一種芳基硫酸酯酶的生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種芳基硫酸酯酶的生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用，具體提供了保藏編號為CCTCC?NO:M?2013613的菌株、所述菌株在生產(chǎn)芳基硫酸酯酶中的應(yīng)用、利用所述菌株生產(chǎn)芳基硫酸酯酶的方法以及一種生產(chǎn)高凝膠強度、低電內(nèi)滲瓊膠的方法。本發(fā)明篩選獲得的菌株可有效地生產(chǎn)芳基硫酸酯酶，所述芳基硫酸酯酶可用于酶解瓊膠粉，特異性地脫出硫瓊膠多糖上的硫酸根，大大提高了高凝膠強度、低電內(nèi)滲瓊膠的得率，在工業(yè)生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價值。
【專利說明】一種芳基硫酸酯酶的生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，是一種芳基硫酸酯酶的生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用。
【【背景技術(shù)】】
[0002]瓊膠(Agar)來源于石花菜、江蘺等紅藻，是一種具有特殊凝固性和穩(wěn)定性的多糖，被廣泛應(yīng)用于食品、化工等科學(xué)研究領(lǐng)域。其化學(xué)組成包括不含硫酸根的瓊脂糖和含有硫酸根的硫瓊膠兩部分。瓊脂糖是形成凝膠的組分，而硫瓊膠是非凝膠部分，也是商業(yè)瓊膠提取過程中力圖除去的部分。瓊膠的凝膠強度和電內(nèi)滲大小與硫酸根的含量關(guān)系密切，硫酸根含量高者，凝膠強度低，電內(nèi)滲值大；反之，凝膠強度大，電內(nèi)滲值小。不同硫酸根含量的瓊膠有不同的用途，含有2% -7%硫酸根的瓊膠，基于其不同的凝膠強度，不但可以作為增稠劑和凝固劑應(yīng)用于食品工業(yè)，還可以作為固化劑用于固體和半固體微生物培養(yǎng)；硫酸根含量低于2%的低電內(nèi)滲瓊膠在生化分離和分子生物學(xué)研究中應(yīng)用于凝膠過濾、凝膠擴散和凝膠電泳。瓊膠基于不同的電內(nèi)滲值，又可細分為中等電內(nèi)滲、低電內(nèi)滲、超低電內(nèi)滲瓊膠。目前，普通瓊膠的售價約為20，000美元/噸,而各種低電滲瓊膠的價格為普通瓊膠的1000~2000倍。隨著食品工業(yè)、生化分離技術(shù)和分子生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，對不同電內(nèi)滲瓊膠的需求量將逐漸增加。
[0003]堿處理是目前常用的瓊膠制備方法，但該方法不經(jīng)濟、不環(huán)保，同時會使瓊膠的顏色加深及瓊膠分子部分降解而導(dǎo)致其凝膠強度下降。高凝膠強度、低電內(nèi)滲瓊膠的制備則主要采用分離并脫除瓊膠中硫瓊膠的方法，如聚乙二醇法、異丙醇法、季銨鹽法、DEAE纖維素法等。以上方法由于脫除了瓊膠中的硫瓊膠組分，均存在處理工藝復(fù)雜、回收率低(}30% )的缺陷。
[0004]芳基硫酸酯酶(Arylsulfatase)是一種催化裂解硫酸酯鍵，生成相應(yīng)的醇和無機硫酸根的酶。利用酶法特異性地脫出硫瓊膠多糖上的硫酸根，而非生化分離方法脫除硫瓊膠，必將大大提高高凝膠強度、低電內(nèi)滲瓊膠的得率。目前國內(nèi)尚無從海洋資源中篩選得到產(chǎn)芳基硫酸酯酶菌株的相關(guān)報道，也沒有用自然界產(chǎn)生的芳基硫酸酯酶生產(chǎn)高凝膠強度、低電內(nèi)滲瓊膠的報道。
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【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種生產(chǎn)芳基硫酸酯酶的菌株。
[0006]本發(fā)明的再一的目的是提供上述菌株的用途。
[0007]本發(fā)明的另一的目的是提供一種芳基硫酸酯酶的制備方法。
[0008]本發(fā)明的第四個目的是提供一種生產(chǎn)高凝膠強度、低電內(nèi)滲瓊膠的方法。
[0009]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種生產(chǎn)芳基硫酸酯酶的菌株，所述的菌株保藏編號為CCTCC N0:M2013613，保藏日期:2013年11月27日，保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址:中國.武漢.武漢大學(xué)，培養(yǎng)物名稱:海單胞菌FW—lMarinomonas sp.FW—1。
[0010]為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:如上所述的菌株在生產(chǎn)芳基硫酸酯酶中的用途。
[0011]為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
