食源性致病菌定量檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型涉及一種食源性致病菌定量檢測試劑盒，其特征是：包括盒體、盒蓋和若干個發(fā)酵增菌容器，所述盒體內(nèi)均勻排列發(fā)酵增菌容器，所述發(fā)酵增菌容器內(nèi)設(shè)有集氣窗，所述集氣窗前端與發(fā)酵增菌容器內(nèi)前壁固接，集氣窗末端與發(fā)酵增菌容器內(nèi)底部固接，所述集氣窗橫向截面形狀呈開口矩形，其縱向截面形狀呈直角三角形，所述集氣窗與發(fā)酵增菌容器固接后，在發(fā)酵增菌容器的底部呈坡度的氣泡收集空間。有益效果：通過致病菌定量檢測的數(shù)目可以定量評價檢測目標(biāo)的污染程度是否達到安全限量標(biāo)準(zhǔn)，為食品安全致病菌檢測提供了可靠的數(shù)據(jù)?？蓮V泛應(yīng)用于食品、自來水、純凈水、飲料、制藥、保健品、化妝品、疾病預(yù)防控制、出入境檢疫局等十余個行業(yè)。
【專利說明】 食源性致病菌定量檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型屬于食品檢測，尤其涉及一種直接應(yīng)用于食品、飲用水的食源性致病菌定量檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]2012年食源性致病菌檢測手冊中對部分致病菌由原有的定性檢測方法重新修訂為定量檢測方法。即，對食品中大腸艾希氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、阪崎腸桿菌、單核細胞增生李斯特菌等致病菌、采用九管定量檢測，即九管發(fā)酵法(MPN)檢測方法。其培養(yǎng)基載體為液體培養(yǎng)基，檢測程序多達六個步驟:試劑配制、分裝、消毒、檢測、洗滌、烘烤。該方法檢測成本高、檢測周期長，檢驗方法及操作程序繁雜。專利申請?zhí)?201010550133.8公開了一種對食品中的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌進行同時快速檢測的多重?zé)晒舛縋CR方法，其特征是由以下步驟構(gòu)成:(I)應(yīng)用一定配比的含7.5%氯化鈉肉湯和GN的混合培養(yǎng)基對含有上述致病菌的食品進行快速同時增菌，并使用離心柱式細菌基因組DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)液中的細菌基因組總DNA ; (2)應(yīng)用根據(jù)沙門氏菌的復(fù)制原點C基因、金黃色葡萄球菌的Nuc基因、志賀氏菌的IpaH基因設(shè)計的擴增引物和Taqman探針對上述細菌基因組總DNA進行多重?zé)晒舛縋CR同時檢測，并使用自行設(shè)計的重組DNA片段作為陽性內(nèi)參監(jiān)控反應(yīng)體系，根據(jù)分別代表三種致病菌的熒光信號在一定循環(huán)數(shù)內(nèi)是否出現(xiàn)顯著擴增判定食品中是否存在上述致病菌。該方法手段復(fù)雜、檢測周期很長。專利申請?zhí)?201010556679.4公開了一種快速檢測嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的PCR方法，其特征是包括以下幾個步驟:(I)阪崎腸桿菌的培養(yǎng)；(2)制備阪崎腸桿菌基因組DNA ； (3)構(gòu)建阪崎腸桿菌重組質(zhì)粒,作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量；(4)構(gòu)建ompA內(nèi)標(biāo)重組質(zhì)粒，與目的基因在同一反應(yīng)體系內(nèi)同時擴增，監(jiān)測反應(yīng)體系，排除假陰性；(5)建立分子信標(biāo)熒光定量技術(shù)檢測嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的方法，優(yōu)化反應(yīng)條件；(6)對3種從嬰兒配方奶粉中高效提取阪崎腸桿菌的方法進行比較；(7)確定分子信標(biāo)熒光定量方法的靈敏度；(8)人工污染樣品，確定檢測限；(9)實際檢測，確定該方法的特異性、靈敏度、符合率。