一種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)探針、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)探針、檢測(cè)試劑盒以及檢測(cè)方法。本發(fā)明提供的基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)探針不需要任何的標(biāo)記和修飾，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單。而且本發(fā)明將甲基化酶和特定的依賴甲基化的內(nèi)切酶的作為組合使用，只有兩者的相互作用才能將發(fā)卡結(jié)構(gòu)的檢測(cè)探針切開(kāi)，產(chǎn)生引物信號(hào)，從而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)；而任何其他甲基化酶作用發(fā)卡結(jié)構(gòu)后都不能被該組合之外的內(nèi)切酶識(shí)別，不能產(chǎn)生引物信號(hào)，從而沒(méi)有化學(xué)發(fā)光信號(hào)，使本發(fā)明的特異性非常高。此外，本發(fā)明的技術(shù)方案將連接酶催化效率高與化學(xué)發(fā)光信號(hào)顯著增強(qiáng)的兩種優(yōu)勢(shì)串聯(lián)起來(lái)，極大地提高了檢測(cè)靈敏度。本發(fā)明在疾病早期診斷和藥物篩選方面具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)探針、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)探針、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甲基化酶(如Dam甲基化酶、Dcm甲基化酶、EcoK I甲基化酶、Sss I甲基化酶)已經(jīng)成為包括癌癥在內(nèi)的眾多疾病早期診斷的重要生物標(biāo)志物，但它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的含量較低，因而對(duì)甲基化酶進(jìn)行高靈敏分析具有很大的挑戰(zhàn)性。
[0003]現(xiàn)有的甲基化酶檢測(cè)技術(shù)主要包括高效液相色譜技術(shù)(HPLC)，放射性標(biāo)記技術(shù)，金納米比色檢測(cè)法和熒光檢測(cè)法。高效液相色譜技術(shù)需要消耗巨大的物力與人力；放射性標(biāo)記技術(shù)常需要引入放射性元素，不安全；金納米顆粒預(yù)處理操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)；熒光檢測(cè)常存在靈敏度低的缺點(diǎn)。
[0004]因此，有必要提供一種成本低、簡(jiǎn)單易行、且能快速、高靈敏地檢測(cè)甲基化酶的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明第一方面提供了一種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)探針。本發(fā)明第二方面提供了一`種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明第三方面提供了一種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)方法。本發(fā)明第四方面提供了一種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)方法，用于檢測(cè)待測(cè)樣品中基化酶的濃度C。本發(fā)明提供的基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)探針不需要任何的標(biāo)記和修飾，本發(fā)明提供的基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)試劑盒采用的試劑成本低，本發(fā)明提供的基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)方法具有很高的靈敏度和特異性，本發(fā)明提供的基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)探針、檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法在疾病早期診斷和藥物篩選方面具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。
[0006]本發(fā)明所述的片段A為單鏈脫氧核苷酸。
[0007]第一方面，本發(fā)明提供了一種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)探針，所述檢測(cè)探針包括發(fā)卡探針、引物-1和引物_2，所述發(fā)卡探針依次包括莖-1、環(huán)以及莖_2，所述莖-1、環(huán)以及莖-2均為單鏈脫氧核苷酸，所述莖-1與莖-2互補(bǔ)形成雙鏈DNA (1)，所述雙鏈DNA (I)具有甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)以及依賴甲基化的內(nèi)切酶的酶切序列，其中，所述甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)與環(huán)的末端堿基距離為2~Sbp ;
[0008]所述引物-1為單鏈脫氧核苷酸，所述引物-1具有至少一個(gè)片段A，所述片段A的5’端或3’端具有切刻內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的互補(bǔ)序列，所述片段A的核苷酸序列與DNA酶序列互補(bǔ)，其中，所述DNA酶序列為具有氯高鐵血紅素結(jié)合位點(diǎn)的多G核苷酸序列；所述引物-1還具有與所述發(fā)卡探針的部分核苷酸序列互補(bǔ)的序列，所述引物-2為單鏈脫氧核苷酸，所述引物-2與所述引物-1兩端的核苷酸序列互補(bǔ)。[0009]優(yōu)選地，所述發(fā)卡探針的雙鏈DNA (I)具有甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)以及依賴甲基化的內(nèi)切酶的酶切序列中，所述甲基化酶為Dam甲基化酶或M.Taq I甲基化酶，所述依賴甲基化的內(nèi)切酶為Dpn I內(nèi)切酶。[0010]具體的，所述Dam甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)為GATC，；所述依賴甲基化的內(nèi)切酶為DpnI內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)為G*ATC，其中G*ATC即為Dpn I酶切位點(diǎn)；在S-腺苷甲硫氨酸(Sam)存在時(shí)，Dam甲基化酶在其識(shí)別位點(diǎn)GATC的A堿基上加上一個(gè)甲基形成G*ATC，即Dpn I酶切位點(diǎn)。
