用于腦膜炎球菌中增加的蛋白表達(dá)的啟動子的制作方法
【專利摘要】描述了新啟動子來驅(qū)動腦膜炎球菌中的轉(zhuǎn)錄，例如用于過表達(dá)蛋白抗原以保持在膜囊泡中。經(jīng)修飾的porA啟動子缺少可以造成相轉(zhuǎn)變的野生型聚-G序列?？梢允褂媚X膜炎球菌rRNA編碼基因(例如，編碼16S?rRNA)來驅(qū)動蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄。這些方法可以組合使用。
【專利說明】用于腦膜炎球菌中增加的蛋白表達(dá)的啟動子
[0001] 本申請要求2012年2月2日提交的美國臨時(shí)專利申請61/594, 159的優(yōu)先權(quán)，其 全部內(nèi)容通過引用納入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于用于在腦膜炎球菌中控制轉(zhuǎn)錄的啟動子的領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0003] 腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis)是細(xì)菌性腦膜炎的病因。腦膜炎球 菌疫苗接種的一個(gè)方法依賴于外膜囊泡（0MV)，如在諾華（Novartis)MENZB?產(chǎn)品和挪威公 共衛(wèi)生研究院（Norwegian Institute of Public Health)MENBVAC?產(chǎn)品中所使用，兩者都 通過腦膜炎球菌的去污劑處理產(chǎn)生。
[0004] 已知改變腦膜炎球菌外膜的蛋白組成，并且因此改變0MV的組成。已經(jīng)描述了敲 除不需要的基因并且過表達(dá)需要的基因。參考文獻(xiàn)1-2, 3報(bào)道了 0MV疫苗的臨床前研究， 其中fHbp (也稱為GNA1870)過表達(dá)（并且這種過表達(dá)可以與LpxLl [4]的敲除結(jié)合）。參 考文獻(xiàn)5報(bào)道了 5種配方的0MV疫苗的臨床研究，其中敲除了 PorA和FrpB并且過表達(dá)Hsf 和TbpA。參考文獻(xiàn)6報(bào)道了由具有滅活的synX和lpxLl基因、過表達(dá)的fHbp、兩種不同的 PorA蛋白和穩(wěn)定化的OpcA表達(dá)的細(xì)菌制備的天然外膜囊泡疫苗的I期臨床研究。參考文 獻(xiàn)7報(bào)道了由具有滅活的synX和lpxLl基因（和，在兩個(gè)情況中，滅活的lgtA)、兩種不同 的PorA蛋白和過表達(dá)的NadA或fHbp的細(xì)菌制備的三價(jià)天然外膜囊泡疫苗。如果通過不 去除LPS的方法產(chǎn)生囊泡，諸如lpxLl的基因的滅活是重要的。
[0005] 蛋白組成中的這些變化可以多種方式實(shí)現(xiàn)。例如，細(xì)菌可以在鐵限制條件下生長 以促進(jìn)與鐵代謝相關(guān)的某些蛋白的表達(dá)。其他技術(shù)可以包括對細(xì)菌的工程改造。例如，參 考文獻(xiàn)8提出可以使用強(qiáng)啟動子（諸如porA、porB、lgtF或hpuAB啟動子）來上調(diào)保護(hù)性 外膜蛋白的表達(dá)，或可以去除抑制性轉(zhuǎn)錄控制機(jī)制。參考文獻(xiàn)9提出可以對基因進(jìn)行工程 改造以去除它們的相可變性。在參考文獻(xiàn)7中使用porA啟動子來過表達(dá)NadA，而使用tac 啟動子過表達(dá)fHbp。
[0006] 本發(fā)明的目標(biāo)是進(jìn)一步提供并且改善在腦膜炎球菌中改變蛋白表達(dá)的方式，并且 尤其是提供用于驅(qū)動感興趣基因的表達(dá)的啟動子?？梢允褂蒙险{(diào)來增加在0MV中有用蛋白 的水平。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的第一方面使用經(jīng)修飾的porA啟動子來驅(qū)動轉(zhuǎn)錄。如參考文獻(xiàn)8的實(shí)施 例10-16中使用的天然porA啟動子在其-35到-10區(qū)域之間含有聚-G序列，但是該序列 可能造成相轉(zhuǎn)變并且因此來自天然porA啟動子的表達(dá)可能不穩(wěn)定。本發(fā)明的經(jīng)修飾porA 啟動子有改善，因?yàn)樗鼈內(nèi)鄙僖吧途?G序列。
[0008] 因此，本發(fā)明提供了包含啟動子的核酸，其包括：
[0009] (i)來自腦膜炎球菌porA基因啟動子的-10區(qū)域和/或
[0010] (ii)來自腦膜炎球菌P〇rA基因啟動子的-35區(qū)域，
[0011] 其中-10區(qū)域和-35區(qū)域通過12-20個(gè)核苷酸的間插（或間隔子）序列隔開，并 且其中間插序列不含聚-鳥噪呤（guanidine)序列或者包括具有不超過8個(gè)連續(xù)鳥噪呤核 苷酸的聚-鳥嘌呤序列。
[0012] 本發(fā)明的第二方面使用來自腦膜炎球菌rRNA編碼基因（諸如16S rRNA基因）的 啟動子來驅(qū)動蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄。因此本發(fā)明也提供包含與下游的蛋白編碼基因可操作 連接的啟動子的核酸，其中該啟動子包括（i)來自腦膜炎球菌rRNA基因啟動子的-10區(qū)域 和/或（ii)來自腦膜炎球菌rRNA基因啟動子的-35區(qū)域。
[0013] 本發(fā)明也提供包含來自與具有5' UTR的蛋白編碼基因可操作連接的rRNA基因啟 動子的啟動子區(qū)域的核酸，所述5' UTR含有蛋白表達(dá)的翻譯調(diào)節(jié)元件。啟動子區(qū)域可以包 括⑴來自腦膜炎球菌rRNA基因啟動子的-10區(qū)域，（ii)來自腦膜炎球菌rRNA基因啟動 子的-35區(qū)域，和（iii)來自基因如porA基因的5' UTR。
[0014] 本發(fā)明也提供了包含啟動子的核酸，其包括SEQ ID N0:18,或SEQ ID N0:18的變 體，所述變體與SEQ ID NO :18之間存在最多4個(gè)（例如，1、2、3或4個(gè)）單核甘酸插入、刪 除或取代的差異。
[0015] 可以雜合形式使用porA和rRNA啟動子，例如具有來自porA啟動子的-10區(qū)域和 來自rRNA啟動子的-35區(qū)域（其可以是共有的-35區(qū)域）。因此，本發(fā)明也提供了包含啟 動子的核酸，其包括：
[0016] ⑴來自腦膜炎球菌rRNA基因的-10區(qū)域和來自腦膜炎球菌porA基因的-35區(qū) 域，或
[0017] (ii)來自腦膜炎球菌porA基因的-10區(qū)域和來自腦膜炎球菌rRNA基因的-35區(qū) 域。
[0018] 本發(fā)明的核酸可以在細(xì)菌中存在，并且尤其是在腦膜炎球菌中。啟動子可以驅(qū)動 與之可操作連接的下游蛋白編碼基因的表達(dá)（尤其是編碼外膜蛋白的基因），并且可以使 用該細(xì)菌來制備疫苗（尤其是基于囊泡的疫苗）。本發(fā)明也提供了這些細(xì)菌、這些囊泡和這 些疫苗。
[0019] 本發(fā)明的啟動子
[0020] 細(xì)菌啟動子中的兩個(gè)基本序列是-10區(qū)域（也稱為Pribnow盒）和-35區(qū)域。通 過間插序列分隔這些區(qū)域，并且在-10區(qū)域和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（+1)之間是短非轉(zhuǎn)錄上游序 列。
[0021] 已經(jīng)詳細(xì)研究了 PorA啟動子。參考文獻(xiàn)10報(bào)道了 6聚體的-35區(qū)域，之后是16 聚體或17聚體的間插序列，然后是7聚體Pribnow盒，然后是7-聚體非轉(zhuǎn)錄上游序列，之 后是轉(zhuǎn)錄核苷酸+1。在野生型porA基因中的起始密碼子在轉(zhuǎn)錄體的核苷酸+59,并且在參 考文獻(xiàn)8中證明了這個(gè)59聚體間隔。
[0022] 在本發(fā)明的啟動子包括來自腦膜炎球菌porA基因啟動子的-10區(qū)域的情況中，這 通常是6聚體TATAAT，即典型的-10區(qū)域6聚體。
[0023] 在本發(fā)明的啟動子包括來自腦膜炎球菌porA基因啟動子的-35區(qū)域的情況中，這 通常是6聚體TGGTTT或ATGGTT。
[0024] 在-35區(qū)域和-10區(qū)域之間的間插序列可以是12-20個(gè)核苷酸，例如12、13、14、 15、16、17、18、19或20個(gè)核苷酸。16、17或18個(gè)核苷酸的間插序列是典型的。
[0025] 短非轉(zhuǎn)錄上游序列通常是5-10個(gè)核苷酸，例如6、7或8個(gè)核苷酸。其可以是富G : C的，例如在序列中至少1/2的核苷酸是G或C，例如在6聚體非轉(zhuǎn)錄上游序列中至少3個(gè) G/C殘基。
[0026] 因此，啟動子可以包括6聚體-35區(qū)域、16聚體或17聚體間插序列、6聚體-10區(qū) 域和6聚體或7聚體非轉(zhuǎn)錄上游序列，得到總共34、35或36個(gè)核苷酸的核心啟動子。
[0027] 啟動子當(dāng)然可以在-35區(qū)域上游連續(xù)。-35區(qū)域上游的序列對于來自該啟動子的 高水平表達(dá)、來自該啟動子的表達(dá)調(diào)節(jié)可能是重要的。例如，在rRNA啟動子中核心啟動子 上游稱為UP-元件的序列能夠解釋它們提高轉(zhuǎn)錄高達(dá)300倍的突出力度[11，12]。這些可 以由RNA聚合酶核心的α-亞基所識別。因此本發(fā)明的啟動子可以包括上游UP-元件，其 通常是富A :T的。相似地，本發(fā)明的啟動子可以包括上游的CREN(奈瑟球菌的接觸調(diào)控元 件）[13]。
[0028] 在本發(fā)明的啟動子包括來自porA基因啟動子的-35區(qū)域和/或-10區(qū)域的情況 中，短非轉(zhuǎn)錄上游序列可以是TGAAGAC。
[0029] 在本發(fā)明的啟動子包括來自porA基因啟動子的-35區(qū)域和/或-10區(qū)域的情況 中，如實(shí)施例中所示，間插序列可以變化。例如，可以是TTTGCGGGGGGGGGGG(野生型16聚 體；SEQ ID NO :26)或 TTTGCGGGGGGGGGGGGG(野生型 18 聚體；SEQ ID NO :17)，但是并不優(yōu) 選這些野生型序列。相反，在這16聚體或18聚體中的11聚體或13聚體聚-G序列可以由 非-G核苷酸間斷。兩個(gè)優(yōu)選的間插序列是TTTGCGAGGGAGGTGG(16聚體；SEQ ID N0:27)和 TTTTGCGAGGGAGGTGG(17 聚體；SEQ ID NO :28)。
[0030] 在一些實(shí)施方式中，間插序列不含聚鳥嘌呤序列，即在間插序列中沒有GG二核苷 酸。在其他實(shí)施方式中，間插序列可以含有聚鳥嘌呤序列，但是其含有不超過8個(gè)連續(xù)的鳥 嘌呤核苷酸，即其不包括序列GGGGGGGG。理想地，間插序列不包括序列GGGGGGG。理想地， 間插序列不包括序列GGGGGG。理想地，間插序列不包括序列GGGGG。理想地，間插序列不包 括序列GGGG。間插序列可以包括GGG三核苷酸或GG二核苷酸。因此，在間插序列內(nèi)的聚G 序列可以總共延伸不超過8個(gè)核苷酸，并且理想地具有不超過3個(gè)連續(xù)的鳥嘌呤殘基。
[0031] 在本發(fā)明的啟動子包括來自腦膜炎球菌rRNA基因啟動子的-10區(qū)域的情況中，這 通常是6聚體TATAAT，即典型的-10區(qū)域6聚體。
[0032] 在本發(fā)明的啟動子包括來自腦膜炎球菌rRNA基因啟動子的-35區(qū)域的情況中，這 通常是6聚體TTGACA (其為共有的-35區(qū)域）。
[0033] 在本發(fā)明的啟動子包括來自腦膜炎球菌rRNA基因啟動子的-35區(qū)域和/或-10 區(qū)域的情況中，間插序列可以是GGCGGAAGGAATACTT(SEQ ID N0:29)。
[0034] 在本發(fā)明的啟動子包括來自rRNA基因啟動子的-35區(qū)域和/或-10區(qū)域的情況 中，短非轉(zhuǎn)錄上游序列可以是TCGCAAC。
[0035] 可以雜合形式使用porA和rRNA啟動子，并且可用的啟動子包括來自rRNA 基因的-35區(qū)域（例如，TTGACA)、來自porA基因的經(jīng)修飾的間插序列（例如， TTTGCGAGGGAGGTGG;SEQ ID N0:27)、典型的 Pribnow 盒（TATAAT)和來自 porA 基因的短非 轉(zhuǎn)錄上游序列（例如,TGAAGAC)。因此，啟動子可以包括SEQ ID N0:30(TTGACATTTGCGAGGG AGGTGGTATAATTGAAGAC)〇
[0036] 在一些實(shí)施方式中，啟動子包括SEQ ID NO :18(在野生型腦膜炎球菌16S rRNA啟 動子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之前的35聚體片段）。如本文所示，該序列可改變有1、2、3或4個(gè)單 核苷酸序列插入、刪除或取代。
[0037] 當(dāng)在細(xì)菌中以功能DNA形式存在時(shí)，這些啟動子可操作地連接到編碼感興趣蛋白 的序列，后者的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子的控制?？梢允褂帽景l(fā)明來表達(dá)任意感興趣的蛋白，但是 該蛋白優(yōu)選是可以保留在囊泡中的外膜蛋白。下面提供了外膜蛋白的合適示例，但是并不 優(yōu)選使用本發(fā)明來驅(qū)動編碼PorA外膜蛋白的轉(zhuǎn)錄體的表達(dá)。
[0038] 在編碼DNA序列中，本發(fā)明的啟動子的下游DNA包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，之后是Y未 翻譯區(qū)域（通常包括Shine-Dalgarno序列）然后是編碼的感興趣蛋白的起始密碼子。
[0039] 在啟動子來自rRNA基因的情況中，所轉(zhuǎn)錄序列的起始理想上源自編碼蛋白的基 因而不是rRNA基因。因此，rRNA啟動子（例如，SEQ ID N0 :18或變體）可以與來自腦膜 炎球菌蛋白編碼基因的5' UTR融合。在一些實(shí)施方式中，rRNA啟動子與來自porA基因的 5' UTR(58聚體）融合，并且該5' UTR然后與感興趣基因的編碼序列融合。5' UTR應(yīng)該 包括翻譯調(diào)節(jié)元件，其允許從蛋白編碼基因翻譯蛋白。因此，該實(shí)施方式使用rRNA啟動子 來產(chǎn)生可以被翻譯的蛋白編碼轉(zhuǎn)錄體。啟動子下游在5' UTR以內(nèi)的序列對于下游基因的 表達(dá)的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后影響的調(diào)節(jié)是重要的。
[0040] 也可以使用porA基因的5' UTR與本發(fā)明的經(jīng)修飾porA啟動子聯(lián)用，使得經(jīng)修飾 的porA啟動子與來自porA基因的5' UTR連接，后者再與感興趣蛋白的編碼序列融合。
[0041] 有用的porA 5' UTR可以包括SEQ ID N0 :39的核苷酸序列，S卩GTATCGGGTGTTTGC CCGATGrmTAGGnTTTATCAAAITTACAAAAGGAAGCC，或與 SEQ ID N0:39 存在最多 5 個(gè)（例如， 1、2、3、4或5個(gè)）單核苷酸插入、刪除或取代的差異的序列。
[0042] 可以理解本文的啟動子序列的討論是指正義鏈。在發(fā)生轉(zhuǎn)錄的雙鏈DNA中，啟動 子具有互補(bǔ)鏈。在表述兩個(gè)啟動子元件由"η"個(gè)核苷酸隔開的情況中，這仍指正義鏈的核苷 酸的數(shù)目；在雙鏈DNA中，由"η"個(gè)堿基對隔開元件。如果啟動子表述為缺少鳥嘌呤殘基， 這仍指正義鏈；在雙鏈DNA中，例如無鳥嘌呤的啟動子可以包括鳥嘌呤殘基，但是僅在反義 鏈上作為正義鏈上胞嘧啶殘基的互補(bǔ)堿基。雖然參照正義鏈描述了本發(fā)明，本發(fā)明的范圍 包括包含這類正義鏈的雙鏈核酸，以及包括這類正義鏈或包括這些正義鏈的反義形式的單 鏈核酸（這些反義鏈當(dāng)然可以用于通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備正義鏈）。
[0043] 囊泡
[0044] 當(dāng)制備腦膜炎球菌囊泡，即通過從腦膜炎球菌外膜的破壞或出泡得到的任意蛋白 脂質(zhì)體囊泡時(shí)，本發(fā)明是特別用于由此形成保留來自外膜的抗原的囊泡。因此該術(shù)語包括， 例如0MV(有時(shí)稱為"小泡"）、微囊泡（MV[14])和"天然0MV"（ "N0MV" [15]))。
[0045] MV和N0MV是天然產(chǎn)生的膜囊泡，在細(xì)菌生長期間自發(fā)形成并釋放到培養(yǎng)基中。MV 可以通過以下方法獲得：在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)奈瑟球菌，將全細(xì)胞與肉湯培養(yǎng)基中較小的 MV分離（例如，通過過濾或低速離心，只沉淀細(xì)胞而不沉淀較小囊泡），然后從細(xì)胞耗盡的 培養(yǎng)基中收集MV (例如，通過過濾、示差沉淀或MV聚集，通過高速離心沉淀MV)。一般可以 根據(jù)培養(yǎng)基中產(chǎn)生的MV的量來選擇用于生產(chǎn)MV的菌株，例如，參考文獻(xiàn)16和17描述了具 有高M(jìn)V產(chǎn)量的奈瑟球菌。
[0046] 另一個(gè)用于自發(fā)外膜囊泡產(chǎn)生的技術(shù)是滅活腦膜炎球菌中的mltA基因，如參考 文獻(xiàn)18所公開。這些突變細(xì)菌在生長中向其培養(yǎng)基釋放囊泡。
[0047] 從細(xì)菌人工制備0MV，可以利用去污劑處理（例如用脫氧膽酸鹽）或通過非去污 劑方式（例如參見參考文獻(xiàn)19)進(jìn)行制備。形成0MV的技術(shù)包括：用膽酸鹽去污劑（例 如，石膽酸、鵝脫氧膽酸、烏索脫氧膽酸、脫氧膽酸、膽酸、烏索膽酸等的鹽，優(yōu)選用脫氧膽酸 鈉[20和21]處理奈瑟球菌）在不會沉淀去污劑的充分高的pH下[22]處理細(xì)菌。其它 技術(shù)可以在基本沒有去污劑存在的情況下[19]利用如超聲、均化、微流化、空化、滲透壓沖 擊、研磨、法式壓制、混合等技術(shù)進(jìn)行。不使用或使用低去污劑的方法可以保留有用的抗原， 如NspA[19]。因此一種方法可以使用含有脫氧膽酸鹽濃度約0. 5%或更低如約0. 2%、約 0. 1%、<0. 05%或0的0MV提取緩沖液。參考文獻(xiàn)23描述了一種制備0MV的有用過程，涉 及對粗0MV進(jìn)行超濾，代替高速離心。該過程可以涉及在超濾后進(jìn)行超離心的步驟。
[0048] 一個(gè)純化囊泡的便捷方法是在參考文獻(xiàn)24中公開的雙過濾方法。
[0049] 優(yōu)選的囊泡是在細(xì)菌培養(yǎng)中自發(fā)形成的那些囊泡，而不是僅在細(xì)菌的物理或化學(xué) 處理之后釋放的那些囊泡。具有滅活的MltA的腦膜炎球菌的生長是以這種方式產(chǎn)生囊泡 的優(yōu)選方式。參考文獻(xiàn)47公開了產(chǎn)生高出泡菌株的方式。對于自發(fā)釋放的囊泡，優(yōu)選使用 不產(chǎn)生完整L0S的細(xì)菌（去污劑-提取的囊泡具有降低水平的潛在反應(yīng)原性L0S)。
[0050] 如果脂寡糖（L0S)存在于囊泡中，可以對囊泡進(jìn)行處理，以將其L0S與蛋白質(zhì)組分 連接起來（"泡內(nèi)"偶聯(lián)[48])。
[0051] 囊泡可能完全缺少L0S，或它們可能缺少六?；疞0S，例如，在囊泡中的L0S可能 每個(gè)L0S分子的二級?；湐?shù)有減少[25]。例如，囊泡可以來自具有l(wèi)pxLl刪除或突變的 菌株，其導(dǎo)致產(chǎn)生五酰化的L0S [2,43]。在一個(gè)菌株中的L0S可能缺少乳糖-N-新四糖表 位，例如，其可以是1st和/或lgtB敲除的菌株[5]。L0S可以缺少至少一種野生型一級 0-連接的脂肪酸[26]。所述L0S可以沒有α鏈。L0S可以包含GlcNAc-!fep 2磷脂酰乙醇 胺-1^02-脂質(zhì)4[27]。
[0052] 囊泡可以包括一個(gè)、超過一個(gè)或（優(yōu)選）零個(gè)PorA血清亞型。從例如參考文獻(xiàn) 28 (其公開了從經(jīng)修飾表達(dá)6種不同的PorA亞型的菌株構(gòu)建囊泡）和參考文獻(xiàn)29中獲知 提供了多重-PorA 0MV的腦膜炎球菌的修飾。相反，也從參考文獻(xiàn)5中獲知去除PorA的修 飾。
[0053] 囊泡可能不含PorA和FrpB兩者中的一種或兩種。優(yōu)選的囊泡是不含PorA的。
[0054] 囊泡可缺少莢膜糖。例如，它們可能衍生自具有一個(gè)或多個(gè)用于莢膜生物合成和 /或輸出的基因（例如，synX)被滅活的菌株。
[0055] 本發(fā)明可與不同菌株的囊泡混合物一起使用。例如，參考文獻(xiàn)30公開了含多價(jià)腦 膜炎球菌囊泡組合物的疫苗，含有第一囊泡和第二囊泡，衍生第一囊泡的腦膜炎球菌菌株 具有在使用國有普遍性的血清亞型，衍生第二囊泡的菌株無需具有在使用國有普遍性的血 清亞型。參考文獻(xiàn)31也公開了不同囊泡的有用組合。在一些實(shí)施方式中，可使用各來自L2 和L3免疫型菌株的囊泡組合。
[0056] 過表達(dá)
[0057] 可以使用本發(fā)明的啟動子來在腦膜炎球菌中過表達(dá)感興趣的基因。在基因編碼外 膜蛋白抗原的情況下，可以用這種過表達(dá)來提供有利地保留該抗原的囊泡。下面更詳細(xì)地 討論這類囊泡。作為過表達(dá)的結(jié)果，與相應(yīng)的野生型腦膜炎球菌中所看到的相比，從經(jīng)修飾 的腦膜炎球菌制備的囊泡含有較高水平的過表達(dá)的抗原。以每單位質(zhì)量的囊泡中相關(guān)抗 原的質(zhì)量測量，囊泡中的表達(dá)增加在至少10%時(shí)有益，并且在增加至少20%、30%、40%、 50%、75%、100%或更多時(shí)更有益。
[0058] 通過使用本發(fā)明的啟動子可以用于過表達(dá)抗原的合適的重組修飾包括，但不限 于：（i)啟動子取代；（ii)基因添加；和/或（iii)基因取代。如果需要，這三個(gè)技術(shù)可以 與（iv)抑制子敲除聯(lián)用。
[0059] 在啟動子取代中，用本發(fā)明的啟動子取代細(xì)菌中控制抗原基因表達(dá)的啟動子以提 供較高水平的表達(dá)。
[0060] 在基因添加中，已經(jīng)表達(dá)抗原的細(xì)菌接受相關(guān)基因的第二拷貝。第二拷貝可以整 合進(jìn)細(xì)菌染色體中或可以在諸如質(zhì)粒的附加元件上?？梢允褂帽景l(fā)明的啟動子表達(dá)第二拷 貝?；蛱砑拥男Ч窃黾涌乖谋磉_(dá)量。在使用質(zhì)粒的情況中，理想地是具有高拷貝數(shù) 的質(zhì)粒，例如超過10個(gè)，或甚至超過100個(gè)。
[0061] 在基因取代中，發(fā)生基因添加但是伴隨著刪除所述基因的原有拷貝。例如，在參考 文獻(xiàn)3中使用這種方法，其中刪除了細(xì)菌的內(nèi)源染色體fHbp基因并且用質(zhì)粒編碼的拷貝取 代（也參見參考文獻(xiàn)32)。使用本發(fā)明的啟動子，來自取代拷貝的表達(dá)高于之前的拷貝，因 此導(dǎo)致過表達(dá)。
[0062] 在一些實(shí)施方式中，發(fā)生基因取代，其中基因添加伴隨著另一個(gè)基因的刪除。例 如，當(dāng)需要敲除內(nèi)源基因但不是正由本發(fā)明的啟動子過表達(dá)的感興趣的基因時(shí)。
[0063] 在一些實(shí)施方式中，可以出現(xiàn)超過一個(gè)事件的基因添加或基因取代，使得能發(fā)生 通過本發(fā)明的啟動子表達(dá)多重拷貝的感興趣基因或通過本發(fā)明的啟動子過表達(dá)感興趣的 不同基因。
[0064] 至少一個(gè)抗原的過表達(dá)會使用本發(fā)明的啟動子，但是這些啟動子可以與其他技術(shù) 聯(lián)用。例如，啟動子可以與抑制物敲除聯(lián)用，其中抑制感興趣抗原的表達(dá)的蛋白被敲除。這 種敲除意味著不發(fā)生抑制并且可以更高的水平表達(dá)感興趣的抗原。
[0065] 例如，在NadA過表達(dá)的情況中，nadA基因可以使用本發(fā)明的啟動子，但是另外可 以刪除編碼NadR(NMB1843)的基因。NadR是一種轉(zhuǎn)錄抑制物蛋白[33]，其在所有測試的菌 株中下調(diào)或抑制NadA編碼基因。NadR的敲除導(dǎo)致NadA的組成型表達(dá)。過表達(dá)NadA的另 一個(gè)方式是在培養(yǎng)基中加入4-羥基苯基乙酸。因此，本發(fā)明的啟動子可以單獨(dú)用作過表達(dá) 策略，或與其他方法結(jié)合。
[0066] 在一些實(shí)施方式中，細(xì)菌過表達(dá)NadA。
[0067] 在一些實(shí)施方式中，細(xì)菌過表達(dá)NHBA。
[0068] 在一些實(shí)施方式中，細(xì)菌過表達(dá)fHbp。
[0069] 在一些實(shí)施方式中，細(xì)菌過表達(dá)NHBA和NadA。
[0070] 在一些實(shí)施方式中，細(xì)菌過表達(dá)fHbp和NadA。
[0071] 在一些實(shí)施方式中，細(xì)菌過表達(dá)fHbp和NHBA。
[0072] 在一些實(shí)施方式中，細(xì)菌過表達(dá)fHbp、NHBA和NadA。
[0073] 除了過表達(dá)NHBA和/或NadA以外，細(xì)菌可以過表達(dá)一種或多種其他的抗原。例 如，細(xì)菌可以過表達(dá)以下的一種或多種：（a)NhhA ; (b) TbpA ; (c)HmbR ; (d) TbpB ; (e)NspA ; (f) Cu，Zn-超氧化物歧化酶；（g) Omp85 ; (h) App ;和/或⑴fHbp。已經(jīng)在參考文獻(xiàn)5和34 中報(bào)道了 NhhA的過表達(dá)。已經(jīng)在參考文獻(xiàn)5、34和35中報(bào)道了 TbpA的過表達(dá)。已經(jīng)在參 考文獻(xiàn)36中報(bào)道了 HmbR的過表達(dá)。已經(jīng)在參考文獻(xiàn)35中報(bào)道了 TbpB的過表達(dá)。已經(jīng)在 參考文獻(xiàn)37中報(bào)道了 NspA的過表達(dá)與porA和cps敲除的結(jié)合。已經(jīng)在參考文獻(xiàn)35中報(bào) 道了 Cu，Zn-超氧化物歧化酶的過表達(dá)。已經(jīng)在參考文獻(xiàn)1-3和32中報(bào)道fHbp的過表達(dá) 并且在參考文獻(xiàn)38和39中以不同方法（表達(dá)組成型活性突變FNR)進(jìn)行。在過表達(dá)超過 一種抗原的情況中，使用本發(fā)明的啟動子過表達(dá)至少一種抗原，并且在一些情況中，會使用 本發(fā)明的啟動子過表達(dá)超過一種抗原。
[0074] 在一些實(shí)施方式中，細(xì)菌過表達(dá)NHBA、NadA和fHbp。這三種抗原是在參考文獻(xiàn)40 中公開的"通用疫苗"或"401161^"[41，42]的組分。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過本發(fā)明的啟動 子控制NHBA的表達(dá)，敲除NadR，并且該菌株表達(dá)組成型的活性突變FNR。在另一個(gè)實(shí)施方 式中，通過本發(fā)明的啟動子控制NHBA的表達(dá)，通過本發(fā)明的啟動子控制fHbp的表達(dá)，并且 敲除NadR。
[0075] 過表達(dá)型經(jīng)修飾的菌株通常會是與其親本菌株等基因，除了遺傳修飾以外。作為 修飾的結(jié)果，（在相同條件下）感興趣的抗原在經(jīng)修飾的菌株中的表達(dá)高于在親本菌株中。
[0076] 細(xì)菌
[0077] 如上述，從由于遺傳修飾而過表達(dá)相關(guān)抗原的腦膜炎球菌制備本發(fā)明的囊泡，至 少包括使用本發(fā)明的啟動子。本發(fā)明也提供了這些細(xì)菌。它們可用于制備本發(fā)明的囊泡。
[0078] 除了包括本發(fā)明的啟動子以外，腦膜炎球菌可以包括一個(gè)或多個(gè)其他修飾。例如， 其可以敲除]^1!^1、]^七4、]^七13、口〇^、;1^1)13、871^、111]^4和/或181:中的一種或多種。例如， 參考文獻(xiàn)43報(bào)道了從具有滅活的 SynX、lpxLl和lgtA基因的細(xì)菌制備的N0MV疫苗。敲除 至少lpxLl和synX是特別有用的。
[0079] 通過敲除參與LPS生物合成的酶，細(xì)菌可以具有低的內(nèi)毒素水平[44,45]。
[0080] 細(xì)菌可以來自任意的血清組，例如A、B、C、W135或Y。優(yōu)選血清組B或血清組W135。
[0081] 細(xì)菌可以是任何血清型（例如，l、2a、2b、4、14、15、16等）、任何血清亞型和任何免 疫型（例如，LI ;L2 ;L3 ;L3,3,7 ;L10 ;等）?？梢詮木哂幸韵聛喰椭坏木暧行У刂苽淠?泡：P1. 2 ;Ρ1· 2,5 ;Ρ1· 4 ;Ρ1· 5 ;Ρ1· 5,2 ;Ρ1· 5, c ;P1. 5c，10 ;Ρ1· 7,16 ;Ρ1· 7,16b ;P1. 7h，4 ; PL 9 ;Ρ1· 15 ;Ρ1· 9,15 ;Ρ1· 12,13 ;Ρ1· 13 ;Ρ1· 14 ;Ρ1· 21，16 ;Ρ1· 22,14。
[0082] 細(xì)菌可以來自任何合適的譜系，包括高侵襲性和超毒力譜系，例如下列7個(gè)超毒 力譜系中的任何一個(gè)：亞組I、亞組III、亞組IV-UET-5復(fù)合系、ΕΤ-37復(fù)合系、Α4簇、譜系 3。這些譜系通過多位點(diǎn)酶電泳（MLEE)確定，但也使用多位點(diǎn)序列分型（MLST)也已用于對 腦膜炎球菌分類[參考文獻(xiàn)46]，例如ΕΤ-37復(fù)合系為由MLST所分的ST-11復(fù)合系，ΕΤ-5 復(fù)合系為ST-32 (ΕΤ-5)，譜系3為ST-41/44等。
