半合成抗生素生產(chǎn)中的類MbtH蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及制備β-內(nèi)酰胺抗生素的方法，其中所述方法包括以下步驟：在類MbtH蛋白存在時，將4-羥苯基甘氨酸或苯基甘氨酸、半胱氨酸和纈氨酸與非核糖體肽合成酶接觸，隨后使用異青霉素N合成酶環(huán)化。本發(fā)明還涉及能夠完成所述制備的宿主細(xì)胞。
【專利說明】半合成抗生素生產(chǎn)中的類MbtH蛋白 發(fā)明領(lǐng)域
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及制備β_內(nèi)酰胺抗生素的方法，其中所述方法包括以下步驟：在類 MbtH蛋白存在時，將4-羥苯基甘氨酸或苯基甘氨酸、半胱氨酸和纈氨酸與非核糖體肽合成 酶接觸，隨后使用異青霉素 N合成酶環(huán)化。本發(fā)明還涉及能夠完成所述制備的宿主細(xì)胞。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 類MbtH蛋白是類似于來自Mycobacterium tuberculosis的MbtH的小蛋白。 雖然最近的研究表明類MbtH蛋白在肽的生物合成中起作用（尤其是促進(jìn)腺苷酰化反 應(yīng)），但在很大程度上其功能仍是未知的。Heemstra等人（J. Amer. Chem. Soc. (2009) 131, 15317-15329)已報道了在類MbtH蛋白VbsG參與時，利用腺苷?；δ苡騐bsS腺苷 ?；疦(5) - ((R) -3-羥基丁?；?N(5)-羥基-D-鳥氨酸。同樣地，F(xiàn)elnagle等人 (Biochemistry (2010)盤，8815-8817)已報道了分別利用腺苷酰化功能域EntF、CmnO/VioO 和CmnA腺苷?；疞-絲氨酸、β-賴氨酸和L-2,3-氨基丙酸。對于L-絲氨酸的腺苷酰 化，顯示類MbtH蛋白YbdZ的參與；對于β -賴氨酸的腺苷酰化，顯示類MbtH蛋白CmnN 或VioN的參與，然而還發(fā)現(xiàn)CmnN參與L-2, 3-氨基丙酸的腺苷?；４送?，Zhang等人 (Biochemistry (2010)迎，9946-9947)展示了利用腺苷?；δ苡騊acL腺苷酰化m-酪氨 酸時，類 MbtH 蛋白 KtzJ、PacJ 和 GlbE 的參與；最后，Boll 等人（J.Biol.Chem. (2011)286, 36281-36290)證明了利用腺苷酰化功能域CloH、SimH或Pcza361. 18腺苷?；疞-酪氨酸 時，類MbtH蛋白Cloy、SimY和OrfIvan的參與。
[0004] 編碼類MbtH蛋白的基因（類mbtH基因）往往發(fā)現(xiàn)于原核微生物的非核糖體肽合 成酶（NRPS)基因簇中。GenBank中保藏了許多類mbtH基因。為了鑒定類MbtH蛋白，BLASTP 研究展示了由放線菌門、厚壁菌門和變形菌門的成員編碼的同系物，但是未發(fā)現(xiàn)由古生菌 編碼的同系物（R.H.Baltz，J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (2011)並，1747-1760)。沒有真 核生物中類mbtH基因的報道。
[0005] 微生物產(chǎn)生的許多次級代謝產(chǎn)物都具有重要價值。在這方面重要的一類是β -內(nèi) 酰胺抗生素（尤其是青霉素類和頭孢菌素類）。生物合成青霉素的第一步是將三個氨基酸 的L-異構(gòu)體（L- α -氨基己二酸（A)、L-半胱氨酸（C)和L-纈氨酸（V))縮合為一個三肽 (δ - (L- α -氨基己二?；?L-半胱氨?；?D-纟顏氨酸（ACV))。該步由δ - (L- α -氨基己 二?；?L_半胱氨?；?D-纈氨酸合成酶（ACVS)催化。在第二步，ACV在異青霉素 Ν合成 酶（IPNS)作用下被氧化環(huán)化。該步反應(yīng)的產(chǎn)物是異青霉素 N，通過將其親水性的α -氨基己 二?；鶄?cè)鏈置換為疏水性側(cè)鏈可形成青霉素 G或青霉素 V。在工業(yè)生產(chǎn)中通常使用的側(cè)鏈 是產(chǎn)生青霉素 G的苯乙酸或產(chǎn)生青霉素 V的苯氧基乙酸。置換反應(yīng)由酰基轉(zhuǎn)移酶催化。盡 管研究顯示己二酸和己二酸的某些硫代衍生物能夠被置換（W095/04148和W095/04149)， 但由于?；D(zhuǎn)移酶的底物特異性，幾乎不可能將α -氨基己二?；鶄?cè)鏈置換為感興趣的任 意其它側(cè)鏈。特別地，工業(yè)上重要的青霉素類和頭孢菌素類的側(cè)鏈不能通過?；D(zhuǎn)移酶被 直接置換。因此，目前使用的大部分β -內(nèi)酰胺抗生素是通過半合成方法制備的。這些半合 成的β -內(nèi)酰胺抗生素是通過利用一個或多個化學(xué)反應(yīng)和/或酶反應(yīng)修飾Ν-取代β -內(nèi) 酰胺產(chǎn)物得到的。這些半合成方法的缺點(diǎn)在于步驟繁多、不環(huán)保而且成本高。因此，利用完 全發(fā)酵方法生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺抗生素（例如羥氨芐青霉素、氨芐青霉素、依比青霉素、頭孢羥 氨芐、頭孢氨芐和頭孢拉定）是相當(dāng)令人期待的。
[0006] 對于半合成青霉素類和頭孢菌素類的完全發(fā)酵方法，有多種選項(xiàng)可供考慮。 W02008/040731中建議改良青霉素生物合成方法的前兩步以直接合成和分泌羥氨芐青霉 素。例如，對于羥氨芐青霉素，構(gòu)建包括羥氨芐青霉素側(cè)鏈的三肽（即D-4-羥苯基甘氨酰 基-L-半胱氨酰基-D-纈氨酸）而非ACV，隨后用改良的IPNS環(huán)化所述三肽。
