可利用木糖的棒狀桿菌微生物和利用其產生l-賴氨酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及可利用木糖的棒狀桿菌微生物和利用其產生L-賴氨酸的方法。更具體地，本發(fā)明涉及改良的棒狀桿菌微生物，其中導入編碼作為木糖合酶的木糖異構酶和木酮糖激酶的基因以表達木糖合酶。本發(fā)明還涉及產生L-賴氨酸的方法，包括利用木糖作為碳源而培養(yǎng)改良的棒狀桿菌微生物和從所述培養(yǎng)物回收L-賴氨酸的步驟。
KCCM11016P
1995.12.18

KCCM11242P
2011.12.29

KCCM11347P
1991.12.10
【專利說明】可利用木糖的棒狀桿菌微生物和利用其產生L-賴氨酸的 方法
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 1.發(fā)明領域
[0003] 本發(fā)明涉及經改良利用木糖的棒狀桿菌屬（Corynebacterium sp.)微生物和利用 其產生L-賴氨酸的方法。
[0004] 2.相關技術的描述
[0005] 工業(yè)微生物利用糖如葡萄糖、果糖和蔗糖作為碳源。通常將農產品用作原料來獲 得這些碳源，但是它們花費大，并且作為食物更有價值。最近，代替利用農產品作為傳統(tǒng)原 料，包括農業(yè)廢物或木質廢物、工業(yè)廢物等的纖維素生物質已作為用于發(fā)酵的理想糖原料 而吸引注意，因為它具有低成本和充足供應的優(yōu)勢。
[0006] 它們之中，木糖是自然界中第二最豐富的木質纖維素碳水化合物，并且是代表性 的纖維素生物質。有用的材料已利用工業(yè)微生物從木糖產生。例如，通過在含有包括葡萄 糖和木糖的戊糖混合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)埃希氏菌屬（Escherichia sp.)菌株并且然后從培 養(yǎng)基回收L-氨基酸而產生L-氨基酸的方法是已知的，其中將該菌株（stain)改良以增加 編碼水解木糖苷的酶（木糖苷酶）的xylABFGHR基因簇的表達，木糖苷是源自木糖的糖苷 (日本專利號4665567)。
[0007] 另一方面，棒狀桿菌（Coryneform bacteria)，谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum)被稱作用于多種L-氨基酸產生的革蘭氏陽性菌株。如上面所描述的，因為 木糖是自然界中第二最豐富的木質纖維素碳水化合物，所以期望L-氨基酸如L-賴氨酸可 更經濟地通過利用木糖從谷氨酸棒狀桿菌產生。然而，谷氨酸棒狀桿菌不具有木糖--其 是戊糖--代謝途徑中涉及的重要基因，因此存在這樣的問題：L-氨基酸不能通過利用木 糖而從谷氨酸棒狀桿菌產生。為了解決該問題，已有這樣的報道：通過導入源自大腸桿菌 (Escherichia coli)的木糖異構酶（XylA)和木酮糖激酶（XylB)而將谷氨酸棒狀桿菌改良 以能夠利用木糖（Kawaguchi 等，AEM 72:3418-3428, 2006)。
[0008] 本發(fā)明人已做出了多方面努力來以更經濟的方式產生L-氨基酸，因此，他們發(fā)現(xiàn) 當將源自胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora)的XylA和XylB-編碼基因導入谷氨 酸棒狀桿菌時，該變體能利用木糖產生L-賴氨酸，并還顯示較先前已知的導入有源自大腸 桿菌的xylA和xylB的棒狀桿菌微生物更提高的木糖利用能力，由此完成本發(fā)明。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明的一個目的是提供改良的棒狀桿菌屬微生物，其能通過利用木糖產生 L-賴氨酸。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的是提供利用改良的棒狀桿菌屬微生物產生L-賴氨酸的方 法。
[0012] 附圖簡述
[0013] 圖1顯示本發(fā)明的表達載體pECCG122-pcj7-xylAB(Er)的切割圖；
[0014] 圖2顯示根據(jù)培養(yǎng)基中含有的碳源表示親株和導入有表達載體的轉化體的生長 特性的圖；和
[0015] 圖3顯示根據(jù)培養(yǎng)基中含有的碳源表示親株和將pcj7-xylAB(Er)插入染色體上 的轉化體的生長特性的圖。