[0083] 在一些實(shí)施方式中，細(xì)菌可以包括一個(gè)或多個(gè)在參考文獻(xiàn)8、37、47和48中公開的 敲除和/或過表達(dá)突變。適于修飾的基因包括：（a)Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、 HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA 和 / 或 TbpB [8] ; (b) CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Ope、 PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA 和 / 或 TbpB ; (c)ExbB、ExbD、rmpM、 CtrA、CtrB、CtrD、GalE、LbpA、LpbB、Opa、Ope、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA 和 / 或 TbpB ;和（d)CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、SynA、SynB 和 / 或 SynC〇
[0084] 如上述，腦膜炎球菌有利地不表達(dá)活性MltA (GNA33)，使其自發(fā)釋放囊泡，例如，其 含有使用本發(fā)明的啟動子表達(dá)的抗原。
[0085] 理想地，細(xì)菌并不表達(dá)天然LPS，例如，其具有LpxLl和/或LgtB的突變或敲除。
[0086] 在細(xì)菌具有敲除的情況中，這種敲除通過插入序列方便地實(shí)現(xiàn)，所插入的序列包 括控制感興趣蛋白轉(zhuǎn)錄的本發(fā)明的啟動子。例如，基因組synX或lpxLl基因可以通過在其 中插入序列來敲除，插入的序列包括控制外膜蛋白如fHbp的表達(dá)的本發(fā)明的啟動子。因此 可以使用單個(gè)轉(zhuǎn)化事件來實(shí)現(xiàn)兩個(gè)目標(biāo)。
[0087] 本發(fā)明的細(xì)菌可以包括選擇標(biāo)記物，例如抗生素耐受性標(biāo)記物。
[0088] 細(xì)菌可以有以下的一種或多種或全部特征：（i)LgtB和/或GalE下調(diào)或敲除， 以截短腦膜炎球菌LOS ; (ii)TbpA上調(diào)；（iii)NhhA上調(diào)；（iv)0mp85上調(diào)；（v)LbpA上調(diào)； (vi)NspA上調(diào)；（vii)PorA敲除；（viii)FrpB下調(diào)或敲除；（ix)Opa下調(diào)或敲除；（x)0pc下 調(diào)或敲除；（xii) cps基因復(fù)合體缺失。截短的L0S可以不包括唾液酸-乳糖-N-新四糖表 位，例如，其可以為半乳糖缺陷型L0S。所述L0S可以沒有α鏈。
[0089] 細(xì)菌可具有以下的一種或多種或全部特征：（i)LgtA下調(diào)或敲除；（ii)LpxLl下調(diào) 或敲除；（iii) SynX下調(diào)或敲除；（iv)超過一種PorA亞型，諸如兩種不同的PorA亞型；和/ 或（v)上調(diào)的外膜抗原，諸如NadA或fHbp。
[0090] 菌株生產(chǎn)
[0091] 本發(fā)明提供了用于制備適于囊泡制備的腦膜炎球菌菌株的方法，該方法包含以下 步驟：（i)選擇在特定培養(yǎng)條件下生長時(shí)表達(dá)第一個(gè)量的抗原的起始菌株，然后（ii)修飾 該起始菌株以提供包括本發(fā)明的啟動子的經(jīng)修飾的菌株，其中經(jīng)修飾的菌株在相同的特定 培養(yǎng)條件下生長時(shí)表達(dá)第二個(gè)量的抗原，第二個(gè)量高于第一個(gè)量。以每單位質(zhì)量的細(xì)菌中 相關(guān)抗原的質(zhì)量測量，第二個(gè)量高于第一個(gè)量至少10%是有益的，并且高至少20%、30%、 40%、50%、75%、100%或更多是更有益地。
[0092] 該方法之后可以有步驟（iii)培養(yǎng)在步驟（ii)中得到的經(jīng)修飾的細(xì)菌以得到細(xì) 菌培養(yǎng)物。
[0093] 該方法也可以包括在引入本發(fā)明的啟動子之前或之后的其他步驟的遺傳操作。本 發(fā)明的啟動子引入細(xì)菌可以超過一次并可在超過一個(gè)位點(diǎn)上，例如有多個(gè)受控制的基因。 [0094] 本發(fā)明也提供了制備腦膜炎球菌囊泡的方法，該方法包含處理通過本發(fā)明的方法 所得的細(xì)菌培養(yǎng)物（如上述）的步驟，使其外膜形成囊泡。該處理步驟可以使用任意的上 述技術(shù)。
[0095] 本發(fā)明也提供了制備腦膜炎球菌囊泡的方法，該方法包含處理本發(fā)明的腦膜炎球 菌的步驟，使其外膜形成囊泡。該處理步驟可以使用任意的上述技術(shù)。
[0096] 本發(fā)明也提供了制備腦膜炎球菌囊泡的方法，該方法包含在外膜自發(fā)脫落囊泡的 條件下培養(yǎng)本發(fā)明的腦膜炎球菌的步驟。例如，該腦膜炎球菌可能不表達(dá)活性的MltA。
[0097] 可用的起始菌株是腦膜炎球菌血清組B。三種可用于制備過表達(dá)感興趣的抗原的 細(xì)菌的起始腦膜炎球菌菌株是MC58、NZ98/254和H44/76。MC58具有PorA血清亞型1. 7， 16 ;NZ98/254具有血清亞型P1. 7-2,4 ;并且H44/76具有血清亞型1. 7,16。也可使用具有 這些血清亞型的其它菌株。
[0098] 載體等
[0099] 本發(fā)明提供了如上述的啟動子。這些可以存在于細(xì)菌染色體，或染色體外或在附 加體核酸如質(zhì)粒內(nèi)。細(xì)菌可以包括一個(gè)或多個(gè)拷貝的本發(fā)明的啟動子。在細(xì)菌包括2個(gè)拷 貝的情況中，這些可以在染色體和/或附加體中。
[0100] 因此，本發(fā)明提供的細(xì)菌包含：（i)包括至少一個(gè)本發(fā)明的啟動子的染色體和/或 (ii)包括至少一個(gè)本發(fā)明的啟動子的附加體，諸如質(zhì)粒。
[0101] 本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明的啟動子的核酸載體，諸如細(xì)菌表達(dá)載體。
[0102] 這些載體或細(xì)菌中的這些啟動子可以是沒有任何下游可轉(zhuǎn)錄序列的"孤獨(dú)"啟動 子，但是它們通常會可操作地與轉(zhuǎn)錄的序列連接，并且轉(zhuǎn)錄的序列然后經(jīng)翻譯表達(dá)感興趣 的蛋白。
[0103] 抗原
[0104] NHBA (奈瑟菌屬肝素結(jié)合抗原）
[0105] NHBA[51]作為基因 NMB2l32(GenBank 登錄號 GI :7227388 ;本文的 SEQ ID N0 :9) 包括在奈瑟球菌血清組B菌株MC58[78]的公開基因組序列中。之后已出版了來自許多菌 株的NHBA序列。例如，NHBA(稱為蛋白"287"）的等位基因形式可見參考文獻(xiàn)49的圖5和 15,以及例如文獻(xiàn)50的實(shí)施例13和圖21所示（其中的SEQ ID 3179到3184)。已報(bào)道了 各種NHBA的免疫原性片段。
[0106] 本發(fā)明優(yōu)選使用的NHBA抗原包括以下的氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0 :9有50 % 或更高相同性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99·5%或更高） ；和/或（b)包括SEQIDN0:9的至少"n"個(gè) 連續(xù)氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、 60、70、80、90、100、150、200、250或更多）。（b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID Ν0:9的表位。
[0107] 最有用的NHBA抗原可引發(fā)抗體，其在給予對象后能與由氨基酸序列SEQ ID Ν0 :9 組成的腦膜炎球菌多肽結(jié)合。用于本發(fā)明的優(yōu)選NHBA抗原可在給予對象后引發(fā)殺菌性抗 腦膜炎球菌抗體。
[0108] 已經(jīng)通過各種方式實(shí)現(xiàn)了 NHBA的過表達(dá)，例如，引入NHBA基因到IPTG誘導(dǎo)型啟 動子的控制下[51]。
[0109] NadA(奈瑟菌粘附素 A)
[0110] NadA抗原作為基因 NMB1994(GenBank 登錄號 GI :7227256 ;本文的 SEQ ID N0 :10) 包括在腦膜炎球菌血清組B菌株MC58 [78]的公開基因組序列中。迄今已公布了許多菌株 的NadA抗原序列，并詳細(xì)記載了作為奈瑟菌粘附素的蛋白活性。已報(bào)道了許多NadA的免 疫原性片段。
[0111] 本發(fā)明所用的優(yōu)選NadA抗原包含以下的氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0 :10具 有 50%或更高的相同性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高）；和 / 或（b)包含 SEQ ID N0 :10 的至少 "η"個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、 40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。（b)的優(yōu)選片段包含來自 SEQ ID Ν0:10 的表位。
[0112] 最有用的NadA抗原可引發(fā)抗體，其在給予對象后能與由氨基酸序列SEQ ID NO : 10組成的腦膜炎球菌多肽結(jié)合。用于本發(fā)明的優(yōu)選NadA抗原可在給予對象后引起殺菌性 抗腦膜炎球菌抗體。SEQ ID N0 :6是一種這樣的片段。
[0113] HmbR
[0114] 全長HmbR序列作為基因 NMB1668(本文的SEQ ID NO :7)包括在腦膜炎球菌血清 組B菌株MC58 [78]的公開基因組序列中。參考文獻(xiàn)52報(bào)道了來自不同菌株的HmbR序列 (本文的SEQ ID N0:8)，并且參考文獻(xiàn)36報(bào)道了其他的序列（本文的SEQ ID N0:19hSEQ ID NO :7和8差異為1個(gè)氨基酸并且具有94. 2%相同性。SEQ ID NO :19比SEQ ID NO :7 短一個(gè)氨基酸并且由CLUSTALW確定它們具有99%相同性（1個(gè)插入，7個(gè)差異）。本發(fā)明可 使用任何這種HmbR多肽。本發(fā)明可使用包含HmbR全長序列的多肽，但常用含有部分HmbR 序列的多肽。因此在一些實(shí)施方式中，按照本發(fā)明使用的HmbR序列可包含與SEQ ID NO :7 具有至少i%序列相同性的氨基酸序列，其中i值為50、60、70、80、90、95、99或更高。在其 它實(shí)施方式中，按照本發(fā)明使用的HmbR序列可包含SEQ ID N0 :7的至少j個(gè)連續(xù)氨基酸的 片段，其中 i 值為 7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更高。在其它實(shí)施方式中，按照本發(fā)明使用的HmbR序列可包含以下的氨基酸序列： ⑴與SEQ ID N0 :7具有至少i%序列相同性，和/或（ii)包含SEQ ID N0 :7中至少j個(gè) 連續(xù)氨基酸的片段。
[0115] 優(yōu)選j個(gè)氨基酸的片段包含來自SEQ ID N0 :7的表位。這些表位通常包含位于 HmbR表面上的氨基酸。有用的表位包括涉及HmbR與血凝素結(jié)合的氨基酸，因?yàn)榕c這些表位 結(jié)合的抗體能夠阻斷細(xì)菌與宿主血凝素結(jié)合的能力。HmbR的拓?fù)鋵W(xué)及其關(guān)鍵功能性殘基如 文獻(xiàn)53所述。保留跨膜序列的片段是特別有用的，因?yàn)樗鼈兡軌蝻@示在細(xì)菌表面上，例如 囊泡中。HmbR的長片段的示例對應(yīng)于SEQ ID N0 :21和22。然而，如果使用可溶性HmbR， 則可以使用省略跨膜序列但是通常保留來自胞外部分的表位的序列。
[0116] 本發(fā)明最有用的HmbR抗原可引發(fā)抗體，其在給予對象后能與由氨基酸序列SEQ ID NO :7組成的腦膜炎球菌多肽結(jié)合。用于本發(fā)明的優(yōu)選HmbR抗原可在給予對象后引發(fā)殺菌 性抗腦膜炎球菌抗體。
[0117] fHbp(H因子結(jié)合蛋白）
[0118] 已詳細(xì)確定了 fHbp抗原的特征。它也被稱為蛋白"741" [參考文獻(xiàn)50的SEQ ID 2535 和 2536]、"MB1870"、"GNA1870" [54-56]、"P2086"、"LP2086" 或"0RF2086" [57-59]。 它是一種天然脂蛋白，在所有腦膜炎球菌血清組中有表達(dá)。已經(jīng)通過NMR確定了 fHbp的 C-端免疫決定結(jié)構(gòu)域（"fHbpC"）的結(jié)構(gòu)[60]。蛋白的這個(gè)部分形成了 8-鏈的β-桶，其 鏈通過不同長度的環(huán)相連。桶之前是短α-螺旋和柔性的Ν-端尾部。
[0119] fHbp抗原分為三種不同變體[61]已發(fā)現(xiàn)對給定家族產(chǎn)生的血清對同一家族產(chǎn) 生殺細(xì)菌活性，但對表達(dá)另兩個(gè)家族之一的菌株無活性，即存在家族內(nèi)、而非家族間交叉保 護(hù)。本發(fā)明可以使用單個(gè)fHbp變體，但是可以有益地包括來自兩種或三種變體的fHbp。因 此，其可以使用兩種或三種選自以下的fHbp的組合：（a)第一蛋白，包含與SEQ ID N0 :1具 有至少a%的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由來自SEQ ID N0 :1的至少X個(gè)連續(xù)氨 基酸的片段組成的氨基酸序列；(b)第二蛋白，包含與SEQ ID N0 :2具有至少b%的序列相 同性的氨基酸序列和/或包含由來自SEQ ID N0 :2的至少y個(gè)連續(xù)氨基酸的片段組成的氨 基酸序列；和/或（C)第三蛋白，包含與SEQ ID NO :3具有至少c%的序列相同性的氨基酸 序列和/或包含由來自SEQ ID NO :3的至少z個(gè)連續(xù)氨基酸的片段組成的氨基酸序列。
[0120] a 值為至少 85,例如 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99· 5 或更 高。b 值為至少 85,例如 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99· 5 或更高。c 值為至少 85,例如 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99· 5 或更高。a、b 和 c 的值本質(zhì)上彼此并不相關(guān)。
[0121] X 值為至少 7,例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。 y 值 為至少 7,例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。z 值為至少 7,例如 8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、 60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。x、y 和 z 的值本質(zhì)上彼此并不相關(guān)。
[0122] 在本發(fā)明使用單個(gè)fHbp變體的情況下，組合物可以包括包含以下的多肽：(a)與 SEQ ID N0 :1具有至少a%的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由來自SEQ ID N0 :1的 至少X個(gè)連續(xù)氨基酸的片段組成的氨基酸序列；或（b)包含與SEQ ID N0 :2具有至少b% 的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由來自SEQ ID NO :2的至少y個(gè)連續(xù)氨基酸的片段 組成的氨基酸序列；或（c)包含與SEQ ID N0 :3具有至少c%的序列相同性的氨基酸序列 和/或包含由來自SEQ ID N0 :3的至少z個(gè)連續(xù)氨基酸的片段組成的氨基酸序列。
[0123] 在本發(fā)明使用來自變體中的兩種或三種fHbp的情況下，組合物可以包括兩種或 三種選自以下的不同fHbp的組合：（a)第一多肽，包含與SEQ ID N0 :1具有至少a%的序列 相同性的氨基酸序列和/或包含由來自SEQ ID N0 :1的至少X個(gè)連續(xù)氨基酸的片段組成的 氨基酸序列；(b)第二多肽，包含與SEQ ID N0 :2具有至少b%的序列相同性的氨基酸序列 和/或包含由來自SEQ ID N0 :2的至少y個(gè)連續(xù)氨基酸的片段組成的氨基酸序列；和/或 (c)第三多肽，包含與SEQ ID N0 :3具有至少c %的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由 來自SEQ ID N0 :3的至少z個(gè)連續(xù)氨基酸的片段組成的氨基酸序列。第一、第二和第三多 肽具有不同的氨基酸序列。
[0124] 在本發(fā)明使用來自變體中的兩種fHbp的情況下，組合物可以包括以下的兩種： (a)第一多肽，包含與SEQ ID NO: 1具有至少a%的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由 來自SEQ ID NO: 1的至少X個(gè)連續(xù)氨基酸的片段組成的氨基酸序列；和（b)第二多肽，包 含與SEQ ID N0 :2具有至少b%的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由來自SEQ ID N0: 2的至少y個(gè)連續(xù)氨基酸的片段組成的氨基酸序列。第一和第二多肽具有不同的氨基酸序 列。
[0125] 在本發(fā)明使用來自變體中的兩種fHbp的情況下，組合物可以包括以下的兩種： (a)第一多肽，包含與SEQ ID NO: 1具有至少a%的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由 來自SEQ ID NO : 1的至少X個(gè)連續(xù)氨基酸的片段組成的氨基酸序列；(b)第二多肽，包含與 SEQ ID N0 :3具有至少c%的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由來自SEQ ID N0 :3的 至少z個(gè)連續(xù)氨基酸的片段組成的氨基酸序列。第一和第二多肽具有不同的氨基酸序列。
[0126] 另一種可按照本發(fā)明使用的fHbp是在例如參考文獻(xiàn)62中公開的經(jīng)修飾形式中的 一種，例如，包含其中的SEQ ID N0 :20或23。這些經(jīng)修飾的形式可以引發(fā)抗體應(yīng)答，其對 腦膜炎球菌具有廣泛的殺菌作用。參考文獻(xiàn)62中的SEQ ID NO :77是另一個(gè)可以使用的 fHbp序列。
[0127] fHbp的可用修飾，包括上述序列，是一種突變，其降低或去除蛋白對因子Η的親和 力。例如，參考文獻(xiàn)63和64公開了根據(jù)它們的編號位于殘基Glu-283和/或Glu-304的 這類突變（從這種編號方式中減去72來匹配本文的SEQ ID NO :1)。相似地，參考文獻(xiàn)65 和66公開了變體1根據(jù)殘基編號在位置Arg-41處（減去7來匹配SEQ ID NO :1)的突變 (例如，變?yōu)镾er)和變體2根據(jù)殘基編號在位置80、211、218、220、222和/或236處（減去 7來匹配SEQ ID NO :2)的突變（例如，變?yōu)镾er)。比對會快速揭示任意感興趣的fHbp序 列的相應(yīng)殘基。特別優(yōu)選在變體1序列中的Arg-41-Ser突變。
[0128] 在0MV中的fHbp蛋白會通常在例如N端半胱氨酸處發(fā)生脂化。在其他實(shí)施方式 中，它們未發(fā)生脂化。
[0129] NspA (奈瑟菌表面蛋白A)
[0130] NspA 抗原作為基因 NMB0663(GenBank 登錄號 GI :7225888 ;本文中的 SEQ ID N0 : 11)包括在腦膜炎球菌血清組B菌株MC58 [78]的公開基因組序列中。先前已從文獻(xiàn)67和 68知曉該抗原。之后已公布了來自許多菌株的NspA抗原序列。還報(bào)道了許多NspA的免疫 原性片段。
[0131] 本發(fā)明優(yōu)選使用的NspA抗原包括以下的氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0 :11有 50%或更高相同性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高）；和 / 或（b)包括 SEQ ID N0 :11 的至少 "η"個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、 40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。（b)的優(yōu)選片段包含來自 SEQ ID Ν0:11 的表位。
[0132] 本發(fā)明最有用的NspA抗原可引發(fā)抗體，其在給予對象后能與由氨基酸序列SEQ ID NO :11組成的腦膜炎球菌多肽結(jié)合。用于本發(fā)明的優(yōu)選NspA抗原可在給予對象后引起殺 菌性抗腦膜炎球菌抗體。
[0133] NhhA(奈瑟菌hia同源物）
[0134] NhhA抗原作為基因 NMB0992(GenBank 登錄號 GI :7226232 ;本文的 SEQ ID N0 :12) 包括在腦膜炎球菌血清組B菌株MC58[78]的公開基因組序列中。自從例如文獻(xiàn)49和69 已公開了來自許多菌株的NhhA抗原序列，也已報(bào)道了多種NhhA的免疫原性片段。它也被 稱為Hsf。
[0135] 本發(fā)明優(yōu)選使用的NhhA抗原包括以下的氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO :12有 50%或更高相同性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高）；和 / 或（b)包括 SEQ ID NO :12 的至少 "η"個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、 40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。（b)的優(yōu)選片段包含來自 SEQ ID Ν0:12 的表位。
[0136] 本發(fā)明最有用的NhhA抗原可引發(fā)抗體，其在給予對象后能與由氨基酸序列SEQ ID NO :12組成的腦膜炎球菌多肽結(jié)合。用于本發(fā)明的優(yōu)選NhhA抗原可在給予對象后引起殺 菌性抗腦膜炎球菌抗體。
[0137] App (粘附和滲透蛋白）
[0138] App 抗原作為基因 NMB1985(GenBank 登錄號 GI :7227246 ;本文的 SEQ ID NO :13) 包括在腦膜炎球菌血清組B菌株MC58 [78]的公開基因組序列中。之后已公布了來自許多 菌株的App抗原序列。它也被稱為"0RF1"和"Hap"。還報(bào)道了許多App的免疫原性片段。
[0139] 本發(fā)明優(yōu)選使用的App抗原包括以下的氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0 :13有50 % 或更高相同性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99·5%或更高） ；和/或（b)包括SEQIDN0:13的至少"n"個(gè) 連續(xù)氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、 60、70、80、90、100、150、200、250或更多）。（b)的優(yōu)選片段包含來自SEQIDN0 :13的表位。
[0140] 本發(fā)明最有用的App抗原可引發(fā)抗體，其在給予對象后能與由氨基酸序列SEQ ID NO : 13組成的腦膜炎球菌多肽結(jié)合。用于本發(fā)明的優(yōu)選App抗原可在給予對象后引起殺菌 性抗腦膜炎球菌抗體。
[0141] 0mp85 (85kDa 外膜蛋白）
[0142] 0mp85 抗原作為基因 NMB0182(GenBank 登錄號 GI :7225401 ;本文的 SEQ ID N0 : 14)包括在腦膜炎球菌血清組B菌株MC58[78]的公開基因組序列中。之后已公布了來自許 多菌株的0mp85抗原序列。0mp85的其它信息可見文獻(xiàn)70和71。還報(bào)道了許多0mp85的 免疫原性片段。
[0143] 本發(fā)明優(yōu)選使用的0mp85抗原包括以下的氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:14 有50%或更高相同性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99·5%或更高） ；和/或（b)包括SEQIDN0:14的至少 "η"個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、 40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。（b)的優(yōu)選片段包含來自 SEQ ID Ν0:14 的表位。
[0144] 本發(fā)明最有用的0mp85抗原可引發(fā)抗體，其在給予對象后能與由氨基酸序列SEQ ID N0 :14組成的腦膜炎球菌多肽結(jié)合。用于本發(fā)明的優(yōu)選0mp85抗原可在給予對象后引 起殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。
[0145] TbpA
[0146] TbpA 抗原作為基因 NMB0461(GenBank 登錄號 GI :7225687 ;本文中的 SEQ ID NO : 23)包括在腦膜炎球菌血清組B菌株MC58[78]的公開基因組序列中。之后已出版了來自許 多菌株的TbpA序列。還報(bào)道了多種TbpA的免疫原性片段。
[0147] 本發(fā)明優(yōu)選使用的TbpA抗原包括以下的氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0 :23有 50%或更高相同性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高）；和 / 或（b)包括 SEQ ID N0 :23 的至少 "η"個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、 40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。（b)的優(yōu)選片段包含來自 SEQ ID Ν0:23 的表位。
[0148] 本發(fā)明最有用的TbpA抗原可引發(fā)抗體，其在給予對象后能與由氨基酸序列SEQ ID NO :23組成的腦膜炎球菌多肽結(jié)合。用于本發(fā)明的優(yōu)選TbpA抗原可在給予對象后引起殺 菌性抗腦膜炎球菌抗體。
[0149] TbpB
[0150] TbpB 抗原作為基因 NMB1398(GenBank 登錄號 GI :7225686 ;本文的 SEQ ID NO :24) 包括在腦膜炎球菌血清組B菌株MC58[78]的公開基因組序列中。之后已出版了來自許多 菌株的TbpB序列。還報(bào)道了多種TbpB的免疫原性片段。
[0151] 本發(fā)明優(yōu)選使用的TbpB抗原包括以下的氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0 :24有 50%或更高相同性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高）；和 / 或（b)包括 SEQ ID N0 :24 的至少 "η"個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、 40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。（b)的優(yōu)選片段包含來自 SEQ ID Ν0:24 的表位。
[0152] 本發(fā)明最有用的TbpB抗原可引發(fā)抗體，其在給予對象后能與由氨基酸序列SEQ ID NO :24組成的腦膜炎球菌多肽結(jié)合。用于本發(fā)明的優(yōu)選TbpB抗原可在給予對象后引起殺 菌性抗腦膜炎球菌抗體。
[0153] Cu，Zn-超氧化物歧化酶
[0154] Cu，Zn-超氧化物歧化酶抗原作為基因 NMB1398(GenBank登錄號GI :7226637 ;本 文的SEQ ID N0:25)包括在腦膜炎球菌血清組B菌株MC58[78]的公開基因組序列中。之 后已出版了來自許多菌株的Cu，Zn-超氧化物歧化酶序列。還報(bào)道了多種Cu，Zn-超氧化物 歧化酶的免疫原性片段。
