一種耐酸鋁的細菌菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種耐酸鋁的細菌菌株，該菌株屬于β變形桿菌亞門(β-proteobacteria)伯克氏菌屬(Burkholderia?sp.)，命名為Burkholderia?sp.SB1，并于2013年9月保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為：CGMCC?No.8396；其有益效果是，該菌株表現(xiàn)出比較強的耐酸鋁性能，對鋁有較強的吸附作用，可為進一步利用該菌株對被鋁污染的土壤的改良提供了良好的微生物材料。
【專利說明】一種耐酸鋁的細菌菌株
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明涉及微生物領域的細菌，具體地說是一種耐酸鋁的細菌菌株。
【背景技術】:
[0002]鋁是生物正常生長的非必需元素，在微酸性和中性土壤中，鋁主要以三價氧化態(tài)和穩(wěn)定的礦物質形式存在，表現(xiàn)出極低的生物有效性。但是，隨著土壤pH的降低，鋁可逐漸解離，以離子態(tài)釋放到土壤溶液中，成為有活性的單體形式(monomeric Al)，對土壤生物存在非常大的毒害作用。近年來，隨著酸性沉降和化學肥料的大量使用，酸性紅壤中活性鋁濃度呈持續(xù)升高趨勢，已嚴重影響到農作物的生長。這種污染現(xiàn)狀，已引起了學術界廣泛的關注。
[0003]如何降低土壤中鋁的毒害，提高農作物的產量、減少其對其他環(huán)境的危害，一直是紅壤區(qū)域綜合治理與生態(tài)恢復技術研究中的一個重要課題。傳統(tǒng)上，人們常用石灰和肥料等對土壤進行改良，旨在為作物生長創(chuàng)造適宜的土壤條件。施用石灰和肥料雖能減輕或防治表土的酸鋁所產生的作物生長障礙問題，但對于深底層土壤施用石灰或肥料既有困難也不經濟，而且這些措施需要投入大量的人力、物力和財力，且不能一勞永逸，難以取得良好的經濟效益和生態(tài)效益。
[0004]近年來，隨著 一些耐鋁微生物的發(fā)現(xiàn)，將馴化時間短、鋁離子吸附快、環(huán)境適應性強的微生物用于紅壤鋁毒的改良已日益受到人們的關注。

【發(fā)明內容】
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[0005]本發(fā)明要解決的技術問題是，尋找分離出一種耐酸鋁的微生物細菌菌株。
[0006]本發(fā)明的技術解決方案是，在紅壤土中分離出一種耐酸鋁的細菌菌株，該菌株屬于β變形桿菌亞門(β-proteobacteria)伯克氏菌屬(Burkholderia sp.),命名為Burkholderia sp.SBl,并于2013年9月保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為:CGMCC N0.8396。
[0007]該菌株的生物學特性為:革蘭氏陰性，最適宜在pH值為5.0，溫度為37°C環(huán)境下生長；有較強的耐酸性；具有對氨芐青霉素、四環(huán)素以及硫鏈霉素的聯(lián)合抗性。該菌在生長初期，高濃度鋁會影響細菌的生長，但在其生長中后期表現(xiàn)出很強的耐鋁能力，明顯表現(xiàn)出對鋁的吸附特性。
[0008]本發(fā)明所涉及的耐酸鋁的細菌菌株是通過以下方法分離篩選得到的:
[0009](I)在江西省吉安市境內采集的新鮮紅壤土樣本，在樣本內取5g鮮土加入IOmL無菌水配成土壤溶液；取ImL 土壤溶液于99mL滅菌GM液體培養(yǎng)基中，并在培養(yǎng)基中添加50 μ L lmol/L無菌AlCl3.6H20溶液、放置溫度37°C，振動頻率為260rpm/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15h。
[0010](2)取步驟⑴中獲得的菌液lmL，加到裝有滅菌的99mL液體GM培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，培養(yǎng)基中外加IOOuL lmol/L AlCl3.6H20溶液，放置溫度為37°C，振動頻率為260r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15h。
[0011](3)取步驟⑵中獲得的菌液5份，每份各lmL，分別加到裝有滅菌的99ml液體GM培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，每份培養(yǎng)基中外加鋁濃度分別為2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/LU0mmol/L AlCl3.6H20溶液，并依次編號為1_5號樣本，放置溫度37°C，振動頻率為260rpm/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15h。