[0007] ACVS是催化形成LLD-ACV三肽的NRPS。在這個三肽中，L-α-氨基己二酸的δ-羧 基和L-半胱氨酸的氨基之間形成肽鍵；此外，纈氨酸的構(gòu)象從L改變?yōu)镈。W02008/040731 中公開了經(jīng)改良的ACVS，其能夠催化L-4-羥苯基甘氨?；?L-半胱氨?；?D-纈氨酸和 L-苯基甘氨?；?L-半胱氨?；?D-纈氨酸（氨芐青霉素的前體）的形成并能將第一個氨 基酸的L立體化學(xué)構(gòu)型更改為D構(gòu)型。W02008/040731中還公開了能夠作用于D-4-羥苯基 甘氨?；?L-半胱氨酰基-D-纈氨酸和D-苯基甘氨?；?L-半胱氨?；?D-纈氨酸的工 程IPNS和天然的IPNS。
[0008] 優(yōu)選地，在能夠用于工業(yè)生產(chǎn)的生物體（例如真核生物，例如曲霉屬Aspergillus 和青霉菌屬Penicillium)中實(shí)施上述方法。這種方法的問題在于產(chǎn)量仍然很低，因此需要 大力改善。
[0009] 發(fā)明詳沭
[0010] 在本發(fā)明的語境中，術(shù)語"腺苷?；δ苡?是指能夠識別和激活特定氨基酸的蛋 白質(zhì)序列。優(yōu)選的腺苷?；δ苡騺碓从谀軌蚝喜⒏鱾€氨基酸的非核糖體肽合成酶。
[0011] 術(shù)語"N- a -氨基-4-羥苯基乙?；?-內(nèi)酰胺抗生素"是指具有4-羥苯基甘氨 酸側(cè)鏈的β-內(nèi)酰胺抗生素，例如羥氨芐青霉素、頭孢羥氨芐、頭孢曲秦、頭孢哌酮、頭孢匹 胺、頭孢丙烯以及它們的中間體等，優(yōu)選的是羥氨芐青霉素。
[0012] 術(shù)語"Ν- a -氨苯基乙酰基β -內(nèi)酰胺抗生素"是指具有苯基甘氨酸側(cè)鏈的β -內(nèi) 酰胺抗生素，例如氨芐青霉素、頭孢克洛、頭孢氨芐、頭孢甘氨酸以及它們的中間體等，優(yōu)選 的是氨芐青霉素。
[0013] 術(shù)語"模塊"定義了能夠?qū)⒁粋€肽結(jié)構(gòu)單元（通常是氨基酸）合并至產(chǎn)物（通常 是肽）的催化單元，它可以包括用于修飾（如差向異構(gòu)化和甲基化）的功能域。
[0014] 術(shù)語"異源的"與模塊聯(lián)合使用時，是指所涉及的模塊中的功能域（例如腺苷酰化 功能域或縮合功能域）源于不同的模塊。這些不同的模塊可源于相同的酶或不同的酶。
[0015] 術(shù)語"特異于"表示被稱為特異于指定氨基酸的模塊能夠合并該氨基酸。
[0016] 本發(fā)明的第一方面公開了制備Ν- a -氨基-4-羥苯基乙?；颚? a -氨苯基乙酰 基β -內(nèi)酰胺抗生素的方法，其中所述方法包括以下步驟：
[0017] (a)將4-羥苯基甘氨酸或苯基甘氨酸、半胱氨酸和纈氨酸與非核糖體肽合成酶 (NRPS)接觸，以分別產(chǎn)生4-羥苯基甘氨酰基-半胱氨?；?纈氨酸三肽或苯基甘氨酰 基-半胱氨酰基-纈氨酸三肽；
[0018] (b)將在步驟（a)中得到的三肽與異青霉素 N合成酶接觸，
[0019] 其中存在類MbtH蛋白。
[0020] R. H. Baltz (J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (2011)38, 1747-1760) > Felnagle 等 人（Biochemistry(2010)避，8815-8817)、Wenjum Zhang 等人(Biochemistry(2010)49, 9946-9947)和 Boll 等人（J. Biol. Chem. (2011)286,36281-36290)中暗示了加入類 MbtH 蛋白以改善原始原核宿主體外和體內(nèi)的腺苷酰化，然而這些文件既沒有指出這種方法可以 成功用于真核生物，也沒有指示在生產(chǎn)β_內(nèi)酰胺抗生素時使用類MbtH蛋白?？傊?，迄今 為止還沒有類MbtH蛋白參與合并羥苯基甘氨酸或苯基甘氨酸的報道。相反，Stegman等 人（FEMS Microbial Letter (2006) 262,85-92)中公開了相反情況，即利用 Amycolatopsis balhimycina生產(chǎn)糖肽（包括輕苯基甘氨酸）時，并不需要由balhimycin生物合成基因簇 的內(nèi)部基因編碼的微小類MbtH蛋白。因此，現(xiàn)有技術(shù)沒有提供任何關(guān)于在制備N- α -氨 基-4-羥苯基乙酰基β -內(nèi)酰胺抗生素或Ν- α -氨苯基乙?；?-內(nèi)酰胺抗生素的過程中 使用類MbtH蛋白的教導(dǎo)。出人意料地，我們發(fā)現(xiàn)只有在類MbtH蛋白存在時，方可以通過本 發(fā)明的腺苷?；δ苡蚝喜-羥苯基甘氨酸或L-苯基甘氨酸。
[0021] 在第一個實(shí)施方式中，優(yōu)選的類MbtH蛋白在R. H. Baltz (J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (2011)翌，1747-1760)中有描述。更優(yōu)選的類MbtH蛋白是包括不變的氨基 酸 N17、E19、Q21、S23、W25、P26、P32、G34、W35、L48、W55、T56、D57、R59 和 P60 的那些，也 可被適當(dāng)表示為氨基酸代碼nxexqxsxwp-x5-pxgw-x13-l-x 7-wtdxrp。在上述表示法中，字 母D、E、G、L、N、P、Q、R、S、T、W和X指的是公知的單字母氨基酸代碼（其中X表示1個未 指定的氨基酸、X 5表示5個未指定的氨基酸、X7表示7個未指定的氨基酸、X13表示13個 未指定的氨基酸）。優(yōu)選地，本發(fā)明的類MbtH蛋白存在于如下的生物合成簇中，其中模塊 Ml是從所述生物合成簇中選擇的（見下文）。最優(yōu)選的類MbtH蛋白是在Actinoplanes teichomyceticus 的 teicoplanin 生物合成族中得到的 Tcpl3 (SEQ ID NO : 18)或 Tcpl7 (SEQ ID NO :19) (Sosio 等人，Microbiology(2004)lM，95-102)，或者在從非培養(yǎng)的土壤細(xì)菌 中可得到的Veg生物合成簇中鑒定的由GenBank :EU874252的第33826-34035核苷酸編 碼的類 MbtH 同系物（SEQ ID NO :20) (Banik J. J. USA(2008)1^，17273-17277)，或者在從非培養(yǎng)的土壤細(xì)菌中可得到的Teg生物合成簇 中鑒定的由GenBank :EU874253的第33949-33158核苷酸編碼的類MbtH同系物（SEQ ID NO :32) (BanikJ. J.