一株香味菌屬菌株及其在制備烯丙基甲基硫醚中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株香味菌屬菌株，菌株名為WTC05-2，分類命名為Myroides?sp.，已于2013年1月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.7113。本發(fā)明的菌株，產烯丙基甲基硫醚能力強，可以用于生產制備烯丙基甲基硫醚，采用微生物發(fā)酵法生產烯丙基甲基硫醚，較之化學生產法具有反應溫和、原料綠色天然、工藝簡單、能耗低等優(yōu)點，并且有利于環(huán)境保護，易于推廣使用，為利用微生物發(fā)酵生產烯丙基甲基硫醚奠定了技術基礎。
【專利說明】一株香味菌屬菌株及其在制備烯丙基甲基硫醚中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一株香味菌屬菌株及其在制備烯丙基甲基硫醚中的應用，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]烯丙基甲基硫醚(Allyl methyl sulfide),中文別名:丙烯基甲基硫醚,烯丙基甲基硫化物；CAS號=10152-76-8 ;分子式=C4H8S ;分子量:88.17 ;分子結構:、沸點:88.60C at 760mmHg ;密度 0.85g/mL[1]。
[0003]天然烯丙基硫化物多存在于大蒜、洋蔥等蔬菜中。其中，烯丙基甲基硫醚是一種普遍使用的食品添加劑，醫(yī)藥中間體，它具有重要的生物活性，如下:(I)抗氧化活性，可清除自由基，阻隔體內亞硝胺的生成，抑制脂質過氧化物對膜結構的損傷，從而起到保護肝臟的作用[2’3]。祁紅兵等人對納豆芽孢桿菌米糠發(fā)酵物中抗氧化成分進行分析，發(fā)現乙酸乙酯相和乙醚相的抗氧化活力最強，分別為168和163kU/g，其中乙酸乙酯相抗氧化活性成分主要是烯丙基甲基硫醚tt]。(2)趙懷清、難波恒雄研究了茗蔥(Allium victorialis)浸膏及其化合物對培養(yǎng)心肌細胞的作用，實驗結果表明揮發(fā)性提取物對培養(yǎng)心肌細胞心率和振幅有明顯的增強作用，進而對具有生物活性的揮發(fā)性提取物進行成分分析，表明二甲基二硫、烯丙基甲基三硫、烯丙基甲基硫醚和二烯丙基二硫對培養(yǎng)心肌細胞心率和振幅均有不同程度的增強作用[5]。(3)烯丙基硫化物還是降血糖藥物的主要成分，可提高胰島素的功能或在谷胱甘肽、半胱氨酸等硫醇化合物參與下提高生物體內的氧化還原作用。值得注意的是，烯丙基硫化物僅降低不正常的高血糖，而對正常血糖值無影響[3’6]。劉浩，崔美芝，李春艷研究了大蒜素對糖尿病大鼠血糖的影響，大蒜素的化學名為二烯丙基二硫化物，是從大蒜球莖中分離出的一種化合物m。結果顯示大蒜素能夠降低糖尿病大鼠的血糖，降糖效果與給藥劑量成正相關。同時研究了大 蒜素對正常大鼠血糖的影響，實驗前后比較差異無顯著性意義(P>0.05)，與陰性對照組比較差異無顯著性意義(P>0.05)?？芍笏馑貙φ４笫蟮难菦]有影響[8]。(4)以烯丙基甲基硫醚為主要成分的大蒜精油，在抗腫瘤方面可抑制細胞生長，調控細胞周期依賴素激酶，參與腫瘤發(fā)生的信號轉導，誘導腫瘤細胞分化和凋亡，減少癌基因、增加抑癌基因表達，調節(jié)生物酶活性[9]。
[0004]目前，烯丙基甲基硫醚的制備方法主要是化學合成或天然提取?；瘜W合成生產工藝復雜，包括回流、蒸餾、冷凍、酸化、堿化、壓濾等工藝過程，常有高溫、高壓、負壓，并大量使用易燃易爆的有機試劑，反應中間體或副產品較多；并且化學合成中常會產生大量廢氣、廢水、廢渣，從而污染環(huán)境；因而其應用受到生產中的高危險性、產品安全性以及環(huán)境污染性的限制。隨著人民生活水平的提高，對產品安全性的要求日益嚴格，綠色、純天然的食品成為大家共同的追求。但天然提取的化合物常常因為含量低、資源有限、結構復雜、不能采用化學方法合成等缺點而難以開發(fā)成新產品。生物合成法是由酶催化的化學反應，具有位置選擇性和立體選擇性好、催化效率高、反應條件溫和、反應類型多、環(huán)境友好等特點，因此，利用生物合成法制備烯丙基甲基硫醚將會成為烯丙基甲基硫醚天然生產制備中具有巨大潛力的研究方向。然而經過文獻和專利的檢索，國內外利用這一思路的相關技術和方法至今未見文獻或專利報道。
[0005]香味菌(Myroides)是一類革蘭氏陰性桿菌，目前尚未見關于香味菌產烯丙基甲基硫醚的專利信息或科研文獻報道。在普通瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基上嚴格需氧，在血瓊脂上不溶血_，具有一定生物安全性。本發(fā)明專利申請從泥土中篩選到一株產烯丙基甲基硫醚的香味菌屬菌株CGMCC 7113，并首次報道了其發(fā)酵生產烯丙基甲基硫醚的方法。