[0016] 優(yōu)選實施方式的詳細描述
[0017] 一方面，本發(fā)明提供能通過利用木糖產生L-賴氨酸的改良的棒狀桿菌屬微生物， 其特征在于將源自胡蘿卜軟腐歐文氏菌的木糖異構酶和木酮糖激酶的活性導入其中。
[0018] 如本文所用，術語"木糖異構酶（XylA) "指催化從木糖到木酮糖異構化反應的酶， 其參與木糖代謝途徑，關于本發(fā)明的目的，它可以是源自胡蘿卜軟腐歐文氏菌的酶。
[0019] XylA是源自胡蘿卜軟腐歐文氏菌的木糖異構酶，并可沒有限制地包括能通過將其 活性連同源自胡蘿卜軟腐歐文氏菌的木酮糖激酶活性導入沒有木糖異構酶活性的棒狀桿 菌屬微生物而提供木糖-利用能力的序列。此外，顯然，具有與上述序列的活性等同的活性 的任何序列，雖然它不是源自胡蘿卜軟腐歐文氏菌，也包括在本發(fā)明的范圍內。
[0020] 例如，可包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，或含有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的保 守序列和在一個或多個位置一個氨基酸或幾個氨基酸（可依據(jù)蛋白質三維結構中氨基酸 殘基的位置和類型而變化，具體地2至20,具體地2至10,更具體地2至5個氨基酸）置 換、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列。只要它能保持或提高XylA活性，可包括與SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有80 %或更多，具體地90 %或更多，更具體地95 %或更多，更具體 地97%或更多同源性的氨基酸序列，并且氨基酸的置換、缺失、插入、添加或倒位還包括天 然存在于具有XylA活性的微生物中的突變序列或人工修飾的序列。
[0021] 如本文所用，術語"同源性"指兩個不同氨基酸序列或兩個不同核苷酸序列之間的 同一性，并可通過本領域技術人員熟知的方法測定，例如，BLAST 2.0,其計算參數(shù)如分數(shù)、 同一性和相似性，但是不特別限于此。
[0022] 如本文所用，術語"木酮糖激酶"指催化從木酮糖到木酮糖5-磷酸鹽的產生反應 的酶，其參與木糖代謝途徑，關于本發(fā)明的目的，它可以是源自胡蘿卜軟腐歐文氏菌的酶。
[0023] XylB是源自胡蘿卜軟腐歐文氏菌的木酮糖激酶，并可沒有限制地包括能通過將其 活性連同源自胡蘿卜軟腐歐文氏菌的木糖異構酶活性導入沒有木酮糖激酶活性的棒狀桿 菌屬微生物而提供木糖-利用能力的序列。此外，顯然，具有與上述序列的活性等同的活性 的任何序列，雖然它不是源自胡蘿卜軟腐歐文氏菌，也包括在本發(fā)明的范圍內。
[0024] 例如，可包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列，或含有SEQ ID N0:2的氨基酸序列的保 守序列和在一個或多個位置一個氨基酸或幾個氨基酸（可依據(jù)蛋白質三維結構中氨基酸 殘基的位置和類型而變化，具體地2至20,具體地2至10,更具體地2至5個氨基酸）置 換、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列。只要它能保持或提高XylB活性，可包括與SEQ ID N0:2的氨基酸序列具有80 %或更多，具體地90 %或更多，更具體地95 %或更多，更具體 地97%或更多同源性的氨基酸序列，并且氨基酸的置換、缺失、插入、添加或倒位還包括天 然存在于具有XylB活性的微生物中的突變序列或人工修飾的序列。
[0025] 如本文所用，術語"木糖異構酶（XylA)-編碼基因（在下文中，xylA)"指編碼上述 XylA的多核苷酸。
[0026] 所述基因可包括SEQ ID N0:3的核苷酸序列，可與源自SEQ ID N0:3的核苷酸序 列的探針在"嚴格條件"下雜交的核苷酸序列，或其中一個核苷酸或幾個核苷酸在SEQ ID NO:3的核苷酸序列的一個或多個位置被置換、缺失、插入或添加的核苷酸序列。只要它能保 持或提高XylA活性，所述基因可包括與SEQ ID NO: 3的核苷酸序列具有80%或更多，具體 地90 %或更多，更具體地95 %或更多，更具體地97 %或更多同源性的核苷酸序列，由宿主 細胞偏愛的密碼子置換的核苷酸序列，其N-端或C-端被延伸或除去的核苷酸序列，或其起 始密碼子被修飾以控制表達水平的核苷酸序列，因此所述基因不具體限于此。