該方法只針對阪崎腸桿菌的檢測，只能定性分析，不能滿足食源性致病菌檢測手冊中有關(guān)“定量檢測”的規(guī)定。食品檢測部門亟待開發(fā)一種可以一目了然觀察檢測目標(biāo)細菌的生長繁殖過程，對檢測目標(biāo)致病菌檢測的數(shù)目可以定量評價的檢測裝置和方法。
實用新型內(nèi)容
[0003]本實用新型的目的在于克服上述技術(shù)的不足，而提供一種食源性致病菌定量檢測試劑盒，采用定量檢測方法，通過培養(yǎng)基包被技術(shù)，將食源性致病菌相對應(yīng)的培養(yǎng)基包被在無色透明的試劑盒載體上，檢測目標(biāo)致病菌檢測的數(shù)目可以定量評價，為食品安全提供了檢測目標(biāo)的污染程度是否達到安全限量標(biāo)準(zhǔn)。
[0004]本實用新型為實現(xiàn)上述目的，采用以下技術(shù)方案:一種食源性致病菌定量檢測試劑盒，其特征是:包括盒體、盒蓋和若干個發(fā)酵增菌容器，所述盒體內(nèi)均勻排列發(fā)酵增菌容器，所述發(fā)酵增菌容器內(nèi)設(shè)有集氣窗，所述集氣窗前端與發(fā)酵增菌容器內(nèi)前壁固接，集氣窗末端與發(fā)酵增菌容器內(nèi)底部固接，所述集氣窗橫向截面形狀呈開口矩形，其縱向截面形狀呈直角三角形，所述集氣窗與發(fā)酵增菌容器固接后，在發(fā)酵增菌容器的底部呈坡度的氣泡收集空間。
[0005]所述盒體、盒蓋和發(fā)酵增菌容器均為無色透明體，采用能夠降解的材料制成。
[0006]所述發(fā)酵增菌容器數(shù)量為十個，發(fā)酵增菌容器在盒體中前后排列各五個。
[0007]所述發(fā)酵增菌容器觀測面的側(cè)壁上設(shè)有試驗標(biāo)識刻線。
[0008]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實用新型提供了一種省去了實驗前的大量準(zhǔn)備工作，方便、快捷、準(zhǔn)確的定量測試食源性致病菌的裝置。由原來的定性檢測逐步改為定量檢測，通過上述致病菌定量檢測的數(shù)目的多少可以定量評價以上檢測目標(biāo)的污染程度是否達到安全限量標(biāo)準(zhǔn)，為食品安全致病菌檢測提供了可靠的數(shù)據(jù)。本試劑盒通過培養(yǎng)基包被技術(shù)，將培養(yǎng)基包被在無色透明的試劑盒載體上，本試劑盒提高了試驗準(zhǔn)確性和標(biāo)準(zhǔn)化程度，簡化了操作程序，縮短檢驗時間，減輕了工作強度，減少了試驗耗材，提高了工作效率。本試劑盒為一次性無菌用品，可降解再生，避免污染?？蓮V泛應(yīng)用于食品行業(yè)、自來水公司、純凈水行業(yè)、飲料行業(yè)、制藥行業(yè)、保健品行業(yè)、化妝品行業(yè)、疾病預(yù)防控制系統(tǒng)、出入境檢疫局、技術(shù)監(jiān)督部門、環(huán)境保護行業(yè)、工商管理部門等十余個行業(yè)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1是本實用新型的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0010]圖2是圖1中集氣窗的縱向截面剖視圖。
[0011]圖中:1、盒體，2、盒蓋，3、發(fā)酵增菌容器，4、集氣窗，5、試驗標(biāo)識刻線。
【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合較佳實施例詳細說明本實用新型的【具體實施方式】。