[0006]參考文獻:
[0007][I]烯丙基甲基硫醚.中國化工制造網(http://www.chemmade.com/)。
[0008][2]劉書成.大蒜精油對食用油脂的抗氧化特性[J].食品科學，2001(6):128—131。
[0009][3]孫君社，高孔榮.大蒜的化學與藥效及利用[J].廣州食品科技，1994(S1):8—11。
[0010][4]祁紅兵，宋軍霞，陳鈞.納豆芽孢桿菌米糠發(fā)酵物中抗氧化成分分析[J].安徽農業(yè)科學，2012,40 (12):7414— 7416，741。
[0011][5]趙懷清，難波恒雄.苳蔥浸膏及其化合物對培養(yǎng)心肌細胞的作用[J].沈陽藥科大學學報，1999，16 (4):274-277。
[0012][6]Yin MC, Hwang Sff, Chan KC.Nonenzymatic antioxidant activity of fourorganosulfur compounds derived from garlic.J Agric Food Chem,2002,50 (21):6143-6147。
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[0014][8]劉浩，崔美芝，李春艷.大蒜素對糖尿病大鼠血糖的影響[J].中國臨床康復，2004,8(21):4264-4265。
[0015][9]向妹霖，蘇琦.烯丙基硫化物抗腫瘤進展[J].國外醫(yī)學:腫瘤學分冊，2004，31(10):736—738ο
[0016][10]Μ.VANCA麗EYT, P.SEGERS, U.T0RCK，et al.Reclassification ofFlavobacterium odoraturn(Stutzer 1929)Strains to a New Genus,Myroides, asMyro ides odoratu scomb.nov.and Myroides odorat imimus sp.nov.1JSEM[J]，1996，46(4):926-932。

【發(fā)明內容】

[0017]針對上述現有技術，針對人們對安全健康天然產品的大量需求，本發(fā)明提供了一株產烯丙基甲基硫醚的香味菌屬菌株，并提供了其在制備烯丙基甲基硫醚中的應用，以及制備方法。
[0018]本發(fā)明是通過以下技術方案實現的:
[0019]一株香味菌屬菌株，菌株名為WTC05-2,分類命名為Myroides sp.,已于2013年I月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCN0.7113。
[0020]本發(fā)明的菌株是 申請人:(滕州市悟通香料有限責任公司)從所采集的土樣中篩選獲得的，其生物學特征符合已報道的香味菌屬特征:革蘭氏陰性好氧桿菌，直徑0.5 μ m，長度I~2μπι(如圖1B所示)，無鞭毛，無滑行能力，非聚集生長，能夠產生黃色素(如圖1A所示)，培養(yǎng)物具有水果香味，發(fā)酵培養(yǎng)48h時香味最濃。
[0021]本發(fā)明的菌株，經測定，其16S rRNA的基因序列長度為1481bp JBSEQ ID N0.1所不。通過使用美國生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI) BLASTN程序比對，本發(fā)明的菌株的16S rRNA的基因序列與NCBI注冊的香味菌標準菌株(Myroides) 16S rRNA的基因序列具有較高的同源性(98~99%)，并進一步構建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖2所不),本發(fā)明所篩選到的菌株與Myroides odoratimimus,Myroides profundi親緣關系較近。
[0022]本發(fā)明中，用于菌體形態(tài)觀察的培養(yǎng)基為TSB培養(yǎng)基(胰蛋白胨17g/L，植物蛋白胨3g/L，氯化鈉5g/L，磷酸二氫鉀2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，PH7.2)。
[0023]本發(fā)明中，形態(tài)特征觀測方法為普通熒光倒置顯微鏡觀測。
