一種基于lamp技術(shù)的番茄細菌性潰瘍病的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于LAMP技術(shù)快速鑒定番茄細菌性潰瘍病菌的檢測方法。所述檢測方法包括LAMP引物的設(shè)計與合成、模板DNA的提取、LAMP擴增體系建立，LAMP擴增方法，所述的LAMP擴增方法反應(yīng)溫度為63℃左右、反應(yīng)在90min內(nèi)完成擴增，引物包括外引物、內(nèi)引物；所述方法操作簡便，成本低廉、高靈敏度、檢測特異性大于99%、高特異性、不易污染。
【專利說明】—種基于LAMP技術(shù)的番茄細菌性潰瘍病的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種基于LAMP技術(shù)快速鑒定番茄細菌性潰瘍病菌的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]番茄潰瘍病是番茄生產(chǎn)中最為嚴重、具有毀滅性的病害之一。其病原菌為密執(zhí)安棒桿菌密執(zhí)安亞f中，即 Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis,簡稱 Cmm0
[0003]該病自從1909年首次在美國密執(zhí)安州的溫室番茄上發(fā)現(xiàn)以來，現(xiàn)己廣泛分布于美國各番茄產(chǎn)區(qū)，并逐漸成為世界性病害。20世紀年代、60年代和80年代，番茄潰瘍病在美國中西部地區(qū)、北卡羅來那州及加拿大安大略地區(qū)大流行，造成的產(chǎn)量損失最高達以上。一年期間，該病在英國大流行，使番茄罐頭工業(yè)受到嚴重影響。目前，在美洲、歐洲、亞洲、非洲和大洋洲的多個國家都有番茄潰瘍病發(fā)生危害的報道。我國有關(guān)番茄潰瘍病的記載始于1981年，目前番茄潰瘍病在我國北京、黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、新疆、河北、山西、山東、上海、海南等省、市、自治區(qū)都有發(fā)生，使許多地區(qū)番茄生產(chǎn)受到了不同程度的影響。因此，我國1995年將該病原菌列入《全國植物檢疫對象名單》，2007年列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》。 [0004]目前國內(nèi)通用的GB、SN等標準采用培養(yǎng)、生化反應(yīng)等表型檢測方法和PCR、基因芯片和測序比對等分子檢測方法輔助相結(jié)合的方法，檢驗周期需要2-7天，且操作復雜，成本較高，難以適應(yīng)當代貿(mào)易中快速檢驗的客觀需求。尤其是在田間地頭和碼頭海港等野外工作條件下，不具備PCR往往無法開展快速檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種基于LAMP技術(shù)快速鑒定番茄細菌性潰瘍病菌的檢測方法，以滿足對出入境檢驗檢疫中番茄細菌性潰瘍病的鑒定。
[0006]實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案為:
一種基于LAMP技術(shù)快速鑒定番茄細菌性潰瘍病菌的檢測方法，所述檢測方法包括LAMP引物的設(shè)計與合成、模板DNA的提取、LAMP擴增體系建立，LAMP擴增方法，所述的LAMP擴增方法反應(yīng)溫度為63°C左右、反應(yīng)在90min內(nèi)完成擴增，引物包括外引物、內(nèi)引物；
所述的外引物是Cmm_F3和Cmm-B3 ；
所述的內(nèi)引物是Cmm-FIP和Cmm-BIP ；
所述引物序列自5’端到3’端如下:
Cmm-F3 CGCTCATGGGTGGAACAT Cmm-B3 CGGAAAGGGTCCGACAAG
Cmm-FIP ACGTTCCCACCCCACAAGGATTTTGACATTGATGCCGGCTGA Cmm-BIP CTGGTGTGTCGAGGGCATGTTTTTAAACCAGACACACCCAGAAG。[0007]其中，所述模板DNA提取指番茄組織DNA的提取，離心提取其上清液，具體步驟為:
稱取80mg樣品，加入到2ml的離心管中；加入600 μ L裂解液充分混勻。65°C溫浴至少30分鐘。然后加入30(^1^蛋白沉淀液，13000印111離心41^11。將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈的1.5ml離心管中；若上清很混濁可以再加等體積的氯仿/異戊醇(24:1)顛倒混勻，13000rpm離心4min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈的離心管中；加入0.8倍體積異丙醇，_20°C沉淀30min。13000rpm離心4min,棄上清，加入600 μ L 70%乙醇，13000rpm離心4min,棄上清，晾干，加TE溶液30 μ L溶解。
