具有提高的物理穩(wěn)定性的人碳酸酐酶ii的制作方法
【專(zhuān)利摘要】描述了一種具有碳酸酐酶活性的經(jīng)分離多肽，其序列對(duì)應(yīng)于經(jīng)修飾的人碳酸酐酶II。該經(jīng)分離多肽包括突變A23C、S99C、L202C、C205S以及V241C，并且該多肽具有與野生型碳酸酐酶II相比提高的物理穩(wěn)定性。另外，該多肽包括在C23與C202之間和/或在C99與C241之間的二硫橋鍵。
【專(zhuān)利說(shuō)明】具有提高的物理穩(wěn)定性的人碳酸酐酶N

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種具有如由提高的熱力學(xué)、熱以及動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性所定義的如與野生 型酶相比提高的物理穩(wěn)定性的酶人碳酸酐酶II的工程改造變體。本發(fā)明還涉及一種提高 碳酸酐酶的物理穩(wěn)定性的方法。此外，本發(fā)明涉及所述酶在用于從介質(zhì)提取co2的任何技 術(shù)應(yīng)用中的用途。此外，本發(fā)明還涉及編碼多肽以及經(jīng)分離多肽的經(jīng)分離多核苷酸。本發(fā) 明還涉及包括這些多核苷酸的核酸建構(gòu)體和載體。

【背景技術(shù)】
[0002] 碳酸酐酶（CA，EC4. 2. 2. 1)是根據(jù)下式催化二氧化碳和水變成碳酸氫根和質(zhì)子的 可逆反應(yīng)的一組酶：
[0003]

【權(quán)利要求】
1. 具有碳酸酐酶活性的經(jīng)分離多肽，其序列對(duì)應(yīng)于經(jīng)修飾的人碳酸酐酶II，其中該多 肽包括突變八23(：、599(：、1^02(：、02053以及￥241(：，具有與野生型碳酸酐酶11相比提高的物 理穩(wěn)定性，并且進(jìn)一步包括在C23與C202之間和/或在C99與C241之間的二硫橋鍵。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有碳酸酐酶活性的經(jīng)分離多肽，具有與野生型碳酸酐酶II 相比提高了 23. 5kJ/mol的一種熱力學(xué)穩(wěn)定性。
3. 根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的具有碳酸酐酶活性的經(jīng)分離多肽，具有與野生型 碳酸酐酶II相比提高了 18. 5°C的一個(gè)解鏈點(diǎn)。
4. 根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的具有碳酸酐酶活性的經(jīng)分離多肽，具有與野生型 碳酸酐酶II相比提高了 25kJ/mol的一種去折疊活化能。
5. 根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的具有碳酸酐酶活性的經(jīng)分離多肽，具有在水中在 21°C下與野生型人碳酸酐酶II相比慢約22. 000倍的一個(gè)去折疊速率。
6. 根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的具有碳酸酐酶活性的經(jīng)分離多肽，具有在60°C 下86天，在65°C下8天，并且在70°C下1. 6天的一個(gè)半衰期。
7. 根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的具有碳酸酐酶活性的經(jīng)分離多肽，其中該經(jīng)分離 多肽在乙醇胺水溶液中維持其與野生型碳酸酐酶II相比提高的物理穩(wěn)定性，這些乙醇胺 包括甲基二乙醇胺（MDEA)、單乙醇胺（MEA)、二乙醇胺（DEA)以及氨基乙氧基乙醇。
8. 根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的具有碳酸酐酶活性的經(jīng)分離多肽，其中該序列是 SEQ ID NO:8。
9. 提高選自天然產(chǎn)生或經(jīng)修飾α -碳酸酐酶超家族的碳酸酐酶（EC4. 2. 2. 1)的物理穩(wěn) 定性的方法，包括將兩個(gè)穩(wěn)定二硫橋鍵的一個(gè)組合插入到SEQ ID ΝΟ:8中的C23、C99、C202 以及C241的三維等效或序列同源位置，等效于野生型人碳酸酐酶II中的位置A23、S99、 L202 以及 V241。
10. 構(gòu)建體，包括編碼根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的一種多肽的一種多核苷酸， 該構(gòu)建體可操作地鍵聯(lián)到指導(dǎo)該多肽在一個(gè)表達(dá)宿主中的產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)控制序列。
11. 重組表達(dá)載體，包括根據(jù)權(quán)利要求10所述的構(gòu)建體。
12. 重組宿主細(xì)胞，包括如權(quán)利要求10所述的構(gòu)建體或如權(quán)利要求11所述的重組表達(dá) 載體。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的具有碳酸酐酶活性的經(jīng)分離多肽的用途，用于 從一種含有二氧化碳的介質(zhì)中提取二氧化碳。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途，其中該具有碳酸酐酶活性的經(jīng)分離多肽被用于一個(gè) 生物反應(yīng)器中。
15. 制備SEQ ID NO:8的經(jīng)分離多肽的方法，包括通過(guò)在25°C到60°C的高溫下，在一種 氧化劑的存在下，在7到10的一個(gè)pH下，孵育該多肽來(lái)加速二硫橋鍵的形成。
16. 經(jīng)分離多核苷酸，具有一個(gè)編碼如權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所定義的多肽的序列。
【文檔編號(hào)】C12N9/88GK104114699SQ201380008096
【公開(kāi)日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月23日
【發(fā)明者】烏諾·卡爾松, 馬丁·卡爾森 申請(qǐng)人:合理開(kāi)采抗體酶公司