[0027] 如本文所用，術語"木酮糖激酶（XylB)-編碼基因（在下文中，xylB)"指編碼上述 XylB的多核苷酸。
[0028] 所述基因可包括SEQ ID N0:4的核苷酸序列，可與源自SEQ ID N0:4的核苷酸序列 的探針在"嚴格條件"下雜交的核苷酸序列，或一個核苷酸或幾個核苷酸在SEQ ID N0:4的 核苷酸序列的一個或多個位置被置換、缺失、插入或添加的核苷酸序列。只要它能保持或提 高XylB活性，所述基因可包括與SEQ ID N0:4的核苷酸序列具有80 %或更多，具體地90 % 或更多，更具體地95%或更多，更具體地97%或更多同源性的核苷酸序列，由宿主細胞偏 愛的密碼子置換的核苷酸序列，其N-端或C-端被延伸或除去的核苷酸序列，或其起始密碼 子被修飾以控制表達水平的核苷酸序列，因此所述基因不具體限于此。
[0029] 如本文所用，術語"嚴格條件"指這樣的條件，其允許多核苷酸之間的特異雜交，例 如，在 65°C在雜交緩沖液（3.5XSSC(0. 15M NaCl/O. 15M檸檬酸鈉，pH7.0)、(X02%Ficoll、 0. 02%聚乙烯吡咯烷酮、0. 02%牛血清白蛋白、0. 5%SDS、2mM EDTA、2. 5mM NaH2P04，pH7) 中的雜交，詳細描述公開在相關技術中（Molecular Cloning(A Laboratory Manual, J. Sambrook 等編輯者，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)或 Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel 等編 輯者，John Wiley & Sons, Inc.，New York)。
[0030] 如上所述，XylA和XylB活性導入棒狀桿菌屬微生物可通過本領域眾所周知的多 種方法進行。例如，存在將包括編碼XylA和XylB的核苷酸序列的多核苷酸插入進染色體 的方法，將包括多核苷酸的載體系統(tǒng)導入微生物的方法，將有效的啟動子導入編碼XylA和 XylB的核苷酸序列上游的方法，使xylA和xylB導入有修飾的啟動子的方法，或導入修飾的 編碼XylA和XylB的核苷酸序列的方法等等。更具體地，如果導入編碼XylA和XylB的核 苷酸序列，貝 1J來自產氨棒狀桿菌（Corynebacterium ammoniagenes)的pcj7啟動子（韓國 專利號10-0620092)可用作控制其表達的啟動子。在本發(fā)明的一個實施方式中，木糖-利 用能力的獲得被證實，因為通過表達載體的導入或染色體插入觀察到親株中不存在的外來 基因的活性。
[0031] 如本文所用，術語"載體"指具有編碼靶蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的DNA產 物，其可操作地連接至合適的調控序列以在合適的宿主中表達靶蛋白。調控序列包括能啟 動轉錄的啟動子、用于調控轉錄的任意操縱子序列、編碼適當?shù)膍RNA核糖體結合位點的序 列以及調控轉錄終止和翻譯的序列。一旦轉化進合適的宿主，載體就可不依賴宿主基因組 復制或起作用，或可整合進自身基因組。
[0032] 用于本發(fā)明的載體沒有具體限制并可以是本領域已知的任何載體，只要它可在 宿主中復制。通常使用的載體的實例可以是天然或重組的質粒、粘粒、病毒和噬菌體。例 如，作為噬菌體載體或粘粒載體,可利用pWE15、M13、AMBL3、AMBL4、λΙΧΙΙ、AASHII、 λΑΡΙΙ、λ?ΙΟ、人1：11、〇1已1'〇]14八、〇1已1'〇112]^等。作為質粒載體，可利用卩131?型、卩11〇型、 pBluescriptll 型、pGEM 型、pTZ 型、pCL 型、pET 型等。
[0033] 用于本發(fā)明的載體沒有具體限制，并可利用已知的表達載體。具體地，可利用 pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCCIBAC 載體等。
[0034] 此外，用于本發(fā)明的載體可以是能轉化宿主細胞的載體以將編碼靶蛋白的多核苷 酸插入宿主細胞的染色體。載體的具體實例包括，但不限于，可以在大腸桿菌（E.coli)和 或棒型細菌中以兩個方向自我復制的穿梭載體pECCG112(韓國專利號10-0057684)。
