一種人角質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為人毛囊細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人角質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化制備人毛囊細(xì)胞的方法。其技術(shù)方案：將人角質(zhì)干細(xì)胞移入裝有成分確定的角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM初始培養(yǎng)液培養(yǎng)皿中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，得到初始誘導(dǎo)的人角質(zhì)干細(xì)胞，再制備成細(xì)胞膜片備用；取小鼠胚胎期13.5天的小鼠頭部的下顎，去除下顎第一磨牙的上皮組織，取出牙間充質(zhì)干細(xì)胞組織，吹打成單細(xì)胞懸液，離心后重聚成第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)。將人角質(zhì)干細(xì)胞膜片與牙間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)重聚再植入小鼠腎包膜下繼續(xù)誘導(dǎo)分化，得到具有毛囊細(xì)胞的組織塊。本發(fā)明可成功將人角質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成人毛囊細(xì)胞，整體技術(shù)和方法既合理高效，又簡(jiǎn)便實(shí)用，人工誘導(dǎo)分化的人毛囊細(xì)胞可望通過移植到皮膚，長(zhǎng)出毛發(fā)。
【專利說明】一種人角質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為人毛囊細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種誘導(dǎo)分化細(xì)胞的方法。具體涉及一種人角質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為人毛囊細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]角質(zhì)干細(xì)胞來源于表皮基底層膜，是一種具有增殖和多向分化的潛能，能分化形成表皮各層組織，如生發(fā)層、顆粒層、透明層、角質(zhì)層等。其常處于靜息狀態(tài)，具有非成熟細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征和很強(qiáng)的自我更新能力。
[0003]毛囊與牙齒等器官的發(fā)育在最初期都具有相同的發(fā)育模式，即上皮組織受到間充質(zhì)組織的誘導(dǎo)后，上皮細(xì)胞不斷增殖，同時(shí)上皮向內(nèi)凹陷形成芽蕾狀結(jié)構(gòu)。在一定的條件下，角質(zhì)干細(xì)胞具有增殖和多向分化的潛能，能分化形成表皮各層組織，而后表皮在間充質(zhì)組織的誘導(dǎo)作用下向內(nèi)凹陷形成毛芽，進(jìn)一步誘導(dǎo)分化形成毛囊細(xì)胞。
[0004]目前角質(zhì)干細(xì)胞目前已大量應(yīng)用于組織工程皮膚的構(gòu)建。角質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成為毛囊細(xì)胞成功的報(bào)道很少。本發(fā)明人角干質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為人毛囊細(xì)胞的的整體技術(shù)和方法既合理高效，又簡(jiǎn)便實(shí)用，有較高的誘導(dǎo)分化的轉(zhuǎn)化率。未來人工誘導(dǎo)分化的人毛囊細(xì)胞可以通過移植到皮膚，長(zhǎng)出毛發(fā)，這項(xiàng)技術(shù)有望應(yīng)用于治療禿頭癥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是以人角質(zhì)干細(xì)胞為材料，經(jīng)復(fù)合生長(zhǎng)因子和小鼠下顎磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合誘導(dǎo)分化為人毛囊細(xì)胞。人工誘導(dǎo)分化的人毛囊細(xì)胞可望通過移植到人的頭皮皮膚，長(zhǎng)出毛發(fā)。
[0006]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的采用的技術(shù)方案包括下述步驟:
1.將人角質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇后，移入預(yù)先裝有成分確定的角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM初始培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中；將培養(yǎng)皿放置在37°C、5%濃度的CO2氣體培養(yǎng)箱進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；當(dāng)人角質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)占據(jù)培養(yǎng)皿底面積的50~60%時(shí)，按照復(fù)合生長(zhǎng)因子:成分確定的角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM初始培養(yǎng)液=1: 1000的體積比配制誘導(dǎo)培養(yǎng)液，把培養(yǎng)皿原有的成分確定的角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM初始培養(yǎng)液替換為誘導(dǎo)培養(yǎng)液，進(jìn)行初始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間24小時(shí)，得到初始誘導(dǎo)的人角質(zhì)干細(xì)胞，再制備成細(xì)胞膜片備用。