[0024]本發(fā)明中，16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹構建方法:應用MEGA4.0中的Clustal W對測得的序列以及基因庫中的相似序列一起進行多序列比對，用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行1000次Bootstraps檢驗。
[0025]本發(fā)明的菌株的分離純化與16S rRNA基因測序的基本方法是:用于分離微生物的土壤樣品由 申請人:(滕州市悟通香料有限責任公司)采集并提供。將土壤樣品在LB培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，30°C,200轉/分鐘培養(yǎng)12h后，取不同稀釋度的菌液涂布LB瓊脂平板，挑單菌落進行劃線分離，30°C培養(yǎng)24h ;挑單菌落至LB液體中，3(TC、200轉/分鐘培養(yǎng)12h，超低溫冰箱保存菌種，同時利用細菌基因組提取試劑盒(天根)提取菌株基因組DNA，以菌株基因組DNA為模板，使用細菌16S rDNA通用引物進行擴增，用膠回收試劑盒(天根)純化PCR擴增產物，電泳驗證，連接到PMD19-T載體，轉化到E.coli DH5 α。經氨芐抗性篩選，獲得陽性克隆。16S rDNA測序由山 東省農業(yè)科學院完成，將序列與美國國家生物信息中心(NCBI)收錄的DNA序列進行比對。按照此流程，獲得了一株產烯丙基甲基硫醚能力強的菌株，編號為WTC05-2，命名為Myroides sp.，于2013年I月9日進行了保藏，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.7113。
[0026]上述用于菌株分離純化的LB培養(yǎng)基組成為:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L, ρΗ7.2。
[0027]上述用于菌株16S rDNA擴增的通用引物為:
[0028]正向引物為27f:5’ - AGAGTTTGATCCTG GCT CAG-3’，如 SEQ ID N0.2 所示；
[0029]反向引物為1492r:5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，如 SEQ ID N0.3 所示。
[0030]上述用于菌株16S rDNA擴增的體系為:每30 μ L反應體系中加入濃度為IOmmol/L 的 27f 和 1492r 各 1.0μ L，2mmol/L 的 dNTP 2.4μ L,2XGC Buffer I 15yL，5U/yL 的LA-Taq DNA聚合酶0.2 μ L,模板3uL，18.2ΜΩ.cm超純水8.0yL0所用基因擴增試劑購自大連寶生物技術有限公司。
[0031]上述用于菌株16S rDNA擴增的條件為:94°C預變性5min ;94°C變性30S，55°C退火30S，72°C延伸90S，共35個循環(huán)；72°C延伸15min ;降溫至4°C并保溫15min。
[0032]本發(fā)明的菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化方法為:將供試菌株在LB斜面培養(yǎng)基上活化后，接種于裝有50ml LB培養(yǎng)基的300ml三角瓶中，30°C，200轉/分鐘，搖床培養(yǎng)12h，然后分別按照1.5%接種量接種于LB、TB、SOB、TSB培養(yǎng)基中，30°C，200轉/分鐘搖床培養(yǎng)，分別在3h、6h、9h、12h、18h、24h、30h、42h 時，于 600nm 波長測定菌體濃度(OD6J。
[0033]上述用于菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基組成分別為:
[0034]TB:蛋白胨 12g/L、酵母浸粉 24g/L、甘油 4ml/L、ΚΗ2Ρ042.31g/L、Κ2ΗΡ0412.54g/L、ρΗ7.2。
[0035]2ΧΥΤ:蛋白胨 16g/L、酵母浸粉 10g/L、NaC15g/L、ρΗ7.0。
[0036]SOB:蛋白胨 20g/L、酵母浸粉 5g/L、NaCl0.5g/L、KC10.186g/L、MgCl20.95g/L、pH7.0。
[0037]TSB:胰蛋白胨17g/L、植物蛋白胨3g/L、氯化鈉5g/L、磷酸二氫鉀2.5g/L、葡萄糖
2.5g/L、pH7.2。
[0038]上述用于菌株發(fā)酵條件優(yōu)化的判斷依據是:(I)通過嗅覺直接判斷菌株發(fā)酵過程中香味濃淡的變化；(2)通過產物的純化、氣質聯用的半定量分析來估算產量。