[0013]實施例
[0014]詳見附圖，一種食源性致病菌定量檢測試劑盒，包括盒體1、盒蓋2和若干個發(fā)酵增菌容器3，所述盒體內(nèi)均勻排列發(fā)酵增菌容器，本實施例的發(fā)酵增菌容器數(shù)量為十個，發(fā)酵增菌容器在盒體中前后對應(yīng)排列各五個，第1-9個發(fā)酵增菌容器為試驗檢測容器，第10個發(fā)酵增菌容器為試驗檢測對照容器。所述發(fā)酵增菌容器內(nèi)設(shè)有集氣窗4，所述集氣窗前端與發(fā)酵增菌容器內(nèi)前壁固接，集氣窗末端與發(fā)酵增菌容器內(nèi)底部固接，所述集氣窗橫向截面形狀呈開口矩形，其縱向截面形狀呈直角三角形，所述集氣窗與發(fā)酵增菌容器固接后，在發(fā)酵增菌容器的底部呈坡度的氣泡收集空間，例如:大腸埃希氏、阪崎腸桿菌主要的生化反應(yīng)是產(chǎn)酸產(chǎn)氣，而產(chǎn)氣是判定這兩個致病菌的是與否的重要指標(biāo)之一，通過固定的集氣窗直接觀察其大腸埃希氏、阪崎腸桿菌產(chǎn)氣情況，對其致病菌的判定起到了重要作用。所述發(fā)酵增菌容器觀測面的側(cè)壁上設(shè)有試驗標(biāo)識刻線5，每個發(fā)酵增菌容器的試驗標(biāo)識刻線是符合試驗要求的9mL、10mL的試驗標(biāo)線。
[0015]本實用新型的優(yōu)選方案是:所述盒體、盒蓋和發(fā)酵增菌容器均為無色透明體，采用能夠降解的材料制成，為一次性無菌用品，可降解再生，避免污染。
[0016]使用方法:[0017]本試劑盒可以實現(xiàn)2012年食源性致病菌檢測手冊中規(guī)定的定量檢測方法。試劑盒培養(yǎng)基的包被:與2012年食源性致病菌檢測手冊中所規(guī)定的，大腸艾希氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、阪崎腸桿菌、單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌定量檢測中所應(yīng)用的培養(yǎng)基相同。事先將濃縮月桂基硫酸鹽胰蛋白胨培養(yǎng)基、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液、10%氯化鈉胰蛋白胨肉湯培養(yǎng)基、3%堿性蛋白胨水、李氏增菌肉湯(LBI )、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素培養(yǎng)基包被在試劑盒中，隨時取用。通過培養(yǎng)基包被技術(shù)，將上述致病菌相對應(yīng)的培養(yǎng)基包被放在無色透明的試劑盒載體內(nèi)。
[0018]大腸埃希氏菌的定量檢測
[0019]試劑盒使用說明書
[0020]I適用范圍:適用于食源性致病菌大腸埃希氏菌定量(MPN)方法的檢測。
[0021]2方法原理:依據(jù)《2012年食源性致病菌監(jiān)測工作手冊》中的定量檢驗方法，采用包被技術(shù)，將月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯培養(yǎng)基包被在試劑盒底部，隨時取用，省去了實驗前的大量準(zhǔn)備工作，方便、快捷。
[0022]3試劑盒的組成:試劑盒由5個發(fā)酵增菌容器前后對應(yīng)并排共10個發(fā)酵增菌容器組成，第1-9發(fā)酵增菌容器為試驗盒，第10發(fā)酵增菌容器為試驗對照盒。用前加入無菌蒸餾水或無菌生理鹽水至盒的標(biāo)線處即為IOmL月桂基硫酸鹽胰蛋白胨培養(yǎng)基。
[0023]4操作步驟
[0024]4.1樣品制備:以無菌操作稱取檢樣25g(mL)，加入225mL磷酸鹽緩沖液或無菌生理鹽水中制備成1:10的均勻樣品稀釋液。
[0025]4.2增菌培養(yǎng):
[0026]4.2.1試劑盒的準(zhǔn)備:打開盒蓋，試劑盒1-10發(fā)酵增菌容器中加入無菌鹽水9~IOmL即可，備用；