和 Brady S. F.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2008) 105,17273-17277)， 或者在Actinoplanes balhimycina的balhimycin生物合成簇中鑒定的類MbtH同系 物（SEQ ID NO :31) (Recktenwald 等人，Microbiology (2002) 148,1105-1118, Stegman 等人，F(xiàn)EMSMicrobial Lett. (2006) 262,85-92),或者在 Streptomyces lavendulae 的 complestatine生物合成簇中鑒定的類MbtH同系物（SEQ ID NO :30) (Chiu等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001)並，8548-8553)，或者含有與所述序列的同一性百分比至少為 30%，更優(yōu)選地至少40%，甚至更優(yōu)選地至少50%，最優(yōu)選地至少60%的氨基酸序列的類 MbtH蛋白。這些同一性百分比至少為30%的多肽模塊也被稱為同源序列或同系物。
[0022] 因?yàn)槟K的腺苷?；δ苡蜇?fù)責(zé)識別和激活專門的氨基酸，并將正確的氨基酸裝 載至其下游相鄰的搭檔-硫醇化功能域，所以它決定了對特定氨基酸的特異性。腺苷?；?功能域催化下述腺苷?；磻?yīng)：
[0023] 氨基酸+ ATP ?氨?；?AMP + PPi
[0024] ATP、Mg2+和氨基酸依次可逆結(jié)合至腺苷?；δ苡颉ｋS后，由氨基酸介導(dǎo)，ATP被 腺苷?；δ苡蚩赡媪呀鉃锳MP。在這后一步驟中，釋放焦磷酸。判斷腺苷?；禺愋缘囊?些合適方法是本領(lǐng)域已知的。
[0025] 經(jīng)典的放射性ATP-[32P]焦磷酸（PPi)置換試驗(yàn)（Santi等人（Meth. Enzymol. (1974)豊，620-627))是判斷腺苷?；δ苡蛱禺愋缘某Ｒ姺椒?。該方法利用AMP至ATP的 可逆反應(yīng)量化腺苷酰化功能域與各底物之間的反應(yīng)。它利用[ 32P]PPi被合并至AMP時形成 的被同位素標(biāo)記的ATP。檢測增加的被標(biāo)記的ATP以探測腺苷酰化反應(yīng)（例如Recktenwald 等人(2002)Microbiol〇Ryl48,1105-1118)。為了本發(fā)明的目的，使用更新近研發(fā)的試驗(yàn)分 析焦磷酸的形成，該試驗(yàn)無需使用放射性磷酸鹽即可測定焦磷酸的釋放。這些試驗(yàn)利用無 機(jī)焦磷酸酶將在氨?；?AMP形成過程中產(chǎn)生的焦磷酸轉(zhuǎn)化為正磷酸（Pi)。為了測量正磷 酸的濃度，一部分這些試驗(yàn)利用鑰酸鹽/孔雀綠試劑進(jìn)行比色檢驗(yàn)（McQuade等人2008)或 者利用7-甲基-6-硫鳥苷（MESG)被嘌呤核苷磷酸化酶轉(zhuǎn)換時最大吸光度的變化（如本發(fā) 明的語境中所使用的）（Ehmann D.E.等人（Proc. Natl. Acad Sci. (2000)21,2509-2514)或 Daniel&Aldrich(Anal. Biochem. (2010)404,56-63))。
[0026] 為了完成這些試驗(yàn)，相應(yīng)的酶優(yōu)選地是純化過的蛋白。技術(shù)人員可利用一些方法 獲得這些純化過的蛋白。這些方法包括在合適的宿主生物體（例如Escherichia coli或 Streptomyces lividans)內(nèi)，異源過表達(dá)包括腺苷?；δ苡虻恼麄€模塊或者模塊的單一 腺苷?；δ苡颍缋鏡ecktenwald等人(Microbiology (2002) 148,1105-1118)中所公 開的。優(yōu)選地，這些功能域或模塊帶有一個標(biāo)簽，可利用該標(biāo)簽通過親和層析進(jìn)行純化。如 本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，這些標(biāo)簽對于酶的表征是有用的，但對于它們在合適宿主中的性 能則是不需要的。
[0027] 在第二個實(shí)施方式中，本發(fā)明的NRPS構(gòu)建體包括三個模塊：特異于4-羥苯基甘氨 酸和/或苯基甘氨酸的第一模塊Ml、特異于半胱氨酸的第二模塊M2和特異于纈氨酸的第三 模塊M3。第一模塊Ml能夠合并第一個氨基酸L-4-羥苯基甘氨酸或L-苯基甘氨酸，并優(yōu)選 地將其轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的D-氨基酸。當(dāng)被4-羥苯基甘氨酸或苯基甘氨酸結(jié)合時，第二模塊M2 能夠合并L-半胱氨酸。特別地，當(dāng)4-羥苯基甘氨酸或苯基甘氨酸是D-型時，特異于半胱氨 酸的第二模塊包括特異于D-供體和L-受體的縮合功能域（ DCJ，該功能域與異源的腺苷酰 化功能域融合。第三模塊M3能夠合并L-纈氨酸并將其轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的D-氨基酸。NRPS以 這種方式催化從L-氨基酸前體到DLD-三肽（D-4-羥苯基甘氨?；?L-半胱氨?；?D-纈 氨酸或者D-苯基甘氨?；?L-半胱氨?；?D-纈氨酸）的形成。
[0028] 每個NRPS模塊都由所謂的"功能域"組成，每個功能域負(fù)責(zé)合并一個多肽結(jié)構(gòu)單 元的過程中特定的反應(yīng)步驟。每個模塊至少含有一個負(fù)責(zé)識別和激活氨基酸的腺苷?；?能域和一個負(fù)責(zé)將中間體轉(zhuǎn)運(yùn)至催化中心的硫醇化功能域。第二模塊和其它模塊另外包含 負(fù)責(zé)肽鍵形成的縮合功能域，最后一個模塊進(jìn)一步包含負(fù)責(zé)釋放肽的終止功能域。任選地， 模塊可包含例如負(fù)責(zé)將被合并氨基酸的L-型轉(zhuǎn)換為D-型的差向異構(gòu)化功能域。NRPS的模 塊化結(jié)構(gòu)的綜述請參見Sieber等人（Chem.Rev. (2005) 105,715-738) 〇
