組成型啟動(dòng)子及其用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種組成型啟動(dòng)子及其用途，組成型啟動(dòng)子的核苷酸序列包括如下（a）或（b）的序列：（a）具有SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列；（b）在嚴(yán)格條件下與（a）限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明組成型啟動(dòng)子幾乎在植物的大多數(shù)組織和許多類(lèi)型細(xì)胞中普遍存在活性且顯著地提高目的異源核苷酸序列在植物組織中的表達(dá)量，特別是在葉片和莖中。
【專(zhuān)利說(shuō)明】組成型啟動(dòng)子及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種組成型啟動(dòng)子及其用途，特別是涉及一種組成型的水稻泛素基因啟動(dòng)子及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞生物學(xué)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的重大進(jìn)步使得外源基因合并進(jìn)許多作物中。外源基因被轉(zhuǎn)入植物中主要為表達(dá)蛋白，所述植物被稱(chēng)為“轉(zhuǎn)基因植物”，所述蛋白將給予有益的性狀，如抵抗病原微生物或昆蟲(chóng)、抗除草劑、耐旱或其它不利的環(huán)境。通常，外源基因的DNA編碼區(qū)域連接于一強(qiáng)大的且組成型的DNA啟動(dòng)子區(qū)域以確保外源基因在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中有效表達(dá)。
[0003]大量普通的啟動(dòng)子被用于在轉(zhuǎn)基因植物中驅(qū)動(dòng)外源基因的表達(dá)?；ㄒ嘶ㄈ~病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子被廣泛地用于雙子葉和單子葉植物中，但是它在單子葉植物中的效率顯著低于其在雙子葉植物中的效率。CaMV35S甚至在某些細(xì)胞類(lèi)型中無(wú)活性，例如花粉。
[0004]泛素(Ubiquitin，簡(jiǎn)稱(chēng)UBQ或Ubi)基因啟動(dòng)子作為組成型啟動(dòng)子在植物的大多數(shù)組織和許多類(lèi)型細(xì)胞中都顯示出明顯較高的基因表達(dá)水平，特別是在單子葉植物中具有較高的活性，如分離自玉米聚泛素基因的泛素啟動(dòng)子Ubil在玉米原生質(zhì)體中可以比CaMV35S啟動(dòng)子更有效地驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因CAT的表達(dá)；同時(shí)，泛素基因啟動(dòng)子在幼嫩組織中也顯示出優(yōu)先的活性，如維管束組織和花粉粒。目前，植物來(lái)源的泛素基因啟動(dòng)子主要分離自玉米、向日葵、煙草、馬鈴薯、甘蔗、擬南芥和大豆，而水稻中的泛素基因啟動(dòng)子卻鮮有報(bào)道。另外，在同一轉(zhuǎn)基因植物中多個(gè)轉(zhuǎn)基因的疊加需要大量不同的啟動(dòng)子，否則將會(huì)發(fā)生同源依賴(lài)的基因沉默，這一現(xiàn)象在具有多拷貝同一啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植物中屢見(jiàn)不鮮。因此需要開(kāi)發(fā)不同來(lái)源的泛素基因啟動(dòng)子，使異源核苷酸序列能夠在植物組織中高效表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種組成型啟動(dòng)子及其用途，即新的分離自水稻(Oryzasativa)的Ubi基因啟動(dòng)子，使異源核苷酸序列能夠在植物組織中高效表達(dá)。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種組成型啟動(dòng)子，其核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列:
[0007]Ca)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
[0008](b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
[0009]上述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC (檸檬酸鈉)、0.5%SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液中，在溫度65°C下雜交，然后用2XSSC、0.1%SDS和1XSSC、0.1%SDS各洗膜I次。
[0010]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含與目的異源核苷酸序列可操作地連接的所述組成型啟動(dòng)子的嵌合基因。
[0011]進(jìn)一步地，所述 目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。
[0012]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述嵌合基因的表達(dá)盒。[0013]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述表達(dá)盒的重組載體。
[0014]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種在植物中表達(dá)目的異源核苷酸序列的方法，包括:將與所述組成型啟動(dòng)子可操作地連接的目的異源核苷酸序列穩(wěn)定的整合進(jìn)植物細(xì)胞中。
[0015]進(jìn)一步地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
[0016]優(yōu)選地，所述目的異源核苷酸序列在植物組織中組成型的表達(dá)。
[0017]進(jìn)一步地，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。
[0018]優(yōu)選地，所述目的異源核苷酸序列編碼除草劑耐性蛋白質(zhì)。
[0019]所述目的異源核苷酸序列編碼昆蟲(chóng)抗性蛋白質(zhì)。
[0020]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種所述組成型啟動(dòng)子用于在植物組織中組成型的表達(dá)目的異源核苷酸序列的用途。
[0021 ] 優(yōu)選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
[0022]進(jìn)一步地，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。
