使用可裂解探針檢測c-Met基因的方法
【專利摘要】一個(gè)具體的實(shí)施例的一種形式提供了用于檢測c-Met基因表達(dá)的量的檢測試劑盒，包含特異性地結(jié)合至c-Met基因的一對(duì)引物，以及可裂解探針，其特異性地結(jié)合至由該一對(duì)引物擴(kuò)增的c-Met擴(kuò)增產(chǎn)物之內(nèi)。在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，通過使用根據(jù)該一個(gè)具體的實(shí)施例的檢測試劑盒測量樣品中c-Met基因表達(dá)的量。當(dāng)使用根據(jù)該具體的實(shí)施例的方法時(shí)，可以有效地檢測甚至是處于低濃度下的c-Met基因表達(dá)的量，并且在癌癥診斷和預(yù)后方面可以是有用的。
【專利說明】使用可裂解探針檢測c-Met基因的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及癌癥診斷試劑盒和使用其的診斷方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過使 用引物組和可裂解探針使得能夠?qū)崟r(shí)地檢測基因的試劑盒以及使用其的診斷方法。

【背景技術(shù)】
[0002] c-Met是肝細(xì)胞生長因子（HGF)受體，而HGF是一種細(xì)胞因子，其結(jié)合至c-Met受 體酪氨酸激酶的胞外區(qū)以引起各種正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的分裂、移動(dòng)、形態(tài)發(fā)生和血管 生成。c-Met是存在于細(xì)胞表面的代表性的受體酪氨酸激酶。與HGF無關(guān)（其是配體），由 于c-Met自身也是致癌基因并且有時(shí)參與多種相關(guān)的機(jī)制如腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、癌癥細(xì)胞遷 移，癌癥細(xì)胞侵襲和血管生成，因此c-Met是作為抗癌靶而引起關(guān)注的蛋白質(zhì)。
[0003] 此外，c-Met在許多類型的癌癥中過表達(dá)。特別地，已知c-Met過表達(dá)主要涉及患 者預(yù)后不良的原因。因此，可以使用可以特異性地?cái)U(kuò)增c-Met基因的引物組以通過使用取 自患者的臨床樣品來測量患者中的癌癥發(fā)展。此外，引物組可以被用作選擇癌癥治療劑或 治療方法的重要決策信息。因此，需要開發(fā)特異性地結(jié)合至c-Met的基因或mRNA的引物或 探針，或者能夠驗(yàn)證c-Met基因或mRNA的過表達(dá)程度的診斷試劑盒。
[0004] 最近，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)被用于檢測或擴(kuò)增基因。利用PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)高通量PCR 篩選已經(jīng)引起了現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的創(chuàng)新性變革。分析技術(shù)對(duì)包括診斷、環(huán)境監(jiān)測、血液檢 測和基因型分析在內(nèi)的許多研究領(lǐng)域產(chǎn)生了重大影響。隨著生物信息學(xué)時(shí)代的到來，科學(xué) 家處理基因信息的能力超過以往任何時(shí)候。然而，為了能夠檢測較小量的DNA并實(shí)時(shí)驗(yàn)證 DNA擴(kuò)增量，許多相關(guān)研究仍在進(jìn)行。
[0005] 因此，改進(jìn)PCR方法以開發(fā)檢測c-Met基因的方法，其可以在癌癥診斷中更加有效 地使用。在以上結(jié)果的基礎(chǔ)上，開發(fā)了本發(fā)明的基于探針的檢測試劑盒和診斷方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 技術(shù)問題
[0007] 本發(fā)明的一種實(shí)施方式提供了 c-Met基因檢測試劑盒，該檢測試劑盒包含引物組 和可裂解探針（cleavable probe)。
[0008] 本發(fā)明的另一種實(shí)施方式提供了通過使用含有引物組和可裂解探針的c-Met基 因檢測試劑盒檢測c-Met基因的方法。