[0011]即在該優(yōu)選條件下，被甲基化修飾后的發(fā)卡探針能被依賴甲基化的內(nèi)切酶識(shí)別，并被切斷。被切斷后的發(fā)卡探針產(chǎn)生一個(gè)小的發(fā)卡結(jié)構(gòu)和小段的雙鏈DNA，由于小發(fā)卡結(jié)構(gòu)退火溫度過(guò)低，即打開(kāi)為一條單鏈的DNA，該單鏈DNA能與引物-1的部分序列互補(bǔ)配對(duì)。
[0012]將本發(fā)明提供的引物-1和引物-2混合，用環(huán)形探針連接試劑處理，可得到環(huán)形探針。
[0013]優(yōu)選地，所述環(huán)形探針連接試劑包括:1XT4連接酶緩沖液(6.6毫摩爾每升氯化鎂，10毫摩爾每升二硫蘇糖醇，0.1毫摩爾每升的三磷酸腺苷，66毫摩爾每升的三異丙基乙磺酰鹽酸)、Τ4連接酶、ΡΗ7.9的外切酶混合物(I毫摩爾每升的二硫蘇糖醇、6.7毫摩爾每升的氯化鎂、67毫摩爾每升甘氨酸-氫氧化鉀、10個(gè)單位外切酶1、20個(gè)單位外切酶III)。
[0014]優(yōu)選地，所述處理方式為:取I微摩爾每升的引物-1及I微摩爾每升的引物-2加入I X Τ4連接酶緩沖液中，在95度加熱5分鐘使得兩種引物DNA變性，再緩慢降溫至37度；再加入50個(gè)單位的Τ4連接酶后16度過(guò)夜反應(yīng)；連接反應(yīng)后，將10微升的反應(yīng)產(chǎn)物加入到10微升的外切酶混合物中進(jìn)行消化反應(yīng)，得到所述環(huán)形探針。
[0015]優(yōu)選地，所述DNA酶序列為如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5任一所示的核苷酸序列。
[0016]優(yōu)選地，所述片段A的序列為如SEQ ID Ν0:6~SEQ ID NO: 10任一所示的核苷酸序列。
[0017]具體地，所述SEQ ID Ν0:1 為 GGGTAGGGCGGGTTGGG，
[0018]在此優(yōu)選條件下，
[0019]所述片段A 的序列為 CCCAACCCGCCCTACCC (SEQ ID Ν0:6)；
[0020]所述SEQ ID NO:2 為 GGGTGGGTGGGTGGGT，
[0021]在此優(yōu)選條件下，
[0022]所述片段A 的序列為 ACCCACCCACCCACCC (SEQ ID NO: 7);
[0023]所述SEQ ID NO:3 為 GTGGGTAGGGCGGGTTGG，
[0024]在此優(yōu)選條件下，
[0025]所述片段A 的序列為 CCAACCCGCCCTACCCAC (SEQ ID Ν0:8)；
[0026]所述SEQ ID NO:4 為 GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG，
[0027]在此優(yōu)選條件下，
[0028]所述片段A 的序列為 CCACACCCACCCACAATGACCCAC (SEQ ID Ν0:9)；
[0029]所述SEQ ID NO:5 為 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG，
[0030]在此優(yōu)選條件下，
[0031]所述片段A 的序列為 CCACCACCACCACAACCACCACCACC (SEQ ID NO: 10)。[0032]具體地，所述SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5的序列可形成分子內(nèi)平行型G-四鏈體，該G-四鏈體可與氯高鐵血紅素(hemin)結(jié)合形成血紅素-G四聚體，該血紅素-G四聚體是一種DNA過(guò)氧化物酶，具有過(guò)氧化物酶的催化作用，其在魯米諾和過(guò)氧化氫存在條件下，可催化3-氨基鄰苯二甲酰肼(魯米諾)等發(fā)光試劑發(fā)生氧化反應(yīng)并產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)；此外，還可催化其他氧化還原發(fā)光底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)并產(chǎn)生顏色的變化，如硝酸雙-N-甲基吖啶翁(光澤精，又稱N，N 二甲基二吖啶硝酸鹽)、2，4，5-三苯基咪唑(洛粉堿)、3，4，5-三羥基苯甲酸(沒(méi)食子酸)、雙(2，4，6-三氯苯基)草酸鹽(過(guò)氧草酸鹽)或2，2'-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)。
[0033]優(yōu)選地，所述DNA酶序列的5’端或3’端的切刻內(nèi)切酶為Nt.BspQI切刻內(nèi)切酶、Nt.AlwI切刻內(nèi)切酶、Nb.Bsm I切刻內(nèi)切酶或Nt.BstNBI切刻內(nèi)切酶。
[0034]本發(fā)明發(fā)卡探針經(jīng)依賴甲基化的內(nèi)切酶切割所得的單鏈DNA與所述環(huán)形探針的部分序列互補(bǔ)配對(duì)后，在聚合酶作用下，以環(huán)形探針為擴(kuò)增模板進(jìn)行滾環(huán)反應(yīng)；同時(shí)，由于環(huán)形探針中具有DNA酶序列，所述5’端或3’端的切刻內(nèi)切酶，因而在切刻酶的作用下，滾環(huán)反應(yīng)不斷的進(jìn)行延伸產(chǎn)生的DNA酶序列能被切刻酶不斷切割，得到的切割片段又可以作為新的滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的引物，如此產(chǎn)生大量的短的DNA酶片段，這些DNA酶片段能與hemin結(jié)合形成具有過(guò)氧化物酶催化活性的G-四聚體，能夠催化過(guò)氧化氫與發(fā)光底物如3-氨基鄰苯二甲酰肼、硝酸雙-N-甲基吖啶翁、2，4，5-三苯基咪唑、3，4，5-三羥基苯甲酸、雙(2，4，6-三氯苯基)草酸鹽或2，2'-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ATBS)進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。
[0035]本發(fā)明通過(guò)不斷產(chǎn)生引物的滾環(huán)擴(kuò)增方式產(chǎn)生了大量的短的DNA酶片段，再利用DNA酶能與hemin結(jié)合形成過(guò)氧化物酶催化活性的G-四聚體，將這兩步反應(yīng)串聯(lián)在一起，使化學(xué)發(fā)光信號(hào)指數(shù)級(jí)擴(kuò)大 ，極大地放大了目標(biāo)信號(hào)，從而能夠高靈敏度地檢測(cè)甲基化酶。
[0036]優(yōu)選地，所述引物-2的核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 11所示。
