預(yù)測微生物數(shù)的增殖的方法
【專利摘要】本發(fā)明的課題在于提供一種預(yù)測飲食品中微生物數(shù)的增殖的方法。解決方案為：通過具備下述的工序的方法來解決。(1)取得健康菌和損傷菌的增殖的概率密度函數(shù)以及損傷菌相對于健康菌的誘導(dǎo)期的延長時間數(shù)據(jù)的工序；(2)取得預(yù)測對象試樣中的微生物的增殖數(shù)據(jù)，根據(jù)該數(shù)據(jù)擬合新邏輯模型，算出參數(shù)值，將該參數(shù)值應(yīng)用于新邏輯模型，取得溫度變動型增殖預(yù)測模型的工序；(3)由(1)的概率密度函數(shù)和(2)的增殖預(yù)測模型取得概率論的微生物增殖預(yù)測模型的工序；和(4)將任意的初期存在菌數(shù)、任意的溫度、任意的經(jīng)過時間輸入(3)的模型中，通過概率論的預(yù)測方法，求出對應(yīng)初期存在菌數(shù)的各自的增殖菌數(shù)，將其合計，由此得到飲食品中的增殖菌數(shù)的工序。
【專利說明】預(yù)測微生物數(shù)的增殖的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及預(yù)測微生物數(shù)的增殖的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]因飲食品中的污染微生物導(dǎo)致的腐敗、變敗的程度與污染微生物數(shù)的增殖成比例地進(jìn)行，但實際上受到產(chǎn)品的性質(zhì)、種類、微生物種、保存溫度、污染后的經(jīng)過時間等的影響。為了預(yù)知飲食品中的污染微生物數(shù)的增殖數(shù)，需要實施對對象產(chǎn)品接種微生物的保存試驗。保存試驗以一定的微生物種和一定的溫度進(jìn)行實施，因此必須針對每個對象微生物或每個對象溫度實施保存試驗，需要大量的時間、勞力、費(fèi)用。另外，如實際的產(chǎn)品流通時，保存溫度發(fā)生復(fù)雜的變化的情況下，難以從產(chǎn)品的溫度履歷預(yù)測對象污染微生物的增殖。因此，尋求不像保存試驗?zāi)菢有枰罅康臅r間、勞力、費(fèi)用，預(yù)測在實際的流通保存條件中飲食品中的微生物數(shù)的增殖的方法，進(jìn)行了各種研究。
[0003]例如，在日本特開2007 - 312738號公報(專利文獻(xiàn)I)中公開了一種預(yù)測飲食品中的微生物繁殖性的方法，其針對飲食品取得成分分析值作為定量數(shù)據(jù)，再取得微生物的繁殖性的有無作為微生物的增殖有或微生物的增殖無的任一個定性數(shù)據(jù)，通過鑒別分析法解析所取得的兩個數(shù)據(jù)，由飲食品分析值構(gòu)建預(yù)測微生物的繁殖性的預(yù)測模型，基于該預(yù)測模型，由飲食品的成分分析值預(yù)測飲食品的微生物繁殖性。通過該方法，顯示能夠以高精度預(yù)測含醬油飲食品等飲食品中的危害微生物的繁殖性。另外，也已知有使用大腸菌、沙門氏菌、黃色葡萄球菌等的增殖行為數(shù)據(jù)和數(shù)學(xué)模型，開發(fā)了預(yù)測各種溫度條件下的微生物增殖的計算機(jī)程序的例子(非專利文獻(xiàn)I)。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0005]專利文獻(xiàn)
[0006]專利文獻(xiàn)1:日本特開2007 - 312738號公報
[0007]非專利文獻(xiàn)
[0008]非專利文獻(xiàn)1:食品衛(wèi)生學(xué)雜志47，288 一 292，2006


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]發(fā)明所要解決的課題