[0009] 技術(shù)方案
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了用于檢測c-Met基因的表達(dá)的檢測試劑盒，其中， 檢測試劑盒包括：特異性結(jié)合至c-Met基因的引物組；特異性地結(jié)合至由引物組擴(kuò)增的 c-Met擴(kuò)增產(chǎn)物的內(nèi)部的可裂解探針。
[0011] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供了 c-Met基因檢測試劑盒，包括含有SEQ ID NO: 1的 核酸的引物、含有SEQ ID N0:2的核酸的引物和含有SEQ ID N0:7的核酸的可裂解探針。
[0012] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式提供了 c-Met基因檢測試劑盒，包括含有SEQ ID N0:3 的核酸的引物、含有SEQ ID N0:4的核酸的引物和含有SEQ ID N0:8的核酸的可裂解探針。
[0013] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提供了 C-Met基因檢測試劑盒，包括含有SEQ ID N0:5的 核酸的引物、含有SEQ ID N0:6的核酸的引物和含有SEQ ID N0:9的核酸的可裂解探針。
[0014] 本文使用的術(shù)語"c-Met基因"是指編碼結(jié)合到肝細(xì)胞生長因子（HGF)的受體酪氨 酸激酶的基因。例如，c-Met基因可以對(duì)應(yīng)于GenBank登錄號(hào)NM_000245或GenBank登錄 號(hào) NM_000236。
[0015] c-Met蛋白在許多類型的癌癥中過表達(dá)。特別地，已知c-Met過表達(dá)主要涉及患者 中預(yù)后不良的原因。通過測定可能引起c-Met蛋白過表達(dá)的c-Met基因的過表達(dá)可以診斷 的癌癥類型包括腫瘤（惡性上皮腫瘤，carcinoma)、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤（blastoma)、肉瘤和 白血病等，但不限于此。癌癥（cancer)包括，例如，膀胱癌、乳癌（breast cancer)、子宮頸 癌、膽管癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、卵巢 癌、胰腺癌、膽囊癌、前列腺癌、甲狀腺癌、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤、卡波西氏肉瘤、平 滑肌肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、纖維肉瘤、成人T細(xì)胞白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神 經(jīng)母細(xì)胞瘤/星形細(xì)胞瘤、黑色素瘤、間皮瘤和腎母細(xì)胞瘤，但不限于此。
[0016] 本文所用的術(shù)語"引物"可以與"寡核苷酸"或"多核苷酸"互換地使用。引物是指 在PCR中用作DNA合成的起點(diǎn)的寡核苷酸。引物通常包含約15至約35個(gè)核苷酸，并與靶 序列的互補(bǔ)區(qū)雜交。
[0017] 本文使用的術(shù)語"探針"指的是特異性地結(jié)合至靶序列的寡核苷酸，并且包括，例 如，含有特定區(qū)域的多核苷酸，該特定區(qū)域被設(shè)計(jì)為可通過序列特異方法與特定核酸序列 (如靶核酸序列）互補(bǔ)區(qū)域雜交。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，寡核苷酸探針包含約15至 約60個(gè)核苷酸。適當(dāng)?shù)?，寡核苷酸探針包含約18至約30個(gè)核苷酸。
[0018] 本文使用的術(shù)語"可裂解探針（可斷裂探針，cleavable probe) "是指包括兩種類 型的核酸的探針，例如，在DNA探針的內(nèi)部還包含一些RNA核苷酸的DNA探針?？闪呀馓结?可以含有內(nèi)部區(qū)域，其中約1至10個(gè)DNA核苷酸被替換為RNA核苷酸、其中約2至8個(gè)DNA 核苷酸被替換為RNA核苷酸或者其中約3至7個(gè)DNA核苷酸被替換為RNA核苷酸，但并不 限于此。此外，RNA核苷酸可以連續(xù)或不連續(xù)地定位于在探針內(nèi)。適當(dāng)?shù)兀闪呀馓结樋梢?是SEQ ID N0S:7至SEQ ID N0S:9的探針之一，但并不限于此。