[0037]優(yōu)選地，所述發(fā)卡探針的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
[0038]優(yōu)選地，所述引物-1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 13所示。
[0039]第二方面，本發(fā)明提供了一種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)試劑盒，包括:
[0040]發(fā)卡探針、引物-1、引物_2、發(fā)卡探針甲基化試劑、依賴甲基化的內(nèi)切酶酶切試劑、環(huán)形探針連接試劑、滾換擴(kuò)增及切刻內(nèi)切酶酶切試劑、DNA酶檢測(cè)試劑，
[0041]其中，所述依賴甲基化的內(nèi)切酶酶切試劑包括依賴甲基化的內(nèi)切酶，所述環(huán)形探針連接試劑包括DNA連接酶和DNA外切酶，所述滾換擴(kuò)增及切刻內(nèi)切酶酶切試劑包括DNA聚合酶和切刻內(nèi)切酶，所述DNA酶檢測(cè)試劑包括氯高鐵血紅素以及DNA過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑；
[0042]所述發(fā)卡探針依次包括莖-1、環(huán)以及莖_2，所述莖-1、環(huán)以及莖-2均為單鏈脫氧核苷酸，所述莖-1與莖-2互補(bǔ)形成雙鏈DNA (I )，所述雙鏈DNA (I)具有甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)以及依賴甲基化的內(nèi)切酶的酶切序列，其中，所述甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)與環(huán)的末端堿基距離為2~8bp ;
[0043]所述引物-1為單鏈脫氧核苷酸，所述引物-1具有至少一個(gè)片段A，所述片段A的5’端或3’端具有切刻內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的互補(bǔ)序列，所述片段A的核苷酸序列與DNA酶序列互補(bǔ)，其中，所述DNA酶序列為具有氯高鐵血紅素結(jié)合位點(diǎn)的多G核苷酸序列；所述引物-1還具有與所述發(fā)卡探針的部分核苷酸序列互補(bǔ)的序列，所述引物-2為單鏈脫氧核苷酸，所述引物-2與所述引物-1兩端的核苷酸序列互補(bǔ)。
[0044]優(yōu)選地，發(fā)卡探針的甲基化試劑包括:160微摩爾每升的S-腺苷甲硫氨酸(Sam)、IX甲基化酶反應(yīng)緩沖液(0.05摩爾每升的三異丙基乙磺酰鹽酸，pH7.5，0.01摩爾每升的氯化納，0.01摩爾每升的乙二胺四乙酸，5毫摩爾每升的2-巰基乙醇)，其中，所述發(fā)卡探針優(yōu)選為2微摩爾每升。
[0045]在此優(yōu)選情況下，本發(fā)明提供的發(fā)卡探針的甲基化條件優(yōu)選為:取適量濃度的甲基化酶待測(cè)樣品，加入發(fā)卡探針和發(fā)卡探針的甲基化試劑，37度孵育2小時(shí)后再65度反應(yīng)10分鐘使酶失活，即得到甲基化后的發(fā)卡探針。
[0046]優(yōu)選地，依賴甲基化的內(nèi)切酶的酶切試劑還包括:1XNEB緩沖液4 (50毫摩爾醋酸鉀，20毫摩爾的三異丙基乙磺酰乙酸，10毫摩爾醋酸鎂，I毫摩爾的二硫蘇糖醇，PH7.9)，其中，所述依賴甲基化的內(nèi)切酶優(yōu)選為10單位每微升。
[0047]在此優(yōu)選情況下，采用所述依賴甲基化的內(nèi)切酶對(duì)甲基化后的發(fā)卡探針進(jìn)行反應(yīng)的條件優(yōu)選為:將甲基化反應(yīng)產(chǎn)物與依賴甲基化的內(nèi)切酶的酶切試劑按體積比1:3混合，37度孵育一個(gè)半小時(shí)，然后再80度反應(yīng)20分鐘使酶失活。
[0048]優(yōu)選地，所述環(huán)形探針連接試劑還包括:1XT4DNA連接酶緩沖液(6.6毫摩爾每升氯化鎂，10毫摩爾每升二硫蘇糖醇，0.1毫摩爾每升的三磷酸腺苷，66毫摩爾每升的三異丙基乙磺酰鹽酸)、PH7.9的外切酶緩沖液(I毫摩爾每升的二硫蘇糖醇、6.7毫摩爾每升的氯化鎂、67毫摩爾每升甘氨酸-氫氧化鉀)，其中，所述DNA連接酶優(yōu)選為T(mén)4DNA連接酶，所述DNA外切酶優(yōu)選為包括外切酶I與外切酶III;所述外切酶I與外切酶III分別優(yōu)選為I單位每微升與2單位每微升，所述引物-1和引物-2均優(yōu)選為I微摩爾每升。
[0049]在此優(yōu)選情況下，采用所述環(huán)形探針連接試劑制備環(huán)形探針的方式優(yōu)選為:取I微摩爾每升的引物-1及I微摩爾每升的引物-2加入I XT4連接酶緩沖液中，在95度加熱5分鐘使得兩種引物DNA變性，再緩慢降溫至37度；再加入50個(gè)單位的T4連接酶后16度過(guò)夜反應(yīng)；連接反應(yīng)后，將10微升的反應(yīng)產(chǎn)物加入到10微升的外切酶混合物中進(jìn)行消化反應(yīng)，得到所述環(huán)形探針。
[0050]優(yōu)選地，所述滾換擴(kuò)增及切刻內(nèi)切酶酶切試劑還包括:30納摩爾每升的環(huán)形探針(采用本發(fā)明提供的環(huán)形探針連接試劑所制備)、20毫摩爾每升三異丙基乙磺酰鹽酸(PH8.8),10毫摩爾每升的硫酸銨、10毫摩爾每升的氯化鉀、6毫摩爾每升的硫酸鎂、400微摩爾每升的dNTPs (四種脫氧核糖核苷酸的混合物)、0.1%聚乙二醇辛基苯基醚，其中，所述DNA聚合酶和切刻內(nèi)切酶分別優(yōu)選為0.08單位每微升和0.13單位每微升。
[0051]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述DNA聚合酶為Phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶大片段或VentR exc^DNA 聚合酶。
[0052]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述切刻內(nèi)切酶為Nt.BspQI切刻內(nèi)切酶、Nt.AlwI切刻內(nèi)切酶、Nb.Bsm I切刻內(nèi)切酶或Nt.BstNBI切刻內(nèi)切酶。
[0053]在此優(yōu)選情況下，采用所述滾換擴(kuò)增及切刻內(nèi)切酶酶切試劑進(jìn)行反應(yīng)的方式優(yōu)選為:取體積比為1:19的發(fā)卡探針酶切產(chǎn)物和所述滾換擴(kuò)增及切刻內(nèi)切酶酶切試劑混合，60度孵育90分鐘。
[0054]優(yōu)選地，所述DNA過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑包括:105微升含有0.5毫摩爾每升的魯米諾、15微升的去離子水、75微升2XHEPES緩沖液(40毫摩爾每升的HEPES、600毫摩爾氯化鈉、PH8.0)。