[0007]所述的復(fù)合生長(zhǎng)因子，按其重量份組成為:每I ml復(fù)合生長(zhǎng)因子中含有人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8 (FGF8)30~50 mg、人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10 (FGFlO)50~lOOmg、人骨形成蛋白4 (BMP4) 30~50mg、人刺猬蛋白(SHH) 50~lOOmg。
[0008]2.小鼠下顎第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)制備:切取小鼠胚胎期13.5天的小鼠頭部的下顎，在2.0 U/ml的中性蛋白酶中消化30分鐘。此時(shí)下顎第一磨牙的牙上皮與間充質(zhì)不再緊密相連，于體式顯微鏡下去除下顎第一磨牙的上皮組織，取出下顎第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞組織，下顎第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞組織在高糖Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Deulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)中吹打成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板取I~2X IO6個(gè)細(xì)胞，200 X g離心5分鐘，重聚成第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)。
[0009]3.將備用的初始誘導(dǎo)的人角質(zhì)干細(xì)胞膜片，與分離好的小鼠頭部的下顎第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)體外重聚成嵌合細(xì)胞塊，再將嵌合細(xì)胞塊植入Balb/c免疫缺陷小鼠腎包膜下繼續(xù)進(jìn)行為期14天的誘導(dǎo)分化，得到含有毛囊細(xì)胞的毛囊細(xì)胞組織塊。
[0010]將上述得到的具有毛囊細(xì)胞的組織塊取出，經(jīng)過常規(guī)的固定，脫水，透明，透蠟、包埋、切片后，進(jìn)行蘇木精/伊紅染色，置于100倍顯微鏡視野下觀察，可見具有毛囊細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的毛囊細(xì)胞。
[0011]將上述得到的具有毛囊細(xì)胞的組織塊進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)小鼠主組織相容性復(fù)合蛋白和人角蛋白14的表達(dá)，證明毛囊細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的毛囊細(xì)胞由人角質(zhì)干細(xì)胞分化而來。
[0012]所述的人角質(zhì)干細(xì)胞購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC? PCS-200-010?)。成分確定的角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM培養(yǎng)液購自生命技術(shù)公司(Life technologies)。
[0013]所述的人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8 (FGF8)、人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10 (FGF10)、人骨形成蛋白4 (BMP4)和人刺猬蛋白(SHH)購自于R&D系統(tǒng)公司(R&D Systems)。
[0014]所述的高糖Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基購自生命技術(shù)公司(Lifetechnologies)。
[0015]參照本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，其過程是僅添加復(fù)合生長(zhǎng)因子進(jìn)行初始誘導(dǎo)或僅與小鼠頭部的下顎第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)體外重聚，所得到的細(xì)胞或嵌合細(xì)胞塊移植Balb/c免疫缺陷小鼠腎包膜下14天后取出，采用常規(guī)的固定，脫水，透明，透蠟、包埋、切片后，進(jìn)行蘇木精/伊紅染色，置于100倍顯微鏡視野下觀察，都未見具有毛囊細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的毛囊細(xì)胞，表明僅添加復(fù)合生長(zhǎng)因子進(jìn)行初始誘導(dǎo)或僅與小鼠頭部的下顎第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)體外重聚，移植Balb/c免疫缺陷小鼠腎包膜下14天后取出，人角質(zhì)干細(xì)胞都不能形成毛囊細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中人角質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過體外誘導(dǎo)分化后形成的毛囊細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)圖。
[0017]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中人角質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過體外誘導(dǎo)分化后檢測(cè)到的小鼠主組織相容性復(fù)合蛋白的表達(dá)圖。