[0010]目前為止的預(yù)測方法著眼于微生物繁殖的環(huán)境條件，使用由活化培養(yǎng)的無傷健康菌求得的增殖模型，考慮各種因子，預(yù)測微生物數(shù)的增殖。這是目前的實際情況。但是，可以認(rèn)為飲食品中的微生物通過熱處理、飲食品的PH等收到外部的應(yīng)激，不限于描繪與健康菌同樣的的增殖曲線，這是與預(yù)測的結(jié)果之間產(chǎn)生誤差的原因。
[0011]本發(fā)明的課題在于提供一種考慮了由于外部的應(yīng)激受到損傷的損傷菌的增殖速度、預(yù)測飲食品中微生物數(shù)的增殖的方法。更具體而言，其課題在于提供一種一邊考慮飲食品中污染微生物因外部的應(yīng)激導(dǎo)致的誘導(dǎo)期的延長時間，一邊預(yù)測任意的溫度和任意的經(jīng)過時間的微生物數(shù)的增殖的方法。
[0012]用于解決課題的手段
[0013]為了解決上述課題，本發(fā)明人研究了在由健康菌得到的現(xiàn)有數(shù)學(xué)模型(微生物的增殖預(yù)測模型)中考慮了損傷菌的增殖行為數(shù)據(jù)的微生物增殖的預(yù)測方法。其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)如下方法，即，取得健康菌和損傷菌的增殖的概率密度函數(shù)以及損傷菌相對于健康菌的誘導(dǎo)期的延長時間數(shù)據(jù)，由預(yù)測對象試樣的微生物的增殖數(shù)據(jù)算出新邏輯模型的參數(shù)值，制作溫度變動型增殖預(yù)測模型，由該概率密度函數(shù)和該溫度變動型增殖預(yù)測模型，取得概率論的微生物增殖預(yù)測模型，將任意的初期存在菌數(shù)、任意的溫度、任意的經(jīng)過時間輸入該概率論的微生物增殖預(yù)測模型中，通過概率論的預(yù)測方法，求出對應(yīng)初期存在菌數(shù)的各自的增殖菌數(shù)，將其合計，由此預(yù)測增殖菌數(shù)的方法，從而完成了本發(fā)明。
[0014]即，本發(fā)明第一方面的發(fā)明為預(yù)測飲食品中微生物數(shù)的增殖的方法，其是考慮損傷菌相對于健康菌的誘導(dǎo)期的延長時間，預(yù)測增殖的方法。
[0015]第二方面的發(fā)明為如第一方面所述的方法，其特征在于:從健康菌的增殖的概率密度函數(shù)減去損傷菌的增殖的概率密度函數(shù)，求出上述損傷菌相對于健康菌的誘導(dǎo)期的延長時間。
[0016]第三方面的發(fā)明為如第二方面所述的方法，其特征在于:使用數(shù)字顯微鏡方式細(xì)菌檢測裝置，取得健康菌和損傷菌的增殖的概率密度函數(shù)。
[0017]第四方面的發(fā)明為如第一~三方面的任一方面所述的方法，其包括下述的工序:
[0018](I)取得健康菌和損傷菌的增殖的概率密度函數(shù)以及損傷菌相對于健康菌的誘導(dǎo)期的延長時間數(shù)據(jù)的工序；
[0019](2)取得預(yù)測對象試樣中的微生物的增殖數(shù)據(jù)，根據(jù)該數(shù)據(jù)擬合新邏輯模型，算出參數(shù)值，將該參數(shù)值應(yīng)用于新邏輯模型，取得溫度變動型增殖預(yù)測模型的工序；
[0020](3)由(I)的概率密度函數(shù)和(2)的增殖預(yù)測模型，取得概率論的微生物增殖預(yù)測模型的工序；和
[0021](4)將任意的初期存在菌數(shù)、任意的溫度、任意的經(jīng)過時間輸入(3)的模型中，通過概率論的預(yù)測方法，求出對應(yīng)初期存在菌數(shù)的各自的增殖菌數(shù)，將其合計，由此得到飲食品中的增殖菌數(shù)的工序。
[0022]第五方面的發(fā)明為如第四方方面的方法，其中，概率論的預(yù)測方法為蒙特卡羅模擬法。
[0023]發(fā)明效果