[0155] 本發(fā)明優(yōu)選使用的Cu，Zn-超氧化物歧化酶抗原包括以下的氨基酸序列：（a)與 SEQ ID N0 :25 有 50%或更高相同性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99·5%或更高） ；和/或（b)包括SEQIDN0: 25的至少"η"個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、 25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。（b)的優(yōu)選片段包含來自 SEQ ID N0 :25的表位。
[0156] 本發(fā)明最有用的Cu，Zn-超氧化物歧化酶抗原可引發(fā)抗體，其在給予對象后能與 由氨基酸序列SEQ ID N0:25組成的腦膜炎球菌多肽結(jié)合。用于本發(fā)明的優(yōu)選Cu，Zn-超氧 化物歧化酶抗原可在給予對象后引起殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。
[0157] 藥物組合物
[0158] 本發(fā)明的囊泡可用作給予患者的免疫原性藥物組合物中的活性成分。這些通常會 包括藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體，并且這類運(yùn)載體的充分討論見于參考文獻(xiàn)72。
[0159] 可用常規(guī)方法確定有效劑量體積，但組合物的人用劑量一般為約0. 5ml體積，例 如用于肌內(nèi)注射時(shí)。以0.5ml的體積通過向大腿或上臂肌肉內(nèi)注射給予基于RIVM 0MV的 疫苗[73]。以0. 5ml通過向大腿前側(cè)面或上臂的三角肌內(nèi)肌肉內(nèi)注射給予MeNZB?。對于 其他遞送途徑可以使用相似的劑量，例如霧化的基于0MV的鼻內(nèi)疫苗可以具有每次噴霧約 100 μ 1或約130 μ 1的體積，4次噴霧給予約0. 5ml的總劑量。
[0160] 本發(fā)明的組合物的pH通常為6-8,并且更優(yōu)選6. 5-7. 5 (例如，約7)?；赗IVM 0MV的疫苗的pH為7. 4 [74]，并且對于本發(fā)明的組合物優(yōu)選pH < 7. 5。通過使用10mM Tris/ HC1緩沖液來維持基于RIVM 0MV的疫苗的pH，并且可以通過使用緩沖液（例如，Tris緩沖 液、檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液或組氨酸緩沖液）來維持本發(fā)明的組合物中的穩(wěn)定pH。 因此，本發(fā)明組合物通常會包括緩沖液。
[0161] 該組合物可以是無菌和/或無熱原的。本發(fā)明的組合物可以與人體等張。
[0162] 用于給予患者的本發(fā)明組合物有免疫原性，更優(yōu)選是疫苗組合物。本發(fā)明的疫苗 可以是預(yù)防性（即預(yù)防感染）或治療性（即治療感染）疫苗，但通常是預(yù)防性疫苗。用作疫 苗的免疫原性組合物包含免疫有效量的抗原，以及需要的任何其它組分。'免疫學(xué)有效量' 是指以單一劑量或一系列劑量的部分給予個(gè)體的對治療或預(yù)防有效的量。該量根據(jù)所治 療個(gè)體的健康和身體狀況、年齡、所治療個(gè)體的分類組（例如，非人的靈長動物、靈長動物 等）、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗配方、治療醫(yī)生對醫(yī)學(xué)情況的評 估和其它相關(guān)因素而變化。預(yù)計(jì)所述量將落入可通過常規(guī)試驗(yàn)可確定的相對較寬范圍內(nèi)。 本發(fā)明組合物的抗原含量通常以每劑量中蛋白的量表示。對于基于0MV的鼻內(nèi)疫苗，通常 是約0. 9mg蛋白/ml的劑量。
[0163] 本發(fā)明的組合物可以包括免疫佐劑。因此，例如，它們可以包括鋁鹽佐劑或水包油 乳液（例如，水包鯊烯乳液）。合適的鋁鹽包括氫氧化物（例如，羥基氧化物）、磷酸鹽（羥 基磷酸鹽、正磷酸鹽），（例如，參見參考文獻(xiàn)75的第8和9章），或其混合物。這些鹽可以 是任意合適的形式（例如，凝膠、結(jié)晶、無定形物等），優(yōu)選抗原吸附于鹽。給予患者的組合 物中 A1+++ 的濃度優(yōu)選小于 5mg/ml，例如< 4mg/ml、i^ 3mg/ml、i^ 2mg/ml、i^ lmg/ml 等。優(yōu) 選范圍是0. 3-lmg/ml。優(yōu)選最大值0.85mg/劑量。氫氧化鋁佐劑特別適用于腦膜炎球菌疫 苗。
[0164] 腦膜炎球菌會影響身體的各個(gè)部分，因此本發(fā)明中的組合物可以制備成各種液體 形式。例如，可將所述組合物制備為溶液或懸浮液形式的注射劑?？芍苽渌鼋M合物供肺 部給藥，例如，通過吸入器，采用細(xì)霧進(jìn)行所述給藥?？芍苽渌鼋M合物供鼻部、耳部或眼部 給藥，例如，作為噴霧或滴劑進(jìn)行所述給藥。通常是供肌肉內(nèi)給藥的注射劑。
[0165] 本發(fā)明組合物可包含抗微生物劑，特別是以多劑量形式包裝時(shí)。在疫苗中常見諸 如硫柳汞和2-苯氧乙醇的抗微生物劑，但是優(yōu)選使用不含汞的防腐劑或完全不用防腐劑。
[0166] 本發(fā)明組合物可包含去污劑，如吐溫（聚山梨酯），如吐溫80。去污劑的含量水平 通常較低，如< 〇.〇1%。
[0167] 本發(fā)明的組合物可以包括來自0MV制劑的殘留去污劑（例如，脫氧膽酸鹽）。對于 每μ g的MenB蛋白，殘留的去污劑的量優(yōu)選為低于0. 4 μ g (更優(yōu)選低于0. 2 μ g)。
[0168] 如果本發(fā)明的組合物包括L0S，對于每μ g的蛋白，LOS的量優(yōu)選低于0. 12 μ g (更 優(yōu)選低于〇. 05 μ g)。
[0169] 本發(fā)明組合物可含有鈉鹽（如氯化鈉）以產(chǎn)生張力。NaCl濃度通常為10土2mg/ ml,例如，約 9mg/ml。
[0170] 除了本發(fā)明的囊泡以外，免疫原性組合物可以包括可溶的蛋白抗原。例如，可用的 組合物可以包括本發(fā)明的組合物聯(lián)同以下的一種或多種：（i)NHBA抗原、（ii)NadA抗原和 (iii)fHbp抗原。例如，囊泡可以與"4CMenB"疫苗混合（參見上述）。在一個(gè)可用的實(shí)施方 式中，組合物同時(shí)包括可溶形式和過表達(dá)囊泡形式的fHbp，兩種形式是不同的fHbp變體， 例如，可溶形式的變體1 (4CMenB)和囊泡表面上存在的變體2和/或3,其由從本發(fā)明的啟 動子表達(dá)變體2或3序列的細(xì)菌制備。
[0171] 因此，本發(fā)明的一個(gè)組合物包括：⑴本發(fā)明的囊泡，諸如顯示fHbp序列的自發(fā)釋 放的囊泡；（ii)可溶的NHBA抗原，諸如SEQIDN0:4;(iii)可溶的fHbp抗原，諸如SEQID NO :5 ;和（iv)可溶的NadA抗原，諸如SEQ ID NO :6。
[0172] 治療方法
[0173] 本發(fā)明還提供了一種在哺乳動物中引起免疫應(yīng)答的方法，包含將本發(fā)明的組合物 給予所述哺乳動物。免疫反應(yīng)優(yōu)選為保護(hù)性，優(yōu)選涉及抗體。在已接受針對腦膜炎奈瑟球 菌的初免的患者中，該方法可產(chǎn)生加強(qiáng)應(yīng)答。
[0174] 所述哺乳動物優(yōu)選人。當(dāng)疫苗用于預(yù)防性用途時(shí)，人優(yōu)選為兒童（例如，幼童或嬰 兒）或青少年；當(dāng)疫苗用于治療用途時(shí)，人優(yōu)選為成人。為兒童準(zhǔn)備的疫苗也可給予成年 人，例如，以評估安全性、劑量、免疫原性等。
[0175] 本發(fā)明也提供用作藥物的本發(fā)明的囊泡。藥物優(yōu)選用于引起哺乳動物的免疫反應(yīng) (即，它是一種免疫原性組合物），并且更優(yōu)選是疫苗。
[0176] 本發(fā)明也提供本發(fā)明的囊泡在制備引起哺乳動物免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。
[0177] 這些應(yīng)用和方法優(yōu)選用于預(yù)防和/或治療由腦膜炎奈瑟球菌引起的疾病，例如， 細(xì)菌性（或者，更具體地，腦膜炎球菌）腦膜炎，或敗血癥。
[0178] 檢測治療性治療的功效的一種方式包括在給予本發(fā)明組合物后監(jiān)測奈瑟球菌感 染。監(jiān)測預(yù)防性治療的功效的一種方式包括監(jiān)測給予該組合物后針對抗原產(chǎn)生的免疫應(yīng) 答。本發(fā)明組合物的免疫原性可以通過給予受試對象（例如，12-16個(gè)月大的兒童或動物 模型[76])，然后測定標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，包括血清殺菌性抗體（SBA)和ELISA效價(jià)（GMT)來進(jìn)行測 定。通常在給予該組合物后約4周測定這些免疫應(yīng)答，并與給予該組合物之前測定的值作 比較。優(yōu)選至少4倍或8倍的SBA增長。給予一個(gè)以上劑量的組合物時(shí)，可以進(jìn)行超過一 次的給藥后測定。
[0179] 通常，在給予對象之后，本發(fā)明的組合物能夠誘導(dǎo)血清殺菌活性抗體應(yīng)答。這些應(yīng) 答可以在小鼠中方便地測得，并且是疫苗效力的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)。血清殺菌活性（SBA)測量由補(bǔ) 體介導(dǎo)的細(xì)菌殺傷，并且可以使用人或幼兔補(bǔ)體進(jìn)行試驗(yàn)。WHO標(biāo)準(zhǔn)要求疫苗在超過90% 的接受者中誘導(dǎo)至少4-倍的SBA上升。在給予第三次劑量4-6周之后，MeNZB?引起4-倍 的SBA上升。
[0180] 優(yōu)選的組合物可以在人對象患者中對于可接受百分比的對象產(chǎn)生優(yōu)于血清保護(hù) 標(biāo)準(zhǔn)的抗體效價(jià)。眾所周知抗原的關(guān)聯(lián)抗體效價(jià)，高于該效價(jià)就認(rèn)為宿主針對所述抗原發(fā) 生血清轉(zhuǎn)化，該類效價(jià)由諸如WHO的組織公布。優(yōu)選多于80%的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的對象 樣品發(fā)生血清轉(zhuǎn)化，更優(yōu)選多于90%，更優(yōu)選多于93%，最優(yōu)選96-100%。
[0181] 本發(fā)明的組合物通常直接給予患者?？梢酝ㄟ^胃腸道外注射（例如，皮下、腹膜 內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或遞送至組織間隙），或通過任意其他合適的途徑實(shí)現(xiàn)直接遞送。本發(fā)明 可用來引發(fā)全身和/或粘膜免疫。優(yōu)選肌肉內(nèi)給予到大腿或上臂。注射可以通過針頭（例 如皮下針頭）進(jìn)行，但也可以采用無針注射。肌內(nèi)劑量通常是〇.5ml。
[0182] 劑量治療可采用單劑量方案或多劑量方案。多劑量可用于初次免疫方案和/或加 強(qiáng)的免疫方案。初次給藥方案之后，可以進(jìn)行加強(qiáng)給藥方案?？梢猿Ｒ?guī)確定初次劑量之間 (例如4-16周）以及初次和加強(qiáng)劑量之間的適當(dāng)時(shí)機(jī)。使用3-或4-劑量初免方案測試基 于0MV的RIVM疫苗，在0、2和8個(gè)月或0、1、2和8個(gè)月時(shí)接種疫苗。以三次間隔6周的劑 量給予MeNZB?。
[0183] 可以使用本發(fā)明的組合物來誘導(dǎo)針對超過一種的腦膜炎球菌超毒力譜系的殺菌 性抗體應(yīng)答。具體地，它們可以優(yōu)選誘導(dǎo)針對以下三種超毒力譜系中的兩種或三種的殺菌 應(yīng)答：（i)A4簇；（ii)ET5復(fù)合系；和（iii)譜系3。它們可以另外誘導(dǎo)針對超毒力譜系血 清組I、血清組III、血清組IV-1或ET-37復(fù)合系中的一種或多種和其他譜系如高侵襲性譜 系的殺菌性抗體應(yīng)答。這并不一定表示所述組合物可以誘導(dǎo)針對這些超毒力譜系中各個(gè)和 每個(gè)腦膜炎球菌菌株的殺菌性抗體，例如，相反，對具體超毒力譜系內(nèi)腦膜炎球菌菌株中的 4種或更多種菌株的任何給定組來說，所述組合物誘導(dǎo)的抗體對所述組的至少50% (例如， 60%、70%、80%、90%或更多）具有殺菌作用。優(yōu)選的菌株組包括以下國家中的至少4個(gè)中 分離到的菌株 ：68、4104、勵、11\舊、似、1、81?和(^。所述血清優(yōu)選具有至少為1024(例 如，21°、2 11、212、213、214、215、2 16、217、218或更高，優(yōu)選至少為214)的殺菌效價(jià)，例如所述血清可 以在以1 : 1024稀釋時(shí)殺死特定菌株中至少50%的測試細(xì)菌。
[0184] 可用的組合物可以誘導(dǎo)針對血清組B腦膜炎球菌的以下菌株的殺菌性應(yīng)答：（i) 來自 A4 簇，菌株 961-5945(B :2b :PL 21，16)和 / 或菌株 G2136(B :-) ;(ii)來自 ET-5 復(fù) 合系，菌株此58出：15屮1.7，1613)和/或菌株44/76(8:15屮1.7，16) ;出1)來自譜系3， 菌株394/98 (B :4 :P1. 4)和/或菌株BZ198 (B :NT :-)。更優(yōu)選的組合物可以誘導(dǎo)針對菌株 961-5945、44/76和394/98的殺菌性應(yīng)答。
[0185] 菌株961-5945和G2136都是奈瑟球菌MLST參比菌株（參考文獻(xiàn)77中的編號638 和1002)。菌株MC58是廣泛可得的（例如，ATCC BAA-335)并且是在參考文獻(xiàn)78中測序的 菌株。菌株44/76已被廣泛使用并表征（例如，參考文獻(xiàn)79)并且是奈瑟球菌MLST參比菌 株中的一種（參考文獻(xiàn)77中的編號237 ;參考文獻(xiàn)46中表2第32行）。菌株394/98原始 于1998年在新西蘭分離，并且存在幾個(gè)使用該菌株的公開研究（例如，參考文獻(xiàn)80和81)。 菌株BZ198是另一種MLST參比菌株（參考文獻(xiàn)77中編號409 ;參考文獻(xiàn)46中表2第41 行）。
[0186] 其它抗原組分
[0187] 除了本發(fā)明的囊泡以外，免疫原性組合物可以包括其他非囊泡抗原。
[0188] 在一些實(shí)施方式中，組合物包括一種或多種來自腦膜炎球菌的莢膜糖，例如來自 血清組A、C、W135和/或Y。這些糖通常與蛋白運(yùn)載體偶聯(lián)。本發(fā)明的組合物可以包括來 自腦膜炎球菌血清組A、C、W135和Y的1、2、3或4種的莢膜糖的一種或多種偶聯(lián)物，例如， A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、A+W135+Y、A+C+W135+Y 等。包含 來自所有四種血清組A、C、W135和Y中的糖的組分是理想的。
[0189] 除了含有來自腦膜炎奈瑟球菌的抗原以外，組合物可以包括來自其他病原體的抗 原。例如，所述組合物可以包含一種或多種下列其它抗原：
[0190] -來自肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae)的抗原，諸如糖（通常是偶聯(lián) 的）。
[0191] -來自乙型肝炎病毒的抗原，諸如表面抗原HBsAg。
[0192] -來自百日咳博德特菌（Bordetella pertussis)的抗原，諸如百日咳博德特菌的 百日咳全毒素（PT)和絲狀血凝素（FHA)，也可任選與百日咳桿菌黏附素（百日咳桿菌粘附 素）和/或凝集原2和3的組合。
[0193] -白喉抗原，諸如白喉類毒素。
[0194] -破傷風(fēng)抗原，諸如破傷風(fēng)類毒素。
[0195] -來自B型流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae B) (Hib)的糖抗原，通常是偶 聯(lián)的。
[0196] -滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原。
[0197] 所述組合物中包含白喉抗原時(shí)，也優(yōu)選包含破傷風(fēng)抗原和百日咳抗原。相似地，包 含破傷風(fēng)抗原時(shí)，也優(yōu)選包含白喉和百日咳抗原。相似地，包含百日咳抗原時(shí)，也優(yōu)選包含 白喉和破傷風(fēng)抗原。因此，優(yōu)選DTP組合。
[0198] 如果包括Hib糖（通常是偶聯(lián)物），糖部分可以是多糖（例如，從細(xì)菌中純化的全 長磷酸多核糖基核糖醇（PRP))，但也可能將純化的糖片段化來制備寡糖（例如，約1-約 5kDa的MW)，例如通過水解。組合物中Hib偶聯(lián)物的濃度通常范圍為0. 5 μ g-50 μ g，例如 1-20 μ g、10-15 μ g、12-16 μ g等。在一些實(shí)施方式中，這個(gè)量為約15g，或約12. 5 μ g。小于 5 μ g的質(zhì)量也是合適的[82]，例如1-5 μ g，2-4 μ g，或約2. 5 μ g。如上述，在包括Hib糖和 腦膜炎球菌糖的組合中，可以基于后者的劑量（具體地，有多種腦膜炎球菌血清組時(shí)，它們 的平均質(zhì)量）選擇前者的劑量。Hib偶聯(lián)物的其他特征如以上就腦膜炎球菌偶聯(lián)物所述，包 括運(yùn)載體蛋白的選擇（例如，CRM197或破傷風(fēng)類毒素）、連接、比率等。
[0199] 如果包括肺炎鏈球菌（S. pneumoniae)抗原，這可以是多肽或糖。偶聯(lián)物莢膜糖特 別用于針對肺炎球菌（pneumococcus)的免疫。所述糖可以是多糖，其大小是在從細(xì)菌純化 該糖期間形成，或者可以是這種多糖片段化產(chǎn)生的寡糖。例如，在7價(jià)PREVNAR產(chǎn)品中，6種 糖是完整多糖，而1種（18C血清型）是寡糖。一種組合物可包含來自以下一種或多種肺炎 球菌血清型的莢膜糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、 19卩、20、22?、23?和/或33?。組合物可包含多種血清型，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或更多種血清型。本領(lǐng)域已知7價(jià)、9價(jià)、10價(jià)、11價(jià) 和13價(jià)偶聯(lián)物組合，也了解23價(jià)非偶聯(lián)組合。例如，10價(jià)組合可包含來自血清型1、4、5、 68、7?、聽、14、18(：、19?和23?的糖。11價(jià)組合還可包含來源于血清型3的多糖。12價(jià)組合 可向10價(jià)混合物加入：血清型6A和19A ;6A和22F ; 19A和22F ;6A和15B ; 19A和15B ;r22F 和15B ;13價(jià)組合可向11價(jià)混合物加入：血清型19A和22F ;8和12F ;8和15B ;8和19A ;8 和22F ;12F和15B ;12F和19A ;12F和22F ;15B和19A ;15B和22F ;等等。肺炎球菌偶聯(lián)物 的其他特征如以上腦膜炎球菌偶聯(lián)物就所述，包括運(yùn)載體蛋白的選擇（例如，CRM197或破 傷風(fēng)類毒素）、連接、比率等。當(dāng)組合物包含超過一種偶聯(lián)物時(shí)，每種偶聯(lián)物可使用相同的載 體蛋白或不同的載體蛋白。參考文獻(xiàn)83描述了在多價(jià)肺炎球菌偶聯(lián)物疫苗中使用不同載 體蛋白的潛在優(yōu)點(diǎn)。
[0200] 概述
[0201] 除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施將采用化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和藥理 學(xué)的常規(guī)方法，這些方法在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已有充分描述。參見，例 如，參考文獻(xiàn)84-90等。
[0202] 術(shù)語"包含"涵蓋"包括"以及"由……組成"，例如，"包含"X的組合物可以僅由X 組成或可包括其它物質(zhì)，例如X+Y。
[0203] 與數(shù)值X相關(guān)的術(shù)語"約"是可任選的，并且表示，例如x± 10%。
[0204] 當(dāng)本發(fā)明涉及"表位"時(shí)，該表位可以是B-細(xì)胞表位和/或T-細(xì)胞表位，但通常是 B-細(xì)胞表位。這類表位可憑經(jīng)驗(yàn)確定（例如，使用PEPSCAN[91，92]或相似方法），或它們 可被預(yù)測（如利用Jameson-Wolf抗原性指數(shù)[93]、基于矩陣的方法[94]、MAPIT0PE[95]、 TEPIT0PE[96,97]、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[98]、OptiMer 和 EpiMer[99，100]、ADEPT[101]、T 位點(diǎn) (Tsites) [102]、親水性[103]、抗原性指數(shù)[104]或參考文獻(xiàn)105-106、107、108、109公開的 方法等）。表位是由抗體或T細(xì)胞受體的抗原結(jié)合位點(diǎn)識別并與之結(jié)合的抗原某部分，它們 也稱作"抗原決定簇"。
[0205] 兩個(gè)氨基酸序列間的序列相同性百分?jǐn)?shù)表示進(jìn)行比對時(shí)所比較的兩條序列中相 同氨基酸的百分?jǐn)?shù)。這種比對和同源性百分?jǐn)?shù)或序列相同性百分?jǐn)?shù)可利用本領(lǐng)域所知軟 件程序來確定，例如用參考文獻(xiàn)110的7. 7. 18部分所描述的那些。優(yōu)選的比對通過史密 斯-沃特曼（Smith-Waterman)同源性搜索算法使用仿射缺口搜索確定，其中缺口開放罰12 分，缺口延伸罰2分，BL0SUM矩陣計(jì)62分。參考文獻(xiàn)111中公開了史密斯-沃特曼同源性 搜索算法。
[0206] 術(shù)語"基本上"不排除"完全"，如"基本上不含"Y的組合物可能完全不含Y。如有 需要，"基本上"一詞可從本發(fā)明的定義中省略。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0207] 圖1說明在相同背景中使用5種不同的啟動子在相同背景菌株（NZ98/254)和過 表達(dá)相同fHbp等位基因的基準(zhǔn)菌株[112,113]中的fHbp表達(dá)水平。如圖所示，fHbp的變 體2等位基因在基準(zhǔn)菌株中或來自在間隔區(qū)（spacer tract)中具有11個(gè)G或13個(gè)G的 P〇rA啟動子的2個(gè)野生型相變體或由修飾的ST1、ST2和ST3 porA啟動子過表達(dá)。如圖所 示，從0. 5倍到2倍上樣對各菌株進(jìn)行等當(dāng)量總蛋白的Western印跡，并且箭頭表示fHbp。
[0208] 圖2表示來自porA和16S修飾的啟動子的fHbp表達(dá)的比較分析。在所示的啟動 子控制下表達(dá)fHBP變體2的NZ98/254菌株生長在板上（A)和在液體中生長到對數(shù)期（B) 和穩(wěn)定期（C)，并且通過western印跡測量來自重復(fù)培養(yǎng)基（#1，#2)或來自基準(zhǔn)過表達(dá)菌 株的fHBP表達(dá)水平。實(shí)線箭頭指示fHbp，而較低的虛線箭頭指示上樣對照。
[0209] 圖3顯示來自以下3種菌株的fHbp的表達(dá)：（a) Δ lpxLl敲除；(b) Δ synX敲除；和 (c) Δ lpxLl Δ synX雙敲除。在所有情況中，由經(jīng)修飾的PorA啟動子控制下的fHbp取代敲 除的基因。通過在細(xì)胞粗提取物上使用抗-fHbp血清的western印跡來評價(jià)fHbp的表達(dá)， 并且與作為對照的Hfq比較。圖3A顯示western印跡，并且圖3B以人為單位（arbitrary unit)來定量表達(dá)。
[0210] 圖4顯不在分離自⑴Δ lpxLl Δ synX和（ii) Δ lpxLl Δ synX ΔmltA敲除菌株的 囊泡中的fHbp水平。圖4A以mg/OD顯示產(chǎn)量，并且圖4B是0. 5 μ g囊泡的western印跡。
[0211] 圖5顯示fHbp在兩個(gè)在不同基因座中過表達(dá)變體1或變體2fHbp的菌株中的表 達(dá)（泳道c和d)和在相應(yīng)的基因座中同時(shí)過表達(dá)變體1和變體2的菌株中的表達(dá)（泳道 e)。泳道a是野生型菌株，并且泳道b是該菌株的Λ fHbp敲除。
[0212] 圖6顯示了從三敲除純化的囊泡的銀染SDS-PAGE。

【具體實(shí)施方式】
[0213] 經(jīng)修飾的PorA啟動子
[0214] 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游在間隔子區(qū)域中含有11和13個(gè)連續(xù)G的野生型腦膜炎球菌 P〇rA啟動子的2個(gè)相變體的序列如下，用下劃線表示-35和-10區(qū)域：
[0215] AAAAATGGTTTTTTGCGGGGGGGGGGGTATAATTGAAGAC(SEQ ID NO ：31)
[0216] AAAAATGGTTTTTTGCGGGGGGGGGGGGGTATAATTGAAGAC(SEQ ID NO :40)
[0217] 在-35和-10區(qū)域之間的間插序列包括Gn聚-G序列，其與PorA表達(dá)的相轉(zhuǎn)變有 關(guān)系。為了穩(wěn)定來自這種啟動子的表達(dá)，測試了 3種修飾（小寫字母表示修飾）：
[0218] AAAAATGGTTTTTTGCGaGGGaGGtGGTATAATTGAAGAC( "ST1" ；SEQ ID NO :32)
[0219] AAAAATtGacaTTTGCGaGGGaGGtGGTATAATTGAAGAC( "ST2" ；SEQ ID NO :33)
[0220] AAAAtTGacaTTTTGCGaGGGaGGtGGTATAATTGAAGAC ( "ST3" ；SEQ ID NO :34)
[0221] 因此，在"ST1"中，Gn序列在3個(gè)位置上被間斷，留下不超過3個(gè)連續(xù)的G殘基。 在"ST2"中，使用相同的間插序列，但是用共有的-35區(qū)域TTGACA取代-35區(qū)域。在"ST3" 中，額外的T殘基插入緊接-35區(qū)域的下游。
[0222] 使用這三種啟動子來驅(qū)動NZ98/258菌株中fHbp序列的表達(dá)（fHbp變體2)。當(dāng)與 已經(jīng)在文獻(xiàn)[112,113]中報(bào)道的同等過表達(dá)菌株比較時(shí)，所有的3個(gè)修飾的啟動子在菌株 中導(dǎo)致fHBP的高水平過表達(dá)。在ST2中看到最佳的表達(dá)（圖1和2)。
[0223] 經(jīng)修飾的rRNA啟動子
[0224] 在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，16S rRNA啟動子與以下porA基因的5' UTR融合：
[0225] ATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTATAATTCGCAAC. . . (SEQ ID NO ：35)
[0226] 該啟動子經(jīng)過突變并且3種在-35區(qū)域的下游的變體的測序結(jié)果如下：
[0227] ATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTATAATTCGCAAC( "wt" ；SEQ ID NO :35)
[0228] ATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTATATTCGCAAC. · · ( "#5" ；SEQ ID NO :36)
[0229] ATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTTAATTCGCAC. · · ( "#6" ；SEQ ID NO :37)
[0230] ATATCTTGACAGGCGGAAGGAAACTTTATAATTCGCAAC. · · ( "#8" ；SEQ ID NO :38)
[0231] 因此，在變體#5和#6中，-10序列是5聚體，并且變體#6也在-10區(qū)域和轉(zhuǎn)錄起 始位點(diǎn)之間丟失了一個(gè)核苷酸。在變體#8中，-10區(qū)域及其下游序列與野生型相同，但是 在-35和-10區(qū)域之間的間插序列比野生型短一個(gè)核苷酸。
[0232] 來自經(jīng)修飾啟動子的fHbp表達(dá)
[0233] 這些啟動子與porA基因的5' UTR區(qū)域融合并且用于驅(qū)動fHbp編碼序列的表達(dá)。 如圖2所見，變體#5和#6,變體#5和#6顯示出最強(qiáng)的表達(dá)，接近ST2所見的水平。
[0234] 橫跨野生型啟動子（SEQ ID NO :35)，向下游延伸至轉(zhuǎn)錄區(qū)域并且向上樣延伸的全 區(qū)域如下（SEQ ID N0:41;358聚體），用下劃線表示-35和-10區(qū)域，并且用雙下劃線表示 核苷酸+1 (按照參考文獻(xiàn)10):