[0035] 如本文所用，術語"轉化"指用于將包括編碼靶蛋白的多核苷酸的載體導入宿主細 胞以在宿主細胞中表達多核苷酸編碼的蛋白質的一系列操作。將被導入宿主細胞的多核苷 酸可具有任何形式，只要它被導入宿主細胞和在其中表達。例如，多核苷酸可以以表達盒的 形式導入宿主細胞，該表達盒是包括自我表達需要的所有元件（可操作地連接至多核苷酸 的啟動子、轉錄終止信號、核糖體結合位點、翻譯終止信號等）的結構。表達盒可以是可自 我復制的表達載體的形式。此外，可將多核苷酸自身導入宿主細胞以可操作地連接至在宿 主細胞中表達需要的序列。
[0036] 宿主細胞可以是原核微生物中的任何一種，只要它能產生L-賴氨酸。宿主細胞的 實例可包括普羅威登斯菌屬（Providencia sp.)、棒狀桿菌屬和短桿菌屬（Brevibacterium sp.)微生物，具體地，棒狀桿菌屬微生物，更具體地谷氨酸棒狀桿菌。在本發(fā)明的一個實 施方式中，當作為沒有木糖-利用能力的棒狀桿菌屬微生物的KCCM11016P、KCCM10770P、 KFCC10750和CJ3P導入有源自胡蘿卜軟腐歐文氏菌的)(lyA和)(lyB時，它們擁有木糖-利 用能力，所以，L-氨基酸如L-賴氨酸可通過利用木糖作為碳源而被產生（表1至6)。
[0037] 具有產生L-賴氨酸能力的棒狀桿菌屬微生物可以是抵抗L-賴氨酸類似物的變 體。L-賴氨酸類似物抑制棒狀桿菌微生物的生長，但是當L-賴氨酸在培養(yǎng)基中共存時，該 抑制被完全或部分脫敏。L-賴氨酸類似物的實例包括，但不限于，氧雜-L-賴氨酸、L-賴 氨酸氧肟酸鹽、S-(2_氨乙基）-L_半胱氨酸（AEC)、甲基L-賴氨酸、α-氯己內酰胺 (chlorocaprolactam)等。對這些L-賴氨酸類似物具有抗性的變體可通過對棒狀桿菌微 生物的常規(guī)人工誘變處理而獲得。此外，當進行遺傳操作以誘導產生L-賴氨酸的微生物 時，可通過提高編碼參與L-賴氨酸生物合成系統(tǒng)的酶的基因中一個或多個的表達來實現(xiàn)。 這些基因的實例可包括二氫吡啶二羧酸合酶基因（dapA)、天冬氨酸激酶基因（lysC)、二氫 吡啶二羧酸還原酶基因（dapB)、二氨基庚酸脫羧酶基因（lysA)、二氨基庚二酸脫氫酶基因 (ddh)、磷酸烯醇丙酮酸羧基酶基因（ppc)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因（asd)和天冬氨酸酶 基因（aspA)，但是不限于此。
[0038] 如本文所用，術語"L-賴氨酸"是堿性α -氨基酸的一種，是不在身體中合成的必 需氨基酸，是L-氨基酸的一種，并具有NH2 (CH2) 4CH (NH2) C00H的化學式。L-賴氨酸通過L-賴 氨酸生物合成途徑從草乙酸鹽合成，并且NADPH依賴性還原酶催化L-賴氨酸生物合成的中 間過程。在1分子L-賴氨酸的生物合成過程期間，3分子NADPH由相應的酶直接消耗，并且 1分子NADPH被間接使用。
[0039] 如本文所用，術語"能產生L-賴氨酸的棒狀桿菌屬微生物"指經改良從木糖產生 L-賴氨酸的棒狀桿菌屬微生物，其通過導入編碼參與木糖代謝且棒狀桿菌屬微生物中未發(fā) 現(xiàn)的酶的基因進行制備。棒狀桿菌屬微生物可以是，但不具體限于，谷氨酸棒狀桿菌，并且 參與木糖代謝的酶的可以是，但不具體限于，XylA和XylB。
[0040] 從這一點上，宿主細胞可以是棒狀桿菌屬微生物，其中編碼參與L-賴氨酸生物合 成系統(tǒng)的酶的一個或多個基因的表達得以提高，并且編碼參與L-賴氨酸生物合成系統(tǒng)的 酶的基因可以是，但不限于，二氫吡啶二羧酸合酶基因（dapA)、天冬氨酸激酶基因（lysC)、 二氫吡啶二羧酸還原酶基因（dapB)、二氨基庚酸脫羧酶基因（lysA)、二氨基庚二酸脫氫酶 基因（ddh)、磷酸烯醇丙酮酸羧基酶基因（ppc)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因（asd)和天冬氨 酸酶基因（aspA)等。
[0041] 此外，宿主細胞可以是抵抗L-賴氨酸類似物的突變株。突變株可通過突變棒狀桿 菌屬微生物而獲得。L-賴氨酸類似物抑制棒狀桿菌微生物的生長，但是當L-賴氨酸在培養(yǎng) 基中共存時，該抑制被完全或部分脫敏。L-賴氨酸類似物的實例可以是，但不具體限于，氧 雜-L-賴氨酸、L-賴氨酸氧廂酸鹽、S-(2-氨乙基）-L-半胱氨酸（AEC)、γ -甲基L-賴氨 酸、α-氯己內酰胺等。
