)施方式】
[0012]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的任意組合。
[0013]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式的一株抗Bt小菜蛾有活性的蘇云金芽孢桿菌HLJ-66,它為蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis) HLJ-66,保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2013年11月08日，保藏號(hào)為CGMCCN0.8445。
[0014]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
[0015]從土壤中分離的一株蘇云金芽孢桿菌。用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)至伴孢晶體脫落。對(duì)相對(duì)敏感小菜蛾、抗Btk小菜蛾及抗CrylAc殺蟲晶體蛋白小菜蛾黃粉蟲進(jìn)行生物測(cè)定，對(duì)上述供試害蟲均具有較強(qiáng)殺蟲作用。對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特征分析，分析菌株所含的殺蟲晶體蛋白基因類型。其命名為蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)HLJ-66。該菌株保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，保藏日期為:2013年11月08日，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào):CGMCCN0.8445。
[0016]本實(shí)施方式的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)HLJ_66獲得步驟,具體步驟如下:
[0017]1、取黑龍江土樣Ig加入IOOmL無菌水中，30°C振蕩培養(yǎng)30min，在75-80°C水浴中熱處理14-20min，得培養(yǎng)液；
[0018]2、將培養(yǎng)液稀釋到100倍濃度，均勻涂布于分離培養(yǎng)基平板上，置于28_30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；其中，所述的分離培養(yǎng)基由牛肉膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、15~20g瓊脂和水1000mL混合后， 調(diào)pH值至7.0，即得分離培養(yǎng)基；
[0019]3、培養(yǎng)3-4d后，挑選培養(yǎng)特征類似蘇云金桿菌的菌株涂片，用石碳酸復(fù)紅染色鏡檢，觀察有無芽孢和伴孢晶體；
[0020]4、將產(chǎn)生芽孢和伴孢晶體的菌株檢出純化后，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，至伴孢晶體脫落；其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基由蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCllOg和水1000mL混合而成，調(diào)pH值至7.0,即得發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0021]5、取5mL上一步的發(fā)酵液與50 μ L含量為5%的TritonlOO混合均勻(TritonlOO終濃度為0.05%)，采用浸葉法對(duì)相對(duì)敏感小菜蛾、抗Bt小菜蛾、抗CrylAc殺蟲晶體蛋白小菜蛾及黃粉蟲進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定；
[0022]其中，毒力測(cè)試的具體方法如下:選老嫩適中的甘藍(lán)葉片洗凈晾干，剪成直徑2cm大小，放入藥液(含TritonlOO終濃度為0.05%)中，浸泡IOs晾干，放入鋪有濕潤(rùn)濾紙的平皿中。以無菌水混合TritonlOO (TritonlOO終濃度為0.05%)浸泡葉片作為對(duì)照。選取2-3齡小菜蛾幼蟲，每個(gè)處理10頭，設(shè)4個(gè)重復(fù)，置于溫度25°C、相對(duì)濕度65%-70%、光照比L:D=16:8的條件下飼養(yǎng)，3d后觀察小菜蛾幼蟲死亡情況，5d后觀察黃粉蟲幼蟲死亡情況，計(jì)算死亡率；
[0023]6、對(duì)上述篩選得到的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)描述；
[0024]7、對(duì)上述篩選得到的菌株進(jìn)行生理生化特征分析研究；
[0025]8、對(duì)上述篩選得到的菌株進(jìn)行所含殺蟲晶體蛋白基因類型鑒定。[0026]通過上述方法鑒定出蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis) HLJ-66具有以下性質(zhì):
[0027]根據(jù)上述實(shí)施方法，得到一株對(duì)鱗翅目害蟲、抗Bt鱗翅目害蟲、抗CrylAc殺蟲晶體蛋白鱗翅目害蟲及鞘翅目害蟲具有毒殺作用的蘇云金芽孢桿菌菌株，命名為BacillusthuringiensisHLJ-66,該菌株于2013年11月08日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào):CGMCCN0.8445。
[0028]1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis) HLJ-66的殺蟲活性:該菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至伴孢晶體脫落，對(duì)鱗翅目害蟲小菜蛾(Plutella xylostalla)相對(duì)敏感種群的致死中濃度(LC5tl)為4.41mg/L，對(duì)鱗翅目害蟲小菜蛾抗Bkt種群的致死中濃度(LC5tl)為5.29mg/L，對(duì)鱗翅目害蟲小菜蛾抗CrylAc殺蟲晶體蛋白種群的致死中濃度(LC5tl)為6.21mg/L,顯示出較強(qiáng)毒殺作用。
[0029]2、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis) HLJ-66的形態(tài)特征:菌落均呈白色圓形、扁平，表面干燥無光澤，邊緣缺刻；在普通LB平板上能生長(zhǎng)，為好氧菌；細(xì)胞桿狀，有鞭毛，革蘭氏染色為陽性，且一個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞只有一個(gè)芽孢，芽孢為中生、次端生或端生，孢子囊不膨大，有晶體存在。
[0030]3、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis) HLJ-66的生理生化特性:
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一株抗Bt小菜蛾有活性的蘇云金芽孢桿菌HLJ-66，其特征在于它為蘇云金芽孢桿菌(BaciIIus thuringiensis)HLJ-66,保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2013年11月08日，保藏號(hào)為 CGMCCN0.8445。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株抗Bt小菜蛾有活性的蘇云金芽孢桿菌HLJ-66,其特征在于所述的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)HLJ_66,攜帶的殺蟲晶體蛋白基因有cryIAc、cry2Ab和cry7, 8,以及外毒素cyt基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一株抗Bt小菜蛾有活性的蘇云金芽孢桿菌HLJ-66，其特征在于所述的抗Bt小菜蛾有活性的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)HLJ-66是一株對(duì)鱗翅目害蟲、抗Btk鱗翅目害蟲、抗CrylAc殺蟲晶體蛋白鱗翅目害蟲及鞘翅目害蟲具有高毒力的蘇云金芽孢桿菌。
4.如權(quán)利要求1所述的一株抗Bt小菜蛾有活性的蘇云金芽孢桿菌HLJ-66的應(yīng)用，其特征在于它是在制備防治鱗翅目及抗Bt鱗翅目害蟲的殺蟲劑中的應(yīng)用。
5.一種防治鱗翅目及抗Bt鱗翅目害蟲的殺蟲劑，其特征在于所述的殺蟲劑包含權(quán)利要求I所述的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis) HLJ-66。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103695362SQ201310726299
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】楊峰山, 朱勛, 劉春光, 張友軍, 李柱剛, 楊晶, 谷有芳, 王秀君 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)