一種固定化蜂房哈夫尼菌生產(chǎn)尸胺的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種固定化蜂房哈夫尼菌(Hafnia?alvei)AS1.1009生產(chǎn)尸胺的方法，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。發(fā)明旨在利用微生物包埋技術(shù)，提高尸胺的生產(chǎn)率。方法為：（1）蜂房哈夫尼菌菌種三級培養(yǎng)；（2）在無菌條件下利用包埋載體將菌液包埋固定；（3）將固定化菌體投加到發(fā)酵罐中發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)尸胺；發(fā)酵后尸胺的轉(zhuǎn)化率達95.31%-97.42%。本發(fā)明包埋的高濃度的蜂房哈夫尼菌種，不僅提供了高濃度的菌種微生物，而且包埋微生物顆粒增加了菌種的穩(wěn)定性和底物濃度的耐受性，增加了酶活性，從而增加了尸胺的生產(chǎn)率。
【專利說明】一種固定化蜂房哈夫尼菌生產(chǎn)尸胺的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種固定化蜂房哈夫尼菌生產(chǎn)尸胺的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]尸胺，即1，5- 二氨基戊烷，屬于多胺中的二胺類，是尸體腐敗產(chǎn)生氣味中的成分之一。五碳化合物1，5-戊二胺(尸胺)作為一種生物基的平臺化合物受到越來越多的關(guān)注，特別是作為新型的高性能生物基聚合物的構(gòu)建單體。研究其生產(chǎn)菌株和生產(chǎn)工藝，供應(yīng)生物基的1，5-戊二胺及其衍生品所能帶來的巨大的經(jīng)濟效益也引起人們極大地興趣。L 一賴氨酸脫梭酶(L-lysinedecarboxylase,簡稱LDC, EC4.1.1.15)，是可逆的將賴氨酸脫CO2生成尸胺(1，5—戊二胺)的酶，此酶是誘導(dǎo)性胞內(nèi)酶，需磷酸毗哆醛為輔酶促進脫羧反應(yīng)，LDC存在于大腸桿菌、尸桿菌、蜂房哈夫尼菌等大多數(shù)微生物中。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對1，5-戊二胺的研究不斷深入，從實驗室水平的代謝途徑和遺傳基因，到工業(yè)中的擴大培養(yǎng)和提取衍生化，為1，5-戊二胺的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。日本東麗尖端融合研究所用高效表達的大腸桿菌來源的賴氨酸脫羧酶的大腸桿菌生產(chǎn)尸胺。蔣麗麗，焦慶才等研究了蜂房哈夫尼菌(H.alvei)Asl.1009中，L-賴氨酸脫羧酶對L-賴氨酸的脫羧作用，分析了溫度、pH、培養(yǎng)基、激活劑等因素對酶活的影響。但是依然存在尸胺發(fā)酵過程復(fù)雜，尸胺生產(chǎn)率不高，且發(fā)酵后菌體和發(fā)酵液分離困難等缺點。
[0003]包埋固定化微生物技術(shù)因為其包裹的微生物密度高、抗沖擊能力強、穩(wěn)定性好，適應(yīng)性廣等優(yōu)點備受關(guān)注。傳統(tǒng)發(fā)酵法利用蜂房哈夫尼菌生產(chǎn)尸胺，因為其發(fā)酵菌株濃度低，菌種對底物濃度的耐受性低，LDC的活性低，發(fā)酵轉(zhuǎn)化后菌體和發(fā)酵液分離困難等缺點，使得尸胺的轉(zhuǎn)化效率低，增加了生產(chǎn)成本。為此，研究一種利用包埋固定蜂房哈夫尼菌發(fā)酵生產(chǎn)尸胺，在轉(zhuǎn)化過程中增加了菌種濃度、提高菌種底物的耐受性的包埋蜂房哈夫尼菌的技術(shù)是很有研究前景的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種固定化蜂房哈夫尼菌生產(chǎn)尸胺的方法。
[0005]技術(shù)方案如下:
[0006](1)蜂房哈夫尼菌菌種三級培養(yǎng)；
[0007](2)在無菌條件下利用包埋載體將菌種包埋固定；
[0008](3)將固定化菌體投加到發(fā)酵罐中發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)尸胺。
[0009]所述的蜂房哈夫尼菌三級培養(yǎng)過程如下:
[0010](I) 一級培養(yǎng)-斜面培養(yǎng):將試管菌種接種于斜面培養(yǎng)基，于35°C培養(yǎng)24_36h。