[0029] 在第三個實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的雜交肽合成酶的Ml模塊的合適來源是催化 形成包括4-羥苯基甘氨酸或苯基甘氨酸的肽的NRPS，其中4-羥苯基甘氨酸或苯基甘氨酸 作為所述肽的第一個氨基酸被合并。因此，選擇合適的Ml模塊時要考慮到作為三肽的第一 個氨基酸被合并的氨基酸的性質(zhì)。特別地，模塊的腺苷酰化功能域決定了對于特定氨基酸 的選擇性。因此，可基于腺苷?；δ苡?qū)Ρ缓喜被岬奶禺愋赃x擇Ml模塊?？筛鶕?jù)腺 苷?；δ苡虻臎Q定特異性的特征性基序（如Stachelhaus等人（Chem. &Biol. (1999)巨， 493_5〇5)和 Rausch 等人（Nucleic Acids Res. (2〇〇5)，M，5799_58〇8)中所解釋的）進(jìn)行 選擇。因?yàn)镸l模塊是NRPS的第一個模塊，所以它不需要包含縮合功能域或終止功能域。因 此，如果源模塊中存在縮合和/或終止功能域，可將其適當(dāng)移除以獲得不含所述功能域的 第一模塊Ml。如果L-氨基酸需要被轉(zhuǎn)換為D-氨基酸，那么除含腺苷?；δ苡蚝土虼蓟?功能域之外，NRPS的Ml模塊還應(yīng)該含有差向異構(gòu)化功能域。因此，如果源模塊中不存在差 向異構(gòu)化功能域，則將其融合至源模塊的硫醇化功能域以獲得含有腺苷?；δ苡?、差向 異構(gòu)化功能域和終止功能域的第一模塊Ml。
[0030] 優(yōu)選地，從參與形成糖肽抗生素 vancomycin或vancomycin類化合物 (chloroeremomycin 或 balhimycin)的合成酶、vancomycin 合成酶、chloroeremomycin 合 成酶或者balhimycin合成酶的特異于4-羥苯基甘氨酸的模塊中可得到具有4-羥苯基甘 氨酸特異性的第一模塊Ml。優(yōu)選的模塊是vancomycin合成酶、chloroeremomycin合成 酶、balhimycin合成酶或者Veg合成酶的第四和第五模塊（和Veg合成酶的第一和第三 模塊）。優(yōu)選的來源是從Amycolatopsis orientalis中可得到的chloroeremomycin合 成酶（Trauger 等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA (2000)應(yīng)，3112-3117)、從 Amycolatopsis balhimycina(原名 Amycolatopsis mediterranei)的 Blp 族中可得至lj 的 balhimycin 合 成酶（Recktenwald 等人，Microbiology(2002) 148,1105-1118)和從非培養(yǎng)的土壤細(xì)菌 的 Veg 族中可得到的 Veg 合成酶（Banik J. J.和13四(173.卩.，？1'〇(3.似1:1.六〇3(1.3(3；[· USA(2008) 105,17273-17277) 〇或者，可以從參與形成脂糖肽類抗生素 teicoplanin或 teicoplanin 類抗生素（如 A47934、A40926 或 Teg)的合成酶、teicoplanin 合成酶、A47934 合成酶、A40926合成酶或者Teg合成酶中獲得特異于4-羥苯基甘氨酸的模塊。優(yōu)選的 模塊是teicoplanin合成酶、A47934合成酶、A40926合成酶或者Teg合成酶的第一、第四 和第五模塊。優(yōu)選地，從源于 Actinoplanes teichomyceticus 的 Tcp 族的 teicoplanin 合成酶（Sosio 等人，Microbiology(2004) 150,95-102)、從 Streptomyces toyocaensis NRRL15009的Sta簇中可得到的A47934合成酶、從Nanomurea sp. ATCC39727的Dbv簇中可 得到的A40926合成酶（Sosio等人，Chem. Biol. (2003)叢，541-549)或者從非培養(yǎng)的土壤細(xì) 菌的的Teg族中可得到的Teg合成酶（Banik J. J.和13四(17 3.卩.，？1'〇(3.似1:1.八〇&(1.3(3；[· USA(2008) 105,17273-17277)獲得這些模塊?；蛘撸梢詮腸omplestatin合成酶（優(yōu)選地 是從 Streptomyces lavendulae 可以得到的 complestatin 合成酶），特別是 complestatin 合成酶的第七模塊得到特異于4-輕苯基甘氨酸的模塊（Chiu等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA (2001)並，8548-8553);或者，從CDA (鈣離子依賴的抗生素）合成酶，特別是CDA合成酶 的第六模塊（利用如Hojati等人（Chem.&Biol. (2002)2,1175-1187)所公布的CDA合成酶 模塊的編號）中得到具有4-羥苯基甘氨酸特異性的第一模塊Ml。優(yōu)選地，從Str印tomyces coelicolor中獲得CDA合成酶。