[0039]本發(fā)明的菌株，產烯丙基甲基硫醚能力強，可以用于生產制備烯丙基甲基硫醚。應用時，具體方式如下:
[0040](I)菌種選擇:選用本發(fā)明的菌株Myroides sp.WTC05-2，其菌種保藏編號為CGMCCN0.7113 ；
[0041](2)菌種活化:將上述菌種劃線于固體培養(yǎng)基，在30°C靜置培養(yǎng)18小時，備用；
[0042](3)種子培養(yǎng):將上`述步驟(2)培養(yǎng)的菌株用接種環(huán)挑取單菌落，接種于裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，置搖床中震蕩培養(yǎng)，其轉速為200轉/分鐘，30°C培養(yǎng)12小時,得種子液；
[0043](4)發(fā)酵培養(yǎng):以體積比為1.0%的接種量，將步驟(3)所得種子液繼續(xù)接種于裝有IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，在30°C、轉速為200轉/分鐘的條件下搖瓶培養(yǎng)42h，得發(fā)酵液；
[0044](5)產物富集及純化:向上述發(fā)酵液中加入DlOl大孔吸附樹脂，提取24h，過濾，然后進行洗脫:先用水淋洗樹脂，再用有機試劑淋洗樹脂，收集有機試劑洗脫液，蒸除有機溶劑，即得烯丙基甲基硫醚。
[0045]進一步地，還可以包括以下步驟(6):上述有機試劑洗脫液的檢測:采用氣質聯用(GC-MS)鑒定有機試劑洗脫液中是否含有烯丙基甲基硫醚及其濃度。
[0046]上述應用中，步驟(2) (3) (4)中所述的固體培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基均為胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，其配方組成為:胰蛋白胨17g/L，植物蛋白胨3g/L，氯化鈉5g/L，磷酸二氫鉀2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH7.2。區(qū)別僅在于:固體培養(yǎng)基中還加入了濃度為2%的瓊脂。
[0047]上述的應用中，步驟(5)具體為:按照20g/L添加量向上述發(fā)酵液中加入DlOl大孔吸附樹脂，提取24h，以100目的絹布過濾，將樹脂加入玻璃柱(內徑20mm)中，樹脂裝填高度10mm，按照2ml/min流速，先用4體積去離子水淋洗樹脂，再用3體積的有機試劑淋洗樹脂，收集第3柱體積的有機試劑洗脫液(第一、二柱體積的有機試劑洗脫液中由于雜質較多，不利于目標產物的分離純化，因此只收集雜質少、純度高的第三柱體積的有機試劑洗脫液)即為含有烯丙基甲基硫醚的洗脫液，蒸除有機溶劑，即得烯丙基甲基硫醚。
[0048]上述的應用中，步驟(5)中的DlOl大孔吸附樹脂，使用前需進行預先處理，處理方式為:用2倍樹脂體積的飽和食鹽水，浸泡18~20h，然后排盡食鹽水，用清水漂洗凈，使排出的水不顯黃色，再用質量百分數為2%~4%的氫氧化鈉溶液(其用量為樹脂體積的2倍)，浸泡2~4h，排盡堿液后，沖洗樹脂直至水為中性，待用。
[0049]上述的應用中，步驟(5)中的有機試劑為乙醚。
[0050]上述的應用中，步驟(6 )所述的GC-MS分析條件為:
[0051](I)氣相色譜條件=RTX-1色譜柱，柱溫80°C，載氣He，載氣流量3.0ml/min ；
[0052](2)質譜檢測條件為:檢測器溫度250°C，4.5min后開始檢測，掃描質量范圍45~700。
[0053]經實驗證實:利用本發(fā)明的菌株發(fā)酵，500ml三角瓶進行搖瓶發(fā)酵，經過42小時，烯丙基甲基硫醚的產量可達到70mg/L。
[0054]本發(fā)明的菌株，產烯丙基甲基硫醚能力強，采用微生物發(fā)酵法生產烯丙基甲基硫醚，較之化學生產法具有反應溫和、原料綠色天然、工藝簡單、能耗低等優(yōu)點，并且有利于環(huán)境保護，易于推廣使用，為利用微生物發(fā)酵生產烯丙基甲基硫醚奠定了技術基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0055]本發(fā)明的香味菌屬菌株，菌株名為WTC05-2，分類命名為Myroides sp.，已于2013年I月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCN0.7113，保藏地址: 北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編:100101。