[0027]4.2.2加樣:選擇上述樣品勻液三個連續(xù)的適宜稀釋度，接種到含有月桂基硫酸鹽胰蛋白胨培養(yǎng)基的發(fā)酵增菌容器中(1-3，4-6，7-9。)，每個稀釋度接種3盒，每盒接種lmL。第10發(fā)酵增菌容器不加樣液為陰性對照，于36°C ± 1°C培養(yǎng)48h±2h ;
[0028]4.3分離培養(yǎng):對所有渾濁生長，集氣窗有氣泡產(chǎn)生的試劑盒增菌液，用接種環(huán)移取I環(huán)，接種EC肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，檢查試劑盒中的集氣窗是否有氣泡產(chǎn)生，如未有產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h ;記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的EC肉湯管數(shù)。如所有EC肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報告大腸埃希氏菌MPN結(jié)果；如有產(chǎn)氣者，則進行EMB平板分離培養(yǎng)。
[0029]4.4鑒定:挑取EMB平板典型菌落做確正實驗；
[0030]4.5結(jié)果:根據(jù)證實為大腸埃希氏菌陽性的試管管數(shù)，查MPN檢索表，報告每g(mL)樣品中大腸埃希氏菌MPN值；
[0031]5注意事項
[0032]5.1加入樣品后不需搖勻，平拿平放；
[0033]5.2加樣時可用一次性無菌塑料吸管，將樣品稀釋液加至試劑盒所標(biāo)刻度處；
[0034]5.3在培養(yǎng)箱中取試劑盒時應(yīng)平托出來，不要傾斜以免液體外逸造成污染；
[0035]5.4試劑盒為一次性無菌包裝用品，供一次性即開即用
[0036]6保存條件和有效期:
[0037]避光于保存于干燥處，最佳溫度為2?8°C，有效期18個；[0038]備注:如果樣品污染嚴(yán)重，實驗時直接將1:10樣品勻液加入試劑盒中，不需實驗前加入無菌蒸餾水或無菌生理鹽水即可，
[0039]備注:如果樣品污染嚴(yán)重，每孔直接接種1:10樣品的稀釋液10mL，稀釋后的10_2接種10mL，稀釋后的10_3接種10mL，每個稀釋度接種3盒，(1-3，4-6，7-9。)省去了制備雙料培養(yǎng)基及單料培養(yǎng)基試管的繁瑣的工作。
[0040]阪岐腸桿菌的定量檢測
[0041]試劑盒使用說明書
[0042]I適用范圍:適用于食源性致病菌阪岐腸桿菌定量(MPN方法)的檢測。
[0043]2方法原理:依據(jù)《2012年食源性致病菌監(jiān)測工作手冊》中的定量檢驗方法，采用包被技術(shù)將改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素培養(yǎng)基包被在試劑盒底部，隨時取用，省去了實驗前的大量準(zhǔn)備工作，方便、快捷。
[0044]3試劑盒的組成:試劑盒由5個發(fā)酵增菌容器前后對應(yīng)并排共10個發(fā)酵增菌容器組成，第1-9發(fā)酵增菌容器為試驗盒，第10發(fā)酵增菌容器為試驗對照盒。用前加入無菌蒸餾水或無菌生理鹽水至盒的標(biāo)線處即為IOmL改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素
培養(yǎng)基。
[0045]4操作步驟
[0046]4.1樣品制備:方法見《2012年食源性致病菌監(jiān)測工作手冊》中的阪岐腸桿菌定量檢驗(7.1)。
[0047]4.2增菌培養(yǎng):
[0048]4.2.1試劑盒的準(zhǔn)備:打開盒蓋，試劑盒1-10發(fā)酵增菌容器中加入無菌鹽水9~IOmL即可，備用。