[0023]本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是指DNA調(diào)節(jié)區(qū)，通常含有能夠引導(dǎo)RNA聚合酶II在特定編碼序列的適合轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)啟動(dòng)RNA合成的TATA盒。啟動(dòng)子可另外含有其它的識(shí)別序列，一般位于TATA盒的上游或5’端，稱(chēng)作上游啟動(dòng)子元件，它們影響轉(zhuǎn)錄起始速率。公認(rèn)地，由于本發(fā)明啟動(dòng)子區(qū)域核苷酸序列己經(jīng)確定，從本發(fā)明具體啟動(dòng)子區(qū)域上游的5’非翻譯區(qū)內(nèi)進(jìn)一步分離和鑒定調(diào)節(jié)元件屬于現(xiàn)有技術(shù)。因此，本發(fā)明啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)一步包括上游調(diào)節(jié)元件，它賦予與本發(fā)明啟動(dòng)子序列可操作地連接的任何異源核苷酸序列組成型的表達(dá)，即在植物的大體上所有組織和所有生長(zhǎng)發(fā)育階段都能夠表達(dá)。
[0024]本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“基因”是指在適宜的調(diào)控區(qū)域(例如植物可表達(dá)性啟動(dòng)子區(qū)域)控制下在細(xì)胞內(nèi)含有被轉(zhuǎn)錄成RNA分子(例如mRNA)的DNA區(qū)域(“轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域”)的任何DNA片段。因此，基因可能含有幾種可操作性連接的DNA片段，例如啟動(dòng)子、5’非翻譯前導(dǎo)序列、編碼區(qū)域和含有多聚腺苷酸化位點(diǎn)的3’非翻譯區(qū)域。內(nèi)源植物基因是在植物物種中天然發(fā)現(xiàn)的基因。嵌合基因是通常不在植物物種中發(fā)現(xiàn)的任何基因，或者是在天然情況下其啟動(dòng)子與部分或全部轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域或者與該基因的至少另一調(diào)控區(qū)域無(wú)關(guān)的任何基因。
[0025]本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“組成型啟動(dòng)子”是指在該類(lèi)啟動(dòng)子的控制下，目的異源核苷酸序列的表達(dá)大體恒定在一定水平上，在植物的不同組織和/或不同生長(zhǎng)發(fā)育階段表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。所述組織為植物體中由來(lái)源相同和執(zhí)行同一功能的一種或多種類(lèi)型細(xì)胞集合而成的結(jié)構(gòu)單位，例如保護(hù)組織、輸導(dǎo)組織、營(yíng)養(yǎng)組織、機(jī)械組織、分生組織，幾種不同的組織有機(jī)配合、緊密聯(lián)系，形成不同的器官(organ)，不同的器官之間互相配合，更有效地完成有機(jī)體的整個(gè)生命活動(dòng)過(guò)程。所述生長(zhǎng)發(fā)育階段可根據(jù)植物形態(tài)、機(jī)能的差異劃分為胚胎階段、幼苗階段、成熟階段和衰老階段。本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“組成型的表達(dá)”是指目的異源核苷酸序列在植物的不同組織和/或不同生長(zhǎng)發(fā)育階段都以大體上一致的水平進(jìn)行表達(dá)。
[0026]本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)相同目的能夠容易地鑒定并利用功能上等價(jià)的啟動(dòng)子。具有本質(zhì)上與含有本發(fā)明SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列、或具有啟動(dòng)子活性部分的核苷酸序列的水稻Ubi基因啟動(dòng)子相似的啟動(dòng)子活性的DNA序列，是這些啟動(dòng)子的功能等價(jià)物。這些功能等價(jià)啟動(dòng)子能在嚴(yán)格條件下與含有上述核苷酸序列的水稻Ubi基因啟動(dòng)子區(qū)域雜交。
`[0027]在雜交技術(shù)中，己知核苷酸序列的全部或部分被用作探針，與來(lái)自被選生物體的克隆基因組DNA片段或cDNA片段(如基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù))群體中存在的其它對(duì)應(yīng)核苷酸序列選擇性地雜交。雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，可以被可探測(cè)的基團(tuán)如32P或其它任何可探測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記。因此，例如，通過(guò)標(biāo)記根據(jù)本發(fā)明序列的合成寡核苷酸可以制備雜交探針。制備雜交探針和構(gòu)建cDNA和基因組文庫(kù)的方法為本領(lǐng)域己知并公開(kāi)于SambiOOk等人(1989)分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。
[0028]序列的雜交可在嚴(yán)格條件下進(jìn)行。所述“嚴(yán)格條件”是指探針將與其靶序列雜交至可探測(cè)程度超過(guò)與其它序列雜交(如至少2倍于背景)的條件。嚴(yán)格條件具有序列依賴(lài)性，且因環(huán)境的不同而不同。通過(guò)控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒定與探針100%互補(bǔ)的靶序列(同源探測(cè))?？蛇x擇地，可以調(diào)節(jié)嚴(yán)格條件以允許一些序列錯(cuò)配，使得探測(cè)到較低程度的相似性(異源探測(cè))。通常，探針長(zhǎng)度短于大約1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選地短于500個(gè)核苷酸。 [0029]典型地，嚴(yán)格條件是在pH7.0至8.3下鹽濃度低于大約1.5M Na離子，典型地大約0.01至1.0M Na離子濃度(或其它鹽類(lèi))，溫度對(duì)短探針(如10至50個(gè)核苷酸)至少大約30°C，對(duì)長(zhǎng)探針(如超過(guò)50個(gè)核苷酸)至少大約60°C。通過(guò)添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺也可獲得嚴(yán)格條件。低度嚴(yán)格條件，例如，包括在30-35%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS (十二烷基磺酸鈉)的緩沖溶液中37°C雜交，在IX至2XSSC (20XSSC=3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中50-55°C洗滌。中度嚴(yán)格條件，例如，包括在40-45%甲酰胺、1.0M NaCl、1%SDS的緩沖溶液中37°C雜交，在0.5X至1父55(:中55-601:洗滌。高度嚴(yán)格條件，例如，包括在50%甲酰胺、IMNaCl、l%SDS的緩沖溶液中37°C雜交，在0.1XSSC中60_65°C洗滌。非必要地，洗滌緩沖液可含有大約0.1%至1%的SDS。雜交時(shí)間一般少于大約24小時(shí)，通常大約4至12小時(shí)。