[0024]根據(jù)本發(fā)明，能夠通過微生物各個水平定量評價因外部的應(yīng)激使微生物不均勻受損的損傷程度，同時能夠通過溫度變動型的增殖模型預(yù)測食品中的增殖行為，因此能夠進(jìn)行反映實際的污染菌的性質(zhì)和食品中的行動的客觀菌數(shù)預(yù)測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為表示實施例1中的加熱損傷菌和健康菌的菌落檢測的變化的圖。
[0026]圖2為表示實施例2中的加熱損傷菌和健康菌的菌落檢測的變化的圖。

【具體實施方式】
[0027]本發(fā)明的方法具有上述⑴至⑷的工序。
[0028](I)的工序
[0029]在本發(fā)明的方法中，首先取得健康菌和損傷菌的增殖的概率密度函數(shù)以及損傷菌相對于健康菌的誘導(dǎo)期的延長時間數(shù)據(jù)。所謂損傷菌，通常定義為受到加熱、藥劑等各種外部的應(yīng)激而成為半致死的損傷狀態(tài)的菌?？紤]損傷菌污染產(chǎn)品時，可能表現(xiàn)出與健康菌不同的行為，為了進(jìn)行產(chǎn)品的品質(zhì)、安全性、保存性的評價，需要考慮損傷菌的行為。在本發(fā)明中，著眼于損傷菌的誘導(dǎo)期比健康菌的誘導(dǎo)期慢的事實。而且，將損傷菌相對于健康菌的誘導(dǎo)期的延長時間數(shù)據(jù)輸入預(yù)測模型。
[0030]在實際的環(huán)境下，損傷菌被賦予各種外部的應(yīng)激，各個損傷菌的損傷狀態(tài)不同。在本發(fā)明中，為了得到預(yù)測模型，使用人為地賦予了外部的應(yīng)激的損傷菌。外部的應(yīng)激，例如，作為物理的應(yīng)激包括所有熱處理、特別是生產(chǎn)線中的殺菌工序的熱處理、高壓處理、超聲波處理等，作為化學(xué)應(yīng)激，包括氯類藥劑、醇、細(xì)菌素等抗菌劑等。除此以外，也包括制造環(huán)境的干燥、饑餓應(yīng)激等，其特征在于對微生物賦予損傷的因素沒有特別限定。另外，賦予的外部的應(yīng)激可以是I個應(yīng)激，也可以是多個應(yīng)激。
[0031]在本發(fā)明中，所謂誘導(dǎo)期是指在培養(yǎng)開始后、直到各個細(xì)胞開始增殖的時間，在得到增殖曲線的情況下，大致相當(dāng)于開始培養(yǎng)之后、直至對數(shù)增殖期的時間。損傷菌相對于健康菌的誘導(dǎo)期的延長時間數(shù)據(jù)通過求出健康菌的誘導(dǎo)期(誘導(dǎo)時間)和損傷菌的誘導(dǎo)期(誘導(dǎo)時間)之差而得到。損傷菌相對于健康菌的誘導(dǎo)期的延長時間數(shù)據(jù)的取得，例如能夠使用數(shù)字顯微鏡方式細(xì)菌檢測裝置等設(shè)備來進(jìn)行。
[0032]所謂數(shù)字顯微鏡方式細(xì)菌檢測裝置，是能夠在顯微鏡水平經(jīng)時地對平板培養(yǎng)中的菌落形成進(jìn)行自動計測的裝置，例如由Microb1公司作為B1matic DMCS (商品名；注冊商標(biāo))進(jìn)行售賣。該裝置以細(xì)菌檢查的迅速測定為目的開發(fā)得到，該裝置涉及的細(xì)菌檢測技術(shù)是已知的技術(shù)。但是，關(guān)于損傷菌的損傷恢復(fù)所需要的時間、即關(guān)于微生物的應(yīng)激損傷導(dǎo)致的誘導(dǎo)期的延長時間，在其概率論的預(yù)測中使用數(shù)字顯微鏡方式細(xì)菌檢測裝置的例子仍是未知的。