[0012](4)對步驟(3)中的獲得的5份富集菌液，各取出ImL建立5份菌液樣本，并分別對這5份菌液進行梯度稀釋，稀釋梯度依次為原液、10_1、10_2、10_3、10_4;并相應編號為1-5號樣本，對稀釋后的5份菌液，各取0.1mL所得的稀釋液分別涂布于含有與步驟(3)相對應的鋁濃度的GM固體培養(yǎng)基平板上，在溫度為37°C環(huán)境下培養(yǎng)2d。結果在涂布在GM固體培養(yǎng)基平板上的3-5號樣本沒有發(fā)現(xiàn) 單菌落，而在1-2號樣本中分離篩選出本發(fā)明Burkholderia sp.SBl0
[0013](5)用已滅菌的移液槍頭從2號樣本中挑取8個較大而且獨立的菌落，分別劃線于8個含鋁濃度為4mmol/L AlCl3.6Η20的平板上，在溫度37°C環(huán)境下培養(yǎng)2d。將純化后的單菌于含4mmol/L Al3+濃度培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。獲得菌液部分保種于_80°C冰箱內，部分保存于4°C冰箱內用于后續(xù)實驗。
[0014]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:該菌株表現(xiàn)出比較強的耐酸鋁性能，對鋁有較強的吸附作用，可為進一步利用該菌株對被鋁污染的土壤的改良提供了良好的微生物材料。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0015]圖1為本發(fā)明一種耐酸鋁的細菌菌株利用16SrDNA同源序列和鄰接法(Neighbor-Joining)構建的系統(tǒng)發(fā)育樹圖；
[0016]圖2為本發(fā)明一種耐酸鋁的細菌菌株在不同鋁處理濃度細菌SBl生長的影響曲線對比圖；
[0017]圖3為本發(fā)明一種耐酸鋁的細菌菌株pH對菌株SBl生長的影響柱狀對比圖；
[0018]圖4為本發(fā)明一種耐酸鋁的細菌菌株細菌的抗藥性分析對比圖；
[0019]圖5為本發(fā)明一種耐酸鋁的細菌菌株不同溫度對細菌生長的影響對比分析圖；
[0020]圖6為本發(fā)明一種耐酸鋁的細菌菌株菌株SBl對鋁的吸附柱狀對比圖。
【具體實施方式】:
[0021]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍不僅限于此。
[0022]實施例一菌株SBl的分離:
[0023](I)于江西省吉安市境內采集新鮮紅壤土樣本，該土壤樣本的基本理化性質為pH:4.46,包含有 OM/:17.8g/kg \ AN/:127.5mg/kg S AP/:4.05mg/kg \ AK/:48.5mg/kg SEC/0.15dS/m 1, Monomeric Al:42.6 μ mol/L。在樣本內取 5g 鮮土加入 IOmL 無菌水配成土壤溶液；取ImL 土壤溶液于99mL滅菌GM液體培養(yǎng)基中。隨后在培養(yǎng)基中添加50 μ L lmol/L無菌AlCl3.6H20溶液、置37°C、振動頻率為260rpm/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15h。
[0024]上述GM培養(yǎng)基為:葡萄糖10g，蛋白胨0.5g，酵母提取物0.2g，硫酸鎂(MgSO4.7H20) 0.2g，定容至 1000mL, ρΗ5.0 的溶液瓶內。
[0025](2)取步驟⑴中獲得的菌液lmL，加到裝有滅菌的99ml液體GM培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，培養(yǎng)基中外加lOOuLlmol/L AlCl3.6H20溶液，置入溫度為37°C，振動頻率為260rpm/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15h。
[0026](3)取步驟⑵中獲得的菌液5份，每份各lmL，分別加到裝有滅菌的99ml液體GM培養(yǎng)基的250mL維形瓶中，每份培養(yǎng)基中分別外加2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、IOmmoI/L AlCl3.6H20的鋁濃度液，并依次編號為1_5號樣本，置入溫度為37°C，振動頻率為260r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15h。
[0027](4)對步驟(3)中獲得的5份富集菌液，各取出ImL建立5份菌液樣本，并相應編號為1-5號，對這1-5號的5份菌液樣本分別進行梯度稀釋，稀釋梯度依次為原液、10'10_2、10_3、10_4 ;對稀釋后的5份菌液各取0.1mL分別涂布于含有與步驟(3)中相應鋁濃度2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10mmol/L AlCl3.6H20 的 GM 固體培養(yǎng)基平板上，在 37°C溫度環(huán)境下培養(yǎng)2d。結果在3-5號菌液內沒有發(fā)現(xiàn)單菌落，而在1-2號菌液內發(fā)現(xiàn)有單菌落。