[0030]特別典型地是雜交后洗滌的函數(shù)，關(guān)鍵因素是最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對(duì)于 DNA-DNA 雜交體,T111 可以從 Meinkoth 和 Wahl (1984)Anal.Biochem.138:267-284 的方程估算:1=81.5°C+16.6 (1gM) +0.41 (%GC) -0.61 (%form)-500/L ;其中 M 是單價(jià)陽(yáng)離子的摩爾濃度，%GC是鳥(niǎo)嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％form是甲酰胺在雜交溶液中的百分比，L是雜交體在堿基對(duì)中的長(zhǎng)度。Tm是50%互補(bǔ)靶序列與完全配對(duì)探針雜交的溫度(在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH下)。每1%的錯(cuò)配需Tm降低大約廣匕因此，、雜交和/或洗滌條件可被調(diào)節(jié)以與所需同一性的序列雜交。例如，如果探尋的序列具有> 90%的同一性，^可以降低10°C。一般地，選擇的嚴(yán)格條件是低于特定序列的熱解鏈溫度(Tm)大約5°C，且其在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH下互補(bǔ)。但是，高度嚴(yán)格條件可以應(yīng)用低于熱解鏈溫度(Tm) 1、2、3或4°C的雜交和/或洗滌；中度嚴(yán)格條件可以應(yīng)用低于熱解鏈溫度(Tm) 6、7、8、9或I (TC的雜交和/或洗滌；低度嚴(yán)格條件可以應(yīng)用低于熱解鏈溫度(Tm)IU 12、13、14、15或20°C的雜交和/或洗滌。應(yīng)用此方程、雜交和洗滌組合物和所需的Tm，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)理解雜交和/或洗滌溶液的條件隨嚴(yán)格程度的變化而變化。如果所需的錯(cuò)配程度使Tm低于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，優(yōu)選增加SSC濃度以能夠使用較高的溫度。核酸雜交的指南見(jiàn)于Tijssen (1993)生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)-用核酸探針雜交，第I部分，第2章(Elsevier, New York);和Ausubel等人編輯(1995)分子生物學(xué)現(xiàn)代方法第2 章(Greene Publishing and ffiley-1nterscience, New York)。見(jiàn) Sambrook 等人(1989)分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NewYork)。
[0031]因此，具有啟動(dòng)子活性并在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明啟動(dòng)子序列或其片段雜交的分離序列包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40%-50%同源，大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多同源。即序列同一性的范圍分布在至少大約40%-50%、大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同一性。
[0032]其它功能等價(jià)啟動(dòng)子含有這樣的核苷酸序列，即能用含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的至少約25、優(yōu)選至少約50、特別是至少約100個(gè)連續(xù)核苷酸的寡核苷酸引物在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增的核苷酸序列。
[0033]還可以構(gòu)建人工啟動(dòng)子，其包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的5’調(diào)控區(qū)域的決定啟動(dòng)子的組成型的表達(dá)的內(nèi)部序列。所述人工啟動(dòng)子可能包含能在植物中表達(dá)的另一啟動(dòng)子的“核心啟動(dòng)子”或“TATA盒區(qū)域”，例如W093/19188中所述的CaMV35S “TATA盒區(qū)域”。含有所述人工啟動(dòng)子的啟動(dòng)子區(qū)域的適用性可以通過(guò)它們與目的異源核苷酸序列的適當(dāng)融合以及目的異源核苷酸序列在適宜組織、適當(dāng)發(fā)育階段的表達(dá)的檢測(cè)進(jìn)行鑒定。
[0034]本發(fā)明所述的啟動(dòng)子序列及其片段，當(dāng)組裝進(jìn)DNA結(jié)構(gòu)使啟動(dòng)子序列與目的異源核苷酸序列可操作地連接時(shí)，用于遺傳性操控任何植物。所述“可操作地連接”是指本發(fā)明的啟動(dòng)子序列與第二個(gè)序列之間的功能性連接，其中啟動(dòng)子序列啟動(dòng)和調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)于第二個(gè)序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。一般地，可操作地連接是指被連接的核酸序列是連續(xù)的，必要時(shí)相鄰地結(jié)合兩個(gè)蛋白編碼區(qū)， 并在同一個(gè)閱讀框內(nèi)。以此方式，啟動(dòng)子核苷酸序列與目的異源核苷酸序列構(gòu)成所述嵌合基因在表達(dá)盒中一起提供，以在目的植物中表達(dá)。這種表達(dá)盒提供了大量限制性位點(diǎn)以插入目的異源核苷酸序列，所述目的異源核苷酸序列將受到包含本發(fā)明啟動(dòng)子序列的調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。表達(dá)盒可另外含有至少一個(gè)將共轉(zhuǎn)化進(jìn)生物體的附加基因。可選擇地，附加基因可以在多個(gè)表達(dá)盒上被提供。
[0035]表達(dá)盒可另外含有可選擇的標(biāo)記基因。一般地，表達(dá)盒將包含用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性標(biāo)記基因。所述選擇性標(biāo)記基因用于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。所述選擇性標(biāo)記基因包括但不限于，編碼抗生素抗性的基因(如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II (NPT))和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的基因，以及賦予除草劑抗性的基因如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮類(lèi)和2，4-二氯苯氧乙酸酯(2，4-D)。