[0019] 此外，可裂解探針可以在探針的兩端或內(nèi)部標(biāo)記有可檢測物質(zhì)。用于PCR的混合 物包含RNA酶（核糖核酸酶，RNase酶），其可以特異性地切割RNA-DNA雙鏈中的RNA序列 部分。在由RNA酶切割后，可裂解探針的所有片段將在反應(yīng)溫度下從靶擴(kuò)增子解離并散布 在反應(yīng)溶液中。由于標(biāo)記在探針中的供體和受體被分離，可以監(jiān)測供體的熒光發(fā)射。
[0020] 本文使用的術(shù)語"標(biāo)記物（標(biāo)簽，label)"或"可檢測標(biāo)記"指的是通過共價(jià)鍵或 非共價(jià)鍵結(jié)合至探針的熒光染料（熒光物，fluorochrome)化合物，并且可以是包含熒光供 體和熒光受體的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)對(duì)。
[0021] 本文使用的術(shù)語"熒光染料"是指被具有短于所發(fā)射的光的波長的波長的光激發(fā) 后能發(fā)光的熒光物質(zhì)。此外，術(shù)語"熒光供體"是指發(fā)射由本發(fā)明中公開的測定法測量的光 的熒光染料。同時(shí)，熒光供體可以提供由熒光受體所吸收的光。本文使用的術(shù)語"熒光受 體"是指吸收由熒光供體發(fā)射的能量的二級(jí)熒光染料或猝滅劑。二級(jí)熒光染料吸收由熒光 供體發(fā)射的能量并且隨后發(fā)射具有長于由熒光供體發(fā)射光的光的波長的波長的光。猝滅劑 吸收從熒光供體發(fā)射的能量。
[0022] 任何發(fā)光分子，適當(dāng)?shù)厥菬晒馊玖虾?或猝滅劑，可以用于本發(fā)明的實(shí)施方式中。 例如，發(fā)光分子可以是Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor680、7_ 二乙基氛基香?素 _3_ 竣酸、突光素、 Oregon Green 488、Oregon Green514、四甲基若丹明、若丹明 X、德克薩斯紅（Texas Red) 染料、QSY 7、QSY33、Dabcyl、B0DIPY FL、B0DIPY 630/650、B0DIPY6501665、B0DIPY TMR-X、 BODIPY TR-X、二烷基氨基香豆素、Cy3(青色素 3)、Cy3. 5、Cy5. 5、Cy5、DTPA(Eu3+)-AMCA、# 及TTHA(Eu3+)AMCA，但不限于此。適當(dāng)?shù)?，發(fā)光分子可以是包括6-FAM和愛荷華黑BQ(Iowa Black BQ)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)（FRET)，但不限于此。
[0023] 此外，用于檢測c-Met基因的試劑盒可以進(jìn)一步含有熱穩(wěn)定聚合酶或RNA酶，并且 試劑盒中含有的酶可以是熱穩(wěn)定聚合酶及熱穩(wěn)定RNA酶。
[0024] 在本文中使用并應(yīng)用于酶的術(shù)語"熱穩(wěn)定的"是指酶在升高的溫度下（例如55°C 或更高），或在加熱和冷卻重復(fù)的循環(huán)中保持生物學(xué)活性。熱穩(wěn)定的多核苷酸聚合酶可以 尤其適用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，熱穩(wěn)定的多核苷酸聚合酶可以是Taq 聚合酶。熱穩(wěn)定的多核苷酸聚合酶可以是選自由AmpliTaq、AmpliTaq Stoffel fragment、 SuperTaq、SuperTaq plus、LA Taq、LApro Taq 以及 EX Taq 組成的組中的 Taq 聚合酶。此 夕卜，在本文中使用的術(shù)語"RNA酶"是指特異性切割RNA的酶。RNA可以是由使用RNA和DNA 的雜交形成的雜交雙鏈的雙鏈RNA。