[0055]在此優(yōu)選條件下，所述DNA酶檢測(cè)試劑中的氯高鐵血紅素(hemin)優(yōu)選為75納摩爾每升，采用所述DNA酶檢測(cè)試劑進(jìn)行檢測(cè)的方式優(yōu)選為:將15微升的滾換擴(kuò)增以及切刻內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物加入到105微升的所述DNA酶檢測(cè)試劑中得到混合物，將混合物放入GloMax96微型板塊光度計(jì)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光的信號(hào)，使用自動(dòng)加樣的程序加入過(guò)氧化氫，時(shí)間間隔設(shè)置為1.5秒，得到化學(xué)發(fā)光信號(hào)。
[0056]優(yōu)選地，所述發(fā)卡探針的雙鏈DNA (1)具有甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)以及依賴甲基化的內(nèi)切酶的酶切序列中，所述甲基化酶為Dam甲基化酶或M.Taq I甲基化酶，所述依賴甲基化的內(nèi)切酶為Dpn I內(nèi)切酶。
[0057]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述DNA過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑中所述的魯米諾還可替換為硝酸雙-N-甲基吖啶翁、2，4，5-三苯基咪唑、3，4，5-三羥基苯甲酸、雙(2，4，6-三氯苯基)草酸鹽或2，2'-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)。
[0058]優(yōu)選地，所述DNA酶序列為如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5任一所示的核苷酸序列。
[0059]優(yōu)選地，所述片段A的序列為如SEQ ID N0:6~SEQ ID NO: 10任一所示的核苷酸序列。
[0060]具體地，所述SEQ ID NO:1 為 GGGTAGGGCGGGTTGGG，
[0061]在此優(yōu)選條件下，
[0062]所述片段A 的序列為 CCCAACCCGCCCTACCC (SEQ ID N0:6)；
[0063]所述SEQ ID NO:2 為 GGGTGGGTGGGTGGGT,
[0064]在此優(yōu)選條件下，
[0065]所述片段A 的序列為 ACCCACCCACCCACCC (SEQ ID NO: 7);
[0066]所述SEQ ID NO:3 為 GTGGGTAGGGCGGGTTGG,
[0067]在此優(yōu)選條件下，
[0068]所述片段A 的序列為 CCAACCCGCCCTACCCAC (SEQ ID N0:8)；
[0069]所述SEQ ID NO:4 為 GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG，
[0070]在此優(yōu)選條件下，
[0071]所述片段A 的序列為 CCACACCCACCCACAATGACCCAC (SEQ ID N0:9)；
[0072]所述SEQ ID NO:5 為 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG，
[0073]在此優(yōu)選條件下，
[0074]所述片段A 的序列為 CCACCACCACCACAACCACCACCACC (SEQ ID NO: 10)。
[0075]優(yōu)選地，所述DNA酶序列的5’端或3’端的切刻內(nèi)切酶為Nt.BspQI切刻內(nèi)切酶、Nt.AlwI切刻內(nèi)切酶、Nb.Bsm I切刻內(nèi)切酶或Nt.BstNBI切刻內(nèi)切酶。
[0076]優(yōu)選地，所述引物-2的核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 11所示。
[0077]優(yōu)選地，所述發(fā)卡探針的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
[0078]優(yōu)選地，所述引物-1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 13所示。
[0079]本發(fā)明第三方面提供了一種基于DNA過(guò)氧化物酶的甲基化酶檢測(cè)方法，包括如下步驟:[0080]I)提供發(fā)卡探針、引物-1、引物-2、發(fā)卡探針、引物-1、引物-2、發(fā)卡探針甲基化試劑、依賴甲基化的內(nèi)切酶酶切試劑、環(huán)形探針連接試劑、滾換擴(kuò)增及切刻內(nèi)切酶酶切試劑、DNA酶檢測(cè)試劑，
[0081]其中，所述依賴甲基化的內(nèi)切酶酶切試劑包括依賴甲基化的內(nèi)切酶，所述環(huán)形探針連接試劑包括DNA連接酶和DNA外切酶，所述滾換擴(kuò)增及切刻內(nèi)切酶酶切試劑包括DNA聚合酶和切刻內(nèi)切酶，所述DNA酶檢測(cè)試劑包括氯高鐵血紅素以及DNA過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑；
[0082]所述發(fā)卡探針依次包括莖-1、環(huán)以及莖_2，所述莖-1、環(huán)以及莖-2均為單鏈脫氧核苷酸，所述莖-1與莖-2互補(bǔ)形成雙鏈DNA (I)，所述雙鏈DNA (I)具有Dam甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)以及所述Dpn I內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，其中，所述甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)與環(huán)的末端堿基距離為2~8bp ;
[0083]所述引物-1為單鏈脫氧核苷酸，所述引物-1具有至少一個(gè)片段A，所述片段A的5’端或3’端具有切刻內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的互補(bǔ)序列，所述片段A的核苷酸序列與DNA酶序列互補(bǔ)，其中，所述DNA酶序列為具有氯高鐵血紅素結(jié)合位點(diǎn)的多G核苷酸序列；所述引物-1還具有與所述發(fā)卡探針的部分核苷酸序列互補(bǔ)的序列，所述引物-2為單鏈脫氧核苷酸，所述引物-2與所述引物-1兩端的核苷酸序列互補(bǔ)；及
[0084]2)取待測(cè)甲基化酶樣品，加入所述發(fā)卡探針和發(fā)卡探針甲基化試劑進(jìn)行甲基化反應(yīng)，得到含甲基化的發(fā)卡探針產(chǎn)物 '及
[0085]3)將所得含 甲基化的發(fā)卡探針產(chǎn)物加入依賴甲基化的內(nèi)切酶酶切試劑進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到單鏈DNA，所述單鏈DNA與引物-1的部分序列互補(bǔ)；及
[0086]4)將引物-1和引物-2混合，用環(huán)形探針連接試劑進(jìn)行退火、連接、酶切處理，得到環(huán)形探針 '及