[0036]表達(dá)盒包括沿5’_3’方向轉(zhuǎn)錄的本發(fā)明的啟動(dòng)子序列、翻譯起始區(qū)、目的異源核苷酸序列、和在植物中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。目的異源核苷酸序列可以是天然的或?qū)χ参锼拗魍庠吹幕虍愒吹摹？蛇x擇地，目的異源核苷酸序列可以是天然序列或選擇性合成序列。“外源”是指在導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的天然植物中不存在所述的導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。例如，嵌合基因包含本發(fā)明的啟動(dòng)子序列，本發(fā)明的啟動(dòng)子序列可操作地與不同于本發(fā)明的啟動(dòng)子序列的編碼序列連接。
[0037]終止區(qū)可來(lái)源于本發(fā)明的啟動(dòng)子序列，也可來(lái)源于可操作連接的目的異源核苷酸序列，或可來(lái)源于另外的來(lái)源。傳統(tǒng)的終止區(qū)可從土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒獲得，如肉堿合成酶和胭脂堿合成酶(NOS)終止區(qū)。
[0038]在表達(dá)盒制備中，可以操控不同的DNA片段以提供適當(dāng)方向的DNA序列，并在適合的時(shí)候提供適當(dāng)?shù)拈喿x框。所以，可應(yīng)用接受子或連接子結(jié)合DNA片段，或可進(jìn)行其它操控以提供方便的限制性位點(diǎn)、去除多余的DNA、去除限制性位點(diǎn)等。為此目的，可能涉及體外誘變、引物修復(fù)、限制、退火、再取代，如轉(zhuǎn)變和轉(zhuǎn)換。
[0039]在適合的情況下，目的異源核苷酸序列可被優(yōu)化以增加在轉(zhuǎn)化植物中的表達(dá)量。即可用植物優(yōu)選的密碼子合成基因以改善表達(dá)。
[0040]本領(lǐng)域公知的，另外的序列修飾可提高細(xì)胞宿主中的基因表達(dá)水平。這些包括但不限于，去除編碼假性聚腺苷信號(hào)、外顯子-內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號(hào)、轉(zhuǎn)座子的重復(fù)序列，以及其它充分表征出可能不利于基因表達(dá)的序列。序列的G-C含量可調(diào)節(jié)到指定宿主細(xì)胞的平均水平，引用宿主細(xì)胞中己知的基因表達(dá)水平進(jìn)行計(jì)算。可能地，修飾序列以避免預(yù)測(cè)的發(fā)夾式mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0041]在表達(dá)盒或重組載體中，表達(dá)盒可另外含有5’前導(dǎo)序列。所述前導(dǎo)序列可以起改進(jìn)轉(zhuǎn)錄效率的作用。所述前導(dǎo)序列為本領(lǐng)域已知的，包括但不限于，細(xì)小核糖核酸病毒前導(dǎo)序列，例如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎5’非編碼區(qū))；馬鈴薯病毒組前導(dǎo)序列，例如煙草蝕刻病毒(TEV)前導(dǎo)序列、玉米矮小花葉病毒(MDMV)前導(dǎo)序列和人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP);來(lái)自紫花苜蓿花葉病毒包被蛋白mRNA (AMV RNA4)的非翻譯前導(dǎo)序列；煙草花葉病毒(TMV)前導(dǎo)序列；和玉米萎黃病斑點(diǎn)病毒(MCMV)前導(dǎo)序列。還可以使用其它己知的改進(jìn)轉(zhuǎn)錄效率的元件，例如內(nèi)含子等。
[0042]本發(fā)明的啟動(dòng)子序列可用來(lái)啟動(dòng)與目的異源核苷酸序列的信使RNA (mRNA)至少部分互補(bǔ) 的反義結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄。構(gòu)建反義核苷酸序列以與相應(yīng)的mRNA雜交。只要反義序列長(zhǎng)到可與相應(yīng)的mRNA雜交并干擾其表達(dá)，就可進(jìn)行反義序列的修飾。以此方式，可以使用與相應(yīng)的反義序列具有70%,優(yōu)選的80%,更優(yōu)選的85%序列同一'丨生的反義結(jié)構(gòu)。此外，反義核苷酸序列的一部分可被用來(lái)破壞祀基因的表達(dá)。一般，可使用至少50個(gè)核苷酸、100個(gè)核苷酸、200個(gè)核苷酸或更多個(gè)核苷酸的序列。
[0043]本發(fā)明的啟動(dòng)子序列還可用于啟動(dòng)正義方向的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄以抑制植物中內(nèi)源性基因的表達(dá)。應(yīng)用正義方向的核苷酸序列在植物中抑制基因表達(dá)的方法為本領(lǐng)域己知。該方法通常涉及用含啟動(dòng)子的DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化植物，啟動(dòng)子可操作地連接至少一部分相當(dāng)于內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄體的核苷酸序列，并驅(qū)動(dòng)其在植物中表達(dá)。典型地，所述核苷酸序列與內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄體的序列具有實(shí)質(zhì)上地序列同一性，優(yōu)選地超過(guò)大約65%序列同一性，更優(yōu)選地超過(guò)大約85%序列同一性，最優(yōu)選地超過(guò)大約95%序列同一性。
[0044]本發(fā)明的啟動(dòng)子序列被用于目的異源核苷酸序列的組成型的表達(dá)?！爱愒春塑账嵝蛄小笔侵阜翘烊坏嘏c啟動(dòng)子序列一起存在的序列。雖然所述核苷酸序列與啟動(dòng)子序列是異源的，但對(duì)植物宿主可能是同源的或天然的或異源的或外源的?？刹僮鞯嘏c本發(fā)明的啟動(dòng)子連接的異源核苷酸序列可編碼目的蛋白質(zhì)。這種異源核苷酸序列的實(shí)例包括但不限于，編碼賦予以下抗性多肽的核苷酸序列:非生物應(yīng)激如干旱、溫度、鹽度、臭氧和除草劑，或生物應(yīng)激如病原體侵襲，包括昆蟲(chóng)、病毒、細(xì)菌、真菌和線(xiàn)蟲(chóng)類(lèi)，并防止產(chǎn)生這些生物體伴隨的疾病。
[0045]本發(fā)明中除草劑耐性蛋白質(zhì)可以表達(dá)對(duì)除草劑的抗性和/或耐受性。這些基因包括但不限于，乙酰乳酸合酶(ALS)基因、5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSPS)基因、草胺磷乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)基因、草甘膦氧化還原酶(GOX)基因、GAT基因等。