[0025] 此外，試劑盒可以提供為包括具有一種或多種試劑的包裝單元（package unit)的 試劑盒。試劑盒可以包含選自由以下物品組成的組中的至少一種：緩沖液、操作指南和陽 性或陰性對(duì)照組。試劑盒可以包括以適當(dāng)比例混合以進(jìn)行本文所描述的方法的試劑的容 器。試劑容器適當(dāng)?shù)匕▎挝粩?shù)（unit number)的試劑以省略完成該方法時(shí)的衡量（計(jì)量， measuring)。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒進(jìn)一步包括用于從生物學(xué)樣品提取基因 組DNA或RNA的試劑。此外，試劑盒試劑可以包括用于逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR分析的試劑。
[0026] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了檢測c-Met基因的方法，該方法包括：
[0027] 從樣品中獲得DNA ;
[0028] 使樣品與選自由以下組成的組中的至少一個(gè)引物-探針組混合以制備混合物：包 括含有SEQ ID NO: 1的核酸的引物、含有SEQ ID N0:2的核酸的第二引物以及含有SEQ ID NO:7的核酸的可裂解探針的第一引物-探針組；包括含有SEQ ID NO:3的核酸的引物、含 有SEQ ID N0:4的核酸的引物以及含有SEQ ID N0:8的核酸的可裂解探針的第二引物-探 針組；包括含有SEQ ID N0:5的核酸的引物、含有SEQ ID N0:6的核酸的引物以及含有SEQ ID N0:9的核酸的可裂解探針的第三引物-探針組；
[0029] 使聚合酶、RNA酶和擴(kuò)增緩沖液與該混合物混合以擴(kuò)增混合物中的DNA ;和
[0030] 檢測由探針上的標(biāo)記發(fā)射的信號(hào)的增加。
[0031] 檢測c-Met基因的方法詳細(xì)說明如下。
[0032] 首先，檢測c_Met基因的方法可以包括從樣品獲得DNA。樣品可以獲自癌癥患者或 愿意接受癌癥進(jìn)展診斷的個(gè)體，或特定的人體部分。
[0033] DNA可以是gDNA(基因組DNA)、cDNA(互補(bǔ)DNA)或DNA片段。DNA可直接從細(xì)胞中 獲得。此外，為檢測DNA表達(dá)，可以從細(xì)胞獲得mRNA，然后通過進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶PCR從該mRNA 獲得cDNA。
[0034] 隨后，檢測c-Met基因的方法可以包括使樣品與選自由以下組成的組中的至少一 個(gè)引物-探針組混合以制備混合樣品：包括含有SEQ ID NO: 1的核酸的引物、含有SEQ ID N0:2的核酸的第二引物以及含有SEQ ID N0:7的核酸的可裂解探針的第一引物-探針組； 包括含有SEQ ID N0:3的核酸的引物、含有SEQ ID N0:4的核酸的引物以及含有SEQ ID N0:8的核酸的可裂解探針的第二引物-探針組；包括含有SEQ ID N0:5的核酸的引物、含 有SEQ ID N0:6的核酸的引物以及含有SEQ ID N0:9的核酸的可裂解探針的第三引物-探 針組。
[0035] 可裂解探針可以在其兩端或內(nèi)部標(biāo)記有可檢測物質(zhì)，并且可以標(biāo)記有包括熒光供 體和熒光受體的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)對(duì)。
[0036] 隨后，檢測c-Met基因的方法可以包括使聚合酶、RNA酶和擴(kuò)增緩沖液使混合樣品 混合以擴(kuò)增混合物中的DNA。可以使用任何熱穩(wěn)定聚合酶或RNA酶。
[0037] 本文中所使用的術(shù)語"擴(kuò)增緩沖液"是指被添加到擴(kuò)增反應(yīng)中以控制擴(kuò)增反應(yīng)并 因此改變擴(kuò)增反應(yīng)中至少一個(gè)要素的穩(wěn)定性、活性和/或生命周期（lifecycle)的復(fù)合物 (混合物、化合物，compound)。擴(kuò)增緩沖液可以與PCR擴(kuò)增和RNase Η切割活性相容。例 如，緩沖液的實(shí)例包括含有4- (2-羥乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES)、3- (Ν-嗎啉代）丙烷 磺酸（MOPS)、乙酸鹽或磷酸鹽的緩沖液，但不限于此。
[0038] PCR緩沖液通常包括約70mM或更低的KC1，約1. 5mM或更高的MgCl2，以及約50至 約200 μ Μ的dATP、dCTP、dGTP和dTTP的每種。緩沖液可進(jìn)一步包含用于更有效的逆轉(zhuǎn)錄 酶PCR或優(yōu)化PCR的添加劑。