[0087]5)取步驟3)所得的單鏈DNA和步驟4)所得的環(huán)形探針混合，加入滾換擴(kuò)增及切刻內(nèi)切酶酶切試劑，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增和酶切反應(yīng)，得到切刻內(nèi)切酶的酶切產(chǎn)物；及
[0088]6)取所得切刻內(nèi)切酶的酶切產(chǎn)物加入DNA酶檢測(cè)試劑，并檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)。
[0089]優(yōu)選地，發(fā)卡探針的甲基化試劑包括:160微摩爾每升的S-腺苷甲硫氨酸(Sam)、IX甲基化酶反應(yīng)緩沖液(0.05摩爾每升的三異丙基乙磺酰鹽酸，pH7.5，0.01摩爾每升的氯化納，0.01摩爾每升的乙二胺四乙酸，5毫摩爾每升的2-巰基乙醇)，其中，所述發(fā)卡探針優(yōu)選為2微摩爾每升。
[0090]在此優(yōu)選條件下，在所述步驟(2 )中，所述發(fā)卡探針甲基化試劑處理待測(cè)甲基化酶樣品的過(guò)程中，處理的條件為:取適量濃度的甲基化酶待測(cè)樣品，加入發(fā)卡探針和發(fā)卡探針的甲基化試劑，37度孵育2小時(shí)后再65度反應(yīng)10分鐘使酶失活，即得到甲基化后的發(fā)卡探針。
[0091]優(yōu)選地，依賴甲基化的內(nèi)切酶的酶切試劑還包括:1XNEB緩沖液(50毫摩爾醋酸鉀，20毫摩爾的三異丙基乙磺酰乙酸，10毫摩爾醋酸鎂，I毫摩爾的二硫蘇糖醇，PH7.9)，其中，所述依賴甲基化的內(nèi)切酶優(yōu)選為10單位每微升。
[0092]在此優(yōu)選條件下，在所述步驟(3)中，將所得含甲基化的發(fā)卡探針產(chǎn)物加入依賴甲基化的內(nèi)切酶酶切試劑進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到單鏈DNA的過(guò)程中，處理的條件為:將甲基化反應(yīng)產(chǎn)物與依賴甲基化的內(nèi)切酶的酶切試劑按體積比1:3混合，37度孵育一個(gè)半小時(shí)，然后再80度反應(yīng)20分鐘使酶失活。
[0093]優(yōu)選地，所述環(huán)形探針連接試劑還包括:1XT4DNA連接酶緩沖液(6.6毫摩爾每升氯化鎂，10毫摩爾每升二硫蘇糖醇，0.1毫摩爾每升的三磷酸腺苷，66毫摩爾每升的三異丙基乙磺酰鹽酸)、PH7.9的外切酶緩沖液(I毫摩爾每升的二硫蘇糖醇、6.7毫摩爾每升的氯化鎂、67毫摩爾每升甘氨酸-氫氧化鉀)，其中，所述DNA連接酶優(yōu)選為T(mén)4DNA連接酶，所述DNA外切酶優(yōu)選為包括外切酶I與外切酶III;所述外切酶I與外切酶III分別優(yōu)選為I單位每微升與2單位每微升，所述引物-1和引物-2均優(yōu)選為I微摩爾每升。
[0094]在此優(yōu)選條件下，在所述步驟(4)中，將引物-1和引物-2混合，用環(huán)形探針連接試劑進(jìn)行退火、連接、酶切處理，得到環(huán)形探針的過(guò)程中，處理的條件為:取I微摩爾每升的引物-1及I微摩爾每升的引物-2加入1XT4連接酶緩沖液中，在95度加熱5分鐘使得兩種引物DNA變性，再緩慢降溫至37度；再加入50個(gè)單位的T4連接酶后16度過(guò)夜反應(yīng)；連接反應(yīng)后，將10微升的反應(yīng)產(chǎn)物加入到10微升的外切酶混合物中進(jìn)行消化反應(yīng)，得到所述環(huán)形探針。
[0095]優(yōu)選地，所述滾換擴(kuò)增及切刻內(nèi)切酶酶切試劑還包括:30納摩爾每升的環(huán)形探針(采用本發(fā)明提供的環(huán)形探針連接試劑所制備)、20毫摩爾每升三異丙基乙磺酰鹽酸(PH8.8),10毫摩爾每升的硫酸銨、10毫摩爾每升的氯化鉀、6毫摩爾每升的硫酸鎂、400微摩爾每升的dNTPs (四種脫氧核糖核苷酸的混合物)、0.1%聚乙二醇辛基苯基醚，其中，所述DNA聚合酶和切刻內(nèi)切酶分別優(yōu)選為0.08單位每微升和0.13單位每微升。
[0096]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述DNA聚合酶為Phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶大片段或VentR exc^DNA 聚合酶。
[0097]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述切刻內(nèi)切酶為Nt.BspQI切刻內(nèi)切酶、Nt.AlwI切刻內(nèi)切酶、Nb.Bsm I切刻內(nèi)切酶或Nt.Bs`tNBI切刻內(nèi)切酶。
[0098]在此優(yōu)選條件下，在所述步驟(5)的過(guò)程中，處理的條件為:取體積比為1:19的發(fā)卡探針酶切產(chǎn)物和所述滾換擴(kuò)增及切刻內(nèi)切酶酶切試劑混合，60度孵育90分鐘。
[0099]優(yōu)選地，所述DNA過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑包括:105微升含有0.5毫摩爾每升的魯米諾、15微升的去離子水、75微升2XHEPES緩沖液(40毫摩爾每升的HEPES、600毫摩爾氯化鈉、PH8.0)。
[0100]優(yōu)選地，在所述步驟(6)中，所述DNA酶檢測(cè)試劑中的氯高鐵血紅素(hemin)優(yōu)選為75納摩爾每升。
[0101]在此優(yōu)選條件下，在所述步驟(6)中，取所得切刻內(nèi)切酶的酶切產(chǎn)物加入DNA酶檢測(cè)試劑，并檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的過(guò)程中，處理的條件為:采用所述DNA酶檢測(cè)試劑進(jìn)行檢測(cè)的方式優(yōu)選為:將15微升的滾換擴(kuò)增以及切刻內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物加入到105微升的所述DNA酶檢測(cè)試劑中得到混合物，將混合物放入GloMax96微型板塊光度計(jì)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光的信號(hào)，使用自動(dòng)加樣的程序加入過(guò)氧化氫，時(shí)間間隔設(shè)置為1.5秒，得到化學(xué)發(fā)光信號(hào)。
[0102]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述DNA過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑中所述的魯米諾還可替換為硝酸雙-N-甲基吖啶翁、2，4，5-三苯基咪唑、3，4，5-三羥基苯甲酸、雙(2，4，6-三氯苯基)草酸鹽或2，2'-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)。