[0046]本發(fā)明中“昆蟲(chóng)抗性”是指植物避免植物-昆蟲(chóng)相互作用所致的癥狀和損害。即阻止昆蟲(chóng)引起的植物損害、農(nóng)作物損害、植物損形和植物疾病，或可選擇地，將由昆蟲(chóng)引起的植物損害、農(nóng)作物損害、植物損形和植物疾病減少到最小或減輕。所述昆蟲(chóng)可以屬于鱗翅目(如玉米螟)、半翅目(如椿象)、鞘翅目(如甲蟲(chóng))、直翅目(如飛蝗)、同翅目(如蚜蟲(chóng))、雙翅目(如蠅)等。本領(lǐng)域公知的，目的昆蟲(chóng)抗性蛋白質(zhì)包括但不限于，芽孢桿菌毒性蛋白；凝集素類(lèi)，其中凝集素包括雪花蓮凝集素、豌豆凝集素、刀豆凝集素、麥芽凝集素、馬鈴薯凝集素、花生凝集素等；脂氧化酶類(lèi)，其中脂氧化酶包括豌豆脂氧化酶I或大豆脂氧化酶；昆蟲(chóng)殼多糖酶等。
[0047]不同害蟲(chóng)將病毒從感染的植物傳遞給健康植物的方式不同。所述病毒包括但不限于，水稻東格魯桿狀病毒、煙草花葉病毒、甘薯萎黃矮小病毒和甘薯羽狀斑點(diǎn)病毒等。因此，可以選擇在植物組織中組成型的表達(dá)具有抗致病原體活性或使病毒病原體的影響最小化的異源核苷酸序列。
[0048]本發(fā)明的啟動(dòng)子序列和方法可用于任何目的異源核苷酸序列在植物宿主中的表達(dá)調(diào)節(jié)，以改變植物的表現(xiàn)型。各種目的表現(xiàn)型改變包括但不限于，改變植物的脂肪酸成分、改變植物的氨基酸含量、改變植物病原體防御機(jī)制等。上述改變可以通過(guò)提供異源產(chǎn)物的表達(dá)或增加植物內(nèi)源性產(chǎn)物的表達(dá)而得到?？蛇x擇地,上述改變可以通過(guò)減少植物中一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性產(chǎn)物的表達(dá)而得到，特別是酶或輔助因子。上述改變將導(dǎo)致轉(zhuǎn)化植物的表現(xiàn)型改變。
[0049]轉(zhuǎn)化方案以及將核苷酸序列導(dǎo)入植物的方案依定向轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞類(lèi)型而異，即單子葉植物或雙子葉植物。將核苷酸序列導(dǎo)入植物細(xì)胞并隨后插入植物基因組中的適合方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。
[0050]已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可按照常規(guī)的方式生長(zhǎng)成植物。這些植物被培育，用相同的轉(zhuǎn)化株或不同的轉(zhuǎn)化株授粉，得到的雜交體表達(dá)所需的被鑒定的表現(xiàn)型特征。可培育二代或多代以保證穩(wěn)定地保持和遺傳所需表現(xiàn)型特征的表達(dá)，然后收獲可保證得到所需表現(xiàn)型特征表達(dá)的種子。
[0051]本發(fā)明提供了一種組成型啟動(dòng)子及其用途，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0052]1、普遍存在活性。本發(fā)明組成型啟動(dòng)子幾乎在植物的大多數(shù)組織和許多類(lèi)型細(xì)胞中都顯示出活性，特別是在單子葉植物的根、莖、葉中。
[0053]2、活性高。與CaMV35S啟動(dòng)子相比，本發(fā)明組成型啟動(dòng)子幾乎在植物的大多數(shù)組織和許多類(lèi)型細(xì)胞中都顯示出明顯較高的基因表達(dá)水平，特別是在單子葉植物中具有強(qiáng)大的、普遍存在的活性，例如根、莖、葉。
[0054]下面通過(guò)附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
`[0055]圖1為本發(fā)明組成型啟動(dòng)子及其用途的重組克隆載體pT-pr0sRUBQ2構(gòu)建流程圖；
[0056]圖2為本發(fā)明組成型啟動(dòng)子及其用途的重組表達(dá)載體P100017構(gòu)建流程圖；
[0057]圖3為本發(fā)明組成型啟動(dòng)子及其用途的重組表達(dá)載體P100078示意圖；
[0058]圖4為本發(fā)明組成型啟動(dòng)子及其用途的轉(zhuǎn)基因玉米植株除草劑抗性效果圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0059]下面通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明組成型啟動(dòng)子及其用途的技術(shù)方案。
[0060]第一實(shí)施例、pr0sRUBQ2啟動(dòng)子序列的合成
[0061]獲得本發(fā)明組成型啟動(dòng)子pr0sRUBQ2，如序列表中SEQ ID N0:1所示；所述pr0sRUBQ2啟動(dòng)子序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所述pr0sRUBQ2啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO:1)的5’端還連接有HindIII酶切位點(diǎn)，所述pr0sRUBQ2啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO:1)的3’端還連接有BamHI酶切位點(diǎn)。
[0062]第二實(shí)施例、含有pr0sRUBQ2啟動(dòng)子序列的重組表達(dá)載體pl00017的構(gòu)建及重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0063]1、構(gòu)建含有pr0sRUBQ2啟動(dòng)子序列的重組克隆載體pT_pr0sRUBQ2
[0064]將pr0sRUBQ2 啟動(dòng)子序列連入克隆載體 pGEM-T (Promega, Madison, USA, CAT:A3600 )上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM_T載體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，得到重組克隆載體pT-pr0sRUBQ2，其構(gòu)建流程如圖1所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；f I表示噬菌體Π的復(fù)制起點(diǎn)；LacZ為L(zhǎng)acZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動(dòng)子；T7為T(mén)7RNA聚合酶啟動(dòng)子；pr0sRUBQ2為水稻品種日本晴的Ubiqutin (泛素)2基因啟動(dòng)子(SEQ ID N0:1)；MCS為多克隆位點(diǎn))。