[0039] 添加劑是指為了改變組合物的至少一個(gè)要素的穩(wěn)定性、活性和/或生命周期而添 加的化合物。添加劑的實(shí)例包括可以改變擴(kuò)增效率的甜菜堿、甲酰胺、KC1、CaCl2、MgOAc、 MgCl2、NaCl、NH40Ac、Nal、Na(C03)2、LiCl、MnOAc、NMP、海藻糖、二甲亞砜（DMS0)、甘油、乙二 醇、二硫蘇糖醇（DTT)、焦磷酸酶、無機(jī)焦磷酸酶（TAP)、陽離子、以及其他化合物、蛋白質(zhì)或 輔因子，但不限于此?？梢赃x擇地加入添加劑以促進(jìn)引物退火的選擇性。
[0040] 隨后，檢測c-Met基因的方法可包括檢測由探針上的標(biāo)記發(fā)射的信號(hào)的增加。 發(fā)射的信號(hào)可以是突光。可以通過使用適當(dāng)?shù)难b置如Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR系統(tǒng)或Biorad CFX96 real-time PCR熱循環(huán)儀檢測熒光發(fā)射的結(jié)果，但可 以使用在本領(lǐng)域中可用的所有裝置。
[0041] 此外，檢測c-Met基因的方法可以包括逆轉(zhuǎn)錄PCR，其中，從樣品獲得RNA并通過使 用逆轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增RNA以將獲得的cDNA提供為樣品DNA。RNA可以獲自癌癥患者或愿意經(jīng)歷 癌癥診斷的個(gè)人，隨后可以通過使用逆轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增RNA以獲得cDNA。可以使用本領(lǐng)域中可 用的任何方法進(jìn)行通過逆轉(zhuǎn)錄酶來逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0042] 在逆轉(zhuǎn)錄PCR中，使用模版特異性DNA引物以產(chǎn)生互補(bǔ)DNA鏈。然后，在PCR中， 產(chǎn)物被改變，并且第二模板特異性引物結(jié)合至該cDNA，并延伸以形成雙鏈體（duplex) DNA。 在接下來的溫度循環(huán)中擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物。為了保持最高靈敏度，防止RNA在cDNA合成之 前被降解是重要的。
[0043] 檢測c-Met基因的方法可以用于驗(yàn)證c-Met的表達(dá)并因此診斷腫瘤（惡性上皮細(xì) 胞腫瘤，carcinoma)、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病，但不限于此。具體地，癌癥包括膀胱 癌、乳癌、子宮頸癌、膽管癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺 癌、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、膽囊癌、前列腺癌、甲狀腺癌、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤、 卡波西氏肉瘤、平滑肌肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、纖維肉瘤、成人T細(xì)胞白血病、淋巴瘤、 多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤/星形細(xì)胞瘤、黑色素瘤、間皮瘤和腎母細(xì)胞瘤，但不限于此。 [0044] 有益效果
[0045] 當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式的引物組和可裂解探針（其中，該引物組和探針特 異性地結(jié)合至c-Met)時(shí)，可以實(shí)時(shí)檢測出極少量的c-Met表達(dá)，從而可以診斷與c-Met過 表達(dá)相關(guān)的多種癌癥并且容易地確定預(yù)后。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046] 圖1示出通過使用第一引物-探針組擴(kuò)增c-Met靶核苷酸序列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0047] 圖2示出通過使用第二引物-探針組擴(kuò)增c-Met靶核苷酸序列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0048] 圖3示出通過使用第三引物-探針組擴(kuò)增c-Met靶核苷酸序列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0049] 實(shí)施例