[0031] 或者，為了制備Ν-α-氨苯基乙酰基β-內(nèi)酰胺抗生素，可以從pristinamycin合 成酶，特別是pristinamycin合成酶的SnbD蛋白的羧基末端模塊獲得具有苯基甘氨酸特 異性的第一模塊M1，如Thibaut等人（J.Bact. (1997) 179,697-704)所公布的。優(yōu)選地，從 Streptomyces pristinaspiralis 中可獲得卩1^81:;[11已1115^;[11合成酶。源于卩1'181:;[11已1115^;[11合 成酶的羧基末端源模塊含有終止功能域，但不含差向異構(gòu)化功能域。為了制備作為本發(fā)明 的肽合成酶的第一模塊的模塊，適當(dāng)移除羧基末端源模塊中的終止功能域并將差向異構(gòu)化 功能域融合至被如此修飾后的羧基末端模塊的硫醇化功能域?？梢詮娜我夂线m的NRPS，例 如相同NRPS酶的另一個模塊或者具有相似（例如4-羥苯基甘氨酸或苯基甘氨酸）或不同 的腺苷?；δ苡虻陌被崽禺愋缘牟煌琋RPS酶的的模塊獲得差向異構(gòu)化功能域。優(yōu)選 地，從Streptomyces coelicolor的CDA合成酶，優(yōu)選地從所述酶第六模塊（如上所詳述） 可獲得差向異構(gòu)化功能域。因此，在這個實(shí)施方式中，NRPS的模塊Ml是雜交的模塊。上述 差向異構(gòu)化功能域還可以被融合至那些具有4-羥苯基甘氨酸特異性但缺少差向異構(gòu)化功 能域的模塊Ml (如第一個實(shí)施方式中所述）。
[0032] 出人意料地，我們發(fā)現(xiàn)：在類MbtH蛋白存在時，一些具有4-羥苯基甘氨酸特異 性的模塊Ml (如第一個實(shí)施方式中所述）能夠激活L-苯基甘氨酸，因此它們適合作為第 一模塊Ml用于構(gòu)建生產(chǎn)Ν-α-氨苯基乙?；?內(nèi)酰胺抗生素的NRPS構(gòu)建體。這些模 塊的實(shí)例有teicoplanin合成酶、A47934合成酶或A40926合成酶的第一模塊。優(yōu)選地， 從源于 Actinoplanes teichomyceticus 的 Tcp 族的 teicoplanin 合成酶（Sosio 等人， Microbiology (2004) 150,95-102)、從 Streptomyces toyocaensis NRRL15009 的 Sta 族 可獲得的A47934合成酶或者從Nanomurea sp. ATCC39727的Dbv簇可獲得的A40926合 成酶（Sosio等人，Chem. Biol. (2003)邊，541-549)中獲得這些第一模塊。更進(jìn)一步，這 些模塊是teicoplanin合成酶或Veg合成酶的第三模塊。優(yōu)選地，從源于Actinoplanes teichomyceticus 的 Tcp 族的 teicoplanin 合成酶(Sosio 等人，Microbiology (2004) 150, 95-102)或者從非培養(yǎng)的土壤細(xì)菌的Veg簇中可獲得的Veg合成酶（Banik J.J.和Brady S. F. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2008) 105,17273-17277)中獲得這些第一模塊。更進(jìn)一步， 這些模塊是chloroeremomycin合成酶或balhimycin合成酶的第五模塊。優(yōu)選的第五模塊 的來源是從 Amycolatopsis orientalis 可獲得的 chloroeremomycin 合成酶（Trauger 等 人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA (2000)97, 3112-3117)和從 Amycolatopsis balhimycina (原 名 Amycolatopsis mediterranei)的 Blp 族中可獲得的 balhimycin 合成酶（Recktenwald 等人，Microbiology (2002) 148,1105-1118)。
[0033] 在第四個實(shí)施方式中，肽合成酶的第二模塊M2應(yīng)該能夠合并三肽DLD-XCV的第 二個氨基酸-半胱氨酸，其中X是4-羥苯基甘氨酸或苯基甘氨酸。如Stachelhaus等人 (Chem. &Biol. (1999)§，493-505)中所公布的，可基于腺苷?；δ苡虻臎Q定特異性的特征 性基序選擇該模塊。第二模塊M2的一個實(shí)例是肽合成酶Ecm7的第一模塊，通過突變除去 Ecm7 的 N-甲基化活性（如 Watanabe 等人（Curr. Opin. Chem. Biol. (2009) 13,189-196)中 所述），使所述模塊在利用Streptomyces lasaliensis生物合成echninomycin( -種醌 霉素抗生素）時天然地合并 N-Me-L-Cys-N-Me-L-Val (Watanabe 等人在 Nat. Chem. Biol. (2006)1423-428)。
[0034] 為了將L-半胱氨酰受體連接至D-X-氨?；w，M2模塊的縮合功能域是功 能域（如上文所概述以及Clugston等人（Biochemistry (2003)堅(jiān)，12095-12104)中所解釋 的）。該功能域被融合至異源的腺苷?；δ苡?。包括這種DCf腺苷酰化功能域構(gòu)型的 雜交M2模塊能夠合并半胱氨酸。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，從本發(fā)明的肽合成酶的第一模 塊Ml的源模塊的緊鄰下游模塊中可獲得M2模塊的功能域。例如，肽合成酶的M2模塊的 功能域是CDA合成酶（第一模塊Ml的來源）的第七模塊的功能域。在另一個實(shí)施方 式中，肽合成酶的M2模塊的功能域是Bacillus subtilis RB14的Iturin合成酶（蛋 白質(zhì) ItuC)的第二模塊的 DCL 功能域，如 Tsuge 等人（J.Bacteriol. (2001) 183,6265-6273) 中所解釋的。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，至少可以從肽合成酶的第三模塊M3的來源 酶中獲得部分肽合成酶的第二模塊M2。特別地，從本發(fā)明的肽合成酶的第三模塊的源模塊 的緊鄰上游模塊中可獲得肽合成酶的M2模塊的腺苷?；δ苡蚝土虼脊δ苡颉＠?，肽合 成酶的M2模塊的腺苷?；δ苡蚝土虼脊δ苡蚩梢允茿CVS的第二模塊的腺苷?；δ苡?和硫醇功能域。