[0018]圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中人角質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過體外誘導(dǎo)分化后檢測(cè)到的人角蛋白14的表達(dá)圖。
[0019]圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中人角質(zhì)干細(xì)胞僅進(jìn)行初始誘導(dǎo)，移植Balb/c免疫缺陷小鼠腎包膜下14天后的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)圖。
[0020]圖5是本發(fā)明實(shí)施例2中人角質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過體外誘導(dǎo)分化后形成的毛囊細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)或組織塊中小鼠主組織相容性復(fù)合蛋白和人角蛋白14的表達(dá)情況圖。
[0021]圖6是本發(fā)明實(shí)施例2中人角質(zhì)干細(xì)胞只與小鼠下顎第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)體外重聚，移植Balb/c免疫缺陷小鼠腎包膜下14天后的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)圖?！ぁ揪唧w實(shí)施方式】[0022]為了更為清楚地了解本發(fā)明的技術(shù)方案，現(xiàn)結(jié)合附圖做進(jìn)一步的說明。
[0023]圖1中，白色箭頭所示的為毛囊細(xì)胞，毛囊細(xì)胞緊密包裹在空洞性蜂窩狀的毛髓質(zhì)周圍，與其共同形成明顯可見的毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)。
[0024]圖2中，本發(fā)明采用了免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)了具有毛囊細(xì)胞的組織塊中小鼠主組織相容性復(fù)合蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示非毛囊細(xì)胞(小鼠組織來源)呈現(xiàn)棕色，毛囊細(xì)胞(人組織來源)未呈現(xiàn)棕色，證明所誘導(dǎo)形成的毛囊細(xì)胞來源于人組織，是由人角質(zhì)干細(xì)胞分化而來。
[0025]圖3中，本發(fā)明采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)了具有毛囊細(xì)胞的組織塊中人角蛋白14的表達(dá)情況。結(jié)果顯示毛囊細(xì)胞呈現(xiàn)棕色，證明所誘導(dǎo)形成的毛囊細(xì)胞來源于人組織，是由人角質(zhì)干細(xì)胞分化而來。
[0026]圖4中，本發(fā)明驗(yàn)證試驗(yàn)了僅進(jìn)行初始誘導(dǎo)但并未與小鼠下顎第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)體外重聚的人角質(zhì)干細(xì)胞移植Balb/c免疫缺陷小鼠腎包膜下14天后無毛囊細(xì)胞特征，表明未能被誘導(dǎo)分化成毛囊細(xì)胞。
[0027] 圖5中，A圖是在100倍顯微鏡下拍攝的人角質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過體外誘導(dǎo)分化后形成的毛囊細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)圖是免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)了具有毛囊細(xì)胞的組織塊中小鼠主組織相容性復(fù)合蛋白的表達(dá)情況，C圖是免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)了具有毛囊細(xì)胞的組織塊中人角蛋白14的表達(dá)情況。
[0028]圖6中，本發(fā)明驗(yàn)證試驗(yàn)了人角質(zhì)干細(xì)胞未經(jīng)過初始誘導(dǎo)，僅與小鼠下顎第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)體外重聚，移植Balb/c免疫缺陷小鼠腎包膜下14天后無毛囊細(xì)胞特征，表明未能被誘導(dǎo)分化成毛囊細(xì)胞。
[0029]實(shí)施例1
1.人角質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)與初始誘導(dǎo):將人角質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇后，取人角質(zhì)干細(xì)胞置于預(yù)先裝有成分確定的角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM初始培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放置在37°C、5%濃度的CO2氣體培養(yǎng)箱進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；當(dāng)人角質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)占據(jù)培養(yǎng)皿底面積50%時(shí)，按照復(fù)合生長(zhǎng)因子:成分確定的角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM培養(yǎng)液=1: 1000的體積t匕，配制誘導(dǎo)培養(yǎng)液；把培養(yǎng)皿原有的成分確定的角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM初始培養(yǎng)液替換為誘導(dǎo)培養(yǎng)液，誘導(dǎo)24小時(shí)后，得到初始誘導(dǎo)的人角質(zhì)干細(xì)胞，再制備成細(xì)胞膜片備用。