[0050] 以下，參照下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地說明。然而，這些實(shí)施例僅用于說 明目的，并不意在限制本發(fā)明的使用范圍。
[0051] 實(shí)施例1 :制備用于c-Met檢測的引物組和探針
[0052] 制備用于c-Met檢測的總共三組的引物組和引物（F :正向引物，R :反向引物，IN : CataCleave 探針）。（由 Integrated DNA Technologies, Inc.合成）。
[0053] 表 1
[0054]

【權(quán)利要求】
1. 一種C-Met基因檢測試劑盒，包括含有SEQ ID N0:1的核酸的引物、含有SEQ ID NO:2的核酸的引物和含有SEQ ID NO:7的核酸的可裂解探針。
2. -種c-Met基因檢測試劑盒，包括含有SEQ ID N0:3的核酸的引物、含有SEQ ID N0:4的核酸的引物和含有SEQ ID N0:8的核酸的可裂解探針。
3. -種c-Met基因檢測試劑盒，包括含有SEQ ID N0:5的核酸的引物、含有SEQ ID N0:6的核酸的引物和含有SEQ ID N0:9的核酸的可裂解探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3之一所述的c-Met基因檢測試劑盒，其中，所述c-Met基因檢測 試劑盒進(jìn)一步包含熱穩(wěn)定聚合酶和RNA酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至3之一所述的c-Met基因檢測試劑盒，其中，所述可裂解探針包含 在所述可裂解探針中的1至10個(gè)DNA核苷酸被替換為RNA核苷酸的內(nèi)部區(qū)域。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至3之一所述的c-Met基因檢測試劑盒，其中，所述可裂解探針包含 在所述可裂解探針中的3至7個(gè)DNA核苷酸被替換為RNA核苷酸的內(nèi)部區(qū)域。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的c-Met基因檢測試劑盒，其中，所述可裂解探針在不同的DNA 部分的兩端標(biāo)記有可檢測物質(zhì)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的c-Met基因檢測試劑盒，其中，所述可檢測物質(zhì)是熒光共振能 量轉(zhuǎn)移FRET對(duì)。
9. 一種檢測c-Met基因的方法，所述方法包括： 從樣品獲得DNA ; 使樣品與選自由以下組成的組中的至少一個(gè)引物-探針組混合以制備混合樣品： 包括含有SEQ ID NO: 1的核酸的引物、含有SEQ ID NO:2的核酸的引物和含有SEQ ID NO:7的核酸的可裂解探針的第一引物-探針組； 包括含有SEQ ID N0:3的核酸的引物、含有SEQ ID N0:4的核酸的引物和含有SEQ ID N0:8的核酸的可裂解探針的第二引物-探針組；和 包括含有SEQ ID N0:5的核酸的引物、含有SEQ ID N0:6的核酸的引物和含有SEQ ID N0:9的核酸的可裂解探針的第三引物-探針組； 使聚合酶、RNA酶和擴(kuò)增緩沖液與所述混合樣品混合以擴(kuò)增混合物中的DNA ;以及 檢測由所述探針上的所述標(biāo)記發(fā)射的信號(hào)的增加。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104160026SQ201380013315
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2013年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月9日
【發(fā)明者】金桄佑, 金鐘源, 南都鉉, 奇昌錫 申請(qǐng)人:社會(huì)福祉法人 三星生命公益財(cái)團(tuán)