[0011]斜面培養(yǎng)基組成為(g/L):蛋白胨10，牛肉浸膏5，NaCl5，玉米漿5，瓊脂20，pH7.2。
[0012](2)二級培養(yǎng)-種子培養(yǎng):自一級斜面取I環(huán)菌接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，35°C，170r/min震蕩培養(yǎng)12h。[0013]種子培養(yǎng)基組成為(g/L):蛋白胨10，牛肉浸膏5，NaC15，玉米漿5，pH7.2。
[0014](3)三級培養(yǎng)-發(fā)酵培養(yǎng):將二級培養(yǎng)的種子液按5%接種量接入發(fā)酵罐，于35°C，通氣量(v/v) I:1.5，攪拌轉(zhuǎn)速300-600rpm，溶氧20%，培養(yǎng)24h。
[0015]發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L):葡萄糖20，玉米漿20，酵母膏5，牛肉膏3，蛋白胨10，NaC15，硫酸銨2，維生素B6I, ρΗ7.0。
[0016]優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖20g/L，玉米漿20g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨 10g/L，NaC15g/L，硫酸銨 2g/L，維生素 B61 g/L, ρΗ7.0。
[0017]經(jīng)過三級培養(yǎng)得到的發(fā)酵液菌體濃度為5.5 X 108-6.0 X IO8個/ml。
[0018]所述的包埋載體各組分質(zhì)量比為:海藻酸鈉:聚乙烯醇=55-70:2_5。
[0019]所述菌種包埋固定的方法如下:稱取55_70g的海藻酸鈉加入1000mL蒸餾水中，然后加入2-5g聚乙烯醇混合均勻，放入高壓滅菌鍋內(nèi)121 °C，滅菌30min，在超凈臺內(nèi)冷卻至室溫形成凝膠。將500mL蜂房哈夫尼菌發(fā)酵液離心收集菌體然后用IOmL生理鹽水重懸并加入到凝膠中，攪拌混合均勻后用無菌的IOmL注射器滴加到含2%的經(jīng)過滅菌的CaCl2溶液中，滴加完畢后放在超凈臺內(nèi)室溫繼續(xù)交聯(lián)10h，形成固定化小球，然后用經(jīng)過滅菌的生 理鹽水洗滌3次既得包埋的蜂房哈夫尼菌顆粒。上述所有操作都必須在無菌條件下進行。
[0020]所述的發(fā)酵轉(zhuǎn)化具體方法為:按5-10%w/v的接種量將包埋好的菌體加入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基的初始pH為7.0，培養(yǎng)溫度35°C，通氣量(v/v) 1: 1.5，攪拌轉(zhuǎn)速300-600rpm，溶氧20%，和攪拌相關(guān)聯(lián)。發(fā)酵活化2h時，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至70_100rpm，并關(guān)閉通風(fēng)，用6mol/L的HCl在線調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH至5.5并維持恒定。連接滅菌后的200g/L的L-賴氨酸母液補料瓶,快速流加至發(fā)酵罐中L-賴氨酸的濃度為30g/L。轉(zhuǎn)化過程中，每2h取樣一次，用生物傳感儀測定L-賴氨酸的濃度，當(dāng)L-賴氨酸的濃度降至12g/L以下時，補加L-賴氨酸至30g/L。經(jīng)過32h發(fā)酵后結(jié)束然后離心除去包埋的微生物顆粒。
[0021]所述的蜂房哈夫尼菌具體為蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)ASl.1009。
[0022]本發(fā)明的優(yōu)點如下:(1)包埋的高濃度的蜂房哈夫尼菌種，不僅提供了高濃度的菌種微生物，而且包埋微生物顆粒增加了菌種的穩(wěn)定性和底物濃度的耐受性，增加了酶活性，從而增加了尸胺的生產(chǎn)率。(2)包埋的高濃度蜂房哈夫尼菌種顆粒可長期保存，發(fā)酵使用方便，并且包埋顆粒可以重復(fù)使用，簡化了發(fā)酵步驟、大大的縮短了發(fā)酵周期。(3)包埋的菌種微生物，在發(fā)酵轉(zhuǎn)化過程中使用簡便，且大大的簡化了發(fā)酵液菌液分離的過程，大大降低了生產(chǎn)成本。
【具體實施方式】
[0023]下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0024]實施例1