[0235] · · ·CGTCTGAGTCCCCGAGTTTCAGACAGCATATTCACAAAGGCGCACCAGCCGGAGGAGGGAGAGGA AAGGATTGTTGGAGGCGGCGCAGTATTTAGCAGAAATAAAAAACCTTATCCGACAGCGACATGACGAATTTCCCCA AAAAAATCCCGCTGAAAGCATTGACCGTTTTTCCCTGTGGGCGTATAGTTCGGTTCTTCGCTGCTGCAGAAGTGG CGGACGAACTGAAAAGTATAGCACAGAATGTTGGGGATATCGAGAGATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTA TAATTCGCAAC Q TATCGGGTGTTTGCCCGATGTTTTTAGGTTTTTATCAAATTTACAAAAGGAAGCC. . . (SEQ ID NO ：41)
[0236] 相似地，變體#5和#6的周圍序列如下：
[0237] #5 ：...CGTCTGAGTCCCCGAGTTTCAGACAGCATATTCACAAAGGCGCACCAGCCGGAGGAGGGAG AGGAAAGGATTGTTGGAGGCGGCGCAGTATTTAGCAGAAATAAAAAACCTTATCCGACAGCGACATGACGAATTTC CCCAAAAAAATCCCGCTGAAAGCATTGACCGTTTTTCCCTGTGGGCGTATAGTTCGGTTCTTCGCTGCTGCAGAAG TGGCGGACGAACTGAAAAGTATAGCACAGAATGTTGGGGATATCGAGAGATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACT TTATATTCGCAAC Q TATCGGGTGTTTGCCNNANGTTTTTAGGTTTTTATCAAATTTCAAAAGGAAGCC. . . (SEQ ID NO ：42)
[0238] #6 ：...CGTCTGAGTCCCCGAGTTTCAGACAGCATATTCACAAAGGCGCACCAGCCGGAGGAGGGAG AGGAAAGGATTGTTGGAGGCGGCGCAGTATTTAGCAGAAATAAAAAACCTTATCCGACAGCGACATGACGAATTTC CCCAAAAAAATCCCGCTGAAAGCATTGACCGTTTTTCCCTGTGGGCGTATAGTTCGGTTCTTCGCTGCTGCAGAAG TGGCGGACGAACTGAAAAGTATAGCACAGAATGTTGGGGATATCGAGAGATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACT tttaattcgcacG tatcgggtgtttgcccgatgtttttaggtttttattaaatttacaaaaggaagcccatangaa TCGAACTGC. . . (SEQ ID NO ：43)
[0239] 任意的這些較長序列可以用于本發(fā)明，雖然當(dāng)然可以如本文所述作出修飾。
[0240] 在變體啟動子控制下的fHbp基因在內(nèi)源lpxLl和/或synX基因的位置上穩(wěn)定地 插入腦膜炎球菌（菌株NZ98/254)的染色體中?？梢栽趕ynX基因座上看到稍高的表達(dá)水 平，并且具有兩種插入的菌株（AlpxLlAsynX雙敲除）的表達(dá)是來自個(gè)體基因座的表達(dá)之 和（圖3)。
[0241] 也制備如下菌株，其中2個(gè)不同的fHbp變體（1和2)在經(jīng)修飾的PorA啟動子的 控制下表達(dá)。兩個(gè)變體的共表達(dá)對來自各自不同的基因座的表達(dá)沒有明顯的負(fù)面影響，而 是產(chǎn)生疊加作用（圖5)。
[0242] 在AlpxLlAsynX雙敲除中內(nèi)源mltA(GNA33)基因的敲除進(jìn)一步增加了表達(dá)水 平，并且對于fHbp蛋白定位于菌株的囊泡中沒有負(fù)面影響。圖4顯示了從這些菌株中分離 的囊泡中的fHbp水平，顯示了（A)相對于培養(yǎng)基的光密度（0D)的蛋白產(chǎn)量（mg)，和（B)針 對0. 5 μ g囊泡的抗-fHbp western印跡。SDS-PAGE顯示在三敲除菌株中的fHbp條帶與 PorA和PorB -起是囊泡中最豐富的蛋白之一（圖6)。
[0243] 應(yīng)理解，僅以舉例的方式描述了本發(fā)明，可對之進(jìn)行修改而仍在本發(fā)明的范圍和 精神內(nèi)。
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[0002] <400 2 Val Ala Ala Asp lie GIv Ala Glv Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro 15 10 15 Leu Asp His Lvs Asp Lvs Ser Leu Gin Ser Leu Thr Leu Asp Gin Ser 20 ' 25 30 Val Arg Lvs Asn Glu L^s Leu Lys Leu Ala Ala Gin Glv Ala Glu Lvs 35 40 45' ' Thr Tvr Glv Asn Glv Asp Ser Leu Asn Thr Glv Lys Leu Lys Asn Asp 50 55 60 Lvs Val Ser Arg Phe Asp Phe lie Arg Gin Tie Glu Val Asp Glv Gin 65 70 75 80 Leu lie Thr Leu Glu Ser Glv Glu Phe Gin lie Tvr Lvs Gin Asp His 85 90 * 95 Ser Ala Val Va丄 Ala Leu Gin He G丄u Lys 丄丄e Asn Asn Pro Asp Lvs 100 105 110 lie Asp Ser Leu lie Asn Gin Arg Ser Phe Leu Val Ser Glv Leu Glv 115 120 125 Glv Glu His Thr Ala. Phe A.sn Gin I.bii Prn Asp Glv Lvs Ala Gin Tvr 130 135 140 ' His Glv Lvs Ma Phe Ser Ser Asp Asp Ala Glv Glv Lys Leu Thr TVr 145 ' 150 155 160 Thr lie Asp Phe Ala Ala Lys Gin Gly His Glv Lvs lie Glu His Leu 165 ^ ^ 170 175 Lvs Thr Pro Glu Gin Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lvs Ala 180 185 190 Asp Glu Lys Ser His Ala Val lie heu Glv Asp Thr Arg Tvr Glv Ser 195 2Q0 ' 205 ' Glu Glu Lvs Gly Thr Tvr His Leu Ala Leu Phe Glv Asp Arg Ala Gin 210 ^ 215 220 Glu lie Ala Gly Ser Ala Thr Vnl Lys lie Gly Glu Lvs Val His Glu 225 230 235 240 He Glv He Ala Glv Lvs Gin 245 <210> 3 <211> 250 <212> PRT <213，腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis ) <400〉 3 Val Ala Ala Asp lie Gly Thr Glv Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro 1 5 10 15 Leu Asp His Lys Asp Lvs Glv Leu Lvs Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser 20 25 30 lie Pro Gin Asn Glv Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gin Glv Ala Glu Lvs 35 ' 40 45' ' Thr Phe Lvs Ala Glv Asp Lvs Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lvs Leu 50 55 60 Lvs Asn Asp Lvs lie Ser Arg Phe Asp Phe Val Gin Lys Tie Glu Val 65 70 75 80 Asp Glv Gin Thr lie Thr Leu Ala Ser Glv Glu Phe Gin lie Tvr Lvs 85 90 % ' Gin Asn His ber Ala Val Val Ala Leu Gin He Glu Lvs lie Asn Asn 100 105 110
[0003] Pro Asp Lvs Thr Asp Ser Leu lie Asn Gin Arg Ser Phe Leu V Tal Ser 115 120 125 Glv Leu G1y Glv Glu Ills Thr Ala Phe Asn Gin Leu Pi'〇 GJ v Gly L\rs 130 135 140 Ala Glu Tvr His Glv Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Glv Arg 145 " 150 155 160 Leu His Tvr Ser lie Asp Phe Thr Lvs Lvs Gin Glv Tvr Glv Arg lie " .165 170 ' 175 Glu His Leu Lvs Thr Leu Glu Gin Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu 180 185 19Q Leu Lvs Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Yal lie Leu Glv Asp Thr Arg ' 195 ' 200 205 Tvr G1y Ser Glu Glu Lys Glv Thr Tvr His Leu Ala Leu Phe Glv Asp '210 215 ' 220 ' Arg Ala Gin Glu lie Λ]η Glv Ser Λ]η Thr Val Lvs lie Glv Glu Lvs 225 230 235 240 Val His Glu lie Glv lie Ala Glv Lys Gin 245 ^ 250 <210 4 <211 644 <212 PR丁 <213 人工序列 <220 <223 雜交腦膜炎球菌抗原 <400> 4 Mel Ala Ser Pro Asp Val Lvs Ser Ala Asp Thr Leu. Ser Lva Pro Ala 15 10 15 Ala Pro Val Val Ser Glu Lys Glu Thr Glu Ala Lys G]u Asp Ala Pro 20 25 30 Gin Ala Glv Ser Gin Glv Gin Glv Ala Pro Ser Ala Gin Gly Glv Gin 35' ' 40' 45 ' ' Asp Met Ala Ala Val Ser Glu Glu Asn Thr Glv Asn Glv Glv Ala Ala 50 55 60 ' ' Ala Thr Asp Lys Pro Lvs Asn Glu Asp Glu Glv Ala Gin Asn Asp Met 65 70 75 80 Pro Girt Asn Ala Ala Asp Thr Asp Ser Leu Thr Pro Asn His Thr Pro 85 90 95 Ala Ser Asn Met Pro Ala Glv Asn Met Glu Asn Gin Ala Pro Asp Ala 100 ' 105 110 Glv G]\l Ser Glu Gin Pro Ain Asn Gin Prn Asp Met A]a Asn Thv A] a 115 120 125 Asp Glv Met Gin Glv Asp Asp Pro Ser Ala Glv Glv Glu Asn Ala Gly 130 ' 135 14t) - Asn Thr Ala Ala Gin Glv Thr Asn Gin Ala Glu Asn Asn Gin Thr Ala 145 150 155 160 Glv Ser Gin Asn Pro Ala Ser Ser Thr Asn Pro Ser Ala Thr Asn Ser ' 165 170 175 Glv Gly Asp Phe Glv Arg Thr Asn Val Glv Asn Ser Val Val lie Asp ' 180 ' 185 ' 190 Gly Pro Ser Gin Asn lie Thr Leu Thr His Cys Lvs Glv Asp Scr Cvs 195 200 ' 205 '
[0004] Ser Glv Asn Asn Phe Leu Asp Glu Glu Val Gin Leu Lys Ser Glu Phe 210 215 220 Glu Lys Leu Ser Asp Ala Asp Lvs lie Ser Asn Tvr Lvs Lvs Asp Glv 225 230 ^ 235 ' 240 Lys Asn Asp Glv Lys Asn Asp Lys Phe Val Glv Leu Val Ala Asp Ser 245 250 255 Val Gin Met Lvs Glv lie Asn Gin Tvr lie lie Phe Tvr Lys Pro Lvs 260 ' 265 " 270 ' Pro Thr Ser Phe Ala Arg Phe Arg Arg Ser Ala Arg Ser Arg Arg Ser 275 280 285 Leu Pro Ala Glu Met Pro Leu lie Pro Val Asn Gin Ala Asp Thr Leu 290 295 300 Tie Val Asp G]v Glu Ala Val Ser Leu Thr Glv His Ser Gly Asn Tie 305 310 315 3*20 Phe Ala Pro Glu Glv Asn Tvr Arg Tvr Leu Thr Tyr Glv Ala Glu Lvs 325 ' ' 330 ' 335 Leu Pro Glv Glv Ser Tvr Ala Leu Arg Val Gin Glv Glu Pro Ser Lvs 340 " 345 - 350 ^ Glv Glu Met Leu Ala Glv Thr Ala Vai Tvr Asn Gly Glu Val Leu His 355 360 365 Phe His Thr Glu Asn Glv Arg Pro Ser Pro Ser Arg Glv Arg Phe Ala 370 375 380 ' Ala Lys Val Asp Phe Gly Ser Lys Ser Val Asp Glv lie He Asp Ser 385 390 ^ 395 ' 400 Glv Asp Glv Leu His Met Glv Thr Girt Lys Phe Lvs Ala Ala lie Asp ' ' 405 ' 410 ' 415 Glv Asn Glv Phe Lvs Gly Thr Trp Thr Glu Asn Glv Civ Glv Asp Va] 420 425 430 Ser Gly Lvs Phe Tvr Glv Pro Ala Gly Glu Glu Val Ala Gly Lvs Tvr 435 440 445 Ser TVr Arg Pro Τ--γ Asp Ala Glu Lvs Giv Glv Phe (Uv Val Phe Als 450 455 460 ' Glv Lys Lys Glu Gin Asp Glv Ser Gly Glv Glv Glv Ala Thr Tyr Lys 465 470 475 ' ' 480 Val Asp Glu Tyr His Ala Asn Ala Arg Phe Ala lie Asp His Phe Asn ' 485 490 495 Thr Ser Thr Asn Val Gly Glv Phe Tvr Glv Leu Thr Glv Ser Val Glu 500 ' 505 ' 510 Phe Asp Gin Ala Lvs Arg Asp Glv Lvs lie Asp lie Thr lie Pro Val 515 ' 520 525 Ala Asn Leu Girt Ser Gly Ser Gin Hig Phe Thr Asp His Leu Lys Ser 530 535 540 Ala Asp lie Phe Asp Ala Ala Gin Tvr Pro Asp He Arg Phe Val Ser 545 550 555 560 Thr Lys Phe Asn Phe Asn Gly Lys Lvs Leu Va] Ser Val Asp Glv Asn 565 570 575 Leu Thr Met His Glv Lvs Thr Ala Pro Val Lys Leu Lvs /lla Glu Lvs 580 ' 5B5 > 590 ' Phe Asn Os Tyr Gin Ser Pro Met Ala Lys Thr G丄u Vai Cvs Gly Glv 595 600 605 ' Asp Phe Ser Thr Thr He Asp Arg Thr Lys Trp Gly Val Asp Tyr Leu
[0005] 610 615 620 Val Asn Val Gly Met Thr Lvs Ser Val Arg lie Asp lie Gin lie Glu 625 " 630 635 640 Ala Ala Lys Gin <210 5 <211 434 <212 PRT <213 人工序列 <220'> <223 雜交腦膜炎球菌抗原 <400 5 Met Val Ser Ala Val lie Glv Ser Ala Ala Val Glv Ala Lvs Ser Ala 15 10 15 Val Asp ArR Arg Thr Thr Gly Ala Gin Thr Asp Asp Asn Val Met Ala 20 25 30 Leu Arg lie Glu Thr Thr Ala Arg Ser Tyr Leu Arg Gin Asn Asn Gin 35 40 45 Thr L\rs GUr Trr Thr Pro Gin lie Ser Val Val Glv Tvr Asp Arg His 50 55 60 Leu Leu Leu Leu Glv Gin Val Ala Thr Glu Glv Glu Lvs Gin Phe Val 65 70 75 80 Glv Gin lie Ala ArR Ser Glu Gin Ala Ala Glu Glv Val Tvr Asn Tvr 85 90 9d lie Thr Val Ala Ser Leu Pro Arg Thr Ala Glv Asp lie Ala G1y Asp 100 105 ' 110 Thr Trp Asn Thr Ser Lvs Val Arg Ala Thr Leu Leu Glv lie Ser Pro 115 120 125 Ala Thr Arg Ala Arg Val Lvs Tie Val Thr Tvr Glv Asn Val Thr Tyr 130 135 140 Val Met Gly He Leu Thr Pro Glu Glu Gin Ala Gin lie Thr Gin Lvs 115 150 155 160 Val Ser Thr Thr Val Giv Va_L Gin Lvs Val lie Thr Leu Tvr Gin Asn 165 170 175 Tyr Val Gin Arg Glv Ser Glv Glv Glv Glv Val Ala Ala Asp lie Gly ' 180 ' 185 190 Ala Glv Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lvs Asp Lvs 135 200 205 Glv Leu Gin Ser Leu Thr Leu Asp Gin Ser Val Arg Lvs Asn Glu Lys 210 215 220 Leu Lvs Leu Ala Ala Gin Glv Ala Glu Lvs Thr T?r Glv Asn Glv Asp 225 230 235 240 Ser Leu Asn Thr Glv Lys Leu Lvs Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp 245 250 255 Phe He Arg Gin lie Glu Val Asp G1y Gin Leu He Thr Leu Glu Ser 260 265 270 Glv Glu Phe Gin Val Tvr Lvs Gin Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe 275 280 285 Gin Thr Glu Gin lie Gin Asp Ser Glu His Ser Glv Lvs Met Val Ala 290 295 300 Lvs Arg Gin Phe Arg lie filv Asp He Ala Glv (Uu His Thr Ser Phe 305 310 3?5 320
[0006] Asp Lys Leu Pro Glu Glv Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe 325 330 335 Glv Ser Asp Asp Ala Glv Glv Lys Leu Thr Tvr Thr lie Asp Phe Ala ' 340 ' 345 ' 350 Ala Lvs Gin Glv Asn Glv Lvs lie Glu His Leu Lvs Ser Pro Glu Leu 355 ' 360 ' 365 Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp lie Lvs Pro Asp Gly Lvs Arg His 370 375 " 380 ' Ala Val lie Ser Glv Ser Val Leu Tvr Asn Gin Ala Glu Lvs Glv Ser 385 390 ' 395 ' 400 Tvr Ser Leu Olv lie Phe Glv Glv Lvs Ala Gin Crlu Val Ala Glv Ser ^ 405 ' 410 415 Ala G]u Val Lvs Thr Val Asn Gly He Arg His Tie G]v Leu Ala Ala 420 425 430 Lvs Gin <210 6 <211 327 <212 PRT <213 腦膜炎奈瑟球菌〔Neisseria meningitidis) <400 6 Ala Thr Asn Asp Asp Asp Val Lvs Lys Ala Ala Thr Val Ala lie Ala 1 5 10 15 Ala Ala Tvr Asn Asn Gly Gin Glu He Asn Gly Phe Lvs Ala Gly Glu 20 25 30 Thi- I]e Tyr Asp lie Asp Glu Asp Glv Tbi lie Tiu L\ s Lvy Asp Ala 35 40 45 Thr Ala Ala Asp Val Glu Ala Asp Asp Phe Lys Glv Leu Gly Leu Lys 50 55 60' Lvs Val Val Thr Asn Leu Thr Lys Thr Val Asn Glu Asn Lvs Gin Asn 65 70 75 ' 80 Val Asp Ala Lvs Val Lvs Ala Ala Glu Ser Glu lie Glu Lvs Leu Thr 85 ' 90 95 Thr Lvs Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala ' 100 105 110 Leu Asp Ala. Thr Thr Asn Ala Leu Asn Lvs Leu Gly Glu Asn lie Thr 115 120 125 Thr Phe Ala Glu Glu Thr Lvs Thr Asn He Val Lvs I]e Asp Glu Lys 130 135 140 Leu Glu Ala Val Ala Asp Thr Val Asp Lvs His A丄a Glu Ala Phe Asn 145 150 ' 155 160 Asp lie Ala Asp Ser Leu Asp Glu Thr Asn Thr Lvs Ala Asp Glu Ala 165 170 175 Val Lvs Thr Ala Asn Glu Ala Lvs Gin Thr Ala Glu Glu Thr Lvs Gin ' 180 ' 185 190 Asn Val Asp Ala Lvs ￥al Lvs Ala Ala Glu Thr Ala Ala Glv Lvs Ala 195 ' ' 200 205 ' ' Glu Ala Ala Ala Gly Thr Ala Asn Thr Ala Ala Asp Lys Ala Glu Ala 210 ' 215 220 Val Ala Ala Lvs Val Thr Asp lie Lys Ala Asp Tic Ala Thr Asn Lvs 225 230 235 240
[0007] Asp Asn lie Ala Lvs Lvs Aia Asn Ser Ala Asp Val Tyr Thr Arg Glu 245 250 255 Glu Ser Asp Ser Lvs Phe Val Arg lie Asp G1y Leu Asn Ala Thr Thr 260 265 ' 270 Glu Lys Leu Asp Thr Arg Leu Ala Ser Ala Glu Lvs Ser lie Ala Asp 275 280 285 His Asp Thr Arg Leu Asn Glv Leu Asp Lvs Thr Val Ser Asp Leu Arg 290 " 295 ' 300 Lvs Glu Thr Arg Gin Glv Leu Ala (ilu Gin Ala Ala Leu Ser GLv Leu 305 310 315 320 Phe Gin Pro Tvr Asn Val Glv 325 ^ <210 7 <211 792 <212 PRT <213 腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 7 Met Lvs Pro Leu (iln Met Leu Pro lie Ala Ala Leu Val Glv Ser lie 1 ' 5 10 15 Phe Glv Asn Pro Val Leu Ala Ala Asp Glu Ala Ala Thr Glu Thr Thx- 20 25 30 Pro Val Lvs Ala (ilu lie Lys Ala Vai Arg Val L^s Glv Gin Arg Asn 35 40 45' Ala Pro Ala Ala Val Glu Arg Val Asn Leu Asn Arg lie Lys Girt Glu 50 55 60 ' Met lie Arg Asp Asn Lvs Asp Leu Vai Arg Tyr Ser Thr Asp Val Gly 65 70 75 80' Leu Ser Asp Ser Gly Arg His Gin Lvs Glv Phe Ala Val Arg 〇]y Va] 85 90 95 Glu Gly Asn Arg ￥al Glv Val Ser lie Asp Glv Val Asn Leu Pro Asp ' 100 105 110 Ser Glu Glu Asn Ser Leu Tvr Ala Arg Tvr Glv Asn Phe Asn Ser Ser 115 ' 120 ' ' 125 Arg Leu Ser lie Asp Pro Glu Leu Val Arg Asn lie Glu He Val Lys 130 135 140 Glv Ala Asp Ser Phe Asn Thr Glv Ser Glv Ala Leu Civ Glv G1y Val 145 150 ' 155 160 Asn Tyr Gin Thr Leu Gin Glv Arg Asp Leu Leu Leu Asp Asp Arg Gin 165 ' ' 170 175 Phe Glv Val Met Met Lvs Asn Glv Tyr Ser Thr Arg Asn Arg Glu Trp ' 180 _ 185 190 Thr Asn Thr Leu Gly Phe Glv Val Ser Asn Asp Arg Val Asp Ala Ala 195 ' 200 205 Leu Leu Tvr Ser Gin Arg Arg Gl? His Glu Thi" Glu Ser Ala G1y Asn 210 215 220 Arg Glv Tvr Ala Val Glu Glv Glu Glv Ser Gly Ala Asn lie Ai'g Glv 225 230 ' 235 240 Ser Ala Arg Gly lie Pro Asp Ser Ser Lys His Lvs Tvr Asn His His 245 250 ' > 255 Ala Leu Gly Lys lie Ala Tyr Gin lie Asn Asp Asn His Arg lie Glv ^60 265 270 ' Λ?α Ser Leu Asn Gly Gin Gin Gly His Asn T>r Thr Val Glu Glu Ser