[0103]優(yōu)選地，所述發(fā)卡探針的雙鏈DNA (I)具有甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)以及依賴甲基化的內(nèi)切酶的酶切序列中，所述甲基化酶為Dam甲基化酶或M.Taq I甲基化酶，所述依賴甲基化的內(nèi)切酶為Dpn I內(nèi)切酶。
[0104]優(yōu)選地，所述DNA酶序列為如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5任一所示的核苷酸序列。
[0105]優(yōu)選地，所述片段A的序列為如SEQ ID N0:6~SEQ ID NO: 10任一所示的核苷酸序列。
[0106]具體地，所述SEQ ID N0:1 為 GGGTAGGGCGGGTTGGG，
[0107]在此優(yōu)選條件下，
[0108]所述片段A 的序列為 CCCAACCCGCCCTACCC (SEQ ID N0:6)；
[0109]所述SEQ ID NO:2 為 GGGTGGGTGGGTGGGT，
[0110]在此優(yōu)選條件下，
[0111]所述片段A 的序列為 ACCCACCCACCCACCC (SEQ ID N0:7)；
[0112]所述SEQ ID NO: 3 為 GTGGGTAGGGCGGGTTGG，
[0113]在此優(yōu)選條件下，
[0114]所述片段A 的序列為 CCAACCCGCCCTACCCAC (SEQ ID N0:8)；
[0115]所述SEQ ID N0:4 為 GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG，
[0116]在此優(yōu)選條件下，
[0117]所述片段A 的序列為 CCACACCCACCCACAATGACCCAC (SEQ ID N0:9)；
[0118]所述SEQ ID NO: 5 為 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG，
[0119]在此優(yōu)選條件下，
[0120]所述片段A 的序列為 CCACCACCACCACAACCACCACCACC (SEQ ID NO: 10)。
[0121]優(yōu)選地，所述DNA酶序列的5’端或3’端的切刻內(nèi)切酶為Nt.BspQI切刻內(nèi)切酶、Nt.AlwI切刻內(nèi)切酶、Nb.Bsm I切刻內(nèi)切酶或Nt.BstNBI切刻內(nèi)切酶。
[0122]優(yōu)選地，所述引物-2的核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 11所示。
[0123]優(yōu)選地，所述發(fā)卡探針的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
[0124]優(yōu)選地，所述引物-1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 13所示。
[0125]第四方面，本發(fā)明提供了一種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)方法，用于檢測(cè)待測(cè)樣品中基化酶的濃度C，包括如下步驟:
[0126]將如第三方面所述的基于DNA過(guò)氧化物酶的甲基化酶檢測(cè)方法所得的化學(xué)發(fā)光信號(hào)代入下式
[0127]Ic=147614.4+34572.31og10C
[0128]式中，Ic為所述化學(xué)發(fā)光信號(hào)的發(fā)光強(qiáng)度，所述濃度C為每毫升待測(cè)樣品中含甲基化酶的單位數(shù)。
[0129]優(yōu)選地，所述甲基化酶為Dam甲基化酶。
[0130]本發(fā)明提供基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)探針、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法具有如下有益效果:
[0131]1.發(fā)卡探針、引物-1和引物-2設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單。本發(fā)明提供的發(fā)夾探針只要在頸結(jié)構(gòu)上含有供甲基化酶識(shí)別的序列，不需要任何的修飾；引物-1只要包括切刻酶酶切位點(diǎn)、與發(fā)卡探針互補(bǔ)的位點(diǎn)，引物-2的序列即為引物-1兩末端互補(bǔ)的序列，這使得探針易于設(shè)計(jì)，可行性強(qiáng)。[0132]2.特異性高。本技術(shù)方案將甲基化酶和特定的依賴甲基化的內(nèi)切酶的作為組合使用，只有兩者的相互作用才能將發(fā)卡結(jié)構(gòu)切開(kāi)，產(chǎn)生引物信號(hào)，從而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)；而任何其他甲基化酶作用發(fā)卡結(jié)構(gòu)后都不能被該組合之外的內(nèi)切酶識(shí)別，不能產(chǎn)生引物信號(hào)，從而沒(méi)有化學(xué)發(fā)光信號(hào)，使本技術(shù)方案的特異性非常高。
[0133]3.靈敏度高。本發(fā)明的技術(shù)方案將連接酶催化效率高與化學(xué)發(fā)光信號(hào)顯著增強(qiáng)的兩種優(yōu)勢(shì)串聯(lián)起來(lái)，極大地提高了檢測(cè)靈敏度。
[0134]4.成本低。化學(xué)發(fā)光具有靈敏度高和線性范圍廣的特點(diǎn)，而且價(jià)格低廉，在生物醫(yī)學(xué)研究和疾病診斷方面具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0135]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的發(fā)卡探針的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0136]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2提供的基于DNA過(guò)氧化物酶的甲基化酶檢測(cè)方法流程圖；
[0137]圖3為本發(fā)明實(shí)施例3提供的各濃度甲基化酶溶液的化學(xué)發(fā)光信號(hào)；
[0138]圖4為本發(fā)明實(shí)施例3提供的不同濃度甲基化酶與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化關(guān)系擬合曲線；
[0139]圖5為本發(fā)明對(duì)比實(shí)施例1提供的樣品的化學(xué)發(fā)光信號(hào)；
[0140]圖6為本發(fā)明對(duì)比實(shí)施例2提供的甲基化酶和酶切實(shí)驗(yàn)的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果；