[0025]一種包埋蜂房哈夫尼菌生產(chǎn)尸胺的方法，步驟如下:
[0026]1、將蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei ASl.1009)菌株進行活化6~8h，即將其從斜面培養(yǎng)基中取I環(huán)菌接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，35°C，170r/min震蕩培養(yǎng)12h，得種子液。種子培養(yǎng)基組成為(g/L):蛋白胨10，牛肉浸膏5，NaC15，玉米漿5，pH7.2。
[0027]2、以5%的體積比將步驟2所得的種子液接到5L (裝液量為3L)的發(fā)酵罐中，于35°C，通氣量(v/v) 1:1.5，攪拌轉(zhuǎn)速300-600印111，溶氧20%，培養(yǎng)2411。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L):葡萄糖20，玉米漿20，酵母膏5，牛肉膏3，蛋白胨10，NaC15，硫酸銨2，維生素B6I,ρΗ7.0。
[0028]3、菌種包埋固定:稱取68g的海藻酸鈉加入1000mL蒸餾水中，然后加入2g聚乙烯醇混合均勻，放入高壓滅菌鍋內(nèi)121°C，滅菌30min，在超凈臺內(nèi)冷卻至室溫形成凝膠。將500mL蜂房哈夫尼菌發(fā)酵液離心收集菌體然后用IOmL生理鹽水重懸并加入到凝膠中，攪拌混合均勻后用無菌的IOmL注射器滴滴加到含2%的經(jīng)過滅菌的CaCl2溶液中，滴加完畢后放在超凈臺內(nèi)室溫繼續(xù)交聯(lián)10h，形成固定化小球，然后用經(jīng)過滅菌的生理鹽水洗滌3次既得包埋微生物菌劑。上述所有操作都必須在無菌條件下進行。
[0029]4、按5%w/v的接種量將包埋好的種子加入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基的初始pH=7.0，培養(yǎng)溫度35°C，通氣量(v/v) I:1.5，攪拌轉(zhuǎn)速300_600rpm，溶氧20%，和攪拌相關(guān)聯(lián)。發(fā)酵至2h時，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至70-100rpm，并關(guān)閉通風(fēng)，用6mol/L的HCl在線調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH至5.5并維持恒定。連接滅菌后的200g/L的L-賴氨酸母液補料瓶，快速流加至發(fā)酵罐中L-賴氨酸的濃度為30g/L。轉(zhuǎn)化過程中，每2h取樣一次，用生物傳感儀測定L-賴氨酸的濃度，當(dāng)L-賴氨酸的濃度降至12g/L以下時，補加L-賴氨酸至30g/L。經(jīng)過32h發(fā)酵后結(jié)束然后離心除去包埋的微生物顆粒。尸胺產(chǎn)量為59.21g/L，轉(zhuǎn)化率達96.42%。
[0030]實施例2
[0031]1、種子液的制備和所用菌 種同實施例1。
[0032]2、發(fā)酵液制備同實施例1。
[0033]3、菌種包埋固定:稱取70g的海藻酸鈉加入1000mL蒸餾水中，然后加入2g聚乙烯醇混合均勻，放入高壓滅菌鍋內(nèi)121°C，滅菌30min，在超凈臺內(nèi)冷卻至室溫形成凝膠。將500mL蜂房哈夫尼菌發(fā)酵液離心收集菌體然后用IOmL生理鹽水重懸并加入到凝膠中，攪拌混合均勻后用無菌的IOmL注射器滴加到含2%的經(jīng)過滅菌的CaCl2溶液中，滴加完畢后放在超凈臺內(nèi)室溫繼續(xù)交聯(lián)10h，形成固定化小球，然后用經(jīng)過滅菌的生理鹽水洗滌3次既得包埋微生物菌劑。上述所有操作都必須在無菌條件下進行。
[0034]5、按7%w/v的接種量將包埋好的種子加入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基的初始pH=7.0，培養(yǎng)溫度35°C，通氣量(v/v) I:1.5，攪拌轉(zhuǎn)速300_600rpm，溶氧20%，和攪拌相關(guān)聯(lián)。發(fā)酵至2h時，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至70-100rpm，并關(guān)閉通風(fēng)，用6mol/L的HCl在線調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH至5.5并維持恒定。連接滅菌后的200g/L的L-賴氨酸母液補料瓶，快速流加至發(fā)酵罐中L-賴氨酸的濃度為30g/L。轉(zhuǎn)化過程中，每2h取樣一次，用生物傳感儀測定L-賴氨酸的濃度，當(dāng)L-賴氨酸的濃度降至12g/L以下時，補加L-賴氨酸至30g/L。經(jīng)過32h發(fā)酵后結(jié)束然后離心除去包埋的微生物顆粒。尸胺產(chǎn)量為57.51g/L，轉(zhuǎn)化率達93.42%。
