一種基于莖尖的銀杏染色體核型分析方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于莖尖的銀杏染色體核型分析方法；本發(fā)明采用新梢上莖尖為試驗材料，利用銀杏莖尖分生組織細胞分裂旺盛的特點，通過固定、解離、染色、壓片等步驟，對嫁接保存的銀杏良種資源染色體核型進行分析，結(jié)果準確可靠，方法簡便，易于操作，對于銀杏種質(zhì)資源的收集、分類、評價和保護具有重要意義。
【專利說明】—種基于莖尖的銀杏染色體核型分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于莖尖的銀杏染色體核型分析方法，屬于一種樹木細胞學(xué)的分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]染色體核型分析又稱組型分析，是染色體分析中的一個基本方法，是指某一個個體或種的全部染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，包括染色體的數(shù)目、大小、形狀、主縊痕和副縊痕等特征的總和。它代表了一個個體，一個種甚至一個屬或更大類型的特征。不同的物種具有不同的核型，所以核型是區(qū)別物種的基本遺傳學(xué)依據(jù)，對于研究生物遺傳變異、生物系統(tǒng)的演化、物種之間的親緣關(guān)系、某些生物的起源、遠緣雜交及染色體工程等有重要意義。自從細胞分類學(xué)萌芽以來，核型的差異被廣泛地用作確定植物間分類差別的依據(jù)。核型可以解決常規(guī)形態(tài)分類難以解決的問題，是現(xiàn)代綜合分類的重要組成部分，對裸子植物和被子植物的細胞遺傳學(xué)等具有重要意義。目前，在許多植物類群中，染色體數(shù)據(jù)如染色體數(shù)目、核型分析、染色體帶型分析、染色體組分析等已同形態(tài)特征一樣成為標準分類的基本數(shù)據(jù)。常規(guī)的染色體核型分析是以植物材料的根尖為試材，用壓片法對其染色體進行觀察分析。 [0003]銀杏是第四紀冰川的孑遺物種，是歷史的遺產(chǎn)和活化石，具有重要的經(jīng)濟、生態(tài)和文化價值。從廣義上講，銀杏目前有核用品種、觀賞品種、葉用品種、雄株品種和材用品種等五大栽培變種。目前，銀杏良種繁育和種質(zhì)保存的主要方法是“本砧嫁接”，即利用銀杏種子培育的實生苗，作為砧木，嫁接不同銀杏種質(zhì)。常規(guī)的核型分析技術(shù)因取材部位為根尖，即從砧木部位進行取材，達不到對所保存的種質(zhì)資源的核型進行分析的目的。針對常規(guī)核型分析技術(shù)在銀杏嫁接繁育的不同種質(zhì)、品種上應(yīng)用的局限性，本發(fā)明采用銀杏的莖尖作為核型分析的試材，客服了上述局限性。目前還未見到采用莖尖對銀杏嫁接繁育的不同品種或種質(zhì)進行核型分析的報道，本發(fā)明是在這樣的技術(shù)背景下提出的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種基于莖尖的銀杏染色體核型分析方法；本發(fā)明的目的是，針對銀杏良種繁育和種質(zhì)保存的主要方法是“本砧嫁接”，常規(guī)的染色體核型分析技術(shù)因取材部位為根尖，即從砧木部位進行取材，達不到對所保存的種質(zhì)資源的染色體核型進行分析的目的。為了對嫁接繁育的不同種質(zhì)、品種進行染色體核型分析，本發(fā)明采用了以下
[0005]技術(shù)方案:
[0006]( 1)取材
[0007]在銀杏生長旺盛季節(jié)的晴朗天氣，上午9:00~11:00，下午14:00~16:00，取植株新梢莖尖；由于在野外操作，注意保持材料的干凈；
[0008](2)預(yù)處理
[0009]預(yù)處理的溫度，以材料正常生長溫度為宜，溫度不宜過高。采集的材料立即放入盛有二氯苯的飽和溶液的青霉素小瓶內(nèi)處理8h ；
[0010](3)固定
[0011]將材料沖洗3~4次后放入卡諾固定液中，固定液的體積約為材料的10倍。材料不能裝太多，處理的溫度以室溫為宜；一般固定10~24h。固定后的材料可轉(zhuǎn)入70%乙醇中，于4 C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0012](4)解離