[0008] 275 280 285 Tvr Asn Leu Thr Ala Ser Ser Trp Arg Glu Ala Asp Asp Val Asrt Arg 290 295 300 Arg Arg Asn Ala Asn Leu Phe Tyr Glu Trp Met Pro Asp Ser Asn Trp 305 310 315 320 Leu Ser Ser Leu Lvs Ala Asp Phe Asp Tvr Gin Lys Thr Lvs Val Ala 325 330 335 Ala Val Asn Asn Lvs Glv Ser Phe Pro Met Asp T?r Ser Thr Trp Thr 340 345 350 Arg Asn TVr Asn Gin Lvs Asp Leu Asp Glu lie Tvr Asn Arg Ser Met 355 " 360 365 Asp Thr Arg Phe Lys Arg Phe Thr Leu Arg Leu Asp Ser His Pro Leu 370 375 380 Gin Leu Gly Gly Gly Arg His Arg Leu Ser Phe Lvs Thr Phe Val Ser 385 390 395 400 Arg Arg Asp Phe Glu Asn Leu Asn Arg Asp Asp Tvr Tvr Phe Ser Glv 405 410 415 Arg Val Val Arg Thr Thr Ser Ser lie Gin His Pro Val Lvs Thr Thr 420 425 430 Asn Tyr Glv Phe Ser Leu Ser Asp Gin Tie Gin Trp Asn Asp Val Phe 435 440 445 Ser Ser Arg Ala Gly lie Arg Tvr Asp His Thr Lvs Met Thr Pro Gin 450 455 460 Glu Leu Asn Ala Glu Os His Ala Os Asp Lvs Thr Pro Pro Ala Ala 465 470 ' 475 480 Asn Thr Tvr Lvs Civ Trp Ser Gly Phe Val Gly Leu Ala Ala Gin Leu 485 490 495 Asn Gin Ala Trp Arg Val Glv Tyr Asp He Thr Ser Glv Tvr Arg Val 500 ' ' 505 5?0 Pro Asn Ala Ser Glu Val Tyr Phe Thr Τυγ Asn His Glv Ser Gly Asn 515 520 ' 525 Trp Leu Pro Asn Pro Asn Leu Lvy Ala Glu Arg Ser Ttir Tlir His Thr 530 535 540 Leu Ser Leu Gin Glv Arg Ser Glu Lys Glv Met Leu Asp Ala Asn Leu 545 550 555 560 Tvr Glu Ser Asn Tvr Arg Asn Phe Leu Ser Glu Glu Gla Lvs Leu Thr 565 570 575 Thr Ser Glv Thr Pro Glv Cys Tht Glu Glu Asn Ala Tyr T>r Gly lie 580 585 590 Cvs Ser A^p Pro Tvr Lvs Glu Lvs Leu Asp Trp Gin Mel Lvs Asn lie 595 ' " 600 605 Asp Lvs Ala Arg lie Arg Glv He Glu Leu Thr Glv Arg Leu Aan Val 6?0 615 620 Asp Lvs Val Ala Ser Phe Val Pro Glu Glv Trp Lvs Leu Phe Glv Ser 625 630 635 640 Leu Glv Tvr Ala Lvs Ser Lvs Leu Ser Glv Asp Asn Set Leu Leu Set 645 ' 650 655 Thr Gin Pro Leu Lvs Val lie Ala G1y lie Asp Tyr Glu Ser Pro Ser 660 665 ' 670 Glu Lvs Trp Glv Val Phe Ser Arg Leu Thr Tvr Leu Glv Ala Lva Lvs ' 675 ' 680 ' 685 '
[0009] Val Lys Asp Ala Gin Tvr Thr Val Tyr Glu Asn Lvs Gly Trp Gly Thr 690 ' 695 700 Pro Leu Gin Lys Lvs Val Lys Asp TVr Pro Trp Leu Asn Lvs Ser A]a 705 710 715 ' 720 Tvr Val Phe Asp Met. Tyr Glv Phe Tvr Lvs Pro Ala Lys Asn Leu Thr " 725 ' ^ 73〇 735 Leu Arg Ala filv Val Tyr Asn Leu Phe Asn Arg Lvs Tvr Thr Thr Trp 740 ^ 745 " ' 750 Asp Ser Leu Arg Gly Leu Tvr Ser Tyr Ser Thr Thr Asn Ala Val Asp 755 760 765 Arg Asp Glv Lys Glv Leu Asp Arg Tvr Arg Ala Pro Glv Arg Asn Tvr 770 ' 775 ' 780 . Ala Val Ser Leu Glu Trp Lvs Phe 785 790 <210 8 <211' 793 <212 PRT <213 腦膜炎奈瑟球菌〔Neisseria i丨丨eningitidis) <400 8 Met Lvs Pro Leu Gin Met Leu Pro lie Ala Ala Leu Val Glv Ser lie 1 ' 5 10 15 Phe G1y Asn Pro Val Phe Ala Ala Asp Glu Ala Ala Thr Glu Thr Thr 20 25 30 Pro Val Lys Ala Glu Val Lvs Ala Val Arg Val Lvs Gly Gin Arg Asn 35 40 45^ Ala Pro Ala Ala Val Glu Arg Val Ayri Leu Asn Arg lie Lva Gin Glu 50 55 60 ' Met lie Arg Asp Asn Lvs Asp Leu Val Arg Tvr Ser Thr Asp Val GJ v 65 70 75 80 Leu Ser Asp Ser G1y Arg His Gin Lvs Glv Phe Ala Val Arg Glv Val 85' 90' 95' Glu Gly Asn Arg Val Glv Val Ser lie Asp Glv Val Asn Leu Pro Asp 100 105 110 Ser Glu Glu Asn Ser Leu Tvr Ala Arg Tvr Glv Asn Phe Asn Ser Ser 115 120 125 Arg Leu Ser lie Asp F^ro Glu Leu Val Arg Asn lie Asp lie Val Lvs 130 135 140 ' Gly Ala Asp Ser Phe Asn Thr Glv Ser Glv Ala Leu Glv Glv Glv Val 145 150 ' 155 160 Asn Tvr Gin Thr I.eu Gin Glv Arg Asp Leu Leu Leu Pro Glu Arg Girt 165 170 175 Phe Glv Val Met Met Lvs Asn Glv Tyr Ser Thr Arg Asn Arg Glu Trp ' 180 ' 185 190 Thr Asn Thr Leu Glv Phe Glv Val Ser Asn Asp Arg Val Asp Ala Ala 195 ' 200 205 Leu Leu Tvr Ser Gin Arg Arg Glv His Glu Thr Glu Ser Ala Glv Lvs 210 215 220 Arg Gly Tvr Pro Val Glu Glv Ala Glv Ser Glv Ala Asn lie Arg Glv 225 ' 230 ' 235 240 Scr Ala Arg Glv lie Pro Asp Pro Scr Gin His Lvs Tvr Asn His His 245 250 ' ' 255
[0010] Ala Leu Gly Lvs lie Ala Tyr Gin lie Asn Asp Asn Ills Arg lie Gif 260 265 270 Ala Ser Leu Asn Gly Gin Gin Glv His Asn Tyr Thr Val Glu Cilu Ser 275 ^ 280 ^ 285 Tvr Asn Leu Leu Ala Ser Tvr Trp Arg Glu Ala Asp Asp Val Asn Arg ^ 290 295 300 Arg Arg Asn Thr Asn Leu Phe Tyr Glu Trp Thr Fro Glu Ser Asp Arg 305 310 - 315 320 Leu Ser Met Val Lvs Ala Asp Val Asp Tyr Gin Lys Thr Lys Val Ser 325 330 ' 335 Ala Val Asn Tvr Lvs GIy Ser Phe Pro He Glu Asp Ser Ser Thr Leu 340 345 350 Thr Arg Asn Tyr Asn Gin Lvs Asp Leu Asp Glu lie Tvr Asn Arg Ser 355 360 365 Met Asp Thr Arg Phe Lvs Arg He Thr Leu Arg Leu Asp Ser His Pro 370 ' 375 380 Leu Gin Leu Gly Glv Gly Arg His Arg Leu Ser Phe Lvs Thr Phe Ala 385 390 395 ' 400 Ser Arg Arg Asp Phe Glu Asn Leu Asn Arg Asp Asp Tvr Tyr Phe Ser 405 410 415 Glv Arg Val Val Arg Thr Thr Ser Ser lie Gin His Pro Val Lys Thr ' 420 425 430 Thr Asn Tvr Glv Phe Ser Leu Ser Asp Gin lie Gin Trp Asn Asp Val 435 ' 440 445 Phe Ser Ser Arg Ala GIy lie Arg Tvr Asp His Thr Lvs Met Thr Pro 450 455 ' 460 Gin Glu Leu Asn Ala Glu Cvs His Ala Cvs Asp Lys Thr Pro Pio A]a 465 470 475 480 Ala Asn Thr Tvr Lvs GIy Trp Ser Gly Phe Val Glv Leu Ala Ala Gin 485 490 495 Leu Asn Gin Ala Trp Arg Val Glv Tvr Asp lie Thr Ser Glv TVr Arg 500 505 510 Val Pro Asn Ala Ser Glu Val Tvr Phe Thr Tyr Asn His Glv Ser Gl^ 515 520 525 ' ' Asn Trp Leu Pro Asn Pro Asn Leu Lvs Ala Glu Arg Thr Thr Thr His 530 535 ' 540 Thr Leu Ser Leu Gin Gly Arg Ser Glu Lys Gly Thr Leu Asp Ala Asn 545 550 555 560 Leu Tyr Gin Ser Asn Tvr Arg Asn Phe Leu Ser Glu Glu Gin Lvs Leu - 565 570 575 Thr Thr Ser Glv Asp Val Ser Cys Thr Gin Met Asn Tvr Tyr Tyr Gly 580 ' 585 ' 590 Met Cys Ser Asn Pro Tyr Ser Glu Lvs Leu Glu Trp Gin Met Gin Asn 595 600 605 lie Asp Lys Ala Arg lie Arg Gly He Glu Leu Tin' Civ Arg Leu Asn 610 615 620 Val Asp Lvs Val Ala Ser Phe Val Pro Glu Glv Trp Lvs Leu Phe Glv 625 630 635 > 640 Ser Leu Gly Tyr Ala Lvs Ser Lvs Leu Ser Gly Asp Asn Ser Leu Leu ' ' 645 ' 650 ' 655 Ser Thr Gin Pro Leu Lys Val lie ALa Gly He Asp Tyr Glu Ser Pro
[0011] 660 66δ 670 Ser Glu Lys Trp Glv Val Phe Ser Arg Leu Thr Tvr Leu Glv Ala Lys 675 680 685 " Lys Val Lys Asp Ala Gin Tvr Thr Val Tvr Glu Asn Lys Glv Trp Glv 690 695 700 Thr Pro Leu Gin Lvs Lvs Val Lys Asp Tvr Pro Trp Leu Asn Lvs Ser 705 710 T15 720 Ala Tyr Val Phe Asp Met Tvr Glv Phe Tvr Lvs Pro Val Lys Asn Leu 725 730 735 Thr Leu Arg Ala Gly Val Tyr Asn Val Phe Asn Arg Lvs Tvr Thr Thr 740 745 ' 750 Trp Asp Ser Leu Ar^ G1y Leu Tyr Ser Tvr Ser Thr Thr Asn Ser Val 755 760 765 Asp Arg Asp Glv Lys Glv Leu Asp Arg Tyr Arg Ala Pro Ser Arg Asn 770 775 780 Tvr Ala Val Ser Leu Glu Trp Lys Phe 785 790 <210 9 <211 ' 488 <212 PRT <213 腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis) <400 9 Met Phe Lys ArR Ser Val He Ala Met Ala Cys He Phe Ala Leu Ser 15 10 Id Ala Cvs Gly Glv Gly Glv Gly Glv Ser Pro Asp Val Lvs Ser Ala Asp 20 25 30 Thr Leu Ser Lvs Pro Ala Ala Pro Val Val Ser Glu Lvs Glu Thr Glu 35 40 45 Ala Lvs Glu Asp Ala Pro Gin Ala Gl'r Ser Gin Glv Gin Glv Ala Pro 50 55 60 Ser Ala Gin Gly Ser Gin Asp Met Ala Ala Val Ser Glu Glu Asn Thr 65 70 75 80 G丄v Asn Glv Glv Ala Val Thr Ala Asp Asn Pro Lvs Asn Glu Asp Glu 85 90 95 Val Ala Gin Asn Asp Met Pro Gin Asn Ala Ala GW Thr Asp Ser Ser 100 105 ^ 110 Thr Pro Asn His Thr Pro Asp Pro Asn Met Leu Ala G1y Asn Met Glu 115 120 125 Asn Gin Ala Thr Asp Ala Glv Glu Ser Ser Gin Pro Ala Asn Gin Pro 130 135 140 Asp Met Ala Asn Ala Ala Asp Glv Met Gin Gly Asp Asp Pro Ser Ala 145 150 155 160 Glv Glv Gin Asn Ala Gly Asn Thr Ala Ala Oln Glv Ala Asn Girt Ala 165 170 175 Gly Asn Asn Gin Ala Ala Glv Ser Ser Asp Pro lie Pro Ala Ser Asn 180 185 190 Pi'〇 Ala Pro Ala Asn Glv Glv Sei" Asn Phe Glv Arg Val Asp Leu A] a 195 200 205 Asn Glv Val Leu lie Asp Glv Pro Ser Oln Asn lie Thr Leu Thr His 210 215 220 Cvs Lys Glv Asp Ser Cvs Ser Gly Asn Asn Phe Leu Asp Glu Glu Val 225 230 235 240
[0012] Gin Leu Lys Ser Glu Phe Glu Lys Leu $er Asp Ala Asp Lvs lie Ser 245 250 ' 255 Asrt Tvr Lys Lvs Asp Glv Lys Asn Asp Lvs Phe Val G]v Leu Val Ala 260 265 270 Asp Ser Val Gin Met. Lys Glv lie Asn Gin Tvr lie lie Phe Tyr Lvs 275 280 ^ 285 ' Pro Lvs Pro Thr Ser Phe Ala Arg Phe Arg Arg Ser Ala Arg Ser Arg 290 295 300 Arg Ser Leu Pro Ala Glu Met Pro Leu lie Pro Val Asn Gin Ala Asp 305 310 315 320 Thr Leu lie Val Asp Glv Glu Ala Val Ser Leu Thr Glv His Ser Glv 325 > 330 > 335 ' Asn lie Phe Ala Pro Glu Glv Asn Tvr Arg Tvr Leu Thr Tyr Glv Ala 340 ' 345 ' 350 ' Glu Lvs Leu Pro Glv Glv Ser Tvr Ala Leu Arg Val Gin Glv Glu Pro 355 360 365 Ala Lvs Glv Glu Met Leu Ala Glv Ala Ala Val Tvr Asn Glv Glu Val 370 375 380 Leu His Phe His Thr Glu Asn Glv Arg Pro Tvr Pro Thr Arg Γτ?ν Arg 385 390 ' 395 400 Phe Ala Ala Lvs Val Asp Phe Glv Ser Lvs Ser Val Asp Glv lie lie 405 4?0 415 Asp Ser Glv Asp Asp Leu His Met Glv Thr Gin Lvs Phe Lvs Ala Ala 420 425 - 430 lie Asp Glv A別i (ily Phe Lvs Glv Thr Trp Thr Glu A別i Glv Ser Gly 435 440 445 Asp Val Ser Gly Lys Phe Tvr Glv Pro Ala Glv Glu G]u Val Ala Gly 450 455 460 Lvs Tvr Ser Tvr Arg Pro Thr Asp Ala Glu Lvs Gly Glv Phe Glv Val 465 ' 470 475 ' 480 Phe Ala Gly Lvs Lys Glu Gin Asp 485 <210、 10 <211 364 <212 PRT <2131 腦膜炎佘瑟球菌〔Neisseria meningitidis) <400 10 Met Ser Met Lys His Phe Pro Ser Lys Val Leu Thr Thr Ala lie Leu 1 5 10 15 Ala Thr Phe Cvs Ser Gly Ain Leu Ala Ala Thr Ser Asp Asp Asp Val 20 25 30 Lvs Lvs Ala Ala Thr Val Ala lie Val Ala Ala Tvr Asn Asn Glv Gin ' 35 40 45 Glu lie Asn Glv Phe Lys Ala Glv Glu Thr lie Tvr Asp lie Γτ?ν Glu 50 " 55 ' 60 " Asp Glv Thr lie Thr (Jin Lvs Asp Ala Thr Ala Ala Asp Val Glu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Phe Lvs Glv Leu Glv Leu Lvs Lvs Val Val Thr Asn Leu Thr 85' ' 90 95 Lys Thr Val Asn Glu Asn Lys Gin Asn Val Asp Ala Lvs Val Lvs Ala 100 105 ' 110
[0013] Ala Glu Ser Glu lie Glu Lvs Leu Thr Thr Lys Leu Ala Asp Thr Asp 115 ' 120 125 Ala Ala Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala Leu Asp Glu Thr Thr Asn Ala 130 135 140 Leu Asn Lvs Leu Glv Glu Asn lie Thr Thr Phe Ala Glu Glu Thr Lvs 145 ' 150 155 160 Thr Asn lie Val Lvs lie Asp Glu Lvs Leu Glu Ala Val Ala Asp Thr 165 ' 170 175 Val Asp Lvs Ills Ala Glu Ala Phe Asn Asp lie Ala Asp Ser Leu Asp "180 185 190 Glu Thr Asn Thr Lvs Ala Asp Glu Ala Val Lvs Thr Ala Asn Glu Ala 195 200 205 Lys Gin Thr Ala Glu Glu Thr Lys Gin Asn Va] Asp Ala Lys Val Lys 210 215 *220 Ala Ala Glu Thr Ala Ala Glv Lvs Ala Glu Ala Ala Ala Glv Thr Ala 225 230 > ' 235 ' 240 Asn Thr Ala Ala Asp Lvs Ala Glu Ala Val Ala AJ_a Lvs Val Thr Asp 245 250 ' 255 lie Lvs Ala Asp lie Ala Thr Asn Lvs Ala Asp He Ala Lys Asn Ser 260 265 270 Ala Arg lie Asp Ser Leu Asp Lvs Asn Val Ala Asn Leu Arg Lys Glu 275 280 285 Thr Arg Gin Glv Leu Ala Glu Gin Ala Ala Leu Ser Civ Leu Phe Gin 290 ' 295 300 ' Pro Tvr Asn Val Gly Arg Phe Asn Vai Thr Ala Ala Val Glv Glv Tvr 305 310 315 ' 320 Lvs Ser Glu Ser Ala Val Ala lie Glv Thr Γ.]ν Phe Arg Phe Thr G] u 325 330 335 Asn Phe Ala Ala Lvs Ala Gly Val Ala Val Glv Thr Ser Ser Gly Ser 340 345 350 Ser Ala Ala Tvr His Val filv Vai Asn Tvr Glu Trp 355 360 <210 11 <21] 171 <212 PRT <213 腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 11 Met Lys Lvs Ala Leu Ala Thr Leu lie Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala 1 ' 5 10 15 Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Glv Phe Tvr Val Gin Ala Asp Ala Ala 20 25 30 His Ala Lvs Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lvs Civ Phe Ser Pro 35 40 ' 45' Arg He Ser Ala Glv Tyr Arg lie Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp 50 55 60 Tyr Thr Arg Tyr Lvs Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thi' Asp Phe Lvs Leu 65 " 70 75 ' 80 Tvr Ser lie Gly Ala Ser Ala He Tvr Asp Phe Asp Thr Gin Ser Pro > 85 90 95 Val Lvs Pro Tyr Leu Glv Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val ' 100 ' Ι?δ 110 Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gin Thr Ser lie Gly Leu Glv
[0014] 115 120 125 Val Leu Thr Gly Val Ser Tvr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp 130 135 140 Ala Glv Tvr Arg Tvr Asn Tvr lie Gly Lvs Val Asn Thr Val Lvs Asn 145 150 155 160 Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Glv Val Arg Val Lys Phe 165 170 <210 12 <211 591 <212 PRT <213 腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis) <400 12 Met Asn Lvs lie Tvr Ar^ lie lie Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 1 5' 10 15 Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30 Thr Val Lvs Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45 Ala Ser Ala Asn Asn Glu Glu Gin Glu Glu Asp Leu Tyr Leu Asp Pro 50 55 60 Val Gin Arg Thr Val Ala Val Leu lie Val Asn Ser Asp Lvs Glu Glv 65 70 75 80 Thr Glv Glu Lvs Glu Lys Val Glu Glu Asn Ser Asp Trp Ala Val Tvr 85 90 95 Phe Asn Glu Urs Glv Val I」cu Thr A1 a Arg Glu lie Thr Leu Lvs Ala 100 105 110 Glv Asp Asn Leu Lys He Lvs Gin Asn Gly Thr Asn Phe Thr Tvr Ser 115 120 125 Leu Lvs hys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Glv Thr Glu Lvs Leu 130 135 140 Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn lie Thr Ser Asp Thr Lvs 145 150 155 160 Glv Leu Asn Phe Ala Lvs Glu Thr Ala Glv Thr Asn Glv Asp Thr Thr .165 170 175 Val His Leu Asn Gly He Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu Asn 180 185 190 Thr Glv Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu 195 200 205 Lvs Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Glv Trp Asn 2i〇 215 220 lie Lvs G1y Val Lys Pro Glv Thr Thr Ala Ser Asp Asn Yal Asp Phe 225 230 235 240 Va]紅g Thr Tvr Asp Thr Val G]u Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lvs Thr 245 250 255 Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lvs Asp Asn Glv Lys Lvs Thr Glu Val 260 265 ' 270 Lys He Glv Ala Lvs Thr Ser Val lie Lvs Glu Lvs Asp Glv Lvs Leu 275 280 ^ ' 285 Val Thr Glv Lys Asp Lvs Glv Glu Asn Gly Ser Sex- Thr Ayp Glu Glv 290 295 300 Glu Glv Leu Val Thr Ala Lvs Glu Val lie Asp Ala Val Asn Lys Ala 305 ' 310 315 ' 320