[0030]復(fù)合生長(zhǎng)因子其組成為:每I ml復(fù)合生長(zhǎng)因子中含有人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8(FGF8)為50mg、人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10 (FGFlO) lOOmg、人骨形成蛋白4 (BMP4) 50mg、人刺猬蛋白(SHH) IOOmgo
[0031]2.小鼠下顎第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)制備:取小鼠胚胎期13.5天的小鼠頭部的下顎，在2.0 U/ml的中性蛋白酶中消化30分鐘。此時(shí)第一磨牙的牙上皮與間充質(zhì)不再緊密相連，于體式顯微鏡下去除下顎第一磨牙的上皮組織，取出牙間充質(zhì)干細(xì)胞組織，間充質(zhì)干細(xì)胞組織在高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基(Deulbecco，s Modified Eagle Medium,DMEM)中吹打成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板取IX IO6個(gè)細(xì)胞，200 Xg離心5分鐘，重聚成第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)。
[0032]3.將備用的初始誘導(dǎo)的人角質(zhì)干細(xì)胞膜片，與分離好的小鼠頭部的下顎第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)體外重聚成嵌合細(xì)胞塊，再將嵌合細(xì)胞塊植入Balb/c免疫缺陷小鼠腎包膜下繼續(xù)進(jìn)行為期14天的誘導(dǎo)分化，得到具有毛囊細(xì)胞的組織塊。[0033]4.毛囊細(xì)胞的檢測(cè)
I)將嵌合細(xì)胞塊植入Balb/c免疫缺陷小鼠腎包膜下誘導(dǎo)分化14天后取出，得到具有毛囊細(xì)胞的組織塊，經(jīng)過常規(guī)的固定，脫水，透明，透蠟、包埋、切片后，進(jìn)行蘇木精/伊紅染色。結(jié)果如圖1所示,在圖1中可見毛囊細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的毛囊細(xì)胞。
[0034]2)進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)在具有毛囊細(xì)胞的組織塊中小鼠主組織相容性復(fù)合蛋白(Major Histocompatibility Complex,MHC)的表達(dá)情況,非毛囊細(xì)胞(小鼠組織來源)呈現(xiàn)棕色，毛囊細(xì)胞(人組織來源)未呈現(xiàn)棕色，證明所形成的毛囊細(xì)胞來源于人組織，是由人角質(zhì)干細(xì)胞分化而來。結(jié)果如圖2所示，在圖2中可見非毛囊細(xì)胞呈現(xiàn)出棕色，而毛囊細(xì)胞不顯棕色，說明毛囊細(xì)胞中不會(huì)表達(dá)小鼠主組織相容性復(fù)合蛋白，排除其是小鼠細(xì)胞分化而來的可能性。
[0035]進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)在具有毛囊細(xì)胞的組織塊中人角蛋白14的表達(dá)。結(jié)果如圖3所示，在圖3中可見毛囊細(xì)胞呈現(xiàn)棕色，證明誘導(dǎo)而來的毛囊細(xì)胞能表達(dá)人角蛋白14，是人源性的細(xì)胞。
[0036]參照本實(shí)施例的技術(shù)方案進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，其過程如下:
1.人角質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)與初始誘導(dǎo):將人角質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇后，取人角質(zhì)干細(xì)胞置于預(yù)先裝有成分確定的角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM初始培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放置在37°C、5%濃度的CO2氣體培養(yǎng)箱進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；當(dāng)人角質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)占據(jù)培養(yǎng)皿底面積的50~60%時(shí)，按照復(fù)合生長(zhǎng)因子:成分確定的角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM初始培養(yǎng)液=1:1000的體積比配制誘導(dǎo)培養(yǎng)液，把培養(yǎng)皿原有的成分確定的角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM初始培養(yǎng)液替換為誘導(dǎo)培養(yǎng)液，進(jìn)行初始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間24小時(shí)，得到初始誘導(dǎo)的人角質(zhì)干細(xì)胞，再制備成細(xì)胞膜片。將制備得到的細(xì)胞膜片移植Balb/c免疫缺陷小鼠腎包膜下14天后取出；經(jīng)過常規(guī)的固定，脫水，透明，透蠟、包埋、切片后，進(jìn)行蘇木精/伊紅染色，未見毛囊細(xì)胞特征，表明上述過程未能誘導(dǎo)分化出毛囊細(xì)胞，結(jié)果如圖4所示。
[0037]實(shí)施例2