[0065]然后將重組克隆載體pT-pr0sRUBQ2用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞(Transgen, Beijing, China, CAT:CD501)，其熱激條件為:50 μ I大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、10μ I質(zhì)粒DNA (重組克隆載體pT-pr0sRUBQ2)，42°C水浴30秒；37°C振蕩培養(yǎng)I小時(shí)(200rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動(dòng))，在表面涂有IPTG (異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X_gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100mg/L)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC1 10g/L,瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上生長(zhǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L,氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37 °C條件下培養(yǎng)過(guò)夜。堿法提取其質(zhì)粒:將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心lmin，去上清液，沉淀菌體用100 μ I冰預(yù)冷的溶液I (25mMTris-HCl, IOmM EDTA (乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)懸??；加入200 μ I新配制的溶液II (0.2Μ NaOH, 1%SDS (十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3_5min ;加Λ 150 μ I冰冷的溶液III (3Μ醋酸鉀，5Μ醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5_10min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無(wú)水乙醇，混勻后室溫放置5min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min,棄上清液,沉淀用濃度(V/V)為70%的乙醇洗滌后晾干；加入 30μ I 含 RNase (20μ g/ml)的 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA,PH8.0)溶解沉淀；于溫度37°C下水浴30min，消化RNA ;于溫度_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0066]提取的質(zhì)粒經(jīng)HindIII和BamHI酶切鑒定后，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組克隆載體pT-pr0sRUBQ2中插入的水稻pr0sRUBQ2啟動(dòng)子序列為序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0067]2、構(gòu)建含有pr0sRUBQ2啟動(dòng)子序列的重組表達(dá)載體pl00017
[0068]用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和HindIII分別酶切重組克隆載體pT_pr0sRUBQ2和表達(dá)載體p90000，將切下的pr0sRUBQ2啟動(dòng)子片段插到p90000的BamHI和HindIII位點(diǎn)之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達(dá)載體P100017，其構(gòu)建流程如圖2所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界；prOsRUBQ2:水稻品種日本晴的Ubiqutin (泛素)2基因啟動(dòng)子(SEQ ID NO:1) ;CTP_EPSPS:5_烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶基因(SEQ ID NO: 3) ;Nos:胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID N0:4) ;Ub1:玉米Ubiquitin (泛素)基因啟動(dòng)子(SEQ ID N0:5)；PM1:磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQ ID N0:6)；LB:左邊界)。
[0069]將重組表達(dá)載體P100017用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞，其熱激條件為:50μ I大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、10 μ I質(zhì)粒DNA (重組表達(dá)載體ρ100017)，42 °C水浴30秒；37°C振蕩培養(yǎng)I小時(shí)(200rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動(dòng))；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L, NaC110g/L,瓊脂15g/L,用NaOH調(diào)pH至7.5)上于溫度37°C條件下培養(yǎng)12小時(shí)，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過(guò)夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和HindIII酶切后鑒定，并將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果表明重組表達(dá)載體P100017在BamHI和HindIII位點(diǎn)間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即水稻品種日本晴的Ubiqutin (泛素)2基因啟動(dòng)子序列。
[0070]3、構(gòu)建含有對(duì)照序列的重組表達(dá)載體pl00078 (正對(duì)照)
[0071]按照本發(fā)明第二實(shí)施例中I所述的構(gòu)建含有pr0sRUBQ2啟動(dòng)子序列的重組克隆載體pT-pr0sRUBQ2的方法,利用對(duì)照序列構(gòu)建含有對(duì)照序列的重組克隆載體pT-prOsActl。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組克隆載體ρΤ-prOsActl中插入的prOsActl啟動(dòng)子序列為序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，即對(duì)照序列正確插入。