[0035]實施例3
[0036]1、種子液的制備和所用菌種同實施例1。
[0037]2、發(fā)酵液制備同實施例1。
[0038]3、發(fā)酵罐種子液包埋:稱取75g的海藻酸鈉加入1000mL蒸餾水中，然后加入4g聚乙烯醇混合均勻，放入高壓滅菌鍋內(nèi)121°C，滅菌30min，在超凈臺內(nèi)冷卻至室溫形成凝膠。將500mL蜂房哈夫尼菌發(fā)酵液離心收集菌體然后用IOmL生理鹽水重懸并加入到凝膠中，攪拌混合均勻后用無菌的IOmL注射器滴加到含2%的經(jīng)過滅菌的CaCl2溶液中，滴加完畢后放在超凈臺內(nèi)室溫繼續(xù)交聯(lián)10h，形成固定化小球，然后用經(jīng)過滅菌的生理鹽水洗滌3次既得包埋微生物菌劑。上述所有操作都必須在無菌條件下進行。
[0039]5、按8%w/v的接種量將包埋好的種子加入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基的初始pH=7.0，培養(yǎng)溫度35°C，通氣量(v/v) I:1.5，攪拌轉(zhuǎn)速300_600rpm，溶氧20%，和攪拌相關(guān)聯(lián)。發(fā)酵至2h時，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至70-100rpm，并關(guān)閉通風(fēng)，用6mol/L的HCl在線調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH至5.5并維持恒定。連接滅菌后的200g/L的L-賴氨酸母液補料瓶，快速流加至發(fā)酵罐中L-賴氨酸的濃度為30g/L。轉(zhuǎn)化過程中，每2h取樣一次，用生物傳感儀測定L-賴氨酸的濃度，當(dāng)L-賴氨酸的濃度降至12g/L以下時，補加L-賴氨酸至30g/L。經(jīng)過32h發(fā)酵后結(jié)束然后離心除去包埋的微生物顆粒。尸胺產(chǎn)量為60.51g/L，轉(zhuǎn)化率達97.12%。
[0040]實施例4:發(fā)酵生產(chǎn)對比試驗
[0041]實驗組為將包埋的菌種按8%w/v的接種量加入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，對照組為將與實驗組含有同等菌體量的發(fā)酵液接入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，其他反應(yīng)條件相同，如下:培養(yǎng)基的初始pH=7.0，培養(yǎng)溫度35°C，通氣量(v/v)l:1.5，攪拌轉(zhuǎn)速300-600rpm，溶氧20%，和攪拌相關(guān)聯(lián)。發(fā)酵至2h時，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至70_100rpm，并關(guān)閉通風(fēng)，用6mol/L的HCl在線調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH至5.5并維持恒定。連接滅菌后的200g/L的L-賴氨酸母液補料瓶,快速流加至發(fā)酵罐中L-賴氨酸的濃度為30g/L。轉(zhuǎn)化過程中，每2h取樣一次，用生物傳感儀測定L-賴氨酸的濃度，當(dāng)L-賴氨酸的濃度降至12g/L以下時，補加L-賴氨酸至30g/L。經(jīng)過32h發(fā)酵后結(jié)束然后離心除去微生物等雜質(zhì)，提取尸胺。結(jié)果如表1。
[0042]表1