[0033]誘導(dǎo)期的延長作為菌體中產(chǎn)生的損傷恢復(fù)、開始增殖所需要的時間而被捕捉。誘導(dǎo)期即使為健康菌在各個細(xì)胞中也不同。另外，即使賦予一定條件的損傷，其損傷程度在各個細(xì)胞中也不同，損傷菌的誘導(dǎo)期在各個細(xì)胞中不同。因此，在本發(fā)明中，關(guān)于健康菌和損傷菌，分別考慮各個細(xì)胞的誘導(dǎo)期的偏差，求得兩菌的增殖的概率密度函數(shù)(菌落形成速度曲線)。而且，由所得到的2個概率密度函數(shù)求出誘導(dǎo)期的延長時間，即由損傷菌的分布和健康菌的分布之差求出誘導(dǎo)期的延長時間。數(shù)字顯微鏡方式細(xì)菌檢測裝置對各個菌落形成進(jìn)行計測，因此能夠容易地求得著眼于各個細(xì)胞的誘導(dǎo)期。
[0034]在本發(fā)明的方法中，為了取得健康菌和損傷菌的增殖的概率密度函數(shù)，例如以一定溫度進(jìn)行培養(yǎng)，以一定的時間間隔對菌落形成經(jīng)時地進(jìn)行自動計測，對所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，制作每單位時間新檢測到的健康菌和損傷菌的菌落數(shù)的直方圖，如果利用在計算機(jī)上工作的適當(dāng)?shù)能浖ζ溥M(jìn)行解析就能夠得到。由健康菌和損傷菌分別制作的直方圖表示各個細(xì)胞的誘導(dǎo)期的分布，由該分布取得增殖的概率密度函數(shù)。作為進(jìn)行這樣的解析的軟件，例如可以列舉ORISK(Palisade公司)、Crystall Ball (Oracle公司)等。誘導(dǎo)期的延長時間(X)作為損傷菌的分布(函數(shù))和健康菌的分布(函數(shù))的時間差(Y)而求得。
[0035](2)的工序
[0036]接著，在本發(fā)明的方法中，取得預(yù)測對象試樣中的微生物的增殖數(shù)據(jù)，根據(jù)該數(shù)據(jù)擬合新邏輯模型，算出參數(shù)值，將該參數(shù)值應(yīng)用于新邏輯模型，取得溫度變動型增殖預(yù)測模型。所謂新邏輯模型，是記載在藤川等的文獻(xiàn)(食品衛(wèi)生學(xué)雜志，44，155 — 160，2003)中的微生物增殖模型。具體而言，使用預(yù)測對象試樣，以任意的溫度(希望設(shè)定3種以上的溫度)培養(yǎng)健康菌，將得到的微生物增殖曲線的實測值為基礎(chǔ)，通過數(shù)值解析，以4次的龍格一庫塔法，對新邏輯模型的微分方程式進(jìn)行分解。Nmax(最大菌數(shù))輸入穩(wěn)定期的菌數(shù)的值，Nmin(最小菌數(shù))輸入開始的菌數(shù)的值，對數(shù)的斜率輸入對數(shù)增殖期的近似曲線的斜率，例如通過計算機(jī)軟件Excel (注冊商標(biāo),Microsoft公司)的解算功能等,求出新邏輯模型的調(diào)整參數(shù)的m和η的值。速度常數(shù)k通過平方根模型，由通過增殖數(shù)據(jù)的擬合求得的各培養(yǎng)溫度中的增殖速度進(jìn)行預(yù)測。根據(jù)以上的方法，取得預(yù)測對象試樣中的溫度變動型增殖預(yù)測模型。
[0037]預(yù)測對象試樣只要能夠預(yù)測微生物的增殖即可，沒有特別限定。預(yù)測對象試樣例如可以為茶、果汁等清涼飲料水，可以為牛奶、酸乳酪、冰激凌等的乳產(chǎn)品，也可以是牛肉、豬肉、雞肉等的肉類。
[0038](3)的工序
[0039]在本發(fā)明的方法中，接著由健康菌和損傷菌的增殖的概率密度函數(shù)以及溫度變動型增殖預(yù)測模型，取得概率論的微生物增殖預(yù)測模型。具體而言，使健康菌的概率密度函數(shù)、和損傷菌的概率密度函數(shù)、溫度變動型增殖預(yù)測模型進(jìn)行數(shù)學(xué)結(jié)合，由任意設(shè)定的初期存在菌，考慮誘導(dǎo)期的延長時間(損傷菌和健康菌的菌落檢測時間之差)，例如通過蒙特卡羅模擬等的概率論的預(yù)測方法進(jìn)行預(yù)測，將其值適用于溫度變動型增殖預(yù)測模型，能夠預(yù)測任意溫度中的任意時間經(jīng)過后的增殖菌數(shù)。