[0072]按照本發(fā)明 第二實(shí)施例中2所述的構(gòu)建含有pr0sRUBQ2啟動(dòng)子序列的重組表達(dá)載體pl00017的方法，利用對(duì)照序列構(gòu)建含有對(duì)照序列的重組表達(dá)載體P100078，其構(gòu)建流程如圖3所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界；prOsActl:對(duì)照序列(SEQ ID N0:2)；CTP-EPSPS:5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因(SEQ ID NO: 3) ;Nos:胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID N0:4)；Ub1:玉米 Ubiquitin (泛素)基因啟動(dòng)子(SEQ ID N0:5)；PMI:磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQ ID N0:6);LB:左邊界)。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體P100078中插入的對(duì)照序列為序列表中SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，SP對(duì)照序列正確插入。
[0073]4、重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0074]對(duì)己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體P100017和P100078用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404 (Invitrgen, Chicago, USA, CAT:18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為:100 μ L 農(nóng)桿菌LBA4404、3 μ L質(zhì)粒DNA (重組表達(dá)載體);置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28°C、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時(shí)，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至長(zhǎng)出陽(yáng)性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性?xún)?nèi)切酶AatII和StyI酶切后進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體P100017和pl00078結(jié)構(gòu)完全正確。
[0075]第三實(shí)施例、轉(zhuǎn)入pr0sRUBQ2啟動(dòng)子序列的玉米植株的獲得
[0076]按照常規(guī)采用的農(nóng)桿菌侵染法，將無(wú)菌培養(yǎng)的玉米品種綜31 (Z31)的幼胚與第二實(shí)施例中4所述的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，以將第二實(shí)施例中2和3構(gòu)建的重組表達(dá)載體pl00017和pl00078 (對(duì)照序列)中的T-DNA (包括玉米Ubiquitin基因的啟動(dòng)子序列、prOsRUBQ2啟動(dòng)子序列、對(duì)照序列、CTP-EPSPS基因、PMI基因和Nos終止子序列)轉(zhuǎn)入到玉米染色體組中，獲得了轉(zhuǎn)入pr0sRUBQ2啟動(dòng)子序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入對(duì)照序列的玉米植株(正對(duì)照)；同時(shí)以野生型玉米植株作為負(fù)對(duì)照。
[0077]對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化，簡(jiǎn)要地，從玉米中分離未成熟的幼胚，用農(nóng)桿菌懸浮液接觸幼胚，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)r0sRUBQ2啟動(dòng)子序列傳遞至幼胚之一的至少一個(gè)細(xì)胞(步驟1:侵染步驟)，在此步驟中，幼胚優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液(OD66tl=0.4-0.6，侵染培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L, pH5.3))中以啟動(dòng)接種。幼胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時(shí)期(3天)(步驟2:共培養(yǎng)步驟)。優(yōu)選地，幼胚在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基(MS鹽
4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS) 100mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，可以有一個(gè)選擇性的“恢復(fù)”步驟。在“恢復(fù)”步驟中，恢復(fù)培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖30g/L、2, 4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)lmg/L、瓊脂8g/L,pH5.8)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的抗生素(頭孢霉素)，不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步驟3:恢復(fù)步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有抗生素但沒(méi)有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細(xì)胞提供恢復(fù)期。接著，接種的幼胚在含選擇劑(甘露糖)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長(zhǎng)著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟4:選擇步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D)lmg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上培養(yǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)。然后，愈傷組織再生成植物(步驟5:再生步驟)，優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的愈傷組織在固體培養(yǎng)基(MS分化培養(yǎng)基和MS生根培養(yǎng)基)上培養(yǎng)以再生植物。