[0015] Gly Trp Arg Met Lvs Thr Thr Thr Ala Asn Olv Gin Thr Glv Gin Ala 325 330 ' 335 Asp Lvs Phe Glu Thr Val Thr Ser Glv Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser 340 345 350 Glv Lvs Glv Thr Thr Ala Thr Val Ser Lvs Asp Asp Gin Glv Asn lie ' ' 355 360 " 365 ' Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin 370 ' 375 ^ 380 Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lvs Ala Val Ala Gly Ser 385 390 395 400 Ser Gly Lvs Val lie Ser Glv Asn Val Ser Pro Ser Lvs Glv Lvs Met ' - 405 ' 410 4?5 Asp Glu Thr Val Asn lie Asn Ala Glv Asn Asn lie Glu lie Thr Arg 420 425 430 Λ?^η Glv Lvs Asn He Asp He Ala Thr Ser Met Thr Pro G]n Phe Ser 435 440 445 Ser Val Ser Leu Glv Ala Glv Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp 450 ' 455 460 Glv Asp Ala Leu Asn Val Glv Ser Lvs Lvs Asp Asn Lvs Pro Val Arg 465 470 ' 475 ' 480 lie Thr Asn Val Ala Pro Glv Val Lvs Glu Glv Asp Val Thr Asn Val 485 490 495 Ala Gin Leu L?s Glv Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg lie Asp Asn 500 ' 505 510 Val Asp Glv A別i Ala Arg Ala Glv lie Ala Gl[i Ala lie Ala Thr Ala 515 520 525 Glv Leu Val Gin Ala Tvr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala lie Gly 530 535 540 Glv Glv Thr Tvr Arg Glv Glu Ala Glv Tvr Ala lie Glv Tvr Ser Ser 545 ' ' 550 ' ' 555 ' ' 560 lie Ser Asp Glv Glv Asn Trp lie lie Lvs Glv Thr Ala Ser Glv Asn 565 570 575 Ser Arg Gly His Phe Glv Ala Ser Ala Ser Val G1y Tvr Gin Trp 580 585 ' 590 <210' 13 <211 1457 <212 PRT <213 腦膜炎奈瑟球菌〔Neisseria meningitidis) <400 13 Met Lvs Thr Thr Asp Lvs Arg Thr Thr Glu Thr His Arg Lvs Λ1 a Prn 1 5 10 15 Lvs Thr Glv Arg lie Arg Phe Ser Pro Ala Tvr Leu Ala lie Cvs Leu ' 20 25 30 Ser Phe Glv lie Leu Pro Gin Ala Trp Ala Gly His Thr Tyr Phe Glv 35' 40 45 ' lie Asn Tvr Gin Tvr Tyr Arg Asp Phe Ala Glu Asn Lvs Gly Lys Phe 50 55 60 ~ ' Ala Val Glv Ala Lvs Asp lie Glu Val Tvr Asn Lvs Lvs Glv Glu Leu 65 ' 70 ' 75 > ' ' 80 Val Gly Lys Scr Met Thr Lys Ala Pro Met lie Asp Phe Scr Val Val 85 90 95
[0016] Ser Arg Asn Glv Val Ala Ala Leu Val Glv Asp Gin Tyr He Val Ser 100 105 110 Val Ala Ills Asn Gly Glv Tyr Asn Asn Val Asp Phe Glv Ala Glu Glv 115 - 12〇 125 ' Arg Asn Pro Asp Gin His Arg Phe Thr Tvr Lys lie Val Lys Arg Asn 130 135 140 Asn Tyr Lys Ala Gly Thr Lvs Glv Ilis Pro Tyr Glv Glv Asp Tyr Ills 145 150 155 ' 160 Met. Pro Arg Leu Ills Lys Phe Val Thr Asp Ala Glu Pro Val GIu Met 165 170 175 Thr Ser Tvr Met Asp G1y Arg Lvs Tvr He Asp Gin Asn Asn Tvr Vro 180 185 190 Asp Arg Val Arg He Gly Ala Gly Arg Gin Tyr Trp Ai'g Ser A.sp Glu 195 200 205 Asp Glu Pro Asn Asn Arg Glu Ser Ser Tvr His lie Ala Ser Ala Tvr 210 215 ' 220 ' Ser Trp Leu Val (ilv (Uv Asn Thr Phe Ala Gin Asn Glv Ser (Uy Glv 225 230 235 ' 240 Glv Thr Val Asn Leu Glv Ser Glu Lvs He Lys His Ser Pro Tvr Glv 245 250 255 Phe Leu Pro Thr (ily Glv Ser Phe Gly Asp Ser Glv Ser Pro Met Phe 260 ^ " 265 ' 270 lie Tvr Asp Ala Gin Lys Gin Lys Trp Leu lie Asn G1y Val Leu Gin ' 275 - 280 285 Thr Glv Asn Pro Tyr lie Glv Lvs Ser Asn Glv Phe Gin Leu Val Arg 290 295 300 Lvs Asp Trp Phe Tvr Asp Glu lie Phe Ala CAv Asp Thr His Ser Va] 305 310 3?5 320 Phe Tvr Glu Pro Αγκ Gin Asn Glv Lvs Tvr Ser Phe Asn Asp Asp Asn 325 330 335 Asn Glv Thr Glv Lvs lie Asn Ala Lvs His Glu His Asn Ser Leu Pro ' 340 345 350 Asn Arg Leu Lvs Thr Arg Thr Val Gin Leu Phe Asn Val Ser Leu Ser 355 360 365 Glu Thr Ala Arg Glu Pro Val Tvr His Ala Ala Glv Civ Val Asn Ser 370 375 380 ' Tvi' Arg Pro Arg Leu Asn Asn Glv Glu Asn lie Ser Phe lie Asp Glu 385 390 ^ 395 400 Glv Lys Glv Glu Leu lie Leu Thr Ser Asn lie Asn Gin Glv Ala Glv '^ ' 405 410 415 ' Gly Leu Tyr Phe Gin Gly Asp Phe Thr Val Ser Pro Glu Asn Asn Glu "420 ' 425 430 Thr Trp Gin Glv Ala Glv Val His lie Ser Glu Asp Ser Thr Val Thr 435 440 445 Trp Lys Val Asn Gly Val A]a Asn Asp Arg Leu Ser Lys lie Glv Lvs 450 455 460 Gly Thr Leu His Val Gin Ala Lvs 〇1y Glu Asn Gin Glv Ser lie Ser 465 470 ' > 475 ' 480 Val Gly Asp Glv Thr Val lie Leu Asp Gin (Un Ala Asp Asp Lvs Gly 485 490 495 Lys Lys Gin Ala Phe Ser Glu He Gly Leu Val Ser Glv Arg Glr Thr
[0017] 500 505 510 Val Gin Leu Asn Ala Asp Asn Gin Phe Asn Pro Asp Lys Leu Tvr Phe 515 520 525 Gly Phe Arg Gly Glv Arg Leu Asp Leu Asn Glv His Ser Leu Ser Phe 530 ' ' 535 540 His Arg lie Gin Asn Thr Asp Glu Gly A丄a Met lie Val Asn His Asn 545 550 555 560 (--η Asp Lvs Glu Ser Thr Val Thr lie Thr Glv Asn Lys Asp lie Ala ' 565 570 ' ' 575 Thr Thr Glv Asn Asn Asn Ser Leu Asp Ser Lys Lys Glu lie Ala Tyr 580 585 590 Asn Glv Trp Phe Glv Glu Lvs Asp Thr Thr Lys Thr Asn G1v Arg Leu 595 600 605 Asn Leu Val l>r Gin Pro Aia A丄a Giu Asp Arg Thr Leu Leu Leu Ser 610 ' 615 620 Gly Γτ?ν Thr Asn Leu Asn Gly Asn lie Thr Gin Thr i\sn Gly Lys Leu 625 " 630 ^ 635 ^ ' 640 Phe Phe Ser G1y Arg Pro Thr Pro His Ala Τυγ Asn His Leu Asn Asp 645 650 655 His Trp Ser (Un Lvs Glu G丄v He Pro Arg Glv Giu 丄ie Vai F'rp Asp 660 ' 665 - 670 Asn Asp Trp lie Asn Arg Thr Phe Lvs Ala Glu Asn Phe G]n He Lvs 675 680 6B5 Glv Glv Gin Ala Val Val Ser Arg Asn Val Ala Lvs Val Lvs G1y Asp 690 695 700 Trp His Leu Ser Asn His A丄a G丄n Aia Va丄 Phe (Uv Val Ala Pro His 705 710 715 ' 720 Gin Ser His Thr lie Cvs Thr Arg Ser Asp Trp Thr Gly Leu Thr Asn 725 730 ' 735 Cys Val Glu Lys Thr lie Thr Asp Asp Lvs Val He Ala Ser Leu Thr 740 745 750 Lys Thr Asp lie Ser (Uv Asn Val Asp Leu Ala Asp His Aia tiis Leu 755 ' 760 765 Asn Leu Thr Gly Leu Ala Thr Leu Asn Glv Asn Leu Ser Ala Asn Gly 770 ' 775 780 Asp Thr Atr Τυγ Thr Val Ser His Asn Ala Thr Gin Asn Glv Asn Leu 785 790 795 800 Ser Leu Val Gly Asn Ala Gin Ala Thr Phe Asn Gin Ala Thr Leu Asn 805 810 815 Glv Asn Thr Ser Ala Ser Glv Asn Ala Ser Phe Asn Leu Ser Asp His 820 825 830 Ala Val Gin Asn Glv Ser Leu Thr Leu Ser Glv Asn Ala Lvs Ala Asn 835 840 845 Val Ser Mis Ser A_La· Leu Asn (iiv Asn Va丄 Sef Leu Aia Asp Lvs A丄a 850 855 ' 860 ' Val Phe His Phe Glu Ser Ser Arg Phe Thr Gly Gin lie Ser Gly Glv 865 870 875 880 Lys Asp Thr Ala Leu His Leu Lys Asp Ser Glu Trp Thr Leu Pro Ser 885 890 895 Gly Thr Glu Leu Gly Asn Leu Asn Leu Asp Asn Ala Thr lie Thr Leu 900 905 910
[0018] Asn Ser Ala Tvr Arg His Asp Ala Ala Gly Ala Gin Thr Gly Ser A.la 915 920 925 Thi' Asp Ala Pro Arg Arg Arg Scr Arg Arg Ser Arg Arg Ser Leu Leu 930 935 940 Ser Val Thr Pro Pro Thr Ser Val Glu Ser Arg Phe Asn Thr Leu Thr 945 950 955 960 Val Asn G1y Lys Leu Asn Glv Gin Glv Thr Phe Arg Phe Met Ser Glu "' 965 ' 970 975 Leu Phe G1y Tvr Arg Ser Asp L}^s Leu Lvs Leu Ala Glu Ser Ser Glu 980 985 990 Glv Thr Tvr Thr Leu Ala Val Asn Asn Thr Glv Asn Glu Pro Ala Ser . 995 1000 ' 1005 Leu Glu Gin Leu Thr Val Val Glu Gly Lvs Asp Asn Lvs Pro Leu Ser 1010 1015 - ' 1020 ' Glu Asn Leu Asn Phe Thr Leu Gin Λ?^η Glu His Val Asp Ain Glv ΛΙα 1025 1030 1035 1040 Trp Arg Tyr Gin Leu lie Arg Lvs Asp Glv Glu Phe Arg Leu His Asn ^ 1045 ' 1050 1055 Pro Val Lvs Glu Gin Glu Leu Ser Asp Lvs Leu Glv Lvs Ala Glu Ala "1060 1065 " ' ' 1070 Lvs Lvs Gin Ala Glu Lys Asp Asn Ala Gin Ser Leu Asp Ala Leu lie 1075 1080 1085 Ala Ala Glv Arg Asp Ala Val Glu Lys Thr Glu Ser Val Ala Glu Pro 1090 1095 1100 Ala Arg Gin Ala Glv Glv Glu Asn Val Gly lie MeL Gla Ala Glu Glu 1105 1Π 0 1115 1120 Glu Lvs Lys Arg Val Gin Ala Asp Lvs Asp Thi' Ala Leu Ala Lvs Qln 1125 1130 1135 Arg Glu Ala Glu Thr Arg Pro Ala Thr Thr Ala Phe Pro Arg Ala Arg 1140 1145 1150 Arg Ala Arg Arg Asp Leu Pro Gin Leu Gin Pro Gin Pro Gin Pro Gin 1155 1160 1165 Pro Gin Arg Asp Leu lie Ser Arg Tvr Ala Asn Ser Glv Leu Ser Glu 1170 1175 ~ 1180 Phe Ser Ala Thr Leu Asn Ser Val Phe Ala Val Gin Asp Glu Leu Asp 1185 1190 1195 1200 Arg Val Phe Ala Glu Asp Arg Arg Asn Ala Val Trp Thr Ser Glv lie 1205 1210 1215 Arg Asp Thr Lvs His Tvr Arg Ser Gin Asp Phe Arg Ala Tvr Arg Gin 1220 1225 1230 Gin Thr Asp Leu Arg Gin lie Glv Met Gin Lvs Asn Leu Glv Ser Glv 1235 1240 ' 1245 ' Arg Val GIy lie Leu Phe Ser His Asn Arg Thr Glu Asn Thr Phe Asp 1250 1255 1260 Asp Glv lie Glv Asn Ser Ala Arg Leu Ala His Glv Ala Val Phe Glv 1265 * 1270 1275 1280 Gin Tvr Glv lie Asp Arg Phe Tvr lie Glv lie Ser Ala Glv Ala Glv ' > 1285 ' 1290 1295 Phe Scr Scr Glv Scr Leu Scr Asp Glv lie Olv Gly Lvs lie Arg Arg 1300 1305 ' ' 1310
[0019] Arg Val Leu His Tyr Gly lie Gin Ala Arg Tyr Arg Ala Gly Phe Gly 1315 1320 1325 GW Phe Γτ?γ lie Glu Pro His lie Glv Ala Thr Arg Tvr Phe Val (lln 1330 1335 ' 1340 ^ Lys Ala Asp Tyr Arg Tvr Glu Asn Val Asn He Ala Tbr Pro Glv Leu 1345 1350 1355 1360 Ala Phe Asn Arg Tvr Arg Ala Glv lie Lvs Ala Asp Tvr Ser Phe Lys 1385 " 1370 ' 1375 ' Pro Ala Gin His lie Ser lie Thr Pro Tvr Leu Ser Leu Ser Tyr Thr 1380 1385 ' 1390 Asp Ala Ala Ser Gly Lvs Val Arg Thr Arg Val Asn Thr Ala Val Leu 1395 1400 1405 Ala Gin Asp Phe Glv Lys Thr Arg Ser Ala Glu Trp Gly Val Asn Ala 1410 1415 1420 Glu lie Lys G1y Phe Thr Leu Ser Leu His Ala Ala Ala Ala Lvs Glv 1425 ' ^ 1430 1435 ' 1440 Pro Gin Leu G丄u Ala Gin His Ser Ala Gly lie Lys Leu Glv Tvr Arg 1445 1450 ' 1455 Trp <210 14 <211, 797 <212 PRT <213 腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 14 Met Lys Leu Lys Gin lie Ala Ser Ala Leu Met Met Leu Glv lie Ser 1 ' '5 10 15 Pro Leu Ala Leu Ala Asp Phe Thr Tie Gin Asp lie Arg Val Glu OU 20 25 30 Leu Gin Arg Thr Glu Pro Ser Thr Val Phe Asn Tvr Leu Pro Val Lys 35 40 45 Val Giv Asp Thr Tvr Asn Asp Thr His Gly Ser Ala lie lie Lvs Ser 50^ ' 55 ' 60 ' Leu Tyr Ala Thr Glv Phe Phe Asp Asp Val Arg Val Glu Thr Ala Asp 65 70 75 80 Glv Gin Leu Leu Leu Thr Val lie Glu Arg Pro Thr lie Glv Ser Leu " 85 90 95 Asn lie Thr Gly Ala Lvs Met Leu Gin Asn Asp Ala lie Lvs Lvs Asn 100 105 110 Leu Glu Ser Phe Glv Leu Ala Gin Ser Gin Tvr Phe Asn Gin Ala Thr 115 - 120 ' 125 Leu Asn Oln Ala Val Ala Glv Leu Lvs Glu Glu Tyr Leu Civ Arg Gly 130 135 ' 140 ' Lys Leu Asn He Gin lie Thr Pro Lvs Val Thr Lys Leu Λ?α Arg Asn 145 150 155 160 Arg Val Asp lie Asp lie Thr Tie Asp Glu Glv Lvs Ser A]a Lvs lie 165 170 175 Thr Asp lie Glu Phe Glu Glv Asn Oln Va.1 Tvr Ser Asp Arg Lvs Leu 180 ' 185 ' 190 Met Arg Gin Met Ser Leu Thr Glu Glv Gly lie Trp Thr Trp Leu Thr 195 200 ' ' 205 Arg Ser 八sn Gin Phe Asn Glu Gin Lys Phe Ala Gin Asp Met Glu Lys
[0020] 210 215 220 Val Thr Asp Phe Tyr Gin Asn Asn Glv Tvr Phe Asp Phe Arg lie Leu 225 230 ' 235 240 Asp Thr Asp lie Gin Thr Asn Glu Asp Lvs Thr Lys Gin Thr lie Lvs 245 250 255 lie Thr Val His Glu G1y Gly Arg Phe Arg Trp Gly Lvs Val Set lie 260 265 270 Glu Glv Asp Thr Asn Glu Val Pro Lvs Ala Glu Leu Glu Lys Leu Leu 275 280 285 Thr Met Lvs Pro Gly Lys Trp Tyr Glu Arg Gin Gin Met Thr ALa Val 290 295 300 Leu Glv Glu lie Gin Asn Arg Met G1y Ser Ala Glv Tvr Ala Tvr Ser 305 310 315 32Q Glu lie Ser Val Gin Pro Leu Pro Asn Ala Ghi Thr Lys Thr Val Asp 325 330 335 Phe Val Leu His lie Glu Pro Glv Arg Lys lie Tvr Val Asn Glu lie 340 345 350 His lie Thr Glv Asn Asn Lvs Thr Arg Asp Glu Val Val Arg Arg Glu 355 360 " 365 Leu Arg Gin Met Glu Ser Ala Pro Tvr Asp Thr Ser Lvs Leu Gin Arg 370 375 380 Ser Lvs Glu ArR Val Glu Leu Leu G1y Tvr Phe Asp Asn Val Gin Phe 385 390 395 400 Asp Ala Val Pro Leu Ala Glv Thr Pro Asp Lvs Val Asp Leu Asn Met 405 410 415 Ser Leu Thr Glu Arg Ser Thr Gly Ser Leu Asp Leu Ser Ala G1y Trp 420 425 430 * Val Γτ?η Asp Thr Glv Leu Val Met Ser Ala Glv Val Ser Gin Asp Asn 435 440 445 Leu Phe Glv Thr Gly Lys Ser Ala Ala Leu Arg Ala Ser Arg Ser Lys 450 455 460 Thr Thr Leu Asn (ilv Ser Leu Ser Phe Thr Asp Pro Tvr Phe Thr Ala 465 470 475 480 Asp Glv Val Ser Leu Gly Tyr Asp Val Tvr Glv Lvs Ala Phe Asp Pro 485 ' 490 495 Arg Lvs Ala Ser Thr Ser lie Lvs Gin Tvr Lys Thr Thr Thr Ala Glv 500 505 510 Ala Glv lie Arg Met Ser Val Pro Vai Thr Glu Tvr Asp Arg Val Asa 515 520 525 Phe Glv Leu Val Ala Glu His Leu Thr Val Asn Thr Tvr Asn Lys Ala 530 535 540 Pro Lvs His Tyr Ala Asp Phe lie Lvs Lvs Tvr Glv Lvs Thr Asp Glv 545 550 555 ' 56D Thr Asp Glv Ser Phe Lys Glv Trp Leu Tvr Lvs Glv Thr Val Gly Trp 565 570 575 Gly Arg Asn Lvs Thr Asp Ser Ala Leu Trp Pro Thr Arg Glv Tyr Leu 580 585 590 Thr Glv Val Asn Ala Glu lie Ala Leu Pro Olv Ser Lvs Leu Girt Tvr 595 600 605 Tvr Ser Ala Thr His Asn filn Thr Trp Phe Phe Pro Leu Ser Lvs Thr 610 615 620
[0021] Phc Thr l.eu Met Leu Giv Gly Glu Yal Glv lie Ala Gly Gly Tvr Glv 625 630 635 640 Arg Thr Lvs Glu lie Pro Phe Phe Glu Asn Phe Tyr Glv Glv Glv Leu _ 645 650 655 Glv Ser Val Ar^ Glv Tvr Glu Ser Gly Thr Leu Gly Pro Lvs Val Tyr ' 660 ' ' 665 670 Asp (ilu Tvr Glv (ilu Lvs 丄丄e Ser Tvr i;丄v G_Lv Asn Lvs Lys A丄a Asn 675 ' 680 ' 685 Val Ser Ala Glu Leu Leu Phe Pro Met Pro Glv Ala L^s Asp Ala Arg 690 695 700 Thr Val Arg Leu Ser Leu Phe Ala Asp Ala Glv Ser Val Trp Asp Glv 705 710 715 720 Lvs Thr Tyr Asp Asp Asn Ser Ser Ser Ala Thr Gly Gly Arg Val Gin ' 725 730 735 Asn lie Tvr Gly Ala Glv Asn Thr His Lvs Ser Thr Phe Thr Asn Glu "740 ^ 745 750 Leu Arg Tvi Ser Aia G_Lv A_La Va丄 Thr 1'rp Leu Ser Pro Leu G_Lv " 760 76h " Pro Met Lvs Phe Ser Tvr Ala Tyr Pro Leu Lvs Lys Lys Pro Glu Asp 770 775 780 Gin Tie Gin Arg Phe Gin Phe Gin I,en Glv Thr Thr Phe 785 790 795 <210.. 15 <211 6 <212 PRT <213. 人工序列 <220 <223 接頭 <400. 15 Glv Ser Gly GIy Glv Glv 1 - 5 <210 - 16 <211 8 <212 PRT <213 人工序列 <220 <223 接頭 <400 16 Glv Ser Glv Ser Glv Glv Gly Glv 1 5 <210 17 <211 IS <212^ DNA <213^ 腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 17 tttgcggggg gggggggg 18 <210> 18 <211> 35 <212^ DNA <213 腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria niemngitidis) <400> 18 ttgacaggcg gaaggaatac tttataattc gcaac 35 CIO 19 <211 791