[0042] 同時，在本發(fā)明中，參與L-賴氨酸生物合成的已知酶的活性可被另外控制以進一 步提高L-賴氨酸產生。具體地，在本發(fā)明中，將asd、dapB和ddh基因--每個編碼天冬氨 酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸還原酶和二氨基庚二酸脫氫酶--過量表達以另外控制酶 活性，由此提高L-賴氨酸產生。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，本發(fā)明人選擇源自胡蘿卜軟腐歐文氏菌（SCRI1043) 的 ECA0097(xylA) (SEQ ID N0:1)和 ECA0096(xylB) (SEQ ID N0:2)作為編碼 XylA 和 XylB的合適基因以導入棒狀桿菌屬微生物（實施例1)，并且他們克隆了選擇的編碼 XylA和XylB的基因以構建同時表達xylA和xylB(在下文中，xylAB(Er))的表達載體 pECCG122-pcj7-xylA-xylB (在下文中，pECCG122-pcj7-xylAB (Er))。將所述表達載體導入 谷氨酸棒狀桿菌KCCM11016P (該微生物被公開為KFCC10881，并重新保存到布達佩斯條約 規(guī)定的國際保藏管理局（International Depositary Authority),登記號 KCCM11016P，韓 國專利號10-0159812和10-0397322)以制備過量表達xylAB(Er)的轉化體。據(jù)證實，制備的 轉化體通過利用木糖作為碳源而生長（圖2)，并通過利用葡萄糖和木糖中的每一種，或通 過同時利用葡萄糖和木糖而產生L-賴氨酸（表1)。此外，為了表達染色體上的xylAB (Er)， 構建用于染色體插入的重組載體，pDZTn-pcj7-xylAB(Er)，并轉化進KCCM11016P，通過第二 交換，構建具有xylAB(Er)的轉化體KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er)，xylAB(Er)可操作地連 接至染色體上轉座子內的pcj7啟動子。還證實，轉化體通過利用木糖作為碳源而生長（圖 3)，并通過利用葡萄糖和木糖中的每一種，或通過同時利用葡萄糖和木糖而產生L-賴氨酸 (表2)。此外，為了比較先前報道的源自大腸桿菌的xylAB (在下文中，xylAB (Ec))的導入和 本發(fā)明的源自胡蘿卜軟腐歐文氏菌的xylAB (Er)導入之間提高木糖-利用能力的效果，菌 株（KCCM11016P-pcj7-xylAB(Ec))通過將 xylAB(Ec)導入 KCCM11016P 來制備，并與制備的 KCCM11016P-pcj7-XylAB(Er)比較其木糖-利用能力和L-賴氨酸產生特性。因此，發(fā)現(xiàn)與 KCCM11016P-pcj7-xylAB(Ec)相比，KCCM11016P-pcj7-xylAB(Er)的木糖消耗率顯著增加， 這表明L-賴氨酸的發(fā)酵產生的提高（表3)。此外，為了證實是否多種棒狀桿菌屬微生物顯 示相同的結果，將pDZTn-pc j7-xylAB (Er)導入L-賴氨酸-產生菌株KCCM10770P，制備轉化 體KCCM10770P-pC j7-xylAB (Er)，并證實所述轉化體能通過利用葡萄糖和木糖中每一種，或 通過同時利用葡萄糖和木糖而產生L-賴氨酸（表4)。還將pDZTn-pcj7-xylAB(Er)導入另 一個L-賴氨酸-產生菌株KFCC10750 (該微生物被公開為KFCC10750,并重新保存到布達佩 斯條約規(guī)定的國際保藏管理局，登記號KCCM11347P，韓國專利號10-0073610)以制備轉化 體KFCC10750-pCj7-xylAB (Er)。據(jù)證實，該轉化體能通過利用葡萄糖和木糖中每一種，或通 過同時利用葡萄糖和木糖而產生L-賴氨酸（表5)。進一步，還將pDZTn-pcj7-xylAB(Er) 導入其它L-賴氨酸-產生菌株CJ3P，以制備轉化體CJ3P-p C j7-xylAB (Er)。還證實該轉化 體能通過利用葡萄糖和木糖中每一種，或通過同時利用葡萄糖和木糖而產生L-賴氨酸（表 6)。