[0049]4.2.2加樣:用滅菌吸管分別吸取18小時培養(yǎng)后的三份不同重量前增菌,各ImL,(每份不同重量樣品各取3個ImL)分別加入含有IOmL改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素的試劑盒的發(fā)酵增菌容器中(1-3，4-6，7-9。)。第10發(fā)酵增菌容器不加樣液為陰性對照，置44°C ±0.5°C恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24h ；
[0050]4.3分離培養(yǎng):對所有顯示渾濁并產(chǎn)生大量氣體的試劑盒增菌液,用接種環(huán)接種于阪岐顯色培養(yǎng)基平板上劃線分離。置36°C培養(yǎng)24h±2h ；
[0051]4.4鑒定:挑取可疑菌落(藍綠色)，劃線接種胰蛋白胨大豆瓊脂平板(TSA)，250C ±1°C培養(yǎng)24-48h，挑取黃色菌落用全自動微生物鑒定系統(tǒng)VITEK-2進行生化鑒定；
[0052]4.5結(jié)果:根據(jù)證實為阪岐腸桿菌的陽性管數(shù)查MPN檢索表；
[0053]5注意事項
[0054]5.1加入樣品后不需搖勻，平拿平放；
[0055]5.2加樣時可用一次性無菌塑料吸管，將樣品稀釋液加至試劑盒所標(biāo)刻度處；
[0056]5.3在培養(yǎng)箱中取試劑盒時應(yīng)平托出來，不要傾斜以免液體外逸造成污染。
[0057]5.4試劑盒為一次性無菌包裝用品，供一次性即開即用
[0058]6保存條件和有效期:
[0059]避光于保存于干燥處，最佳溫度為2?8°C，有效期18個。
[0060]備注:如果樣品污染嚴(yán)重，每孔直接接種1:10樣品的稀釋液10mL，稀釋后的10_2接種10mL，稀釋后的10_3接種10mL，每個稀釋度接種3盒，(1-3，4-6，7-9。)省去了制備雙料培養(yǎng)基及單料培養(yǎng)基試管的繁瑣的工作。
[0061]食源性致病菌定量檢測項目，包含了七種致病菌定量檢測，相對有七種定量致病菌檢測試劑盒。
[0062]以上所述，僅是本實用新型的較佳實施例而已，并非對本實用新型的結(jié)構(gòu)作任何形式上的限制。凡是依據(jù)本實用新型的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本實用新型的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種食源性致病菌定量檢測試劑盒，其特征是:包括盒體、盒蓋和若干個發(fā)酵增菌容器，所述盒體內(nèi)均勻排列發(fā)酵增菌容器，所述發(fā)酵增菌容器內(nèi)設(shè)有集氣窗，所述集氣窗前端與發(fā)酵增菌容器內(nèi)前壁固接，集氣窗末端與發(fā)酵增菌容器內(nèi)底部固接，所述集氣窗橫向截面形狀呈開口矩形，其縱向截面形狀呈直角三角形，所述集氣窗與發(fā)酵增菌容器固接后，在發(fā)酵增菌容器的底部呈坡度的氣泡收集空間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食源性致病菌定量檢測試劑盒，其特征是:所述盒體、盒蓋和發(fā)酵增菌容器均為無色透明體，采用能夠降解的材料制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的食源性致病菌定量檢測試劑盒，其特征是:所述發(fā)酵增菌容器數(shù)量為十個，發(fā)酵增菌容器在盒體中前后排列各五個。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的食源性致病菌定量檢測試劑盒，其特征是:所述發(fā)酵增菌容器觀測面的側(cè)壁上設(shè)有試驗標(biāo)識刻線。
【文檔編號】C12M1/34GK203668405SQ201320894143
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】劉軍 申請人:劉軍