1.人角質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)與初始誘導(dǎo):將人角質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇后，取人角質(zhì)干細(xì)胞置于預(yù)先裝有成分確定的角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM初始培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放置在37°C、5%濃度的CO2氣體培養(yǎng)箱進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；當(dāng)人角質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)占據(jù)培養(yǎng)皿底面積50%時(shí)，按照復(fù)合生長(zhǎng)因子:成分確定的角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM培養(yǎng)液=1: 1000的體積t匕，配制誘導(dǎo)培養(yǎng)液；把培養(yǎng)皿原有的成分確定的角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM初始培養(yǎng)液替換為誘導(dǎo)培養(yǎng)液，誘導(dǎo)24小時(shí)后，得到初始誘導(dǎo)的人角質(zhì)干細(xì)胞，再制備成細(xì)胞膜片備用。
[0038]復(fù)合生長(zhǎng)因子其組成為:每I ml復(fù)合生長(zhǎng)因子中含有人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8(FGF8)為30mg、人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10 (FGFlO) 50mg、人骨形成蛋白4 (BMP4)30mg、人刺猬蛋白(SHH) 50mg。 [0039]2.小鼠下顎第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)制備:取小鼠胚胎期13.5天的小鼠頭部的下顎，在2.0 U/ml的中性蛋白酶中消化30分鐘。此時(shí)第一磨牙的牙上皮與間充質(zhì)不再緊密相連，于體式顯微鏡下去除下顎第一磨牙的上皮組織，取出牙間充質(zhì)干細(xì)胞組織，間充質(zhì)干細(xì)胞組織在高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基(Deulbecco，s Modified Eagle Medium,DMEM)中吹打成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板取2 X IO6個(gè)細(xì)胞，200 Xg離心5分鐘，重聚成第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)。[0040]3.將備用的初始誘導(dǎo)的人角質(zhì)干細(xì)胞膜片，與分離好的小鼠頭部的下顎第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)體外重聚成嵌合細(xì)胞塊，再將嵌合細(xì)胞塊植入Balb/c免疫缺陷小鼠腎包膜下繼續(xù)進(jìn)行為期14天的誘導(dǎo)分化，得到具有毛囊細(xì)胞的組織塊。
[0041]4.毛囊細(xì)胞的檢測(cè)
I)將嵌合細(xì)胞塊植入Balb/c免疫缺陷小鼠腎包膜下誘導(dǎo)分化14天后取出，得到具有毛囊細(xì)胞的組織塊，經(jīng)過常規(guī)的固定，脫水，透明，透蠟、包埋、切片后，進(jìn)行蘇木精/伊紅染色。結(jié)果如圖5中的A所示，圖中可見毛囊細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的毛囊細(xì)胞。
[0042]2)進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)在具有毛囊細(xì)胞的組織塊中小鼠主組織相容性復(fù)合蛋白(Major Histocompatibility Complex,MHC)的表達(dá)情況,非毛囊細(xì)胞(小鼠組織來源)呈現(xiàn)棕色，毛囊細(xì)胞(人組織來源)未呈現(xiàn)棕色，證明所形成的毛囊細(xì)胞來源于人組織，是由人角質(zhì)干細(xì)胞分化而來。結(jié)果如圖5中的B所示，圖中可見非毛囊細(xì)胞呈現(xiàn)出棕色，而毛囊細(xì)胞不顯棕色，說明毛囊細(xì)胞中不會(huì)表達(dá)小鼠主組織相容性復(fù)合蛋白，排除其是小鼠細(xì)胞分化而來的可能性。
[0043]進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)在具有毛囊細(xì)胞的組織塊中人角蛋白14的表達(dá)。結(jié)果如圖5中的C所示，圖中可見毛囊細(xì)胞呈現(xiàn)棕色，證明誘導(dǎo)而來的毛囊細(xì)胞能表達(dá)人角蛋白14，是人源性的細(xì)胞。
[0044]參照本實(shí)施例的技術(shù)方案進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，其過程如下:
1.人角質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)與初始誘導(dǎo):將人角質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇后，取人角質(zhì)干細(xì)胞置于預(yù)先裝有成分確定的角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM初始培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放置在37°C、5%濃度的CO2氣體培養(yǎng)箱進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；當(dāng)人角質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)占據(jù)培養(yǎng)皿底面積的50~60%時(shí)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，再制備成細(xì)胞膜片。將制備得到的細(xì)胞膜片與分離好的小鼠頭部的下顎第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)體外重聚成嵌合細(xì)胞塊，再將嵌合細(xì)胞塊植入Balb/c免疫缺陷小鼠腎包膜下14天后取出；經(jīng)過常規(guī)的固定，脫水，透明，透蠟、包埋、切片后，進(jìn)行蘇木精/伊紅染色，·未見毛囊細(xì)胞特征，表明上述過程未能誘導(dǎo)分化出毛囊細(xì)胞，結(jié)果如圖6所不。
【權(quán)利要求】
1.一種人角質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為人毛囊細(xì)胞的方法，其特征在于: 1)將人角質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇后，移入預(yù)先裝有成分確定的角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM初始培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中；將培養(yǎng)皿放置在CO2氣體培養(yǎng)箱進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；當(dāng)人角質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)占據(jù)培養(yǎng)皿底面積的50~60%時(shí)，將初始培養(yǎng)液替換為誘導(dǎo)培養(yǎng)液，進(jìn)行初始誘導(dǎo)，得到初始誘導(dǎo)的人角質(zhì)干細(xì)胞，再制備成細(xì)胞膜片備用； 2)切取小鼠胚胎期13.5天的小鼠頭部的下顎，在2.0 U/ml的中性蛋白酶中消化30分鐘，于體式顯微鏡下去除下顎第一磨牙的上皮組織，取出下顎第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞組織；將下顎第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞組織在高糖Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中吹打成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板取I~2 X IO6個(gè)細(xì)胞，200 X g離心5分鐘，重聚成第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)； 3)將備用的初始誘導(dǎo)的人角質(zhì)干細(xì)胞膜片，與分離好的小鼠頭部的下顎第一磨牙間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)體外重聚成嵌合細(xì)胞塊，再將嵌合細(xì)胞塊植入Balb/c免疫缺陷小鼠腎包膜下繼續(xù)進(jìn)行誘導(dǎo)分化，得到含有毛囊細(xì)胞的毛囊細(xì)胞組織塊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人角質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為人毛囊細(xì)胞的方法，其特征在于所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)液是按照復(fù)合生長(zhǎng)因子:成分確定的角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM培養(yǎng)液=1: 1000的體積比進(jìn)行配制的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種人角質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為人毛囊細(xì)胞的方法，其特征在于所述的復(fù)合生長(zhǎng)因子，按其重量份組成為:每I ml復(fù)合生長(zhǎng)因子中含有人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8為30~50 mg、人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10為50~lOOmg、人骨形成蛋白4為30~50mg、人刺猬蛋白為50~IOOmg0`
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人角質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為人毛囊細(xì)胞的方法，其特征在于所述的初始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間24小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人角質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為人毛囊細(xì)胞的方法，其特征在于所述的誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)分化時(shí)間14天。
【文檔編號(hào)】C12N5/074GK103667180SQ201310754832
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】黃鎮(zhèn), 張彥定, 陳素珠, 林鑫 申請(qǐng)人:福建師范大學(xué)