[0022] <212> PRT <213/ 腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 19 Met Lys Pro Leu Gin Met Leu Pro lie Ala Ala Leu Val G3v Ser lie 1 5 10 15 Phe G]y Asn Pro Val Leu Ala Ala Asp Glu Ala Ala Thr Glu Thr Thr 20 25 30 Pro Val Lvs Ala Glu lie Lvs Ala Val Arg Val Lys Glv Gin Arg Asn 35 40 45' Ala Pro Ala Ala Val Glu Arg Val Asn Leu Asn Arg He Lvs Gin Glu 50 55 60 ' Met 11c Arg Asp Asn Lvs Asp Leu Val Arg Tvr Scr Thr Asp Val (rly G5 70 7?3 80' Leu Ser Asp Ser Glv Arg His Gin Lvs Glv Phe Ala Val Arg Glv Val 85 90 95 Glu Glv Ayn Arg Val Gly Val Ser lie Aap Glv Veil Asn Leu Pro Ayp 100 105 110 Ser Glu Glu Asn Ser Leu Tvr Ala Arg Tvr Glv Asn Phe Asn Ser Ser 115 120 ' 125 Arg Leu Ser lie Asp Pro Glu Leu Val Arg Asn lie Glu lie Val Lys 130 135 140 GIy Ala Asp Ser Phe Asn Thr Glv Ser Glv Ala Leu Glv Gly Glv Val 145 150 ' 155 160 Asn Tvr Gin Thr Leu Gin Glv Arg Asp Leu Leu Leu Asp Asp Arg Gin .165 170 175 Phe Glv Val Mel MeL Lvs Ayn Glv Tvr Ser Tl:ir Arg Asn Arg Glu Trp ' 180 ' i85 190 Thr Asn Thr Leu Glv Phe Glv Val Ser Asn Asp Arg Val Asp Ala Ala 195 ' 200 205 Leu Leu Tvr Ser Gin Arg Arg Glv His Glu Thr Glu Ser Ala Glv Asn 210 215 > 220 > Arg G]v Tvr Ala Val Glu Glv Glu Gly Ser Glv /Ua Asn He Arg G]y 225 230 235 240 Ser Ala Arg Glv lie Pro Asp Ser Ser Lvs His Lvs Tvr His Ser Phe 245 250 255 Leu Glv Lvs lie Ala Tvr Gin lie Asn Asp Asn His Arg lie Glv Ala 260 265 270 Ser Leu Asn Glv Gin Gin Glv His Asn Tvr Thr Val Glu Glu Ser Tvr 275 ' 280 285 ' Asn Leu Thr A丄a Ser Ser Trp Arg Giu Aia Asp Asp Val Asn Arg Arg 290 295 300 Arg Asn Ala Asn Leu Phe 丁vr (Uu Trp Met Pro Asp Ser Asn Trp Lou 305 310 315 320 Ser Ser T.eii l.vs Ala. Asp Phe Asp Tvr Gin Lvs Thr Lvs Val Ala Ala ' 325 330 ' 335 Val Asn Asn Lvs Glv Ser Phe Pro Met Asp Tvr Ser Thr Trp Thr Arg 340 " 345 ' 350 Asn Tvr Asn Gin Lvs Asp Leu Asp Glu lie Tvr Asn Arg Ser Met Asp ' 355 ' 360 ' 365 Thr Arg Phe Lvs Arg Phe Thr Leu Arg Leu Asp Ser His Pro Leu Gin 370 375 380
[0023] Leu Gly Gly Gly Arg His Arg Leu Ser Phe Lys Thr Phe Vai Ser Arg 385 ' 390 395 400 Arg Asp Phe Glu Asn Leu Asn Arg Asp Asp Tyr Tvr Phe Ser G1y Arg 405 410 ' 415 Val Val Arg Thr Thr Ser Ser lie Gin His Pro Val Lvs Thr Thr Asn 420 425 430 Tyr Glv Phe Ser Leu Ser Asp Gin lie Gin Trp Asn Asp Val Phe Ser ' 435 440 445 Ser Arg Ala Gly lie Arg Tvr Asp His Thr Lys Met Thr Pro Gin Glu 450 455 ' 460 Leu Asn Ala Glu Cys His Ala Cvs Asp Lvs Thi" Pro Pro Ala Ala Asn 465 470 475 480 Thr Tyr Lvs G]v Ti'p Ser Glv Phe Val Glv Leu Ala Ala Gin Leu Asn 485 490 495 Gin Ala Trp His Val Gly Tvr Asp lie Thr Ser Glv Tvr Arg Val Pro 500 ' 505 ' 510 Asn Ala Ser Glu Val Tvr Phe Thr Tvr Asn His G丄v &r Glv Asn Trp 515 " 520 525 Leu Pro Asn Pro Asn Leu Lvs Ala Glu Arg Ser Thr Thr His Thr Leu 530 535 540 Ser Leu Gin Gly Arg Ser Glu Lys Gly Met Leu Asp Ala Asn Leu Ττγ 545 550 - 555 560 Gin Ser Asn Tvr Arg Asn Phe Leu Ser Glu Glu Gin Lvs Leu Thr Thr ' 565 570 ' 575 Ser Glv Thr Pro Gly Cvs Thr Glu Glu Asn Ala Tyr Tyr Glv lie Cvs ' 580 ' - 5H5 ' - 590 ' Scr Asp Pro Tvr Lvs Glu Lvs Leu Asp Trp Γ.3η Met Lvs Asn lie Asp 595 600 605 Lys Ala Arg lie ArK Glv lie Glu Leu Thr Glv Arg Leu Asn Val Asp 610 615 620 Lvs Val Ala Ser Phe Val Pro Glu G1y Trp Lys Leu Phe Glv Ser Leu 625 630 ' 635 ' 640 Glv Tvr Ala Lvs Ser Lvs Leu Ser Gly Asp Asn Ser Leu Leu Ser Thr ' > ' 645 650 655 Gin Pro Leu Lts Val lie Ala Glv lie Asp Tyr Glu Ser Pro Ser Glu 660 665 ' 670 Lys Trp Glv Val Phe Ser Arg Leu Thr Tvr Leu Glv Ala Lvs Lys Ala 675 680 685 Lvs Asp Ala Gin Tvr Thr Val Tyr Glu Asn Lvs Glv Trp Glv Thr Pro ' 690 ' 695 ' 700 ' Leu Gin Lvs Lys Val Lvs Asp Tvr Pro Trp Leu Asn Lvs Ser Ala Tvr 705 " 710 ' Π 5 ' 720 Val Phe Asp Met Tvr G1y Phe Tvr Lvs Pro Ala Lys Asn Leu Thr Leu 725 730 735 Arg Ala Glv Val Tvr Asn Val Phe Asn Arg L\'s Tvr Thr Thr Trp Asp 740 745 750 Ser Leu Arg Gly Leu Tvr Ser Tvr Ser Thr Thr Asn Ser Val Asp Arg 755 ' ' 760 765 Asp Glv Lvs Glv Leu Asp Arg Tvr Arg Ala Pro Ser Arg Asn Tvr Ala 770 775 780 ' Val Ser Leu Glu Trp Lys Phe
[0024] 785 790 <210 20 <211 147 <212 PRT <213/ 腦膜炎奈瑟球菌（iNeisseria meningitidis ) <400 20 Ala Asp Glu Ala Ala Thr Glu Thr Thr Pro Val Lys Ala Glu lie Lys 15 10 15 /^la Val Arg Val Lys G1y Gin Arg Asn Ala Pro Ala Ala Yal Glu Arg 20 25 30 Val Asn Leu Asn Arg lie Lys Gin Glu Met lie Arg Asp Asn Lys Asp 35 40 45 Leu Val Arg Tvr Ser Thr Asp Val GIy Leu Ser Asp Ser Glv Arg His 50 _ ' 55 60 Gin Lvs Gly Phe Ala Val Arg Gly Val Glu Glv Asn Arg Val Glv Val 65 70 75 80 Ser lie Asp Glv Val Asn Leu Pro Asp Ser Glu Glu Asn Ser Leu Tvr 85 90 95 Ala Arg Tvr Glv Asn Phe Asn Ser Ser Arg Leu Ser He Asp Pro Glu 100 106 110 Leu Val Arg Asn lie Glu lie Val Lvs Glv Ala Asp Ser Phe Asn Thr 115 120 125 Glv Ser Glv Ala Leu Gly Glv Glv Val Asn Tvr Gin Thr Leu Gin Glv 130 135 140 Arg Asp Leu 145 <210 21 <211 621 <212 PRT <213 腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meninKitidis ) <400 21 Leu Leu Asp Asp Arg Gin Phe Gly Val Met Met Lys Asn Glv Tvr Ser 1 5 10 15 Thr Arg Asn Arg Glu Trp Thr Asn Thr Leu Glv Phe Glv Val Ser Asn 20 25 30 Asp Arg Val Asp Ala Ala Leu Leu Tvr Ser Gin Arg Arg Glv His Glu 35 40 45 Thr Glu Ser Ala Glv Asn Arg Glv Tvr Ala Val Glu Glv Glu Gly Ser 50 55 60 Glv Ala Asn lie Arg Glv Ser Ala Arg Glv lie Pro Asp Ser Ser Lvs 65 70 75 80 His Lvs Tvr His Ser Phe Leu GIy Lvs lie Ala Tvr Gin lie Asn Asp B5 90 95 Asn His Arg Tic Glv Ala Ser Leu Asn Glv G]n Gin Glv His Asn Tvr 100 105 110 Thr Val Glu Glu Ser Tvr Asn Leu Thr Ala Ser Ser Trp Arg Glu Ala 115 " 120 125 Asp Asp Val Asn Arg Arg Arg Asn Ala Asn Leu Phe Tvr Glu Trp Met 130 135 140 Pro Asp Ser Asn Trp Leu Ser Ser Leu Lvs Ala Asp Phe Asp Tvr Gin 145 150 155 ' 160 Lvs Thr Lys Val Ala Ala Val Asn Asn Lys Glv Ser Phe Pro Met Asp ' " 165 170 ' 175
[0025] Tyr Ser Thr Trp Thr Arg Asn Tvr Asn Gin Lys Asp Leu Asp Glu He 180 185 190 Tvr Asn Arg Ser Met Asp Thr Arg Phe Lvs Arg Phe Thr Leu Arg Leu ' 195 200 ' 205 Asp Ser His Pro Leu Gin Leu Gly G1 y G1 v Arg His Arg I.eu Ser Phe 210 215 ' 220 Lys Thr Phe Val Ser Arg Arg Asp Phe Glu Asn Leu Asn Arg Asp Asp 225 230 235 240 Tyr Tvr Phe Ser Glv Arg Val Val Arg Thr Thr Ser Ser lie Gin His ' 245 250 255 Pro Val Lvs Thr Thr Asn Tvr Glv Phe Ser Leu Ser Asp Gin lie Gin 260 265 270 Trp Asn Asp Val Phe Ser Ser Arg Ala Glv lie Arg Tvr Asp His Thr 275 280 285 Lvs Met Thr Pro Gin Glu Leu Asn Ala Glu Cvs His Ala Os Asp Lys ' 290 295 300 ' ' Thr Pro Pro Ala Ala Asn Thr Tyr Lvs Glv Trp Ser (ilv Phe Val Glv 305 310 315 320 Leu Ala Ala Gin Leu Asn Gin Ala Trp His Val Gly Tyr Asp lie Thr 325 330 335 Ser Glv Tyr Arg Val Pro Asn Ala Ser Glu Val Tvr Phe Thr Tyr Asn ' ^ 340 345 > 350 His Glv Ser Glv Asn Trp Leu Pro Asn Pro Asn Leu Lvs Ala Glu Arg 355 ' 360 365 Ser Thr Thr His Thr Leu Ser Leu Gin Glv Arg Ser G]u Lvs Glv Met 370 375 380 Leu Asp Ala Asn Leu Tvr (iln Ser Asn Tvr Arg Asn Phe Leu Ser Glu 385 390 ' 395 400 Glu Gin Lvs Leu Thr Thr Ser Glv Thr Pro Gly Cvs Thr Glu Glu Asn 405 410 415 Ala Tvr Tvr Glv lie Cvs Ser Asp Pro Tvr Lvs Glu Lvs Leu Asp Trp ' ' 420 ' 425 ' 430 Gin Met Lvs Asn lie Asp Lvs Ala Arg lie Arg Glv lie Glu Leu Thr 435 ' 440 445 Glv Arg Leu Asn Yal Asp Lvs Val Ala Ser Phe Val Pro Glu Glv Trp 450 455 460 Lvs Leu Phe Glv Ser Leu Glv Tvr Ala Lys Sei' Lvs Leu Scr Gly Asp 465 470 475 480 Asn Ser l.eu Leu Ser Thr Gin Pro i.eu l.vs Val Π e Ala. Glv T1 e Asp 485 490 495 Tvr Glu Ser Pro Ser Glu Lvs Trp Gly Val Phe Ser Arg Leu Thr Tvr 500 505 510 ' Leu Glv Ala Lvs Lys Ala Lvs Asp Ala Gin Tvr Thr Val Tvr Glu Asn 515 ' 520 ' 525 Lvs Glv Trp Glv Thr Pro Leu Gin Lvs Lvs Val Lvs Asp Tvr Pro Trp ' 530 > 535 ' 540 ' Leu Asn Lvs Ser Ala Tvr Val Phe Asp Met Tvr Gly Phe Tvr Lvs Pro 545 ^ 550 555 ' - ' 560 Ain Lys Asn Leu Thr Leu Arg Ala Glv Val Tyr Asn Val Phe Asn Arg B65 570 575
[0026] Lys Tyr Thr Thr Trp Asp Ser Leu Arg Glv Leu Tyr Ser Tyr Ser Thr 580 585 ' ^ 590 Thr Asn Ser Val Asp Arg Asp Glv Lvs Glv Leu Asp Arg T\r Arg Ala 595 600 605 Pro Ser Arg Asn Tyr Ala Val Ser Leu Glu Trp Lys Phe 610 615 620 <210 22 <211 768 <212 PRT <213 腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <4QQ\ 22 Ala Asp Glu Ala Ala Thr Glu Thr Thr Pro Val Lvs Ala Glu lie Lys 15 10 15 Ala Val Arg Val Lys Gly Gin Arg Asn Ala Pro Ala Ala Va] Glu Arg 20 25 30 Val Asn Leu Asn Arg lie Lvs Gin Glu Met lie Arg Asp Asn Lys Asp 35 40 45 Leu Val Arg Tyr Ser Thr Asp Va丄 G1y Leu Ser Asp Ser Glv Arg His 50 ' 55 ' 60 ' Gin Lys Gly Phe Ala Val Arg Glv Vai Glu Gly Asn Arg Val GIy Val 65 70 75 80 Ser lie Asp Gly Val Asn Leu Pro Asp Ser Glu Glu Asn Ser Leu Tvr 85 90 95 Ala Arg Tvr Glv Asn Phe Asn Ser Ser Arg Leu Ser lie Asp Pro Glu ' 100 105 110 Leu Val Arg Asn lie Glu lie Val Lvs Glv Ala Asp Ser Phe Asn Thr 115 120 ' 125 Glv Ser Glv Ala Leu Gly Gly Glv Val Asn Tvr Gin Thr Leu 〇]n G]v 130 135 140 Arg Asp Leu Leu Leu Asp Asp Arg Gin Phe Glv Val Met Met Lvs Asn 145 150 155 160 Glv Tvr Ser Thr Arg Asn Arg Glu Trp Thr Asn Thr Lea Glv Phe Glv ' ' 165 170 175 ' Val Ser Asn Asp Arg Val Asp Ala Ala Leu Leu Tyr Ser Gin Arg Arg 180 185 190 Glv His Glu Thr Glu Ser Ala Glv Asn Arg G1y Tvr Ala Val Glu Glv ^ 195 200 205 ' Glu Glv Ser Glv Ala Asn He Arg Glv Ser Ala Arg Glv lie Pro Asp 21?) 215 . " 220 Ser Ser Lvs His Lvs Tvr His Ser Phe Leu Glv Lvs lie Ala Tvr Gin 225 - ' 230 235 ' 240 lie Asn Asp Asn His Arg lie Glv Ala Ser Leu Asn Gly Gin Gin Gly 245 ' 250 255 ' His Asn Tvr Thr Val Glu Glu Ser TVr Asn Leu Thr Ala Ser Ser Trp 260 265 270 Arg Glu A]a Asp Asp Val Asn Arg Arg Arg Asn Ala Asn Leu Phe Tyr 275 280 285 Glu Trp Met Pro Asp Ser Asn Trp Leu Ser Ser Leu Lvs Ala Asp Phe 290 295 300 Asp Tvr Gin Lys Thr Lys Val Ala Ala Val Asn Asn Lvs Glv Ser Phe 305 310 315 ' ' 320 Pro Met Asp Tyr Ser Thr Trp Thr Arg Asn T\r Asn Gin Lys Asp Leu
[0027] 325 330 335 Asp Glu lie Tvr Asn Arg Ser Met Asp Thr Arg Phe Lvs Arg Phe Thr 340 345 350 Leu Arg Leu Asp Ser His Pro Leu Gin Leu Glv Glv Glv Arg His Arg 355 360 365 Leu Ser Phe Lvs Thr Phe Val Ser Arg Arg Asp Phe Glu Asn Leu Asn 370 375 380 Ar^ Asp Asp Tvr Tvr Phe Ser G1y Arg Val Val Arg Thr Thr Ser Ser 385 390 395 400 lie Gin His Pro Val Lvs Thr Thr Asn Tvr G]v Phe Ser Leu Ser Asp 405 410 415 Gin lie Gin Trp Asn Asp Val Phe Ser Ser Arg Ala Glv He Arg Tvr 420 425 430 Asp His Thr Lvs Met Thr Pro Gin Glu Leu Asn Aia Glu Cys His Ala 435 440 445 Cvs Asp Lvs Thr Pro Pro Ala Ala Asn Thr Tvr Lvs Glv Trp Ser Glv 450 455 460 Phe Val G1y Leu Ala Ala Gin Leu Asn Gin Ala Trp His Val Gly Tvr 465 470 475 480 Asp lie Thr Ser Glv Tvr Arg Val Pro Asn Ala Ser Glu Val Tvr Phe 485 490 495 Thr Tvr Asn His Glv Ser Glv Asn Trp Leu Pro Asn Pro Asn Leu Lvs 500 505 510 Ala Glu Arg Ser Thr Thi' His Thr Leu Ser Leu Gin Glv Arg Ser Glu 515 520 525 Lvs Glv Met Leu Asp Ala Asn Leu Tvr Gin Ser Asn Tvr Arg Asn Phe 530 535 540 Leu Ser Glu Glu (iln Lvs Leu Thr Thr Ser Glv Thr Pro Gly Cvs Thr 545 550 555 560 Glu Glu Asn Ala Tvr Tyr Gly lie Cys Ser Asp Pro Tyr Lys Glu Lvs 565 570 " 575 Leu Asp Trp Gin Met Lvs Asn lie Asp Lvs Ala Arg lie Arg Glv lie 580 585 590 Glu Leu Thr Gly Arg Leu Asn Val Asp Lys Val Ala Ser Phe Val Pro 595 600 605 Glu Glv Trp Lys Leu Phe Glv Ser Leu Glv Tvr Ala Lys Ser Lys Leu 610 615 620 Ser Gly Asp Asn Ser Leu Leu Ser Thr Gin Pro Leu Lys Val lie Ala 625 630 635 640 Gly lie Asp Tvr Glu Ser Pro Ser Glu Lvs Trp Glv Val Phe Ser Arg 645 650 655 I,eu Thr Tvr Leu Glv Ala Lys Lys Ala Lvs Asp Ala Gin Tvr Thr Val 660 665 670 Tvr Glu Asn Lvs Glv Trp Glv Thr Pro Leu Gin Lys Lvs Val Lvs Asp - 675 680 ' 685 . Tvr Pro Trp Leu Asn Lvs Ser Ala Tvr Val Phe Asp Met Tvr G1y Phe 690 " 695 ' 700 Tvr Lvs Pro Ala Lvs Asn Leu Ttir Leu Arg Ala, Glv Val Tvr A.sn Val 705 ^ 710 715 " ^ 720 Phe Asn Arg Lvs Tvr Thr Thr Trp Asp Ser Leu Arg Glv Leu Tvr Ser 725 730 735
[0028] Tyr Ser Thr Thr Asn Ser Val Asp Arg Asp 01v Lys Glv Leu Asp Arg 740 745 750 Tvr Arg Ala Pro Ser Arg Asn Tvr Ala Val Ser Leu Glu Trp Lys Phe ' 755 760 765 ' <210 23 <211 915 <212 PRT <213 腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis ) <400 23 Met Gin Gin Gin His Leu Phe Arg Phe Asn lie Leu Cys Leu Ser Leu 15 10 15 Met Thr Ala Leu Pro Ala Tvr Ala Glu Asn Val Gin Ala Glv Gin Ala 20 ' 25 30' Gin Glu Lvs Gin Leu Asp Thr lie Γτ?η Val Lys Ala Lys Lvs Gin Lvs 35 40 45 Thr Arg Arg Asp Asn Glu Va丄 Thr Giv Leu Glv Lvs Leu Val Lvs Ser 50 55 ' 6() ' Ser Asp Thr beu Ser tvs Glu G丄n Vai Leu Asn lie Arg Asp Leu Thr 65 70 75 80 krg Tvr Asp Pro Glv lie Ala Val Val Glu Gin Glv Arg Glv Ala Ser ^ 85 90 ' 95 Ser Glv Tvr Ser lie Arg Glv Met Asp Lys Asn Arg Val Ser Leu Thr 100 ' 105 110 Val Asp Gly Val Ser Gin lie Gin Ser Tvr Thr Ala Gin Ala Ala Leu 115 120 ' 125 Glv Glv Thr Arg Thr Ala Glv Ser Ser Giy Ala lie Asn Glu lie Glu 130 135 140 Tvr Glu Asn Vnl Lvs Ala Val Glu lie Scr Lvg Gly Scr Asn Scr Val 145 150 155 160 Glu Gin Glv Ser Glv Ala Leu Ala Glv Ser Val Ala Phe Gin Thr Lvs 165 170 175 Thr Ala Asp Asp Val lie Glv Glu Glv Ai'g Gin Trp Gly lie Gin Ser 180 185 190 Lys Thr Ala Tvr Ser Gly Lvs Asn Arg Glv Leu Thr Gin Ser lie Ala ^ 195 200 ' 205 Leu Ala Gly Arg lie Glv Glv Ala Glu Ala Leu Leu He His Thr Glv 210 ' 215 220 ' Arg Ai'g Ala Glv Glu lie Arg Ala His Glu Asp Ala Glv Arg Gly Vnl 225 230 235 ' 240 Oln Ser Phe Asn Arg Leu Val Pro Val Glu Asp Ser Ser Asn Tvr Ala 245 250 255 Tvr Phe He Val Lvs Glu Glu Cvs Lvs Asn Glv Ser Tvr Glu Thr Cvs 260 265 ' 270 Lvs Ala Asn Pro Lvs Lvs Asp Val Val (ilv Lys Asp G_Lu Arg Gin Thr ' 275 ' 280 ' 285 Val Ser Thr Arg Asp Tvr Thr Glv Pro Asn Arg Phe Leu Ala Asp Pro 290 295 300 Leu Ser Tyr Glu Ser Arg Ser Trp Leu Phe Arg Pro Glv Phe Arg Phe 305 - 310 315 ' 320 Glu Asn Lys Arg His Tyr lie Gly Gly lie Leu Glu His Thr Gin Gin