[0013]倒去固定液，用蒸餾水漂洗2~3次。在體式顯微鏡下剝離幼嫩葉取出分生組織部分，放入預(yù)熱的lmol/L HC1中，60°C水浴中解離10~12min，然后用蒸餾水漂洗2~3次；
[0014](5)染色
[0015]將材料轉(zhuǎn)置到載玻片上，加一小滴改良卡寶品紅染液，染色約lOmin。為了使染色體著色加深，可以用吸水紙把載玻片上的染液吸掉，再滴加染液復(fù)染一次；
[0016](6)壓片
[0017]在平整的桌面上，先鋪上兩層柔軟的面巾紙，上放一張吸水紙，將帶有染色的材料的載玻片放于吸水紙上。用鑷子夾取蓋玻片，先一端接觸到載玻片，然后慢慢輕放，盡量趕走氣泡；用左手手指拿吸水紙的一角壓住蓋玻片的一角，防止蓋玻片的滑動，然后用右手持一解剖針，先用針尖輕敲蓋 玻片，使材料分散均勻，后用吸水紙把多余的染液吸走，最后用針柄再敲擊蓋玻片，使細胞分散壓平；
[0018](7)鏡檢
[0019]鏡檢時先用低倍鏡如10倍鏡進行觀察，找到一個好的視野后再轉(zhuǎn)到高倍鏡如40倍鏡下觀察。看到有合適的細胞后，可滴加香柏油，轉(zhuǎn)到100倍的油鏡下觀察；觀察到有分散良好的中期染色體后，用NikonE200顯微鏡攝影，用DT2000圖像分析系統(tǒng)將圖像直接保存于電腦中。
[0020]本發(fā)明的有益效果是:
[0021](1)本發(fā)明用銀杏莖尖為染色體核型分析材料，使通過嫁接方式保留的良種、種質(zhì)的核型分析獲得成功。
[0022](2)進行核型分析時一般利用體細胞分裂中期的染色體，因為此時染色體已充分縮短而穩(wěn)定。本發(fā)明取材的時間選在上午9:00~11:00，下午14:00~16:00，在這個時間段所取的材料中期分裂相較多，染色體核型分析容易成功。
[0023](3)本發(fā)明對試驗材料的預(yù)處理時間為8h，解離時間為10~12min，此條件能獲得
最佳觀察效果。
[0024]利用上述方法對通過“本砧嫁接”保存的優(yōu)良種質(zhì)的染色核型進行分析，結(jié)果準確可靠，方法簡便，易于操作，對于銀杏種質(zhì)資源的收集、分類、評價和保護具有重要意義。
【具體實施方式】
[0025]實施例1
[0026]應(yīng)用本方法對山東農(nóng)業(yè)大學(xué)葉籽銀杏種質(zhì)資源基因庫中通過嫁接保存的28株樹齡5年的來自日本、山東等地的葉籽銀杏進行核型分析，均取得準確可靠結(jié)果，葉籽銀杏染色體核型分析的實施步驟如下:
[0027]1.藥品的配制[0028](1)飽和對二氯苯溶液的配制
[0029]稱取5g結(jié)晶放入棕色試劑瓶中，加入100ml已加熱到40~45°C的蒸餾水中，振蕩5min，靜置冷卻約lh后即可使用。該溶液在10~20°C條件下存放和處理為宜。溶液用完后，可重新加入溫?zé)嵴麴s水，如上法配制。
[0030](2)改良卡寶品紅染液的配制:
[0031 ] 原液A:3克堿性品紅溶于100ml體積分數(shù)70%酒精中。原液B:取原液AlOml，加入90ml體積分數(shù)5%的苯酚水溶液，充分混勻后，置于37°C溫箱中2~4h，此液只可保存2周。原液C，即苯酚品紅染液:取原液B45ml，加入體積分數(shù)37%的甲醛、冰醋酸各6ml充分混勻，此液可長期保存。配好以上溶液后，取原液C10~20ml，加入80~90ml體積分數(shù)45%冰醋酸和1.8克山梨醇即得改良卡寶品紅。該溶液要放置3周以上用效果才好。
[0032](3)卡諾固定液
[0033]常規(guī)的卡諾固定液為無水酒精:冰醋酸=3:1。為了進一步促進染色體的分散，對固定液進行了改進，加大了酸的用量，采用無水酒精:冰醋酸=2:1的配方，效果較理想。
[0034](4) 1N鹽酸的配制
[0035]取36.5%的濃鹽酸83ml定容至1升。
[0036]2.染色體制片
[0037]( 1)取材
[0038]在銀杏生長旺盛季節(jié)的晴朗天氣，上午9:00~11:00，下午14:00~16:00，取植株新梢莖尖；由于在野外操作，注意保持材料的干凈。
`[0039](2)預(yù)處理
[0040]預(yù)處理的溫度，以材料正常生長溫度為宜，溫度不宜過高。采集的材料立即放入盛有二氯苯的飽和溶液的青霉素小瓶內(nèi)處理8h。
[0041](3)固定
[0042]將材料沖洗3~4次后放入卡諾固定液中，固定液的體積約為材料的10倍。材料不能裝太多，處理的溫度以室溫為宜；一般固定10~24h。固定后的材料可轉(zhuǎn)入70%乙醇中，于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0043](4)解離