[0035] 在第五個實(shí)施方式中，肽合成酶的第三模塊M3能夠合并三肽的第三個氨基酸-纈 氨酸并將其轉(zhuǎn)換為D-型，以產(chǎn)生三肽DLD-XCV。第三模塊M3的一個實(shí)例是肽合成酶 Ecm7的第二模塊，通過突變除去Ecm7的N-甲基化活性（如Watanabe等人（Curr. Opin. Chem. Biol. (2009)垃，189-196)中所述）并將差向異構(gòu)化功能域融合至硫醇化功能域，使 所述模塊能夠天然地將 N-Me-L-Cys-N-Me-L-Val 合并至 Streptomyces lasaliensis 的 echninomycin(Watanabe 等人在 Nat. Chem. Biol. (2006)2,423-428)。可以從任意合適的 NRPS，例如相同NRPS酶的另一個模塊或者不同NRPS酶的具有相似（例如L-纈氨酸）或 不同的腺苷?；δ苡虻陌被崽禺愋缘牟煌哪K獲得差向異構(gòu)化功能域。在本發(fā)明 的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，可以從ACVS，優(yōu)選地從ACVS的第三模塊中獲得肽合成酶的第三模 塊。如上所述的ACVS優(yōu)選地是細(xì)菌或真菌的ACVS，更優(yōu)選地是從Nocardia lactamdurans 可得到的細(xì)菌ACVS或者從絲狀真菌（例如Penicillium chrysogenum、Acremonium chrysogenum 和 Aspergillus nidulans)可得到的真菌 ACVS。
[0036] 肽合成酶的模塊Ml、M2和M3可以含有如W02008/040731中所公開的氨基酸序 列。因此，肽合成酶的Ml模塊含有，例如根據(jù)W02008/040731的SEQ ID N0 :2或4或者本 發(fā)明的SEQ ID NO :1-9的氨基酸序列，或者與所述序列的同一性百分比至少30%，更優(yōu)選 地至少40%，甚至更優(yōu)選地至少50%，最優(yōu)選地至少60 %的氨基酸序列。同一'丨生百分比至 少30%的這種多肽模塊也被稱為同源序列或同系物。同樣地，肽合成酶的M2模塊含有，例 如根據(jù)W02008/040731的SEQ ID N0:6或8的氨基酸序列或者與所述序列的同一性百分比 至少30 %，更優(yōu)選地至少40 %，甚至更優(yōu)選地至少50 %，最優(yōu)選地至少60 %的氨基酸序列。 最后，肽合成酶的M3模塊含有，例如根據(jù)W02008/040731的SEQ ID N0 :10的氨基酸序列或 者與所述序列的同一性百分比至少30 %，更優(yōu)選地至少40 %，甚至更優(yōu)選地至少50 %，最 優(yōu)選地至少60 %的氨基酸序列。
[0037] 可以通過如W02008/040731中所公開的方法獲得本發(fā)明的NRPS構(gòu)建體的模塊。通 常，模塊的腺苷?；δ苡驔Q定了對特定氨基酸的特異性，但差向異構(gòu)化功能域和縮合功 能域可從選擇的任意模塊中獲得?？梢酝ㄟ^以適當(dāng)?shù)捻樞蛉诤线m當(dāng)?shù)墓δ苡蚝?或模塊來 構(gòu)建工程N(yùn)RPS。也可以將一種酶的模塊或功能域置換為合適的另一種酶的模塊或功能域。 可以使用本領(lǐng)域公知的基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)這種功能域和/或模塊的融合或置換。通常可在 模塊或功能域之間的連接區(qū)域完成兩種不同模塊或功能域的融合。請參見例如公開這些構(gòu) 建方法的 EP1255816 和 Mootz 等人（Proc. Natl. Acad. Sci. USA，（2000)21，5848-5853)。也 可以通過定制合成適當(dāng)?shù)亩嗪塑账嵝蛄幸垣@得部分或全部序列。
[0038] 例如，可以在連接位置（更具體地，如果是羧基末端模塊，則在縮合功能域和特異 于4-羥苯基甘氨酸模塊的腺苷酰化功能域之間；如果是內(nèi)部延伸模塊，則在縮合功能域和 特異于4-羥苯基甘氨酸模塊的腺苷酰化功能域之間以及差向異構(gòu)化功能域和隨后的功能 域（縮合功能域或終止功能域）中間）利用限制性內(nèi)切酶消化相應(yīng)NRPS基因進(jìn)行分離，從 而將源于特異于4-羥苯基甘氨酸的NRPS模塊的腺苷酰化-硫醇化-差向異構(gòu)化三功能域 片段融合至ACVS的二模塊的特異于半胱氨酸-纈氨酸的片段。可通過以下步驟獲得ACVS 的二模塊的特異于半胱氨酸-纈氨酸的片段：1)保留羧基末端的完整，和2)將特異于半 胱氨酸的模塊2的縮合功能域置換為具有特異性的縮合功能域。類似于腺苷酰化-硫 醇化-差向異構(gòu)化片段的分離，可分離包括鄰近下游模塊的縮合功能域的腺苷酰化-硫醇 化-差向異構(gòu)化-縮合化四功能域片段。后者被融合至ACVS的二模塊的特異于半胱氨 酸-纈氨酸的片段（不含上游縮合功能域）。
[0039] 在第六個實(shí)施方式中，可以使用基因突變技術(shù)適當(dāng)處理本文所述的NRPS酶，例如 用以改善酶的催化性能?？梢酝ㄟ^合成的方法生產(chǎn)本文所述的多肽，但通常通過在合適的 宿主生物體中表達(dá)編碼多肽的多核苷酸序列重組產(chǎn)生。使用如W02008/040731中所述的方 法獲得編碼本發(fā)明的NRPS構(gòu)建體的多核苷酸、具有改善活性的多肽和包括所述多核苷酸 的載體。
[0040] 本發(fā)明的第二方面提供宿主細(xì)胞，其中用如W02008/040731中所述的多核苷酸 (或載體）和根據(jù)本發(fā)明所述的允許表達(dá)類MbtH蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)化所述宿主細(xì)胞或者 所述宿主細(xì)胞包括上述多核苷酸（或載體）和多核苷酸。合適的宿主細(xì)胞能夠使感興趣的 多肽高水平表達(dá)。如果需要產(chǎn)生并進(jìn)一步使用多肽（例如在體外反應(yīng)中），則可使用這種 宿主細(xì)胞。如果生產(chǎn)的本發(fā)明的多肽實(shí)質(zhì)上不含具有與本發(fā)明的多肽相似的活性的其它多 肽，那么可以選擇異源宿主。這可以通過選擇通常不產(chǎn)生具有相似活性的這種多肽的宿主 實(shí)現(xiàn)。能夠產(chǎn)生β -內(nèi)酰胺化合物的細(xì)胞也是合適的宿主細(xì)胞，優(yōu)選能夠高水平產(chǎn)生β -內(nèi) 酰胺化合物的細(xì)胞。可基于生產(chǎn)青霉素或頭孢菌素化合物的選項(xiàng)來選擇宿主。