(2)的工序中的溫度變動型增殖預(yù)測模型為以使用健康菌而得到的增殖曲線為基礎(chǔ)進(jìn)行模擬的模型，為通過輸入預(yù)測對象試樣的初期存在菌數(shù)、任意的溫度、任意的經(jīng)過時間(T)，預(yù)測在該溫度中保存的情況下預(yù)測對象試樣中增殖的菌數(shù)的模型。但是，實際的食品中的細(xì)菌為在保存開始時已經(jīng)通過加熱處理等受到損傷的損傷菌，如上所述，與健康菌不同，直至開始增殖的時間延遲。(3)的工序是考慮損傷菌中直至該增殖開始的延遲的工序，在該工序中，針對健康菌，修正誘導(dǎo)期的延長時間之后，取得溫度變動型增殖預(yù)測模型。具體而言，損傷菌與健康菌相比，只是誘導(dǎo)期的延長時間延遲而進(jìn)行增殖，因此將從設(shè)定的任意時間(T)減去誘導(dǎo)期的延長時間(X)而得到的時間(t)作為健康菌的經(jīng)過時間，對該經(jīng)過時間所增殖的菌數(shù)進(jìn)行模擬，取得概率論的微生物增殖預(yù)測模型。這里得到的概率論的微生物增殖預(yù)測模型以I個損傷菌在設(shè)定的任意時間(T)增殖為幾個這樣的概率論的模型表示。也就是說，I個損傷菌例如增殖為1000個、增殖為1100個、還是增殖為900個能夠進(jìn)行概率論預(yù)測。
[0040]⑷的工序
[0041]接著，對關(guān)于初期存在菌數(shù)分別得到的增殖預(yù)測菌數(shù)進(jìn)行合計，作為任意溫度和任意經(jīng)過時間(T)的、飲食品中的污染微生物數(shù)的總數(shù)(預(yù)測菌數(shù))。以上述(3)的工序得到的概率論的微生物增殖預(yù)測模型為輸入I個細(xì)菌得到經(jīng)過時間(T)后的增殖菌數(shù)的概率論的模型。在該模型中，初期存在菌數(shù)為I個時，作為概率論得到經(jīng)過時間(T)的增殖推定菌數(shù)。因此，初期存在菌數(shù)如果為多個的情況下，按照該概率論的微生物增殖預(yù)測模型進(jìn)行多次模擬，將以各模擬得到的菌數(shù)進(jìn)行合計，作為預(yù)測菌數(shù)。
[0042]該結(jié)果，能夠預(yù)測受到外部應(yīng)激的細(xì)菌在預(yù)測對象試樣中增殖的結(jié)果、增殖為何種程度的菌數(shù)。即，接受加熱處理的食品、例如作為產(chǎn)品的乳飲料被保存的情況下，能夠以更接近于實際狀態(tài)的狀態(tài)推定食品中殘留的細(xì)菌增殖為何種程度的菌數(shù)。另外，本發(fā)明的方法的特征在于，考慮損傷菌相對于健康菌的誘導(dǎo)期的延長時間，預(yù)測飲食品中的微生物數(shù)的增殖，只要是考慮損傷菌相對于健康菌的誘導(dǎo)期的延長時間來預(yù)測飲食品中的微生物數(shù)的增殖的方法即可，對上述的預(yù)測方法沒有特別限定。
[0043]以下，基于實施例，更詳細(xì)地對本發(fā)明進(jìn)行說明。另外，該實施例不對本發(fā)明進(jìn)行限定。
[0044]實施例1
[0045]〔健康菌和損傷菌的概率密度函數(shù)的定義〕
[0046]利用胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TRYPTICASE SOY BROTH) (TSB)將作為供試驗菌的Enterobacter cloacae (陰溝腸桿菌)B — 855活化后,利用滅菌磷酸緩沖生理鹽水進(jìn)行清洗，制備菌液。在試驗管中加入滅菌磷酸緩沖生理鹽水，確認(rèn)在熱水浴中升溫到52°C，添加菌液，保持20分鐘，實施加熱處理(損傷菌)。將健康菌(未加熱菌)和加熱處理菌涂抹在標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基，以DMCS S- 12 (Microb1公司)進(jìn)行30°C培養(yǎng)，以30分鐘間隔經(jīng)時地自動計測菌落形成。