[0044]倒去固定液，用蒸餾水漂洗2~3次。在體式顯微鏡下剝離幼嫩葉取出分生組織部分，放入預(yù)熱的lmol/L HC1中，60°C水浴中解離10~12min，然后用蒸餾水漂洗2~3次。
[0045](5)染色
[0046]將材料轉(zhuǎn)置到載玻片上，加一小滴改良卡寶品紅染液，染色約lOmin。為了使染色體著色加深，可以用吸水紙把載玻片上的染液吸掉，再滴加染液復(fù)染一次。
[0047](6)壓片
[0048]在平整的桌面上，先鋪上兩層柔軟的面巾紙，上放一張吸水紙，將帶有染色的材料的載玻片放于吸水紙上。用鑷子夾取蓋玻片，先一端接觸到載玻片，然后慢慢輕放，盡量趕走氣泡；用左手手指拿吸水紙的一角壓住蓋玻片的一角，防止蓋玻片的滑動，然后用右手持一解剖針，先用針尖輕敲蓋玻片，使材料分散均勻，后用吸水紙把多余的染液吸走，最后用針柄再敲擊蓋玻片，使細胞分散壓平。
[0049](7)鏡檢[0050]鏡檢時先用低如10倍鏡下進行觀察，找到一個好的視野后再轉(zhuǎn)到高倍鏡如40倍鏡下觀察?？吹接泻线m的細胞后，可滴加香柏油，轉(zhuǎn)到100倍的油鏡下觀察；觀察到有分散良好的中期染色體后，用NikonE200顯微鏡攝影，用DT2000圖像分析系統(tǒng)將圖像直接保存于電腦 中。
【權(quán)利要求】
1.一種基于莖尖的銀杏染色體核型分析方法，該方法包括下述順序的步驟:(1)取材在銀杏生長旺盛季節(jié)的晴朗天氣，上午9:00~11:00，下午14:00~16:00，取植株新梢莖尖，由于在野外操作，注意保持材料的干凈；(2)預(yù)處理預(yù)處理的溫度，以材料正常生長溫度為宜，溫度不宜過高，采集的材料立即放入盛有二氯苯的飽和溶液的青霉素小瓶內(nèi)處理8h ；(3)固定將材料沖洗3~4次后放入卡諾固定液中，固定液的體積約為材料的10倍；材料不能裝太多，處理的溫度以室溫為宜；一般固定10~24h,固定后的材料可轉(zhuǎn)入70%乙醇中，于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?(4)解離倒去固定液，用蒸餾水漂洗2~3次；在體式顯微鏡下剝離幼嫩葉取出分生組織部分，放入預(yù)熱的lmol/L HC1中，60°C水浴中解離10~12min，然后用蒸餾水漂洗2~3次；(5)染色將材料轉(zhuǎn)置到載玻片上，加一小滴改良卡寶品紅染液，染色約lOmin ;為了使染色體著色加深，可以用吸水紙把載玻片上的染液吸掉，再滴加染液復(fù)染一次；(6)壓片在平整的桌面上，先鋪上兩層柔軟的面巾紙，上放一張吸水紙，將帶有染色的材料的載玻片放于吸水紙上；用鑷子夾取蓋玻片，先一端接觸到載玻片，然后慢慢輕放，盡量趕走氣泡；用左手手指拿吸水紙的一角壓住蓋玻片的一角，防止蓋玻片的滑動，然后用右手持一解剖針，先用針尖輕敲蓋玻片，使材料分散均勻，后用吸水紙把多余的染液吸走，最后用針柄再敲擊蓋玻片，使細胞分散壓平；(7)鏡檢鏡檢時先用低倍鏡如10倍鏡下進行觀察，找到一個好的視野后再轉(zhuǎn)到高倍鏡如40倍鏡下觀察?？吹接泻线m的細胞后，可滴加香柏油，轉(zhuǎn)到100倍的油鏡下觀察；觀察到有分散良好的中期染色體后，用NikonE200顯微鏡攝影，用DT2000圖像分析系統(tǒng)將圖像直接保存于電腦中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于莖尖的銀杏染色體核型分析方法，其特征在于，步驟(1)所描述的所選擇的材料及取材時間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于莖尖的銀杏染色體核型分析方法，其特征在于，步驟(2)所描述的預(yù)處理時間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于莖尖的銀杏染色體核型分析方法，其特征在于，步驟(4)所描述的解離時間。
【文檔編號】C12Q1/68GK103695557SQ201310752322
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】邢世巖, 付兆軍, 李際紅, 高進紅, 張芳, 韓晨靜, 李士美, 李保進 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)