[0041] 在一個實(shí)施方式中，合適的宿主細(xì)胞中編碼ACVS和/或IPNS酶的原生基因被滅 活，例如通過插入失活。還可以刪除包括編碼ACVS、IPNS和AT的基因的完整青霉素生物合 成簇。用這種方法可以在生產(chǎn)感興趣的β-內(nèi)酰胺化合物的同時不產(chǎn)生天然β-內(nèi)酰胺。 可使用如上所述的編碼NRPS和/或IPNS的基因?qū)崿F(xiàn)插入失活。在含有多拷貝的β-內(nèi)酰 胺基因簇的宿主細(xì)胞中，可選擇天然缺失這些基因簇的宿主細(xì)胞。例如，W02007/122249中 描述了 β-內(nèi)酰胺基因簇的缺失。
[0042] 另一個合適的宿主細(xì)胞能夠合成前體氨基酸-4-羥苯基甘氨酸或苯基甘氨酸。 W02002/034921中公開了產(chǎn)生4-羥苯基甘氨酸或苯基甘氨酸的生物合成通路基因的異源 表達(dá)。通過下述步驟實(shí)現(xiàn)4-羥苯基甘氨酸或苯基甘氨酸的生物合成：首先從芳香族氨基酸 通路中分別回收4-羥基苯丙酮酸或苯丙酮酸，接著所述成分被分別轉(zhuǎn)換為4-羥基扁桃酸 或扁桃酸，然后被分別轉(zhuǎn)換為4-羥苯基乙醛酸或苯基乙醛酸，最后被分別轉(zhuǎn)換為D-4-羥苯 基甘氨酸或D-苯基甘氨酸。
[0043] 另一個合適的宿主細(xì)胞（過）表達(dá)4'-磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶。4'-磷酸泛酰 巰基乙胺（4'_phosphopantetheine)是脂肪酸合成酶和聚酮合成酶的?；d體蛋白以及 NRPS的肽基載體蛋白的基本輔基（prosthetic group)。
[0044] 在單體前體的多步驟組裝過程中，4' -磷酸泛酰巰基乙胺的游離硫醇部分與酰基 反應(yīng)中間體（通常是乙?；⒈；桶滨；┕矁r結(jié)合為硫酯。4'-磷酸泛酰巰基乙胺 部分來源于輔酶A，翻譯后被轉(zhuǎn)移至不變的絲氨酸側(cè)鏈。4'-磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶催化 脫輔基蛋白（apoprotein)轉(zhuǎn)換為全蛋白，該過程依賴Mg 2+。（過）表達(dá)具有廣泛底物特異 性的4' -磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶是有益的。例如，Bacillus brevis的gsp基因編碼這 種4'-磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶（如Borchert等人（J.Bacteriol. (1994) 176,2458-2462) 中所述）。
[0045] 宿主可適當(dāng)?shù)匕ㄒ环N或多種上述修飾。優(yōu)選的宿主是能夠用于工業(yè)生產(chǎn)的 微生物，例如真核生物，如青霉菌屬（例如Penicillium chrysogenum)、支項(xiàng)孢屬（例如 Acremonium chrysogenum)和曲霉屬（例如 Aspergillus nidulans)。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0046] 圖1-圖4描述了焦磷酸釋放試驗(yàn)中，對于底物L(fēng)-苯基丙氨酸（□)、0_苯基丙氨 酸（ )、L-羥苯基甘氨酸（·）和D-羥苯基甘氨酸（▲)的腺苷酰化活性測定值，其中 使用無底物的孵化以使測定值標(biāo)準(zhǔn)化。X-軸：
[0047] 時間（min) ;Y-軸：吸收值（360nm)。
[0048] 圖1 :使用控制蛋白TycA
[0049] 圖 2 :使用 StaA_Ml_A
[0050] 圖 3 :使用 Veg8_Ml_A
[0051] 圖 4 :使用 Veg8_Ml_A 和 Tcpl3 實(shí)施例
[0052] 通用材料和方法
[0053] 分子和遺傳技術(shù)
[0054] 標(biāo)準(zhǔn)的遺傳和分子生物學(xué)技術(shù)是本領(lǐng)域已知的（例如Maniatis等人"Molecular cloning ：a laboratory manual，'（1982)Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,N. Y. ；Miller^Experiments in molecular genetics，'（1972)Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. ;Sambrook 和 Russell，'Molecular cloning ：a laboratory manual，'（3rdedition)，'（2001) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press；AusubeCurrent protocols in molecular biology，'（1987) Green Publishing and Wiley Interscience, New York)〇
[0055] 質(zhì)粒和菌株