[0008]所述LAMP擴增體系建立是采用水溶液配置，體系總體積25 μ L，其中包括:
模板DNA 2 μ L
2X U-LAMP MIX 17 μ L
Cmm-F3 5uM， IuL
Cmm-B3 5uM， IuL
Cmm-FIP40uM，I μ L
Cmm-BIP40uM，I μ L
Bst DNA 酶 8 U/ μ L，I μ L 熒光染料I μ L。
[0009]所述LAMP擴增方法采用實時熒光PCR儀，將按照LAMP擴增體系配制好的試劑加入反應(yīng)器中，63°C左右反應(yīng)I小時，共分為40個循環(huán)，每個循環(huán)I分鐘30秒，每個循環(huán)結(jié)束時收集熒光。
[0010]所述LAMP擴增方法采用普通水浴鍋或金屬浴完成，將按照LAMP擴增體系配制好的試劑加入PE管中，放入63°C左右水浴鍋中保溫90min，然后取出放入另一 80°C水浴鍋中保溫10 min后，取出。
[0011]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比其顯著優(yōu)點是:(1)操作簡便，成本低廉。環(huán)介導等溫擴增(LAMP)方法是具有與PCR技術(shù)同等甚至超越的優(yōu)勢，加之對儀器設(shè)備要求寬松，不用PCR儀，簡單易行，周期短至I小時，可縮短檢驗周期50%以上，可實現(xiàn)大量樣品的快速檢測，適合進行現(xiàn)場及大量樣品的高通量檢測。(2)高靈敏度。檢測靈敏度高于普通PCR2-3個數(shù)量級，檢測敏感性為100-10000cfu/mL，檢測特異性大于99%。(3)高特異性。所檢測的陰性對照株均無陽性結(jié)果出來。(4)不易污染。本發(fā)明的熒光染料是在反應(yīng)前加入的鈣黃綠素商用染料，上機檢測過程不需要開蓋，可以有效避免開蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠污染。提高了檢測的重復性，降低了檢測的假陽性。
[0012]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是本發(fā)明LAMP方法特異性擴增曲線圖；(I為番茄細菌性潰瘍病菌；2_6為苜蓿細菌性萎蔫病菌；玉米內(nèi)州萎蔫病菌；馬鈴薯環(huán)腐病菌；菜豆細菌性萎蔫病菌；郁金香黃色皰斑病菌；番茄細菌性葉斑病菌)。
[0014]圖2是本發(fā)明LAMP 方法檢測番茄樣品電泳結(jié)果圖；(M:DNA Marker DL2000 ；1:陰性對照；2-7:待檢番茄樣品)?！揪唧w實施方式】
[0015]下面結(jié)合基于LAMP技術(shù)快速鑒定番茄細菌性潰瘍病菌的方法的實例說明本發(fā)明的【具體實施方式】。
[0016]實施例1
基于LAMP技術(shù)快速鑒定番茄細菌性潰瘍病菌的檢測方法，所述檢測方法包括LAMP引物的設(shè)計與合成、模板DNA的提取、LAMP擴增體系建立，LAMP擴增方法，所述的LAMP擴增方法反應(yīng)溫度為63°C左右、反應(yīng)在90min內(nèi)完成擴增，引物包括外引物、內(nèi)引物；
所述的外引物是Cmm_F3和Cmm-B3 ；
所述的內(nèi)引物是Cmm-FIP和Cmm-BIP ；
所述引物序列自5’端到3’端如下:
Cmm-F3 CGCTCATGGGTGGAACAT Cmm-B3 CGGAAAGGGTCCGACAAG
Cmm-FIP ACGTTCCCACCCCACAAGGATTTTGACATTGATGCCGGCTGA Cmm-BIP CTGGTGTGTCGAGGGCATGTTTTTAAACCAGACACACCCAGAAG。
[0017]具體步驟為:
步驟一，模板DNA的 提取:稱取80mg菌體組織。加入到2ml的離心管中；加入600 μ L裂解液充分混勻。65°C溫浴至少30分鐘。然后加入300 μ L蛋白沉淀液，13000rpm離心4min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈的1.5ml離心管中；若上清很混濁可以再加等體積的氯仿/異戊醇(24:1)顛倒混勻，13000rpm離心4min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈的離心管中；加Λ 0.8倍體積異丙醇,_20°C沉淀30min。13000rpm離心4min,棄上清,加入600 μ L 70%乙醇，13000rpm離心4min,棄上清，晾干，加TE溶液30 μ L溶解。
[0018]步驟二，引物設(shè)計和合成:引物序列自5’端到3’端如下:
Cmm-F3 CGCTCATGGGTGGAACAT
Cmm-B3 CGGAAAGGGTCCGACAAG