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種固定化蜂房哈夫尼菌生產(chǎn)尸胺的方法，包括如下步驟: (1)蜂房哈夫尼菌菌種三級培養(yǎng)； (2)在無菌條件下利用包埋載體將菌種包埋固定； (3)將固定化菌體投加到發(fā)酵罐中發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)尸胺； 所述的蜂房哈夫尼菌具體為蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)ASl.1009。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固定化蜂房哈夫尼菌生產(chǎn)尸胺的方法，其特征在于:所述的三級培養(yǎng)過程如下: (O 一級培養(yǎng)-斜面培養(yǎng):將試管菌種接種于斜面培養(yǎng)基，于35°C培養(yǎng)24-36h。所述斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成 為(g/L):蛋白胨10，牛肉浸膏5，NaC15，玉米漿5，瓊脂20，pH7.2 ； (2)二級培養(yǎng)-種子培養(yǎng):自一級斜面取I環(huán)菌接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，35°C，170r/min震蕩培養(yǎng)12h ； 所述種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(g/L):蛋白胨10，牛肉浸膏5，NaC15，玉米漿5，pH7.2 ;。 (3)三級培養(yǎng)-發(fā)酵培養(yǎng):將二級培養(yǎng)的種子液按5%接種量接入發(fā)酵罐，于35°C，通氣量(v/v) I:1.5，攪拌轉(zhuǎn)速 300-600rpm，溶氧 20%，培養(yǎng) 24h ； 所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(g/L):葡萄糖20，玉米漿20，酵母膏5，牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，硫酸銨 2，維生素 B6I, ρΗ7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固定化蜂房哈夫尼菌生產(chǎn)尸胺的方法，其特征在于:所述包埋載體各組分質(zhì)量比為:海藻酸鈉:聚乙烯醇=55-70:2-5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固定化蜂房哈夫尼菌生產(chǎn)尸胺的方法，其特征在于:所述包埋固定的具體方法如下:稱取55-70g的海藻酸鈉加入1000mL蒸餾水中，然后加入2-5g聚乙烯醇混合均勻，放入高壓滅菌鍋內(nèi)121°C，滅菌30min，在超凈臺內(nèi)冷卻至室溫形成凝膠df500mL蜂房哈夫尼菌發(fā)酵液離心收集菌體然后用IOmL生理鹽水重懸并加入到凝膠中，攪拌混合均勻后用無菌的IOmL注射器滴加到含2%的經(jīng)過滅菌的CaCl2溶液中，滴加完畢后放在超凈臺內(nèi)室溫繼續(xù)交聯(lián)10h，形成固定化小球，然后用經(jīng)過滅菌的生理鹽水洗滌3次既得包埋的蜂房哈夫尼菌顆粒；上述所有操作都必須在無菌條件下進行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固定化蜂房哈夫尼菌生產(chǎn)尸胺的方法，其特征在于: 所述發(fā)酵轉(zhuǎn)化生成尸胺的具體方法為:按5-10%w/v的接種量將包埋好的菌體加入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基的初始pH為7.0，培養(yǎng)溫度35°C，通氣量(v/V) 1:1.5，攪拌轉(zhuǎn)速300-600印111，溶氧20%，和攪拌相關(guān)聯(lián)。發(fā)酵活化2h時，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至70-100rpm,并關(guān)閉通風(fēng),用6mol/L的HCl在線調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH至5.5并維持恒定；連接滅菌后的200g/L的L-賴氨酸母液補料瓶，快速流加至發(fā)酵罐中L-賴氨酸的濃度為30g/L ；轉(zhuǎn)化過程中，每2h取樣一次，用生物傳感儀測定L-賴氨酸的濃度，當(dāng)L-賴氨酸的濃度降至12g/L以下時，補加L-賴氨酸至30g/L ；32h發(fā)酵結(jié)束后離心除去包埋的微生物顆粒。
【文檔編號】C12P13/00GK103725724SQ201310755027
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月28日
【發(fā)明者】喬長晟, 彭巧, 林青, 石漫漫 申請人:天津北洋百川生物技術(shù)有限公司