[0056] pMAL_c5x 從 New England Biolabs Inc.獲得，pACYCtac 在先前已有描 述(M. Kramer ^Untersuchungen zumEinf luss erhohter Bereitstellung van Erythrose-4-Phosphat und Phosphoenolpyruvat auf den Kohlesrofffluss in den Aromatenbiosyntheseweg von Escherichia coli，'， Berichte des Forschungszentrums Jiilich, 3824, ISSN0944-2952 (PhD Thesis, University of Diisseldorf)) 〇 使用 Escherichia coli 菌株ToplO(Invitrogen，Carlsbad, CA，USA)或DHlOb (Grant 等人（1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)§!，4645-4649)進(jìn)行克隆和表達(dá)蛋白。如 Mootz，H.D.等 人（Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000)^I，5848-53)以及 Mootz H. D.和 Marahiel，M. A. (J Bacteriol. (1997) 179,6843-6850)中所述的 Escherichia coli 菌株 M15pQE60_tycA pRep4 由 Prof. M. Marahiel, Philipps University Marburg, Marburg, Germany 提供。
[0057] 培養(yǎng)某
[0058] Escherichia coli 生長于2XPY培養(yǎng)基（16g/l BD BBL? Phytone? Peptone, 10g/ 1酵母提取物，5g/l NaCl)。補(bǔ)充抗生素（取決于所用質(zhì)粒，使用100 μ g/ml氨節(jié)青霉素，或 50 μ g/ml氨芐青霉素和20 μ g/ml氯霉素，或100 μ g/ml氨芐青霉素和25 μ g/ml新霉素） 以維持質(zhì)粒。使用終濃度為〇. 03-0. 5mM的IPTG以誘導(dǎo)基因表達(dá)。
[0059] 鑒定質(zhì)粒
[〇〇6〇] 利用本領(lǐng)域公知的遺傳、生化和/或表型方法（例如轉(zhuǎn)化株對抗生素的抗性、質(zhì)粒 DNA的純化、純化質(zhì)粒DNA的限制性酶切分析或DNA序列分析）鑒定帶有不同基因的質(zhì)粒。
[0061] 從Unim~ot/NCBI-ENV-PAT數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的NRPS序列中收集的椎定的HPG腺苷酰 化功會R域
[0062] 表 1
【權(quán)利要求】
1. 制備Ν-α -氨基-4-羥苯基乙?；?-內(nèi)酰胺抗生素或Ν-α -氨苯基乙?；?-內(nèi) 酰胺抗生素的方法，其中所述方法包括以下步驟： (a) 將4-羥苯基甘氨酸或苯基甘氨酸、半胱氨酸和纈氨酸與非核糖體肽合成酶接觸， 以分別產(chǎn)生4-羥苯基甘氨?；?半胱氨酰基-纈氨酸三肽或苯基甘氨?；?半胱氨酰 基 -纟顏氨酸二肽； (b) 將在步驟（a)中得到的三肽與異青霉素 N合成酶接觸， 其特征在于類MbtH蛋白的存在。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述類MbtH蛋白具有SEQ ID N0:18、19、20、30、 31或32或者至少50%同源于SEQ ID NO :18、19或20、30、31或32的序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述類MbtH蛋白具有氨基酸代碼NXEXQXSXWP-X5 -pxgw-x13-l-x7-wtdxrp。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述非核糖體肽合成酶包括特異 于4-羥苯基甘氨酸和/或苯基甘氨酸的第一模塊Ml、特異于半胱氨酸的第二模塊M2和特 異于纟顏氨酸的第三模塊M3。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中在真核微生物中進(jìn)行所述方法。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述真核微生物是青霉菌屬。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4-6中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述β-內(nèi)酰胺抗生素是 Ν-α -氨苯基乙酰基β -內(nèi)酰胺抗生素，所述第一模塊Ml包括一個腺苷?；δ苡?，其中所 述腺苷?；δ苡蜻x自SEQIDN0:1、2、3、4、5、6、7和至少50%同源于SEQIDN0 :1、2、3、 4、5、6或7的序列。
8. -種真核宿主細(xì)胞,其中所述宿主細(xì)胞包括非核糖體肽合成酶、異青霉素 N合成酶 和能夠表達(dá)類MbtH蛋白的多核苷酸。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其中所述類MbtH蛋白具有SEQ ID N0:18、19、20、 30、31或32或者至少50%同源于SEQ ID勵：18、19或20、30、31或32的序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其中所述類MbtH蛋白具有氨基酸代碼NXEXQXSX wp-x5-pxgw-x13-l-x7-wtdxrp。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8-10中的任意一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其是PeniciIlium chrysogenum、Acremonium chrysogenum 或 Aspergillus nidulans。
【文檔編號】C12P35/00GK104093831SQ201380007614
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月31日
【發(fā)明者】烏爾里克·瑪麗亞·穆勒爾, 瑞蒙·鮑爾, 魯洛夫·阿利·蘭斯·伯韋比格 申請人:中化帝斯曼制藥有限公司荷蘭公司