[0078]篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到所述MS分化培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上，25°C下培養(yǎng)分化。分化出來(lái)的小苗轉(zhuǎn)移到所述MS生根培養(yǎng)基(MS鹽2.15g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸lmg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上，25°C下培養(yǎng)至約IOcm高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實(shí)。在溫室中，每天于28°C下培養(yǎng)16小時(shí)，再于20°C下培養(yǎng)8小時(shí)。
[0079]第四實(shí)施例、pr0sRUBQ2啟動(dòng)子序列的活性測(cè)定[0080]實(shí)驗(yàn)一、EPSPS基因拷貝數(shù)的鑒定
[0081]分別取轉(zhuǎn)入pr0sRUBQ2啟動(dòng)子序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入對(duì)照序列的玉米植株的葉片約IOOmg作為樣品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組DNA,通過(guò)Taqman探針熒光定量PCR方法檢測(cè)EPSPS基因的拷貝數(shù)。同時(shí)以野生型玉米植株作為負(fù)對(duì)照，按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值。
[0082]檢測(cè)EPSPS基因拷貝數(shù)的具體方法如下:
[0083]步驟11、分別取轉(zhuǎn)入pr0sRUBQ2啟動(dòng)子序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入對(duì)照序列的玉米植株和野生型玉米植株的葉片各lOOmg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個(gè)樣品取3個(gè)重復(fù)；
[0084]步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA,具體方法參考其產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)；
[0085]步驟13、用NanoDrop2000 (Thermo Scientific)測(cè)定上述樣品的基因組DNA濃度；
[0086]步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80_100ng/μ I ；
[0087]步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過(guò)鑒定已知拷貝數(shù)的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，以野生型玉米植株的樣品作為負(fù)對(duì)照，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，取其平均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是:
[0088]引物I (EF):TTGGTGCTAACCTTACCGTTGAG 如序列表中 SEQ ID NO: 7 所示；
[0089]引物2 (ER):GCTTACCACGACCTTCAAGACG 如序列表中 SEQ ID NO:8 所示；
[0090]探針I(yè) (EP):CTGATGCTGACGGTGTGCGTACCATC 如序列表中 SEQ ID NO:9 所示；
[0091]PCR反應(yīng)體系為:
[0092]
【權(quán)利要求】
1.一種組成型啟動(dòng)子，其特征在于，其核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列: Ca)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或 (b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
2.一種包含與目的異源核苷酸序列可操作地連接的權(quán)利要求1所述組成型啟動(dòng)子的嵌合基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述嵌合基因，其特征在于，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。
4.一種包含權(quán)利要求2或3所述嵌合基因的表達(dá)盒。
5.一種包含權(quán)利要求4所述表達(dá)盒的重組載體。
6.—種在植物中表達(dá)目的異源核苷酸序列的方法,其特征在于,包括:將與權(quán)利要求1所述組成型啟動(dòng)子可操作地連接的目的異源核苷酸序列穩(wěn)定的整合進(jìn)植物細(xì)胞中。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述在植物中表達(dá)目的異源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述在植物中表達(dá)目的異源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述目的異源核苷酸序列在植物組織中組成型的表達(dá)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6 所述在植物中表達(dá)目的異源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述在植物中表達(dá)目的異源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述目的異源核苷酸序列編碼除草劑耐性蛋白質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述在植物中表達(dá)目的異源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述目的異源核苷酸序列編碼昆蟲(chóng)抗性蛋白質(zhì)。
12.—種權(quán)利要求1所述組成型啟動(dòng)子用于在植物組織中組成型的表達(dá)目的異源核苷酸序列的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述組成型啟動(dòng)子用于在植物組織中組成型的表達(dá)目的異源核苷酸序列的用途，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述組成型啟動(dòng)子用于在植物組織中組成型的表達(dá)目的異源核苷酸序列的用途，其特征在于，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。
【文檔編號(hào)】C12N15/62GK103725678SQ201310728596
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】龐潔, 張成偉, 鮑曉明, 劉海利, 王登元 申請(qǐng)人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司生物技術(shù)中心