[0044] 因此，本發(fā)明人將所述轉化體稱作"CA01-2195"，其通過利用培養(yǎng)基中的木糖而生 長并還通過利用培養(yǎng)基中的木糖和葡萄糖來產生L-賴氨酸，并于2011年12月29日根據(jù) 布達佩斯條約將它保藏在韓國微生物培養(yǎng)中心（KCCM,其位于!1〇1^」361-0〇叩，56〇(^61]11111-Gu，Seoul，Korea)，登記號KCCM11242P。即，該保藏被布達佩斯條約規(guī)定的國際保藏管理局 認可。
[0045] 另一方面，本發(fā)明提供產生L-賴氨酸的方法，包括以下步驟：（i)培養(yǎng)改良的能通 過利用含有木糖的培養(yǎng)基中的木糖作為碳源而產生L-賴氨酸的棒狀桿菌屬微生物，以獲 得培養(yǎng)肉湯；和（ii)從培養(yǎng)肉湯回收L-賴氨酸。
[0046] 如本文所用，術語"培養(yǎng)"指將微生物在人工控制的環(huán)境條件下培養(yǎng)。在本發(fā)明中， 培養(yǎng)棒狀桿菌屬微生物的方法可利用本領域廣泛已知的方法來進行。具體地，培養(yǎng)方法的 實例包括分批法、連續(xù)方式的補料分批或重復的補料分批法，但是不限于此。
[0047] 用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基必需以適當方式滿足特定微生物的要求同時在需氧條件下在 含有適當碳源、氮源、氨基酸、維生素等的典型培養(yǎng)基中控制溫度、pH等。用于棒狀桿菌 菌株的培養(yǎng)基被公開（例如，Manual of Methods for General Bacteriology, American Society for Bacteriology, Washington D.C·，USA, 1981)?？赡艿奶荚纯砂ㄌ呛吞妓?化合物如蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉和纖維素，除了作為主要碳源的葡萄糖和木糖的混 合物以外，油和脂肪如大豆油、葵花子油、蓖麻油和椰子脂，脂肪酸如棕櫚酸、硬脂酸和亞油 酸，醇如甘油和乙醇，以及有機酸如乙酸。這些物質可單獨或作為混合物使用。可能的氮源 可包括無機氮源如銨、硫酸銨、氯化銨、乙酸銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨；氨基酸如谷氨酸、 甲硫氨酸和谷氨酰胺；和有機氮源如蛋白胨、NZ-胺、肉膏、酵母提取物、麥芽提取物、玉米 浸出液體、酪蛋白水解物、魚或其分解產物、以及脫脂大豆餅或其分解產物。這些氮源可單 獨或組合使用。培養(yǎng)基可包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀或相應的含鈉鹽作為磷源?？赡艿牧?源可包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀或相應的含鈉鹽。進一步，可利用無機化合物如氯化鈉、 氯化鈣、氯化鐵、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳和碳酸鈣。除了以上的物質以外，可包括必要的 生長物質，如氨基酸和維生素。
[0048] 還可將適當?shù)那绑w加入培養(yǎng)基。培養(yǎng)期間可將上面提到的物質適當?shù)匾苑峙?、補 料分批或連續(xù)方式加入培養(yǎng)基，但是不具體限于此。培養(yǎng)基的pH可通過適當?shù)丶尤雺A性化 合物如氫氧化鈉、氫氧化鉀和銨，或酸性化合物如磷酸和硫酸來調節(jié)。
[0049] 消泡劑如脂肪酸聚乙二醇酯可用于抑制泡沫發(fā)展。為了保持需氧條件，可將氧或 含氧氣體（例如，空氣）導入培養(yǎng)肉湯。培養(yǎng)肉湯溫度通常是27°C至37°C，具體地30°C至 35°C。培養(yǎng)可持續(xù)直到L-賴氨酸的產生達到期望的水平。該目的可通常在10至100小時 內達到。L-賴氨酸可被釋放進培養(yǎng)基或包括在細胞內。
[0050] 此外，從培養(yǎng)肉湯回收L-賴氨酸的步驟可通過本領域已知的方法進行。具體地， 已知回收L-賴氨酸方法是，但不具體限于，具體地離心、過濾、萃取、噴霧、干燥、蒸發(fā)、沉 淀、結晶、電泳、差別性溶解度（例如，硫酸銨沉淀）、色譜法（例如，離子交換、親和、疏水和 大小排阻）等。