[0012]一種芳基硫酸酯酶的制備方法，包括以下步驟:發(fā)酵培養(yǎng)如上所述的菌株，然后從菌體中分離純化芳基硫酸酯酶。
[0013]優(yōu)選地，所述的從菌體中分離純化芳基硫酸酯酶具體是:收集菌體，用0.05M/L、PH = 7.2的Tris-HCl緩沖液復(fù)溶菌體，冰浴條件下進行功率為200w的超聲細胞破碎，離心取上清，得到胞內(nèi)酶液；取胞內(nèi)酶液加入硫酸銨至其終濃度為20%，靜置6h，4°C、1000Or/min離心lOmim，棄沉淀取上清，上清加入硫酸銨至其終濃度為60%，靜置12h，4°C、1000Or/min離心lOmim，棄上清取沉淀；沉淀用0.05M/L、pH = 7.2的Tris-HCl溶解，4°C下用30KD的透析袋透析12h ;之后用50KD的超濾膜超濾濃縮即得酶液。
[0014]為實現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
[0015]一種生產(chǎn)高凝膠強度、低電內(nèi)滲瓊膠的方法，包括以下步驟:
[0016]a)培養(yǎng)如上所述的菌株并分離純化得到芳基硫酸酯酶；
[0017]b)取瓊膠粉，加入去離子水并調(diào)節(jié)pH至9，再加入步驟a)的芳基硫酸酯酶，在45 °C下進行酶解反應(yīng)。
[0018]所述的瓊膠粉是石花菜瓊膠粉和/或江蘺瓊膠粉和/或其它紅藻瓊膠粉。
[0019]本發(fā)明優(yōu)點在于:本發(fā)明篩選獲得一種芳基硫酸酯酶生產(chǎn)菌株，可通過發(fā)酵培養(yǎng)該菌獲得芳基硫酸酯酶，將其用于酶`解瓊膠粉能特異性地脫除硫瓊膠多糖上的硫酸根，大大提高了高凝膠強度、低電內(nèi)滲瓊膠的得率，在工業(yè)生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價值。
【【具體實施方式】】
[0020]下面對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0021]實施例1
[0022]一:菌株 Marinomonas sp.FW-1 的篩選和鑒定
[0023]對青島沿岸海域的海藻樣品進行微生物富集、初篩、復(fù)篩，獲得產(chǎn)酶穩(wěn)定的目標菌，并根據(jù)其形態(tài)、生理生化特征及分子生物學(xué)進行菌種鑒定。
[0024](I)微生物富集培養(yǎng):無菌條件下取適量采集的海藻樣品于無菌燒杯中，加入適量無菌不含硫酸根的人工海水(NaC120.0Og, MgCl2.6Η201.61g，KC15.0Og, CaCl2L 06g，K2HPO4.3Η200.85g，F(xiàn)eCl2.4Η200.51g，蒸餾水 1L，pH = 8)。用八層醫(yī)用紗布封口，在室溫陰涼處自然發(fā)酵5天。
[0025](2)產(chǎn)酶微生物初篩:將富集發(fā)酵液經(jīng)濾紙過濾后，進行梯度稀釋，取0.5mL菌液涂布于表面涂有100 μ L母液濃度為5mM/L的對硝基苯酚硫酸酯鉀鹽(pNPS)的選擇性培養(yǎng)基(蛋白胨2%。，酵母膏3%。，瓊脂4%，不含硫酸根的人工海水lL，pH = 8)平板上，在28°C培養(yǎng)2d后定期觀察平板上底部及周圍呈現(xiàn)黃色的菌落，在2216E培養(yǎng)基(購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)中進行純化培養(yǎng)，并接種于斜面培養(yǎng)基，置于4°C冰箱保存。
[0026](3)產(chǎn)酶微生物復(fù)篩:將上述純化后的斜面菌種分別接種于上述選擇性培養(yǎng)基中再次進行底物顏色驗證，取底物及周圍呈現(xiàn)明顯黃色的菌落接種于液體培養(yǎng)基(蛋白胨2%。，酵母膏3%。，瓊脂0.4%，不含硫酸根的人工海水1L，pH = 8)，在28°C，IOOrpm條件下?lián)u床培養(yǎng)2d，定時取樣，用pNPS進行酶活測定。酶活力測定的條件:取2ml胞內(nèi)酶與
0.5ml5mM/LpNPS均勻混合，在45°C反應(yīng)lh，加入2ml0.5M的NaOH終止反應(yīng)，在410nm處測吸光值。以對硝基苯酚(PNP)做標準曲線，一個酶活力單位定義為45°C條件下，每毫升酶液每分鐘產(chǎn)生I微克PNP所需的酶量。結(jié)果獲得產(chǎn)酶性能最好(酶活為0.25U)的菌株Marinomonas sp.FW—1。