[0029] 325 330 335 Thr Phe Asp Thr Ar^ Asp Met Thr Val Pro Ala Phe Leu Thr Lys Ala 340 345 350 Val Phe Asp Ala Asn Lys Lvs Gin Ala Glv Ser Leu Pro Glv Asn Glv 355 360 365 Lvs Tvr Ala Gly Asn His Lvs Tvr Gly Gly Leu Phe Thr Asn Gly Glu 370 375 380 Asn Glv Ala Leu Val G1y Ala Glu Tvr Glv Thr Glv Val Phe Tvr Asp 385 390 395 400 Glu Thr His Thr Lvs Ser Ar^ Tyr G1y Lcu G]u Tyr Val Tvr Thr Asn 405 410 415 Ala Asp Lvs Asp Thr Trp Ala Asp Tvr Ala Arg Leu Ser Tvr Asp Arg 420 425 430 " Gin Glv lie Glv Leu Asp Asn His Phe Gin Gin Thr His Cvs Ser Ala 435 440 445 Asp Glv Ser Asp Lvs Tvr Cvs Arg Pro Ser Ala Asp Lvs Pro Phe Ser 450 455 460 Tvr Tvr Lvs Ser Asp Arg Val He Tvr Glv Glu Ser His Arg Leu Leu 465 470 475 480 Gin Ala Ala Phe Lvs Lys Ser Phe Asp Thr Ala Lvs lie Arg His Asa 485 490 495 Leu Ser Val Asn Leu Gly Phe Asp Arg Phe Glv Ser Asn Leu Arg His 500 ' 505 ' 510 Gin Asp Tvr Τλγγ Tyr Gin His Ala Asn Arg A]a Τγτ Ser Ser Asn Thr 515 520 525 Pro Pro Gin Asn Asn G1y Lvs Lys lie Ser Pro Asn Glv Ser Glu Thr 530 535 540 her Pro TVr Trp Val Thr lie Glv Arg G_Lv Asn Val Val Thr G1y Gin 545 550 555 560 lie Cys Arg Leu (}ly Asn Asn Thr T>r Thr Asp Cys Thr Pro Arg Ser 565 570 575 lie Asn Glv Lvs Ser Tvr Tvr Ala Ala Val Arg Asp Asn Val Arg Leu 580 585 590 Glv Arg Trp Ala Asp Val Glv Ala Gly Leu Arg Tvr Asp Tyr Arg Ser 595 600 605 Thr His Ser Asp Asp Gly Ser Val Ser Thr Gly Thr His Arg Thr Leu 610 615 620 Ser Trp Asn Ala Glv He Val Leu Lys Pro Thr Asp Trp Leu Asp Leu 625 630 635 640 Thr Τυγ Arg Thr Ser Thr Glv Phe Arg Leu Pro Ser Phe Ala Glu Met 645 650 655 Tyr Gly Trp Arg Ala Gly Val G]n Ser Lvs A]a Va] Lys He Asp Pro 660 665 670 Glu Lys Ser Phe Asn Lvs Glu Ala Glv lie Val Phe Lvs Glv Asp Phe ' 675 " 680 " 685 ' Glv Asn Leu Glu Ala Ser Trp Phe Asn Asn Ala Tvr Arg Asp Leu lie 690 695 700 Val Arg Glv Tyr Glu Ala Gin lie Lvs Asp Gly Lvs Glu Glu Ala Lvs 705 710 715 720 Glv Asp Pro Ala Tyr Leu Asn Ala Gin Ser Ala Arg He Thr Gly lie ' 725 730 735
[0030] Asn lie Leu GLy Lys lie Asp Trp Asn Glv Val Trp Asp Lvs Leu Pro 740 745 750 Glu Glv Trp Tvr Ser Thr Phe Ala Tvr Asn Arg Val Arg Va丄 Arg Asp 755 760 765 Tie Lvs I.ys Arg Ala. Asp Arg Thr Asp Tie Gin Ser Hi s I.eu Phe Asp 770 775 780 Ala lie Gin Pro Ser Arg Tvr Val Val Glv Leu Glv Tvr Asp Gin Pro 785 790 795 ' ' 800 Glu Glv Lvs Trp Glv Val Asn Glv Met Leu Thr Τυγ Ser Lvs Ala Lvs ' - 805 810 . 815 Glu lie Thr Glu Leu Leu Glv Ser Arg Ala Leu Leu Asn Gly Asn Ser 820 ' 825 830 Arg Asn Thr Lvs Ala Thr Ala Arg Arg Thr Arg Pro Trp Tyr lie Val 835 840 845 Asp Val Scr Glv Tvr Tvr Thr Val Lvs Lvs His Phe Thr Leu Arg Ala 850 ' 855 ' ' 860 Glv Val Tvr Asn Leu Leu Asn Tyr Arg Tvr Val Thr Trp Glu Asn Val 865 870 875 880 Arg Gin Thr Ala Glv Glv Ala Val Asn Gin His Lvs Asn Val Glv Val 885 ' 890 " 895 Tvr Asn Arg Tyr Ala Ala Pro Glv Arg Asn Tvr Thr Phe Ser Leu Glu . 900 905 ' 910 Met Lvs Phe 915 <210 24 <211 712 <212. PRT <213 腦膜炎奈瑟球菌〔Neisseria meningitidis) <400> 24 Met Asn Asn Pro Leu Val Asn Gin Ala Ala Met Val Leu Pro Val Phe 1 5 10 15 Leu Leu Ser Ala Cvs Leu Glv Glv Glv Glv Ser Phe Asp Leu Asp Ser 20 25' 30 Val Asp Thr Glu Ala Pro Arg Pro Ala Pro Lvs Tvr Gin Asp Val Phe 35 40 ' 45 Ser Glu Lvs Pro Gin Ala Gin Lvs Asp Gin Glv Gly Tyr Glv Phe Ala 50 55 60 Met Arg l.eu Lvs Ai'g Arg Asn Trp Tvr Pro Girt Ala Lvs G]u Asp Glu 65 70 75 80 Vr.1 Lys l.eu Asp Glu Ser Asp Trp Glu Ala Thr Glv Leu Pro Asp Gin ^ 85 90 ' 95 Pro Lvs Glu Leu Pro Lvs Arg Gin Lvs Ser Val lie Glu Lvs Val Glu ' 100 ' 105 1?0 Thr Asp Ser Asp Asn Asn lie Tvr Ser Ser Pro Tvr Leu Lvs Pro Ser 115 120 ' 125 Asn His Gin Asn Glv Asn Thr Glv Asn Glv lie Asn Gin Pro Lvs Asn 130 ' 135 140 ' Gin Ala Lvs Asp Tyr Glu Asn Phe Lvs Tvr Val Tvr Ser Glv Trp Phe 145 ^ " i5〇 ' ' 155 ' 160 Tyr Lvs His Ala Lvs Arg Glu Phe Asn Leu Lvs Val Glu Pro Lvs Ser 165 170 175
[0031] Ala Lys Asn Glv Asp Asp Gly Tvr lie Phe Tyr His Gly Lys Glu Pro 180 185 ' 190 Ser Arg Gin Leu Pro Ala Ser Glv Lvs lie Thr Tvr Lvs Glv Val Trp 195 200 205 Ilis Phe Ala Thr Asp Thr Lvs Lvs Gly Gin Lys Phe Arg Glu lie lie 210 215 ^ 220 Gin Pro Ser Lvs Ser Gin Glv Asp Arg Tvr Ser Glv Phe Ser Gl3? Asp 225 230 ' 235 ' 240 Asp Gly Glu Glu Tvr Ser Asn Lys Asn Lys Ser Thr Leu Thr Asp Gly 245 250 255 Gin Glu Glv Tvr Glv Phe Thr Ser Asn Leu Glu Val Asp Phe His Asn 260 265 270 Lys Lys Leu Thr Gly Lys Leu lie Arg Asn Asn Ala Asn Thr Asp Asn ' 275 280 *285 Asn Gin Ala Thr Thr Thr Gin Tvr Tvr Ser Leu Glu Ala Gin Val Thr 290 295 ' 300 (i丄v Asn Arg Phe Asn (Uv Lvs Ala Thr Ala Thr Asp Lvs Pro Gin Gin 305 310 315 ' 320 Asn Sex- Glu Thr Lys Glu His Pro Phe Val Ser Asp Ser Ser Ser Leu 325 330 335 Ser Glv Glv Phe Phe Glv Pro Gin Gly Glu Glu Leu Glv Phe Arg Phe ^ 340 " 345 350 Leu Ser Asp Asp Gin Lys Val Ala Val Val Glv Ser Ala Lys Thr Lvs 355 " 360 ' 365 ' Asp Lys Pro Ala Asn G1y Asn Thr Ala Ala Ala Ser Gly Glv Thr Asp 370 375 380 ' ' Ala Ala Ala Ser Asn Glv A] a Ala Γ.1 v Thr Scr Ser Glu Asn Glv Lvs 385 390 395 400 Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Lvs Leu Gly Asp Lvs Glu 405 410 415 Val Gin Lvs Leu Asp Asn Phe Ser Asn Aia Aia Gin Leu Val Val Asp "420 425 430 Glv lie Met lie Pro Leu Leu Pro Glu Ala Ser Glu Ser Glv Asn Asn ' 435 440 445 ' Gin Ala Asn Gin Gly Thr Asn Glv Glv Thr Ala Phe Thr Arg Lvs Phe 450 ^ 455 ' 460 ' Asp His Thr Pro Glu Ser Asp Lvs Lvs Asp Ala Gin Ala Glv Thr Gin 465 470 475 480 Thr Asn Glv Ala Gin Thr Ala Ser Asn Thr Λ·1α Glv Asp Thr Asn Glv ' 485 490 ' ' Lvs Thr Lys Thr Tvr Glu Val Glu Val Cys Cvs Ser Asn Leu Asn Tyr ' "500 505 510 Leu Lvs Tvr Glv Met Leu Thr Arg Lvs Asn Ser Lvs Ser Ala Met Gin 515 520 525 Ala Glv Glu Ser Ser Ser Gin Ala Asp Ala Lvs Thi' Glu Gin Val Glu 530 535 540 Gin Ser Met Phe Leu Gin Glv Glu Arg Thr Asp Glu Lvs Glu lie Pro 545 550 > 555 > 560 Ser Glu Gin Asn lie Val Tyr Arg Gly Ser Trp Tvr Gly Tvr lie Ala 565 570 ' ' 575 Asn Asp Lys Ser Thr Ser Trp Ser Gly Asn Ala Ser Asn Ala Thr Ser
[0032] 580 585 590 Glv Asn Arg Ala Glu Phe Thr Val Asn Phe Ala Asp Lvs lie Thr 、 595 600 605 Glv Thr I.en Thr Ala. A.sp Asn Arg Gin Glu Ala. Thr Phe Thr Tie Asp 610 615 620 Glv Asn lie Lvs Asp Asn Glv Phe Glu Glv Thr Ala Lvs Thr Ala Glu 625 630 635 ' 640 Ser Gly Phe Asp Leu Asp Gin Ser Asn Thr Thr Arg Thr Pro Lvs Ala - 645 650 655 Tyr lie Thr Asp Ala Lvs Val Gin Glv Gly Phe Tvr (ilv Pro Lvs Ala 660 ' 665 ' 670 Glu Glu Leu Glv G1y Trp Phe Ala Tvr Pro Olv Asp Lvs Gin Thr Lvs 675 ' 680 ' 685 > Asn A] a Thr Asn Ala Ser Glv Asn Ser Ser Ala Thr Val Val Phe Γτ?ν 690 695 700 Ala Lys Arg Gin Gin Pro Val Arg 705 710 <210 25 <211> 186 <212> PRT (213 腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 25 Met Asn Met Lys Thr Leu Leu Ala Leu Ala Val Ser Ala Val Cvs Ser 1 5 10 15 Val Glv Val Ala Gin Ala His Glu His Asn Thr lie Pro Lys Glv Ala " 20 25 30 ' Ser lie Glu Val Lys Val Gin Gin Leu Asp Pro Val Asn Gly Asn Lvs 35 40 45 " Asp Val Glv Thr Val Thr lie Thr Glu Ser Asn Tvr Glv Leu Val Phe 50 ' 55 60 ' Thr Pro Asp Leu Gin Glv Leu Ser Glu Glv Leu His Glv Phe His lie 65 70 75 80 His Glu Asn Pro Sei' Cvs Glu Pro Lys Glu Lvs Glu Glv Lys Leu Thr 85 90 95 Ala (ily Leu Glv Ala Glv Glv His Trp Asp Pro Lys Crlv Ala Lvs Gin - 100 105 110 His Glv Tvr Pro Trp Gin Asp Asp Ala His Leu Glv Asp Leu Pro Ala 115 120 125 Leu Thr Vai Leu His Asp Gly Thr Ala Thr Asn Pro Val Leu Ala Pro 130 135 140 Arg Leu Lvs His Leu Asp Asp Val Arg Glv His Ser Tie Met lie His 145 150 155 160 Thr Glv Glv Asp Asn His Ser Asp His Pro Ala Pro Leu Glv Glv Gly ' - 165 170 175 Gly Pro Arg Met Ala Cvs Olv Val lie Lys 180 ' ' 185 (210 26 (211 16 (212 DNA <213 腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis ) (400 26 tttgrggggg gggggg 16
[0033] <210 21 <211 16 <212 DNA <213 腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 27 tttgcgaggg aggtgg 16 <210 28 <211 17 <2V2 DNA <213/ 腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 ttttgcgagg gaggtgg 17 <210 29 <211 16 <212 DNA <213. 腦膜炎奈瑟球齒(Neisseria meningitidis) <400 29 ggcggaagga atactt 16 <210 30 <2U 35 <212 DNA <213 腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 30 ttgacatttg cgagggaggt ggtataattg aagac 35 <210 31 <211 40 <212 DNA <213，腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 31 aaaaat^gtt ttttgc^gg gggggggtat aattgaagac 40 <210 <211 40 <212 DNA d彳 、丄序列 <220 <23 經(jīng)修飾的pnrA啟動子 <400 32 Taaaatggtt ttTtgrgagg gaggtggtat aattgsagar. 40 <210 33 <*^11 4U <212 DNA <213 腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria mcrnngitidis) <400 33 aaaaattgac atttgegagg gaggtggtat aattgaagac 40 <210 34 <211 40 <212 DNA <213 腦膜炎奈瑟球菌丨丨itMiingiUdls) <40(]> 34 daaHltgaca ttltgcgdgg gagglggtal aaligaagcic 40 <2IO> 35 cm 4〇 <212 DNA d K丄序列 <21^0 雜交rRNA后動子 <100 35
[0034] atatcttgac aggcggangg aatactttat anttcgcaac 40 <210 36 <21L 39 <212 DNA <213. 人工序列 <220 <223 雜交rRNA啟動子 <400 36 atatcttgac aggcggaagg aatactttat attcgcaac 39 <210 37 <211 38 <212 DNA <213 λ丄序列 <220、、 <223 - 雜交rRNA啟動子 <400> 37 atatcttgac aggcggaagg aatactttta attcgcac 38 <210 3B <211 39 <212 DNA <213 人工序列 <220 <223 雜交rRNA啟動子 <400 3S atatcttgac aggcggaagg aaactttata atIcgcaac 39 <210 39 <211 56 <212 DNA <213 人工宇列 <220'、 <223 雜交iRNA啟動子 <400 39 glalcggglg 11 Lgcccgat gill L laggL L11 laLcatia l L tacariaag gaagcc 56 <21 0 - 40 <211 42 <212 - DNA <213 人丁序列 <220 <223 雜殳rRNA啟動子 <400 10 aaaaatggtt ttttgcgggg ataattgaag ac 42 <210 41 <211 358 <212 DNA <213. 人工序列 <220'v <223,> 啟動子區(qū)域 <400> 41 cgtctgagtc cccgagtttc agacagcata ttcacaaagg cgcaccagcc ggaggaggga 60 gaggaaagga ttgttggagg cggcgcagta tttagcngsa ataaaaaacc ttatccgaca 120 gcgacatgac gaatttcccc a?aaaaatcc cgctgaaagc attgaccgtt tttccctgtg 1B0 ggcgtatagt tcggttcttc gctgctgcag aagtggcgga cgaactgaaa agtatagcac 240 agaatgttgg ggatatcgag agatatcttg acaggcggaa ggaatacttt ataattcgca 300 acgtatcggg tgtt1:gcccg atgttt十tag gtttttatca aatttacaaa aggaagcc 358 <210 42 <211 35G <212 DNA
[0035] <213 人工序列 <220^ <223> 啟動子區(qū)域 <220> <221/ misc_feature <222> 318，-319，321 <223/ ' η' 是a, c, g或t <400> 42 cgtctgagtc cccgagtttc agacagcata ttcncanagg cgcaccagcc ggaggaggga 60 gaggaaagga ttgttggagg cggcgcagta tttagcagaa ataaaaaacc ttatccgaca 120 gcga_catgac gaatttcccc aaaaaaatcc cgctgaaagc attgaccgtt tttccctgtg 180 ggcgtatagt tcggttcttc gctgctgcag aagtggcgga cgaactgaaa agtatagcac 240 agaatgttgg ggatatcgag agatatcttg acaggcggaa ggaatacttt atattcgcaa 300 cgtatcgggt gtttgccnna ngtttttagg tttttatcaa atttcaaaag gaagcc 356 〈210. 43 <211 373 <212 DNA 〈213. λ工序列 <22〇\ <223 啟動子區(qū)域 〈220 <221 misc-士'eature <222 361 ~ <223/ ' n' 是a, c, g或t <400> 43 cgtctgagtc cccgagtttc agacagcata ttcacaaagg cgcaccagcc ggaggaggga 60 gaggaaagga ttgttggagg cggcgcagta tttagcagaa ataaaaaacc ttatccgaca 120 gcgacatgac gaatttcccc aaaaaaaixc cgctgaaagc attgaccg+t i'ttccci'gtg 180 ggcgtatagt tcggttcttc gctgctgcag aagtggcgga cgaactgaaa agtatagcac 240 agaatgttgg ggatatcgag agatatcttg acaggcggaa ggaatacttt taattcgcac 300 gtatcgggtg tttgcccgai· ttttattaaa tttacaaaag gaagcccata 360 ngaatcgaac tgc 373
【權(quán)利要求】
1. 一種包含啟動子的核酸，所述啟動子包括 (i) 來自腦膜炎球菌porA基因啟動子的-10區(qū)域和 (ii) 來自腦膜炎球菌P〇rA基因啟動子的-35區(qū)域， 其中所述-10區(qū)域和-35區(qū)域由12-20個(gè)核苷酸的間插序列隔開，并且其中所述間插 序列不含聚-G序列或者包括具有不超過8個(gè)連續(xù)G核苷酸的聚-G序列。
2. -種包含與下游的蛋白編碼基因可操作連接的啟動子的核酸，其特征在于，所述啟 動子包括⑴來自腦膜炎球菌rRNA基因啟動子的-10區(qū)域和/或（ii)來自腦膜炎球菌 rRNA基因啟動子的-35區(qū)域。
3. -種包含與蛋白編碼基因可操作連接的啟動子區(qū)域的核酸，所述啟動子區(qū)域來自腦 膜炎球菌rRNA基因啟動子，所述蛋白編碼基因具有5' UTR，所述5' UTR含有用于表達(dá)所 述蛋白的翻譯調(diào)節(jié)元件。
4. 一種包含啟動子的核酸，所述啟動子包括來自腦膜炎球菌porA基因啟動子的-10區(qū) 域和來自腦膜炎球菌rRNA基因啟動子的-35區(qū)域。
5. -種包含啟動子的核酸，所述啟動子包括SEQ ID N0:18,或SEQ ID N0:18的變體， 所述變體與SEQ ID NO :18之間存在最多4個(gè)單核甘酸插入、刪除或取代的差異。
6. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的核酸，其特征在于 所述-10區(qū)域是TATAAT ; 所述來自腦膜炎球菌porA基因啟動子的-35區(qū)域是TGGTTT ;和/或 所述來自腦膜炎球菌rRNA基因啟動子的-35區(qū)域是TTGACA。
7. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的核酸，其特征在于，所述在-35區(qū)域和-10區(qū)域之間 的間插序列具有12-20個(gè)核苷酸，例如，SEQ ID N0:27或SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29。
8. 如權(quán)利要求7所述的核酸，其特征在于，所述間插序列不包括序列GGGGG。
9. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的核酸，其特征在于，所述-10序列的非轉(zhuǎn)錄下游但 是所述轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游具有5-10個(gè)核苷酸，例如，TGAAGAC或TCGCAAC。
10. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的核酸，其特征在于，所述核酸包含SEQ ID NO :30。
11. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的核酸，其特征在于，所述核酸包含SEQ ID NO :18 或其變體，例如，SEQ ID NO :36的核苷酸6-39、SEQ ID NO :37的核苷酸6-38或SEQ ID NO: 38的核苷酸6-39。
12. -種包含DNA序列的細(xì)菌表達(dá)載體，所述DNA序列包括前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)中所 述的啟動子。
13. -種包含DNA序列的腦膜炎球菌，所述DNA序列包括前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)中所述 的啟動子。
14. 如權(quán)利要求13所述的腦膜炎球菌，其特征在于，所述啟動子驅(qū)動外膜蛋白的表達(dá)。
15. 如權(quán)利要求14所述的腦膜炎球菌，其特征在于，所述外膜蛋白是fHbp。
16. 如權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的腦膜炎球菌，其特征在于，所述細(xì)菌不表達(dá)活性 MltA〇
17. 如權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的腦膜炎球菌，其特征在于，所述細(xì)菌具有SynX和 /或LpxLl的敲除。
18. 如權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)所述的腦膜炎球菌，其特征在于，所述腦膜炎球菌是血 清組B。
19. 如權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)所述的腦膜炎球菌，其特征在于，所述腦膜炎球菌是血 清組W135。
20. 如權(quán)利要求13-19中任一項(xiàng)所述的腦膜炎球菌，其特征在于，所述腦膜炎球菌是免 疫型L3。
21. 從權(quán)利要求13-20中任一項(xiàng)所述的腦膜炎球菌制備的外膜囊泡。
22. -種免疫原性藥物組合物，所述組合物包含權(quán)利要求21所述的囊泡。
23. 如權(quán)利要求22所述的組合物，其特征在于，所述組合物包括一種或多種來自腦膜 炎球菌的偶聯(lián)的莢膜糖。
24. -種在哺乳動物中引起免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含向所述哺乳動物給予權(quán)利 要求22或23所述的組合物。
【文檔編號】C12N15/74GK104114706SQ201380007752
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月2日
【發(fā)明者】I·德萊尼, S·瓜達(dá)諾羅 申請人:諾華股份有限公司