[0051] 在下文中，本發(fā)明的組成和效果將參考實施例被更詳細地描述。然而，這些實施例 僅用于說明的目的，本發(fā)明的范圍不意欲受這些實施例限制。
[0052] 實施例1 :外來某閔的詵擇
[0053] 選擇源自胡蘿卜軟腐歐文氏菌（SCRI1043)的ECA0097(xylA)(氨基酸：SEQ ID N0:l，核苷酸：SEQIDN0:3)和ECA0096(xylB)(氨基酸：SEQIDN0:2，核苷酸：SEQID NO:4)作為外來基因來制備改良的擁有木糖-利用能力的棒狀桿菌屬微生物。
[0054] 實施例2 :源自胡蘿卜軟腐歐f氐菌的xvlAB表汰載體的構律
[0055] 將實施例1中選擇的源自胡蘿卜軟腐歐文氏菌的XylA和XylB-編碼基因彼此接 近地定位。關于xylA和xylB(Er)以及周圍核苷酸序列的信息（登記號BX950851)獲自 US NIH GenBank，并且基于獲得的核苷酸序列，合成用于擴增源自胡蘿卜軟腐歐文氏菌的 xylAB(Er)的引物。
[0056] SEQ ID NO: 5:5 ' -ACACATATGCAAGCCTATTTTGAACAGATC-3 '
[0057] SEQ ID NO: 6:5 ' -AGAACTAGTGCCTTTTGGTGGTGTTTAAGT-3 '
[0058] 為了獲得xylAB(Er)片段，利用胡蘿卜軟腐歐文氏菌菌株SCRI1043的染色體DNA 作為模板和一對引物（SEQ ID N0s:5和6)進行PCR。PfuUltra?高保真度DNA聚合酶 (Stratagene)用作聚合酶，如下進行PCR :在94°C變性5分鐘，之后重復包括在94°C變性30 秒、在56°C退火30秒和在72°C聚合3分鐘的循環(huán)30次，然后在72°C聚合7分鐘。因此，獲得 含有 2844bp 的 xylAB(Er) (SEQ ID N0:17)的 3122bp 的基因片段（SEQ ID N0:18)。為了獲 得源自產氨棒狀桿菌的pc j7啟動子（KR0620092)，利用產氨棒狀桿菌CJHB100 (KR0620092) 的基因組DNA作為模板和一對引物（SEQ ID NOs: 15和16)進行PCR。PfuUltra?高保真度 DNA聚合酶（Stratagene)用作聚合酶，如下進行PCR:在94°C變性5分鐘，之后重復包括在 94°C變性30秒、在56°C退火30秒和在72°C聚合1分鐘的循環(huán)30次，然后在72°C聚合7分 鐘。因此，獲得318bp的多核苷酸（SEQ ID N0:14)。
[0059] SEQ ID NO: 15:5 ' -AATCTAGAAACATCCCAGCGCTA-3 '
[0060] SEQ ID NO: 16:5 ' -AAACTAGTCATATGTGTTTCCTTTCGTTG-3 '
[0061] 利用限制酶Xbal和Spel將pc j7克隆進大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭載體pECCG122， 然后利用Ndel和Spel克隆xylAB (Er)片段，由此獲得pECCG122-pc j7-xylAB (Er)載體（圖 1)。圖1是本發(fā)明的表達載體pECCG122-pcj7-xylAB(Er)的切割圖。
[0062] 實施例3 :導入有源自胡蘿卜軟腐歐f氐菌的xvlAB的L-賴氨酸-產牛菌株的牛 長和木糖-利用能力的考杳
[0063] 將實施例2中獲得的每個表達載體pECCG122-pcj7-xylAB (Er)導入谷氨酸棒狀桿 菌KCCM11016P (韓國專利號10-0159812和10-0397322)以制備xylAB (Er)-表達轉化體， 谷氨酸棒狀桿菌CA01-2195。
[0064] 為了比較KCCM11016P和CA01-2195之間的木糖-利用能力，將所述菌株在含有葡 萄糖或木糖作為碳源的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并比較它們的生長特性。還將它們在含有葡萄 糖或木糖作為碳源的生產培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且比較它們的L-賴氨酸產生特性。