[0027](4)產(chǎn)酶菌Marinomonas sp.FW-1的形態(tài)、生理生化特征及分子生物學(xué)鑒定:將目標菌接種于2216E瓊脂平板培養(yǎng)24h后，光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡和生理生化鑒定其為彎的桿菌，大小為0.7 μ m~1.5 μ mX 1.8 μ m~3.0 μ m,以一根極生鞭毛運動,革蘭氏染色為陰性，呼吸代謝而不是發(fā)酵代謝，明膠酶和脂酶為陰性，無鹽時不生長，在海水中可以良好生長。16S rDNA分子生物學(xué)鑒定屬于海單胞菌屬,通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹得知與Marinomonas_alcarazii_strain有98%的相似性,說明兩者是同屬不同種菌株。該菌株已于2013年11月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址:中國.武漢.武漢大學(xué)，培養(yǎng)物名稱:海單胞菌 FW-1Marinomonas sp.FW-1，保藏編號為 CCTCC NO:M2013613。
[0028]二:Marinomonas sp.Fff-1 菌液的制備及應(yīng)用
[0029](I)Marinomonas sp.FW-1 菌液的制備
[0030]將Marinomonas sp.FW-1經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)48h后即得菌液。
[0031](2)芳基硫 酸酯酶的分離純化
[0032]將200mLMarmomonas sp.Fff-1 的菌液 4°C離心取菌體,用 SOmT,0.05M/L、pH = 7.2的Tris-HCl緩沖液復(fù)溶菌體，在冰浴條件下，進行功率為200w的超聲細胞破碎，破碎時間為45min，離心取上清，即為胞內(nèi)酶液。取胞內(nèi)酶液加入硫酸銨至硫酸銨為20%濃度，靜置6h ;4°C、10000r/min離心lOmim,棄沉淀取上清；上清加入硫酸銨至硫酸銨為60%濃度，靜置 12h, 4°C > 10000r/min 離心 lOmim,棄上清取沉淀;沉淀用 50mL0.05M/L、pH = 7.2 的Tris-HCl溶解，4°C下用30KD的透析袋透析12h。之后經(jīng)50KD的超濾膜超濾濃縮5倍后即得一定純度的酶液。
[0033](3)芳基硫酸酯酶的應(yīng)用
[0034]設(shè)定空白組和酶處理組(即實驗組)兩組實驗，分別對石花菜和江蘺瓊膠進行酶解反應(yīng)，并通過測定反應(yīng)前后瓊膠的硫酸根含量來反映酶解效果。
[0035]空白組:取5.0Og瓊膠粉，加入50mL去離子水，調(diào)節(jié)pH = 9，45°C溫度下反應(yīng)12h。
[0036]酶處理組:取5.0Og瓊膠粉，加入200U純化后酶液用去離子水補足50mL，調(diào)節(jié)pH=9，45 °C溫度下酶解反應(yīng)12h。
[0037]取兩組反應(yīng)前后的瓊膠分別進行消化，用明膠-BaCl2法進行硫酸根含量測定。測定結(jié)果見表1和表2。
[0038]表1石花菜瓊膠
[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)芳基硫酸酯酶的菌株，其特征在于，所述的菌株保藏編號為CCTCC NO:M2013613。
2.權(quán)利要求1所述的菌株在生產(chǎn)芳基硫酸酯酶中的用途。
3.一種芳基硫酸酯酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的菌株，然后從菌體中分離純化芳基硫酸酯酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的從菌體中分離純化芳基硫酸酯酶具體是:收集菌體，用0.05M/L、pH = 7.2的Tris-HCl緩沖液復(fù)溶菌體，冰浴條件下進行功率為200w的超聲細胞破碎，離心取上清，得到胞內(nèi)酶液；取胞內(nèi)酶液加入硫酸銨至其終濃度為20%，靜置6h，4°C、10000r/min離心lOmim，棄沉淀取上清，上清加入硫酸銨至其終濃度為60%，靜置12h，4°C、10000r/min離心lOmim，棄上清取沉淀；沉淀用0.05M/L、pH=7.2的Tris-HCl溶解，4°C下用30KD的透析袋透析12h ;之后用50KD的超濾膜超濾濃縮即得酶液。
5.一種生產(chǎn)高凝膠強度、低電內(nèi)滲瓊膠的方法，其特征在于，包括以下步驟: a)培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的菌株并分離純化得到芳基硫酸酯酶； b)取瓊膠粉，加入去離子水并調(diào)節(jié)pH至9，再加入步驟a)的芳基硫酸酯酶，在45°C下進行酶解反應(yīng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的瓊膠粉是石花菜瓊膠粉和/或江蘺瓊膠粉 。
【文檔編號】C12R1/01GK103710288SQ201310745723
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月26日
【發(fā)明者】付曉婷, 王志朋, 王雪艷, 林洪, 許加超, 高昕 申請人:中國海洋大學(xué)