高密度發(fā)酵生產普魯蘭多糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公布了一種高密度發(fā)酵生產普魯蘭多糖的方法，屬于微生物發(fā)酵領域。為了解決傳統(tǒng)優(yōu)化調控方法中的不足，進一步增加普魯蘭多糖產量，提高普魯蘭多糖發(fā)酵過程中的效率，降低發(fā)酵過程中色素的產生，本發(fā)明通過兩階段調控pH和溶氧，從而實現(xiàn)高密度發(fā)酵，將普魯蘭多糖產量提高50%以上，而且在一定程度上降低了色素的產生，為后續(xù)提取減少了麻煩，進一步降低了普魯蘭多糖的成本。
【專利說明】高密度發(fā)酵生產普魯蘭多糖的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領域，具體涉及一種高密度發(fā)酵生產普魯蘭多糖的方法，特別涉及一種兩階段調控PH和溶氧來生產普魯蘭多糖的方法。
【背景技術】
[0002]微生物多糖主要指大部分細菌、少量的真菌和藻類產生的多糖。由于具有安全性高、副作用小、理化特性獨特等優(yōu)點且生產周期短，不受季節(jié)、地域、病蟲害等條件的限制而使其在食品和非食品工業(yè)備受關注，尤其在醫(yī)藥領域具有巨大的應用潛力。常見的微生物多糖有:黃原膠、結冷膠、熱凝膠、普魯蘭多糖等。
[0003]微生物多糖發(fā)酵大部分屬于高粘度發(fā)酵，由于微生物多糖多屬于次級代謝產物，在微生物處于穩(wěn)定期開始大量產生，所以目前研究提高微生物多糖產量的方法基本上都是將微生物多糖發(fā)酵分為兩個階段:第一階段是通過優(yōu)化條件使菌體大量產生；第二階段是菌體進入穩(wěn)定期以后通過改變條件使多糖大量產生。
[0004]高密度發(fā)酵采用兩階段工藝，一方面可以減少菌體培養(yǎng)階段的設備規(guī)模，節(jié)省大型發(fā)酵罐在發(fā)酵過程中的功率消耗和能量消耗，另一方面可以提高細胞培養(yǎng)和多糖合成的生產強度，使生產過程達到節(jié)能降耗的目的。
[0005]現(xiàn)有技術中大多都是通過菌種誘變、培養(yǎng)基優(yōu)化來提高普魯蘭多糖產量，但由于普魯蘭多糖發(fā)酵屬于高粘度發(fā)酵，在發(fā)酵后期，隨著粘度的增加，菌體對底物的利用效率大大降低，色素產生嚴重，對后續(xù)提取過程帶來了極大的不便，而通過傳統(tǒng)優(yōu)化的方法進行調控，對普魯蘭多糖產量的增加往往不是很明顯，而且發(fā)酵效率也不能得到很好提高。

【發(fā)明內容】

[0006]為了解決傳統(tǒng)優(yōu)化調控方法中的不足，進一步增加普魯蘭多糖產量，提高普魯蘭多糖發(fā)酵過程中的效率，降低發(fā)酵過程中色素的產生，本發(fā)明通過兩階段調控PH和溶氧，從而實現(xiàn)高密度發(fā)酵，大大提高普魯蘭多糖的生產強度。
[0007]本發(fā)明技術方案如下:
[0008]高密度發(fā)酵生產普魯蘭多糖的方法，通過兩階段調控pH和溶氧，第一階段使菌體大量生長，菌體得到大量的積累；第二階段改變PH和溶氧，使普魯蘭多糖大量產生。具體包括如下步驟:
[0009](I)將菌株接于種子培養(yǎng)基進行搖瓶活化，轉速為150-250rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時間為30-35小時。
[0010](2)活化后的種子培養(yǎng)液以2-5% (v/v)的量接于新的種子搖瓶中進行擴大培養(yǎng)，轉速為150-250rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時間為16-20小時。
[0011](3)將步驟(2)所得種子液以2-5% (v/v)的量接于5L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，根據菌體生長情況即OD62tl值對pH和溶氧進行調控:當菌體OD62tl < 0.7(種子干重小于12g/L)時，溶氧降至60%左右時，將溶氧與攪拌串聯(lián)，使溶氧維持在50%-60%之間，同時利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調控pH使其穩(wěn)定在2.8-3.2之間使菌體大量產生；當菌體OD620 ^ 0.7 (種子干重不小于12g/L)時，將溶氧設定在25%-30%之間，同時利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調控pH使其穩(wěn)定在4.8-5.2之間使菌體大量合成普魯蘭多糖；溫度28°C，發(fā)酵時間72-96小時。
[0012](4)每隔8小時取樣記錄測定各項指標:pH、溶氧、菌體干重、普魯蘭多糖產量。
[0013]所述菌株具體為出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans) BCSWGHPL101,于 2012年12月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號CGMCC N0.7055，分類命名出芽短梗霉 Aureobasidium pullulans。