[0065] 首先，為了比較生長特性，將菌株分別接種在25ml種子培養(yǎng)基[碳源（葡萄 糖或木糖）l0g/l、蛋白胨 l0g/l、酵母提取物 l0g/l、尿素 5g/l、KH2P044g/l、K2HP048g/l、 MgS047H200. 5g/l、生物素 100μ g/1、硫胺素-HC1 lmg/l、pH7. 0]中。當在 30°C培養(yǎng)菌株 32 小時時測量培養(yǎng)肉湯的吸光度（0D600)，并互相比較（圖2)。圖2是根據(jù)培養(yǎng)基中含有的 碳源顯示KCCM11016P和CA01-2195的生長特性的圖，其中（?)表示在含有葡萄糖的培養(yǎng) 基中培養(yǎng)的KCCM11016P，（ )表示在含有木糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的KCCM11016P，（ ▲)表 示在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的CA01-2195,和（X)表示在含有木糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 CA01-2195〇
[0066] 如圖2所示，在含有葡萄糖作為碳源的種子培養(yǎng)基中KCCM11016P和CA01-2195之 間的生長特性沒有差異。然而，在含有木糖作為碳源的種子培養(yǎng)基中，CA01-2195生長到某 個水平，而KCCM11016P幾乎不生長。因此，可見CA01-2195能通過利用培養(yǎng)基中含有的木 糖作為唯一碳源而生長。
[0067] 接下來，為了比較KCCM11016P和CA01-2195之間的L-賴氨酸產生特性，將1ml種 子培養(yǎng)肉湯接種在24ml生產培養(yǎng)基[碳源、（NH 4)2S0440g/l、大豆蛋白質2. 5g/l、玉米浸出 固體（corn steep solids)5g/l、尿素3g/l、KH2P04lg/l、MgS047H 20 0.5g/l、生物素 100yg/ 1、硫胺素-HC1 lmg/l、CaC0330g/l，pH7.0]中，并在 35°C 和 200rpm 培養(yǎng) 72 小時。這時，測 定葡萄糖l〇〇g/l、葡萄糖50g/l+木糖50g/l和葡萄糖70g/l+木糖30g/l以用作碳源。接下 來，測量和比較每個培養(yǎng)肉湯中L-賴氨酸濃度、剩余木糖的濃度和剩余葡萄糖的濃度（表 1)。
[0068] [表 1]
[0069]
【權利要求】
1. 改良的能通過利用木糖而產生L-賴氨酸的棒狀桿菌屬微生物，其中導入源自胡蘿 卜軟腐歐文氏菌的木糖異構酶（XylA)和木酮糖激酶（XylB)的活性。
2. 根據(jù)權利要求1所述的微生物，其中XylA包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，以及 XylB包括SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。
3. 根據(jù)權利要求1所述的微生物，其中XylA由SEQ ID NO:3的多核苷酸序列編碼，以 及XylB由SEQ ID N0:4的多核苷酸序列編碼。
4. 根據(jù)權利要求1所述的微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒狀桿菌。
5. 根據(jù)權利要求1所述的微生物，其中所述XylA和XylB活性的導入通過將包括編碼 XylA和XylB的核苷酸序列的多核苷酸插入染色體，將包括所述多核苷酸的載體系統(tǒng)導入 所述微生物，將有效的啟動子導入到所述編碼XylA和XylB的核苷酸序列上游，使XylA和 XylB導入有修飾的啟動子，或導入修飾的編碼XylA和XylB的核苷酸序列而實施。
6. 產生L-賴氨酸的方法，包括以下步驟： (i) 在含有木糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權利要求1至5中任一項所述的改良的 能通過利用木糖而產生L-賴氨酸的棒狀桿菌屬微生物以獲得培養(yǎng)肉湯；和 (ii) 從所述培養(yǎng)肉湯回收L-賴氨酸。
【文檔編號】C12N15/52GK104245921SQ201380013346
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年1月10日 優(yōu)先權日:2012年1月10日
【發(fā)明者】羅昭研, 許蘭, 金昌謙, 李光鎬, 文準玉, 李庚翰, 成珍錫, 金亨俊 申請人:Cj第一制糖株式會社