[0056]圖1:本發(fā)明的菌株的基本形態(tài)學特征，其中，A圖示本發(fā)明的菌株在TSB培養(yǎng)基上生長24h后的形態(tài)；B圖示本發(fā)明的菌株的細胞形態(tài)。
[0057]圖2:本發(fā)明的菌株基于16S rRNA基因序列繪制的進化樹。
[0058]圖3:本發(fā)明的菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化圖，圖中描繪了 WTC05-2分別在LB、TB、2XYT、S0B、TSB培養(yǎng)基中的生長曲線，并通過嗅覺判斷，選取適合發(fā)酵生產烯丙基甲基硫醚的培養(yǎng)基。
[0059]圖4:本發(fā)明的菌株在胰蛋白胨大豆肉湯中發(fā)酵42h后，乙醚萃取發(fā)酵液的氣相色譜圖，圖中顯示，烯丙基甲基硫醚的出峰時間為9.858min。
[0060]圖5:本發(fā)明的菌株所產烯丙基甲基硫醚的質譜圖。
[0061]圖6:稀丙基甲基硫釀標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0062]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0063]實施例1菌株的篩選獲得及16S rRNA基因測序
[0064]用于分離微生物的土壤樣品由 申請人:(滕州市悟通香料有限責任公司)采集并提供。將土壤樣品在LB培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，30°C,200轉/分鐘培養(yǎng)12h后，取不同稀釋度的菌液涂布LB瓊脂平板，挑單菌落進行劃線分離，30°C培養(yǎng)24h ;挑單菌落至LB液體中，30°C、200轉/分鐘培養(yǎng)12h，超低溫冰箱保存菌種，同時利用細菌基因組提取試劑盒(天根)提取菌株基因組DNA，以菌株基因組DNA為模板，使用細菌16S rDNA通用引物進行擴增，用膠回收試劑盒(天根)純化PCR擴增產物，電泳驗證，連接到PMD19-T載體，轉化到E.coli DH5 α。經氨芐抗性篩選，獲得陽性克隆。16S rDNA測序由山東省農業(yè)科學院完成，將序列與美國國家生物信息中心(NCBI)收錄的DNA序列進行比對。按照此流程，獲得了一株產烯丙基甲基硫醚能力強的菌株，編號為WTC05-2，命名為Myroides sp.，于2013年I月9日進行了保藏，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.7113。
[0065]上述用于菌株分離純化的LB培養(yǎng)基組成為:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L, ρΗ7.2。
[0066]上述用于菌株16SrDNA擴增的通用引物為:
[0067]正向引物為27f:5’ -AGAGTTTGATCCTG GCT CAG-3’ ；
[0068]反向引物為1492r:5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3，。
[0069]上述用于菌株16S rDNA擴增的體系為:每30 μ L反應體系中加入濃度為IOmmol/L 的 27f 和 1492r 各 1.0μ L，2mmol/L 的 dNTP 2.4μ L,2XGC Buffer I 15yL，5U/yL 的LA-Taq DNA聚合酶0.2 μ L,模板3uL，18.2ΜΩ.cm超純水8.0yL0所用基因擴增試劑購自大連寶生物技術有限公司。
[0070]上述用于菌株16S rDNA擴增的條件為:94°C預變性5min ;94°C變性30S，55°C退火30S，72°C延伸90S，共35個循環(huán)；72°C延伸15min ;降溫至4°C并保溫15min。
[0071]實施例2菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化
[0072]將供試菌株(WTC05-2)在LB斜面培養(yǎng)基上活化后，接種于裝有50ml LB培養(yǎng)基的300ml三角瓶中，30°C，200轉/分鐘，搖床培養(yǎng)12h，然后分別按照1.5%接種量接種于LB、TB、SOB、TSB 培養(yǎng)基中，30°C，200 轉 / 分鐘搖床培養(yǎng)，分別在 3h、6h、9h、12h、18h、24h、30h、42h時，于600nm波長測定菌體濃度(OD6J，結果如圖3所示，通過圖3可以看出，WTC05-2在TSB培養(yǎng)基中相對其他四種培養(yǎng)基生長緩慢，使其能更好的積累次級代謝產物，因此選擇TSB培養(yǎng)基作為后續(xù)的發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0073]上述用于菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基組成分別為:
[0074]TB:蛋白胨 12g/L、酵母浸粉 24g/L、甘油 4ml/L、ΚΗ2Ρ042.31g/L、Κ2ΗΡ0412.54g/L、ρΗ7.2。
[0075]2 X YT:蛋白胨 16g/L、酵母浸粉 10g/L、NaCl 5g/L、pH7.0。
[0076]SOB:蛋白胨 20g/L、酵母浸粉 5g/L、NaCl 0.5g/L、KCl 0.186g/L、MgCl20.95g/L、pH7.0。
[0077]TSB:胰蛋白胨17g/L、植物蛋白胨3g/L、氯化鈉5g/L、磷酸二氫鉀2.5g/L、葡萄糖2.5g/L、pH7.2。
[0078]上述用于菌株發(fā)酵條件優(yōu)化的判斷依據是:(I)通過嗅覺直接判斷菌株發(fā)酵過程中香味濃淡的變化；(2)通過產物的純化、氣質聯用的半定量分析來估算產量。
[0079]實施例3菌株在生產制備烯丙基甲基硫醚中的應用
[0080]具體方式如下:
[0081](I)菌種選擇:選用本發(fā)明的菌株Myroides sp.WTC05-2，其菌種保藏編號為CGMCCN0.7113 ；
[0082](2)菌種活化:將上述菌種劃線于固體培養(yǎng)基，在30°C靜置培養(yǎng)18小時，備用；
[0083](3)種子培養(yǎng):將上述步驟(2)培養(yǎng)的菌株用接種環(huán)挑取單菌落，接種于裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，置搖床中震蕩培養(yǎng)，其轉速為200轉/分鐘，30°C培養(yǎng)12小時,得種子液；
[0084](4)發(fā)酵培養(yǎng):以體積比為1.0%的接種量，將步驟(3)所得種子液繼續(xù)接種于裝有IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，在30°C、轉速為200轉/分鐘的條件下搖瓶培養(yǎng)42h，得發(fā)酵液；
[0085](5)產物富集及純化:按照20g/L添加量向發(fā)酵液中加入預先處理好的DlOl大孔吸附樹脂，提取24h，以100目的絹布過濾，將樹脂加入玻璃柱(內徑20mm)中，樹脂裝填高度IOmm,按照2ml/min流速，先用4體積去離子水淋洗樹脂，再用3體積的有機試劑淋洗樹脂，收集第3柱體積的有機試劑洗脫液，即為含有烯丙基甲基硫醚的洗脫液，蒸除有機溶劑，即得烯丙基甲基硫醚；
[0086]上述的應用中，步驟(5)中的DlOl大孔吸附樹脂，使用前需進行預先處理，處理方式為:用2倍樹脂體積的飽和食鹽水，浸泡20h，然后排盡食鹽水，用清水漂洗凈，使排出的水不顯黃色，再用質量百分數為3%的氫氧化鈉溶液(其用量為樹脂體積的2倍)，浸泡3h，排盡堿液后，沖洗樹脂直至水為中性，待用。
[0087](6)洗脫產物粗浸膏的檢測:采用氣質聯用(GC-MS)鑒定上述有機試劑洗脫液中是否含有烯丙基甲基硫醚，以及其濃度。
[0088]上述應用中，步驟(2) (3) (4)中所述的固體培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基均為胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，其配方組成為:胰蛋白胨17g/L，植物蛋白胨3g/L，氯化鈉5g/L，磷酸二氫鉀2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH7.2。區(qū)別僅在于:固體培養(yǎng)基中還加入了濃度為2%的瓊脂。
[0089]上述的應用中，步驟(5)中的有機試劑為乙醚。
[0090]上述的應用中，步`驟(6)所述的GC-MS分析條件及其結果為:
[0091](I)氣相色譜條件:RTX-1色譜柱，柱溫80°C，載氣He，載氣流量3.0ml/min ；
[0092](2)質譜檢測條件為:檢測器溫度250°C，4.5min后開始檢測，掃描質量范圍45~700 ；
[0093](3)所得到的氣相色譜圖中烯丙基甲基硫醚出峰時間為9.858min，如圖4所示，通過該圖譜可看出，烯丙基甲基硫醚在提取物中含量最多，峰面積為1429067。
[0094](4)烯丙基甲基硫醚的質譜結果如圖5所示，通過該圖譜可看出，該物質的分子量為88，符合烯丙基甲基硫醚的分子量大小。另外，與數據庫中烯丙基甲基硫醚的標準質譜圖進行比對，相似度大于99%，因此判斷該物質為烯丙基甲基硫醚。