[0028]上述GM固體培養(yǎng)基為在GM液體培養(yǎng)基內加入1.5%瓊脂粉而成。
[0029](5)用已滅菌的移液槍頭從步驟⑷中的2號菌液，即鋁濃度為4mmol/L的GM固體培養(yǎng)基平板上挑取8個較大而且獨立的菌落，分別劃線于8個含4mmol/L AlCl3.6H20的平板上，在37°C溫度環(huán)境下培養(yǎng)2d。將純化后的單菌于含4mmol/LAl3+濃度培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。獲得菌液部分保種于-80°C冰箱，部分用于后續(xù)實驗。
[0030]實施例二菌 株SBl的培養(yǎng)及分子鑒定:
[0031](I)運用巢式PCR(nested-PCR)對8株菌的16S rDNAs進行擴增。方法如下:
[0032]第一輪反應(體積25 μ L)含I μ L(大約lng)DNA為模板,0.5 μ L引物(10 μ Μ),2 μ L 的 dNTP 混合物(2.5mM)試劑，1.5 μ L MgCl2 (25mM) ,2.5μ LlOX PCR 反應緩沖液和0.2 μ LTaq DNA聚合酶(5U/μ L，Takara公司)。第一輪反應的引物為:27f(5' -AGAGT TTGATCCTGG CTCAG-3')和 1492r (5' -TACCT TGTTA CGAC TT-3' )。PCR 反應程序為:94°C預變性 5min，94°C 30s，55°C 40s，72°C lmin，共 10 個循環(huán)，最后 72°C延伸 lOmin。第二輪反應以第一輪反應的PCR產物為模板，引物為:63f (5' -CAGGC CTAAC ACATG CAAGT CS')和1389r(5/ -ACGGG CGGTG TGTAC AAG-3 ^ )。在這一輪反應中，設置30個循環(huán)，反應條件同第一輪反應。PCR結束后，產物用含I %溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳、檢測(大約1300bp長度的片段為目標片段)。
[0033](2)將巢式PCR產物分別用限制性內切核酸酶HhaI和RsaI消化(37°C，Ih)。酶切DNA片段用2 %的瓊脂糖凝膠電泳分離，經溴化乙錠染色和凝膠成像系統(tǒng)成像后，所得DNA帶型圖譜在GIS凝膠分析軟件輔助下進行人工比較分析。以基因片段多態(tài)圖譜為基礎進行聚類，聚合到一起的具有相同圖譜的克隆視為相同的基因型。每一個基因型作為一個分類操作單位(0TU, Operational Taxonomic Unit)或稱為唯一基因型。
[0034](3)將16S rDNA PCR產物用I %的瓊脂糖凝膠電泳分離并用瓊脂糖凝膠分離純化試劑盒進行純化。通過TA克隆技術將純化后的16S rDNA片段轉化到E.coli DH5 α中，氨芐青霉素及藍白斑篩選挑取陽性克隆子送生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。測序結果與GenBank數(shù)據庫中的16S rDNA序列進行比對分析，獲得最相近菌株的16SrDNA序列。通過MEGA 5.0軟件，用Neighbor-joining構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。見附圖1。
[0035](4) RDP聚類分析表明菌株SBl屬于β變形桿菌亞門(β-proteobacteria)伯克氏菌屬(Burkholderia sp.),相似性為 99%。菌株命名為 Burkholderia sp.SBl。[0036]實施例三菌株SBl在不同鋁脅迫濃度下的生長實驗:
[0037]取保存于_80°C冰箱中的菌液30 μ L分別接種于鋁處理濃度為:0、l、2、3、4mmol/LAlCl3.6H20的3mL新鮮GM培養(yǎng)基的試管中，的試管中，并將試管置入溫度37°C、振動頻率為260r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15h。且每個鋁處理濃度設置12組重復，對每組試管菌液每隔2小時分別取樣(以不接菌的培養(yǎng)基為對照)，測定其0D600值，繪制SBl菌株的生長曲線。結果顯示:在細菌生長的初期鋁的加入會影響細菌的生長，濃度越高細菌進入指數(shù)生長期的時間會延長。在細菌生長后期，鋁濃度對細菌種群數(shù)量的影響不大。低濃度的反而表現(xiàn)出一定的促進作用?？梢?，鋁對菌株SBl生長的影響主要發(fā)生在其生長初期。見附圖2。
[0038]實施例四菌株SBl耐酸性實驗:
[0039]取保存于4 °C冰箱中的菌液30yL分別接種于不同pH值且均含2mmol/LAlCl3.6H20的3mL新鮮LB培養(yǎng)基的試管中(ρΗ4.2)，于37°C、260r/min振蕩培養(yǎng)14h。pH值設為:2.2,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,4.0,4.2。14小時后取樣，測定其0D600值。結果表明:pH每降低一個單位，細菌生長會受到顯著影響，pH3.2是SBl在鋁含量為2mmol/L培養(yǎng)液中的極限pH。此外，我們以不加鋁為對照，發(fā)現(xiàn)SBl在無鋁的培養(yǎng)液中的生長情況更好?？梢姡琒Bl具有很強的耐酸性，當鋁不存在的情況下細菌能在pH2.2的培養(yǎng)液中生長。然而，鋁的存在會增加酸對細菌生長的毒害作用。見附圖3。
[0040]實施例五菌株SBl的抗藥性實驗:
[0041]取保存于4°C冰 箱中的菌液30 μ L接種于含2mmol/LAlC13.6H20的3mL新鮮LB培養(yǎng)基的試管中(PH4.2)。設5個實驗組；以不加鋁和加鋁不加抗生素為二個對照組，共7組。往5個實驗組分別加入相同濃度不同的抗生素(氨芐青霉素Amp、鹽酸四環(huán)素Tm、硫鏈霉素Str、氯霉素Cm)及抗生素組合(氨芐青霉素Amp、鹽酸四環(huán)素Tm、硫鏈霉素Str)，于37°C、260r/min振蕩培養(yǎng)14h。14小時后取樣0，測定其0D600值。結果表明(表2) =SBl表現(xiàn)出對Amp、Str和Tm三者的聯(lián)合抗性。在鋁存在時，這種抗性效應依然存在。由此可以推測SBl應該攜帶有Amp、Str和Tm抗性基因。此外，SBl還表出對Cm的敏感性。見附圖4。
[0042]實施例六菌株SBl的溫敏感性實驗:
[0043]取30 μ L保存于4°C冰箱中的菌液接種含2mmol/L AlCl3.6H20的3mL新鮮LB培養(yǎng)基的試管中(PH4.2)。共設4個不同溫度(25°C、37°C、45°C、55°C )的實驗組，各實驗組分別以不添加抗生素為對照，共8組。于相同轉速(260r/min)振蕩培養(yǎng)14h，14小時后取樣，測定其0D_值。結果表明(表1):細菌最適的生長溫度應該為37°C。高溫顯著抑制細菌的生長，細菌在45°C條件下培養(yǎng)以表現(xiàn)出顯著的抑制作用，當溫度上升至55°C時，細菌的生長幾乎完全停止。而且，從實驗結果還可以看出高溫對細菌生長的抑制作用與抗生素的存在無直接關系。此外，適當?shù)牡蜏貤l件對菌體生長的影響不大。實驗表明，細菌在25°C和37°C條件下培養(yǎng)，細菌的生長幾乎沒有影響。具體見附圖表5。
[0044]實施例七菌株SBl的鋁吸附能力實驗:
[0045]取保存于4°C冰箱中的菌液5份，每份為1.5mL，分別接種于鋁處理濃度分別為:0、
l、2、3、4mmol/L A1C13.6H20的150mL新鮮LB培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，每個濃度設置3組重復，置入溫度為37°C、振動頻率為260r/min振蕩培養(yǎng)14h。14小時后分別收集濾液和菌體(于105°C烘干)備用。[0046]將收集的濾液及烘干稱重后的菌體用于鋁含量的測定。鋁含量的測定方法采用ICP-MS法(ELAN9000，美國Perkin-Elmer公司)，樣品處理參考史芳亮等(2008)的進行。鋁工作標準溶液的配制，根據樣品中鋁含量配制工作標準溶液，用去離子水稀釋，配制成系列工作標準溶液。內標溶液稀釋，用1%硝酸將內標溶液稀釋至1.0yg*mL-l，測定時在線加入與工作標準溶液或供試品溶液混合進入ICP-MS，測定時選擇Li (6)為內標元素。儀器參數(shù)設定為功率:1.35kW，載氣流速:1.18L.min-1，采樣深度:7mm，分析模式:全定量。 [0047]鋁吸附量的計算方法:用上清液中測定的鋁離子濃度，除以菌體的干重，即得總吸附量ql (mg/g),方法如下:ql = (c0_cl) V/W*1000。c0和cl別為吸附實驗初始招離子濃度和取樣時間點時鋁離子的濃度(mg/L)…為培養(yǎng)液的體積(mL);胃為取樣時間點時菌體的干重(g)。
[0048]從附圖6可以看出，隨著鋁處理濃度的升高，菌株SBl對鋁的吸附量增多，鋁的吸附值從0.03增加到1.68mg/Kg,溶液中的招含量有下降的趨勢。說明本發(fā)明Burkholderiasp.SBl對鋁具有一定的吸附作用。然而，在高濃度下，細菌對鋁的吸附很快達到飽和。見附圖6。
【權利要求】
1.一種耐酸招的細菌菌株，該菌株屬于β變形桿菌亞門(β-proteobacteria)伯克氏菌屬(Burkholderia sp.),命名為Burkholderia sp.SBl,并于2013年9月保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為=CGMCC N0.8396。
【文檔編號】C12R1/22GK104017745SQ201310751019
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2013年12月27日 優(yōu)先權日:2013年12月27日
【發(fā)明者】賀根和, 林俊岳, 吳吉春, 張友海 申請人:井岡山大學