Cmm-FIP ACGTTCCCACCCCACAAGGATTTTGACATTGATGCCGGCTGA Cmm-BIP CTGGTGTGTCGAGGGCATGTTTTTAAACCAGACACACCCAGAAG。
[0019]步驟三，LAMP擴增體系建立:采用水溶液配置，體系總體積25 μ L,其中包括: 模板DNA 2 μ L
2X U-LAMP MIX 17 μ L
Cmm-F3 5uM， IuL
Cmm-B3 5uM， IuL
Cmm-FIP40uM，I μ L
Cmm-BIP40uM，I μ L
Bst DNA 酶 8 U/ μ L，I μ L 熒光染料I μ L。
[0020]步驟四，LAMP擴增:將按照LAMP擴增體系配制好的試劑放入八聯(lián)管，置于實時熒光PCR儀中，63°C左右反應(yīng)I小時，共分為40個循環(huán)，每個循環(huán)I分鐘30秒，每個循環(huán)結(jié)束時收集熒光。根據(jù)管中熒光的的情況即可判斷該番茄樣品是否攜帶細菌性潰瘍病病菌。[0021]分別選取番茄細菌性潰瘍病菌；苜蓿細菌性萎蔫病菌；玉米內(nèi)州萎蔫病菌；馬鈴薯環(huán)腐病菌；菜豆細菌性萎蔫病菌；郁金香黃色皰斑病菌；番茄細菌性葉斑病菌菌體組織經(jīng)過DNA提取后，配制LAMP擴增體系，使用實時熒光PCR儀作為反應(yīng)器，進行LAMP檢測，經(jīng)過實時熒光擴增之后，觀察熒光曲線圖，從圖1可以看出:2-6病原菌均未出現(xiàn)擴增信號，而僅有目標病原菌番茄細菌性潰瘍病菌出現(xiàn)明顯的擴增信號，判定為檢出。
[0022]實施例2
基于LAMP技術(shù)快速鑒定番茄細菌性潰瘍病菌的檢測方法，所述檢測方法包括LAMP引物的設(shè)計與合成、模板DNA的提取、LAMP擴增體系建立，LAMP擴增方法，所述的LAMP擴增方法反應(yīng)溫度為63°C左右、反應(yīng)在90min內(nèi)完成擴增，引物包括外引物、內(nèi)引物；
所述的外引物是Cmm_F3和Cmm-B3 ；
所述的內(nèi)引物是Cmm-FIP和Cmm-BIP ；
所述引物序列自5’端到3’端如下:
【權(quán)利要求】
1.一種基于LAMP技術(shù)快速鑒定番茄細菌性潰瘍病菌的檢測方法，其特征在于:所述檢測方法包括LAMP引物的設(shè)計與合成、模板DNA的提取、LAMP擴增體系建立，LAMP擴增方法，所述的LAMP擴增方法反應(yīng)溫度為63°C左右、反應(yīng)在90min內(nèi)完成擴增，引物包括外引物、內(nèi)引物; 所述的外引物是Cmm_F3和Cmm-B3 ； 所述的內(nèi)引物是Cmm-FIP和Cmm-BIP ； 所述引物序列自5’端到3’端如下: Cmm-F3 CGCTCATGGGTGGAACAT Cmm-B3 CGGAAAGGGTCCGACAAG Cmm-FIP ACGTTCCCACCCCACAAGGATTTTGACATTGATGCCGGCTGA Cmm-BIP CTGGTGTGTCGAGGGCATGTTTTTAAACCAGACACACCCAGAAG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于:所述模板DNA提取指番茄組織DNA的提取。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于:所述LAMP擴增體系建立是采用水溶液配置，體系總體積25 μ L,其中包括: 模板DNA 2 μ L 2 X U-LAMP MIX 17 μ L Cmm-F3`5uM，IuL Cmm-B35uM，IuL Cmm-FIP40uM，I μ L Cmm-BIP40uM，I μ L Bst DNA 酶8 U/ μ L，I μ L 熒光染料I μ L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于:所述LAMP擴增方法采用實時熒光PCR儀，將按照LAMP擴增體系配制好的試劑加入反應(yīng)器中，63°C左右反應(yīng)I小時，共分為40個循環(huán)，每個循環(huán)I分鐘30秒，每個循環(huán)結(jié)束時收集熒光。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于:所述LAMP擴增方法采用普通水浴鍋或金屬浴完成，將按照LAMP擴增體系配制好的試劑加入PE管中，放入63°C左右水浴鍋中保溫90min，然后取出放入另一 80°C水浴鍋中保溫10 min后，取出。
【文檔編號】C12Q1/68GK103773853SQ201310737212
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】楊雷亮, 孫麗霞, 邱德義, 陳定虎, 管維, 王章根 申請人:中華人民共和國中山出入境檢驗檢疫局