[0014]所述菌體干重測定:準確取30mL發(fā)酵液5000rpm離心20min,去除上清,菌體蒸懼水洗滌離心2-3次，然后進行抽濾，80°C烘箱烘干稱重，此質量乘以1000除以30即粗干重，以g/L記。
[0015]所述普魯蘭多糖粗糖測定:準確取30mL發(fā)酵液15000rpm離心20min去除菌體,上清液用兩倍無水乙醇醇沉，所得沉淀烘干稱重，此質量乘以1000除以30即粗產量，以g/L記。
[0016]有益效果
[0017]本發(fā)明提供了一種生產普魯蘭多糖的方法，操作簡單，不僅解決了普魯蘭高粘度發(fā)酵過程中對底物利用率低的問題，而且增加了普魯蘭多糖的產量，提高了普魯蘭多糖的生產強度，而且在一定程度上降低了色素的產生，為后續(xù)提取減少了麻煩，進一步降低了普魯蘭多糖的成本。
【具體實施方式】
[0018]實施例1
[0019](I)將CGMCC N0.7055菌株接于種子培養(yǎng)基進行搖瓶活化，轉速為150rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時間為35小時。
[0020](2)活化后的種子培養(yǎng)液以2-5% (v/v)的量接于新的種子搖瓶中進行擴大培養(yǎng)，轉速為150rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時間為20小時。
[0021](3)將所得種子液以2-5% (v/v)的量接于5L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，根據菌體生長情況即OD62tl值對pH和溶氧進行調控:當菌體OD62tl < 0.7(種子干重小于12g/L)時，溶氧降至60%左右時，將溶氧與攪拌串聯(lián)，使溶氧維持在50%，同時利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調控PH使其穩(wěn)定在2.8之間使菌體大量產生；當菌體OD62tl ^ 0.7(種子干重不小于12g/L)時，將溶氧設定為25%，同時利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調控pH使其穩(wěn)定在4.8之間使菌體大量合成普魯蘭多糖；溫度28°C，轉速300rpm，發(fā)酵時間72小時。
[0022] 種子培養(yǎng)基組成為:蔗糖100g/L、酵母浸粉3g/L、氯化鈉2.5g/L、硫酸銨lg/L、MgS04.7H200.4g/L、K2HP041g/L、FeS04.7H200.05g/L，其余為水，ρΗ7.0。
[0023]發(fā)酵培養(yǎng)基成分:蔗糖150g/L、尿素 2g/L、氯化鈉 2.5g/L、MgS04.7H200.4g/L、K2HP042g/L、FeS04.7H200.05g/L,其余為水，初始 pH6.0。
[0024]發(fā)酵完成后，菌體粗干重為16.53g/L，粗多糖產量為:78.8g/L。與未進行調控(pH自然，通風比1:1，轉速300rpm)的對照試驗相比產量提高了 57.6% ;離心之后上清在654nm下OD值為0.132，與未進行調控相比(0D值為0.25)，色素降低了 47.2%。
[0025]注:飽和硫酸鈉溶氧為零；轉速500rpm，通風量為7L/min時溶氧為100%。
[0026]實施例2
[0027](I)將CGMCC.N0.7055菌株接于種子培養(yǎng)基進行搖瓶活化，轉速為200rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時間為32小時。
[0028](2)活化后的種子培養(yǎng)液以2-5% (v/v)的量接于新的種子搖瓶中進行擴大培養(yǎng)，轉速為200rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時間為18小時。
[0029](3)將所得種子液以2-5% (v/v)的量接于5L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，根據菌體生長情況即OD62tl值對pH和溶氧進行調控:當菌體OD62tl < 0.7(種子干重小于12g/L)時，溶氧降至60%左右時，將溶氧與攪拌串聯(lián)，使溶氧維持在55%，同時利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調控PH使其穩(wěn)定在3.0使菌體大量產生；當菌體OD62tl ^ 0.7 (種子干重不小于12g/L)時，將溶氧設定為28%，同時利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調控pH使其穩(wěn)定在5.0之間使菌體大量合成普魯蘭多糖；溫度28°C，轉速300rpm，發(fā)酵時間88小時。
[0030]種子培養(yǎng)基組成為:蔗糖100g/L、酵母浸粉3g/L、氯化鈉2.5g/L、硫酸銨lg/L、MgS04.7H200.4g/L、K2HP041g/L、 FeS04.7H200.05g/L，其余為水，ρΗ7.0。