[0141]圖7為本發(fā)明對(duì)比實(shí)施例2提供的樣品的擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)結(jié)果；
`[0142]圖8為本發(fā)明對(duì)比實(shí)施例2提供的樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
[0143]圖9為本發(fā)明對(duì)比實(shí)施例2提供的樣品的化學(xué)發(fā)光信號(hào)；
[0144]圖10為本發(fā)明對(duì)比實(shí)施例3提供的5-氟尿嘧啶作為抑制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0145]下述實(shí)施例中所用的方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見(jiàn):((Molecular Cloning:A Laboratory Manual K Sambrook, J., Russell, David ff., MolecularCloning:A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海生工合成。
[0146]實(shí)施例1
[0147]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的發(fā)卡探針的5’端側(cè)鏈(莖-1)與3’端側(cè)鏈(莖-2)互補(bǔ)形成雙鏈I的結(jié)構(gòu)示意圖，該發(fā)卡探針包括雙鏈I和環(huán)。其中，所述雙鏈DNAl具有甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)以及依賴甲基化的內(nèi)切酶的酶切序列，其中，所述甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)與環(huán)的末端堿基距離為2~8bp ;
[0148]結(jié)合圖1，以Dam甲基化酶為例，本實(shí)施例提供了一種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)探針，包括如下步驟:
[0149](I)體外合成發(fā)卡探針，核苷酸序列(5，端到3，)如SEQ ID N0:12所示;
[0150](2)根據(jù)發(fā)卡探針的序列設(shè)計(jì)引物-1和引物_2，引物-1只要包括切刻酶酶切位點(diǎn)、與發(fā)卡探針互補(bǔ)的位點(diǎn)，引物-2的序列即為引物-1兩末端互補(bǔ)的序列，所述引物-1和引物-2的核苷酸序列(5，端到3，)分別如SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 11所示；[0151]具體地，所述發(fā)卡探針、引物-1和引物-2的核苷酸序列如下表1所示:
[0152]表1.發(fā)卡探針、引物-1和引物-2的核苷酸序列
[0153]
【權(quán)利要求】
1.一種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)探針，其特征在于，所述檢測(cè)探針包括發(fā)卡探針、引物-1和引物-2，所述發(fā)卡探針依次包括莖-1、環(huán)以及莖-2，所述莖-1、環(huán)以及莖-2均為單鏈脫氧核苷酸，所述莖-1與莖-2互補(bǔ)形成雙鏈DNA (I )，所述雙鏈DNA (I)具有甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)以及依賴甲基化的內(nèi)切酶的酶切序列，其中，所述甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)與環(huán)的末端堿基距離為2~8bp ; 所述引物-1為單鏈脫氧核苷酸，所述引物-1具有至少一個(gè)片段A，所述片段A的5’端或3’端具有切刻內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的互補(bǔ)序列，所述片段A的核苷酸序列與DNA酶序列互補(bǔ)，其中，所述DNA酶序列為具有氯高鐵血紅素結(jié)合位點(diǎn)的多G核苷酸序列；所述引物-1還具有與所述發(fā)卡探針的部分核苷酸序列互補(bǔ)的序列，所述引物-2為單鏈脫氧核苷酸，所述引物-2與所述引物-1兩端的核苷酸序列互補(bǔ)。
2.如權(quán)利要求1所述的基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)探針，其特征在于，所述發(fā)卡探針的雙鏈DNA (I)具有甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)以及依賴甲基化的內(nèi)切酶的酶切序列中，所述甲基化酶為Dam甲基化酶或M.Sss I甲基化酶，所述依賴甲基化的內(nèi)切酶為Dpn I內(nèi)切酶。
3.如權(quán)利要求1所述的基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)探針，其特征在于，所述引物-1中，所述DNA酶序列為如SEQ ID NO:1~5所示的核苷酸序列；所述DNA酶序列的5’端或3’端的切刻內(nèi)切酶為Nb.Bsm I切刻內(nèi)切酶、Nt.BspQI切刻內(nèi)切酶、Nt.AlwI切刻內(nèi)切酶、或Nt.BstNBI切刻內(nèi)切酶。
4.如權(quán)利要求1所述的基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)探針，其特征在于，所述引物-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
5.一種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括: 發(fā)卡探針、引物-1、引物-2、發(fā)卡探針甲基化試劑、依賴甲基化的內(nèi)切酶酶切試劑、環(huán)形探針連接試劑、滾換擴(kuò)增及切刻內(nèi)切酶酶切試劑、DNA酶檢測(cè)試劑， 其中，所述依賴甲基化的內(nèi)切酶酶切試劑包括依賴甲基化的內(nèi)切酶，所述環(huán)形探針連接試劑包括DNA連接酶和DNA外切酶，所述滾換擴(kuò)增及切刻內(nèi)切酶酶切試劑包括DNA聚合酶和切刻內(nèi)切酶，所述DNA酶檢測(cè)試劑包括氯高鐵血紅素以及DNA過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑； 所述發(fā)卡探針依次包括莖-1、環(huán)以及莖_2，所述莖-1、環(huán)以及莖-2均為單鏈脫氧核苷酸，所述莖-1與莖-2互補(bǔ)形成雙鏈DNA (I )，所述雙鏈DNA (I)具有甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)以及依賴甲基化的內(nèi)切酶的酶切序列，其中，所述甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)與環(huán)的末端堿基距離為2~8bp ; 所述引物-1為單鏈脫氧核苷酸，所述引物-1具有至少一個(gè)片段A，所述片段A的5’端或3’端具有切刻內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的互補(bǔ)序列，所述片段A的核苷酸序列與DNA酶序列互補(bǔ)，其中，所述DNA酶序列為具有氯高鐵血紅素結(jié)合位點(diǎn)的多G核苷酸序列；所述引物-1還具有與所述發(fā)卡探針的部分核苷酸序列互補(bǔ)的序列，所述引物-2為單鏈脫氧核苷酸，所述引物-2與所述引物-1兩端的核苷酸序列互補(bǔ)。