[0047]對所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，制作每單位時間新檢測的健康菌和加熱處理菌(加熱損傷菌)的菌落的直方圖(圖1)。該直方圖的概率密度函數(shù)作為@ RISK (Palisade公司)的函數(shù)之一，即使用現(xiàn)有的試樣值表現(xiàn)連續(xù)分布的RiskGeneral函數(shù)(各點(diǎn)由值x和表示其概率的分量的P表示的、η個(X，ρ)配對由X的最小值至最大值之間定義的概率分布的一般密度函數(shù))而得到。然后，由損傷菌的概率密度函數(shù)減去健康菌的概率密度函數(shù)，求出誘導(dǎo)期的延長時間。
[0048]〔溫度變動型增殖預(yù)測模型的制作〕
[0049]利用與上述同樣的方法制備作為供試驗菌的Enterobacter cloacae B — 855的菌液，在牛奶中接種，使得體系內(nèi)成為lOOcfu/mL后，以10°C、20°C、30°C進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)時地取出試樣，利用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)法測定活菌數(shù)。接著，根據(jù)所得到的增殖數(shù)據(jù)(培養(yǎng)時間和菌數(shù)的關(guān)系數(shù)據(jù))擬合新邏輯模型(數(shù)學(xué)式I)，求得新邏輯模型的調(diào)整參數(shù)m和η的值。
[0050][數(shù)學(xué)式I]

【權(quán)利要求】
1.一種預(yù)測飲食品中微生物數(shù)的增殖的方法，其特征在于: 考慮損傷菌相對于健康菌的誘導(dǎo)期的延長時間，預(yù)測增殖。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 從健康菌的增殖的概率密度函數(shù)減去損傷菌的增殖的概率密度函數(shù)，求出所述損傷菌相對于健康菌的誘導(dǎo)期的延長時間。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于: 使用數(shù)字顯微鏡方式細(xì)菌檢測裝置，取得健康菌和損傷菌的增殖的概率密度函數(shù)。
4.如權(quán)利要求1~3中任一項所述的方法，其特征在于，包括下述的工序: (1)取得健康菌和損傷菌的增殖的概率密度函數(shù)以及損傷菌相對于健康菌的誘導(dǎo)期的延長時間數(shù)據(jù)的工序； (2)取得預(yù)測對象試樣中的微生物的增殖數(shù)據(jù)，根據(jù)該數(shù)據(jù)擬合新邏輯模型，算出參數(shù)值，將該參數(shù)值應(yīng)用于新邏輯模型，取得溫度變動型增殖預(yù)測模型的工序； (3)由(I)的概率密度函數(shù)和(2)的增殖預(yù)測模型，取得概率論的微生物增殖預(yù)測模型的工序；和 (4)將任意的初期存在菌數(shù)、任意的溫度、任意的經(jīng)過時間輸入(3)的模型中，通過概率論的預(yù)測方法，求出 對應(yīng)初期存在菌數(shù)的各自的增殖菌數(shù)，將其合計，由此得到飲食品中的增殖菌數(shù)的工序。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于: 概率論的預(yù)測方法為蒙特卡羅模擬法。
【文檔編號】C12Q1/02GK104136624SQ201380010554
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月2日
【發(fā)明者】大島悟, 土方智典, 高橋尚美, 松原裕樹 申請人:株式會社明治