[0031]發(fā)酵培養(yǎng)基成分:蔗糖150g/L、尿素 2g/L、氯化鈉 2.5g/L、MgS04.7H200.4g/L、K2HP042g/L、FeS04.7H200.05g/L,其余為水，初始 pH6.0。
[0032]發(fā)酵完成后，菌體粗干重為16.63g/L，粗多糖產量為:80.67g/L。與未進行調控(pH自然，通風比1:1，轉速300rpm)的對照試驗相比產量提高了 61.34% ;離心之后上清在654nm下OD值為0.112，與未進行調控相比(0D值為0.25)，色素降低了 55.2%。
[0033]實施例3
[0034](I)將CGMCC.N0.7055菌株接于種子培養(yǎng)基進行搖瓶活化，轉速為250rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時間為30小時。
[0035](2)活化后的種子培養(yǎng)液以2-5% (v/v)的量接于新的種子搖瓶中進行擴大培養(yǎng)，轉速為250rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時間為16小時。
[0036](3)將所得種子液以2-5% (v/v)的量接于5L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，根據菌體生長情況即OD62tl值對pH和溶氧進行調控:當菌體OD62tl < 0.7(種子干重小于12g/L)時，溶氧降至60%左右時，將溶氧與攪拌串聯(lián)，將溶氧設定為60%，同時利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調控pH使其穩(wěn)定在3.2使菌體大量產生；當菌體OD62tl ^ 0.7 (種子干重不小于12g/L)時，使溶氧維持在30%之間，同時利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調控PH使其穩(wěn)定在5.2之間使菌體大量合成普魯蘭多糖；溫度28°C，轉速300rpm，發(fā)酵時間96小時。
[0037]種子培養(yǎng)基組成為:蔗糖100g/L、酵母浸粉3g/L、氯化鈉2.5g/L、硫酸銨lg/L、MgS04.7H200.4g/L、K2HP041g/L、FeS04.7H200.05g/L，其余為水，ρΗ7.0。
[0038]發(fā)酵培養(yǎng)基成分:蔗糖150g/L、尿素 2g/L、氯化鈉 2.5g/L、MgS04.7H200.4g/L、K2HP042g/L、FeS04.7H200.05g/L,其余為水，初始 pH6.0。
[0039]發(fā)酵完成后，菌體粗干重為18.70g/L，粗多糖產量為:76.2g/L。與未進行調控(pH自然，通風比1:1，轉速300rpm)的對照試驗相比產量提高了 52.4% ;離心之后上清在654nm下OD值為0.129，與未進行調控相比(0D值 為0.25)，色素降低了 48.4%。
【權利要求】
1.一種高密度發(fā)酵生產普魯蘭多糖的方法，具體步驟如下: (1)將菌株接于種子培養(yǎng)基進行搖瓶活化，轉速為150-250rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時間為30-35小時; (2)活化后的種子培養(yǎng)液以2-5%(v/v)的量接于新的種子搖瓶中進行擴大培養(yǎng)，轉速為150-250rpm，溫度為28°C，培養(yǎng)時間為16-20小時; (3)將步驟(2)所得種子液以2-5%(v/v)的量接于5L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，根據菌體生長情況即OD62tl值對pH和溶氧進行調控:當菌體OD62tl < 0.7 (種子干重小于12g/L)時，溶氧降至60%左右時，將溶氧與攪拌串聯(lián)，使溶氧維持在50%-60%之間，同時利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調控pH使其穩(wěn)定在2.8-3.2之間使菌體大量產生；當菌體OD620 ^ 0.7 (種子干重不小于12g/L)時，將溶氧設定在25%-30%之間，同時利用3mol/L的鹽酸和3mol/L的氫氧化鈉調控pH使其穩(wěn)定在4.8-5.2之間使菌體大量合成普魯蘭多糖；溫度28°C，發(fā)酵時間72-96小時。
2.如權利要求1所述的一種高密度發(fā)酵生產普魯蘭多糖的方法，其特征在于:所述菌種為出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans) BCSWGHPL101,保藏編號 CGMCC N0.7055。
【文檔編號】C12P19/10GK103740785SQ201310754978
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月28日 優(yōu)先權日:2013年12月28日
【發(fā)明者】喬長晟, 宋亞瓊, 郝華旋, 馬正旺 申請人:天津北洋百川生物技術有限公司