6.如權(quán)利要求5所述的基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述發(fā)卡探針的雙鏈DNA(I)具有甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)以及依賴甲基化的內(nèi)切酶的酶切序列中，所述甲基化酶為Dam甲基化酶或M.Sss I甲基化酶，所述依賴甲基化的內(nèi)切酶為Dpn I內(nèi)切酶。
7.如權(quán)利要求5所述的基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述引物-1中，所述DNA酶序列為如SEQ ID NO:1~5所示的核苷酸序列；所述DNA酶序列的5，端或3，端的切刻內(nèi)切酶為Nt.BspQI切刻內(nèi)切酶、Nt.AlwI切刻內(nèi)切酶、Nb.Bsm I切刻內(nèi)切酶或Nt.BstNBI切刻內(nèi)切酶。
8.如權(quán)利要求5所述的基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述引物-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
9.如權(quán)利要求5所述的基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述DNA過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑包括3-氨基鄰苯二甲酰肼、硝酸雙-N-甲基吖啶翁、2，4，5-三苯基咪唑、3，4，5-三羥基苯甲酸、雙(2，4，6-三氯苯基)草酸鹽或2，2'-氨基-二(3-乙基_苯并噻唑啉-6-磺酸)。
10.一種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)提供發(fā)卡探針、引物-1、引物-2、發(fā)卡探針、引物-1、引物_2、發(fā)卡探針甲基化試劑、依賴甲基化的內(nèi)切酶酶切試劑、環(huán)形探針連接試劑、滾換擴(kuò)增及切刻內(nèi)切酶酶切試劑、DNA酶檢測(cè)試劑， 其中，所述依賴甲基化的內(nèi)切酶酶切試劑包括依賴甲基化的內(nèi)切酶，所述環(huán)形探針連接試劑包括DNA連接酶和DNA外切酶，所述滾換擴(kuò)增及切刻內(nèi)切酶酶切試劑包括DNA聚合酶和切刻內(nèi)切酶，所述DNA酶檢測(cè)試劑包括氯高鐵血紅素以及DNA過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑； 所述發(fā)卡探針依次包括莖-1`、環(huán)以及莖_2，所述莖-1、環(huán)以及莖-2均為單鏈脫氧核苷酸，所述莖-1與莖-2互補(bǔ)形成雙鏈DNA (I )，所述雙鏈DNA (I)具有Dam甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)以及所述Dpn I內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，其中，所述甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)與環(huán)的末端堿基距離為2~8bp ; 所述引物-1為單鏈脫氧核苷酸，所述引物-1具有至少一個(gè)片段A，所述片段A的5’端或3’端具有切刻內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的互補(bǔ)序列，所述片段A的核苷酸序列與DNA酶序列互補(bǔ)，其中，所述DNA酶序列為具有氯高鐵血紅素結(jié)合位點(diǎn)的多G核苷酸序列；所述引物-1還具有與所述發(fā)卡探針的部分核苷酸序列互補(bǔ)的序列，所述引物-2為單鏈脫氧核苷酸，所述引物-2與所述引物-1兩端的核苷酸序列互補(bǔ) '及 2)取待測(cè)甲基化酶樣品，加入所述發(fā)卡探針和發(fā)卡探針甲基化試劑進(jìn)行甲基化反應(yīng)，得到含甲基化的發(fā)卡探針產(chǎn)物；及 3)將所得含甲基化的發(fā)卡探針產(chǎn)物加入依賴甲基化的內(nèi)切酶酶切試劑進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到單鏈DNA，所述單鏈DNA與引物-1的部分序列互補(bǔ)；及 4)將引物-1和引物-2混合，用環(huán)形探針連接試劑進(jìn)行退火、連接、酶切處理，得到環(huán)形探針；及 5)取步驟3)所得的單鏈DNA和步驟4)所得的環(huán)形探針混合，加入滾換擴(kuò)增及切刻內(nèi)切酶酶切試劑，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增和酶切反應(yīng)，得到切刻內(nèi)切酶的酶切產(chǎn)物；及 6)取所得切刻內(nèi)切酶的酶切產(chǎn)物加入DNA酶檢測(cè)試劑，并檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)。
11.一種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的甲基化酶檢測(cè)方法，用于檢測(cè)待測(cè)樣品中基化酶的濃度C，其特征在于，包括如下步驟: 將如權(quán)利要求10所述的基于DNA過(guò)氧化物酶的甲基化酶檢測(cè)方法所得的化學(xué)發(fā)光信號(hào)代入下式Ic=147614.4+34572.31og10C 式中，Ic為所述化學(xué)發(fā)光信號(hào)的發(fā)光強(qiáng)度，所述濃度C為每毫升待測(cè)樣品中含甲基化酶的單位數(shù)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/48GK103710453SQ201310746076
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】曾亞平, 張春陽(yáng) 申請(qǐng)人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院