[0095](5)通過繪制烯丙基甲基硫醚標準曲線(圖6)，依據烯丙基甲基硫醚的峰面積計算得發(fā)酵液中烯丙基甲基硫醚的濃度為70mg/L。
【權利要求】
1.一株香味菌屬菌株，菌株名為WTC05-2，分類命名為Myroides sp.，已于2013年I月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.7113。
2.權利要求1所述的香味菌屬菌株在制備烯丙基甲基硫醚中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于:應用時，包括以下步驟: (1)菌種選擇:選用權利要求1的菌株； (2)菌種活化:將上述菌種劃線于固體培養(yǎng)基，在30°C靜置培養(yǎng)18小時，備用； (3)種子培養(yǎng):將上述步驟(2)培養(yǎng)的菌株用接種環(huán)挑取單菌落，接種于裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，置搖床中震蕩培養(yǎng)，其轉速為200轉/分鐘，30°C培養(yǎng)12小時，得種子液； (4)發(fā)酵培養(yǎng):以體積比為1.0%的接種量，將步驟(3)所得種子液繼續(xù)接種于裝有IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，在30°C、轉速為200轉/分鐘的條件下搖瓶培養(yǎng)42h，得發(fā)酵液； (5)產物富集及純化:向上述發(fā)酵液中加入DlOl大孔吸附樹脂，提取24h，過濾，然后進行洗脫:先用水淋洗樹脂，再用有機試劑淋洗樹脂，收集有機試劑洗脫液，蒸除有機溶劑，即得烯丙基甲基硫醚。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:還包括以下步驟(6):上述有機試劑洗脫液的檢測:采用氣質聯 用(GC-MS)鑒定有機試劑洗脫液中是否含有烯丙基甲基硫醚，以及其濃度。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:所述步驟(2)(3)(4)中的固體培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基均為胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，其配方組成為:胰蛋白胨17g/L，植物蛋白胨3g/L，氯化鈉5g/L，磷酸二氫鉀2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH7.2 ;固體培養(yǎng)基中還加入了濃度為2%的瓊脂。
6.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:所述步驟(5)中的有機試劑為乙醚。
7.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:所述步驟(5)具體為:按照20g/L添加量向上述發(fā)酵液中加入DlOl大孔吸附樹脂，提取24h，以100目的絹布過濾，將樹脂加入玻璃柱中，樹脂裝填高度IOmm,按照2ml/min流速,先用4體積去離子水淋洗樹脂,再用3體積的有機試劑淋洗樹脂，收集第3柱體積的有機試劑洗脫液，即為含有烯丙基甲基硫醚的洗脫液，蒸除有機溶劑，即得烯丙基甲基硫醚。
8.根據權利要求3或7所述的應用，其特征在于:所述步驟(5)中的DlOl大孔吸附樹月旨，使用前需進行預先處理，處理方式為:用飽和食鹽水浸泡18~20h，然后排盡食鹽水，用水漂洗凈，使排出的水不顯黃色，再用質量百分數為2%~4%的氫氧化鈉溶液浸泡2~4h，排盡堿液后，沖洗樹脂直至水為中性。
9.根據權利要求4所述的應用，其特征在于:所述步驟(6)中，GC-MS分析條件為: (1)氣相色譜條件=RTX-1色譜柱，柱溫80°C，載氣He，載氣流量3.0ml/min ； (2)質譜檢測條件為:檢測器溫度250°C，4.5min后開始檢測，掃描質量范圍45~700。
【文檔編號】C12P11/00GK103756932SQ201310732431
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月27日 優(yōu)先權日:2013年12月27日
【發(fā)明者】古靜燕, 李越中, 劉會會, 韓文君, 趙帥, 丁濤, 衛(wèi)潔 申請人:滕州市悟通香料有限責任公司