突變的頭孢菌素羥化酶及其在脫乙酰基頭孢菌烷酸合成中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于生成苯乙?；?7-HACA衍生物的突變型羥化酶，所述突變型羥化酶具有增加的活性和對(duì)苯乙酰基-7-ADCA衍生物具有更高的底物特異性，所述突變型羥化酶與野生型羥化酶相比具有一個(gè)或多個(gè)在來(lái)自以下殘基的殘基位置上的氨基酸修飾：位置7的脯氨酸、位置40的丙氨酸、位置51的蘇氨酸、位置53的甲硫氨酸、位置82的谷氨酸、位置91的精氨酸、位置96的蘇氨酸、位置108的甘氨酸、位置149的異亮氨酸、位置171的纈氨酸、位置177的丙氨酸、位置182的精氨酸、位置184的甲硫氨酸、位置193的異亮氨酸、位置195的苯丙氨酸、位置209的谷氨酰胺、位置210的丙氨酸、位置226的纈氨酸、位置233的甲硫氨酸、位置236的亮氨酸、位置237的丙氨酸、位置241的丙氨酸、位置249的纈氨酸、位置250的精氨酸、位置251的絲氨酸、位置255的甘氨酸、位置258的谷氨酸、位置260的絲氨酸、位置267的苯丙氨酸、位置280的丙氨酸、位置307的纈氨酸和位置313的天冬酰胺。本發(fā)明還提供一種使用本發(fā)明的酶從對(duì)應(yīng)的脫乙酰氧基頭孢菌烷酸制備脫乙酰基頭孢菌烷酸的方法。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)和處理這類酶的方法。MTCC 57602012.12.21MTCC 57612012.12.21MTCC 57622012.12.21MTCC 57632012.12.21MTCC 57642012.12.21MTCC 57652012.12.21MTCC 57662012.12.21MTCC 57672012.12.21MTCC 57682012.12.21MTCC 57692012.12.21MTCC 57702012.12.21MTCC 57712012.12.21MTCC 57722012.12.21MTCC 57732012.12.21MTCC 57742012.12.21MTCC 57752012.12.21MTCC 57392012.12.21MTCC 57402012.12.21MTCC 57422012.12.21MTCC 57412012.12.21MTCC 57432012.12.21MTCC 57442012.12.21MTCC 57452012.12.21MTCC 57462012.12.21MTCC 57472012.12.21MTCC 57482012.12.21MTCC 57492012.12.21MTCC 57502012.12.21MTCC 57512012.12.21MTCC 57522012.12.21MTCC 57532012.12.21MTCC 57542012.12.21MTCC 57552012.12.21MTCC 57562012.12.21MTCC 57572012.12.21MTCC 57582012.12.21MTCC 57592012.12.21
【專利說(shuō)明】突變的頭孢菌素羥化酶及其在脫乙?；^孢菌烷酸合成中 的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及具有更好的羥化活性和增加的對(duì)式（II)化合物的特異性的經(jīng)修飾/ 突變的來(lái)自棒狀鏈霉菌（Streptomyces clavuligerus)的頭孢菌素輕化酶，所述式（II)化 合物包括但不限于苯乙?；?7-氨基脫乙酰氧基頭孢菌烷酸（苯乙酰基-7-ADCA)和脫乙 酰氧基頭孢菌素 C (DAOC)。
[0002]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于產(chǎn)生式（I)的化合物的突變型羥化酶，所述突變型羥化酶具有增加的活性 和對(duì)式（II)的化合物具有更高的底物特異性，所述突變型羥化酶與野生型羥化酶相比具 有一個(gè)或多個(gè)在來(lái)自以下殘基的殘基位置上的氨基酸修飾：位置7的脯氨酸、位置40的丙 氨酸、位置51的蘇氨酸、位置53的甲硫氨酸、位置82的谷氨酸、位置91的精氨酸、位置96 的蘇氨酸、位置108的甘氨酸、位置149的異亮氨酸、位置171的纈氨酸、位置177的丙氨酸、 位置182的精氨酸、位置184的甲硫氨酸、位置193的異亮氨酸、位置195的苯丙氨酸、位置 209的谷氨酰胺、位置210的丙氨酸、位置226的纈氨酸、位置233的甲硫氨酸、位置236的 亮氨酸、位置237的丙氨酸、位置241的丙氨酸、位置249的纈氨酸、位置250的精氨酸、位 置251的絲氨酸、位置255的甘氨酸、位置258的谷氨酸、位置260的絲氨酸、位置267的苯 丙氨酸、位置280的丙氨酸、位置307的纈氨酸和位置313的天冬酰胺，
其中R代表氫、苯乙酰基、苯氧乙?；?、氨基己二?；臀於；?。
2. 權(quán)利要求1的突變型羥化酶，其與野生型羥化酶相比還具有一個(gè)或多個(gè)在來(lái)自以下 殘基的殘基位置上的氨基酸修飾：位置16的谷氨酸、位置38的酪氨酸、位置72的脯氨酸、 位置90的蘇氨酸、位置150的纈氨酸、位置186的脯氨酸、位置206的纈氨酸、位置221的 纈氨酸、位置229的甲硫氨酸、位置273的蘇氨酸、位置304的蘇氨酸和位置311的丙氨酸。
3. 權(quán)利要求1和2的突變型羥化酶及其對(duì)應(yīng)基因，其中所述野生型羥化酶及其對(duì)應(yīng)基 因從棒狀鏈霉茵（Streptomyces clavuligerus)中獲得（圖_1)。
4. 權(quán)利要求1的突變型羥化酶，其在一個(gè)或多個(gè)殘基位置上包含選自以下的氨基酸置 換： P7L, A40V, T51M, M53L, E82D, R91G, T96S, G108D, I149T, V171L, V171M, A177V, R182S, R182W, M184I, I193V, F195L, Q209E, A210V, V226I, M233I, L236V, A237V, A241V, V249I, R250L，S251F，G255D，E258K，S260G，F(xiàn)267L，A280S，V307A 和 N313D。
5. 權(quán)利要求4的突變型羥化酶，其還具有一個(gè)或多個(gè)選自以下的具體氨基酸置換： E16G, Y38C, P72L, T90A, T90G, T90D, V150A, P186L, V206I, V221A, V221P, V221H, V221T, M229V，M229I，T273A，T304A，A311M 和 A311V。
6. 權(quán)利要求1的突變型羥化酶，其包含以下氨基酸置換： i) P72L, T90A, V206I, A210V, A311V ii) P7L, P72L, T90A, A237V, A311V iii) T51M, P72L, T90A, A311V iv) A40V, P72L, T90A, A311V v) P72L, T90A, A237V, A311V

8. 含有權(quán)利要求1、6和7的羥化酶基因的載體。
9. 具有權(quán)利要求8的重組載體且能夠表達(dá)所述基因的微生物。
10. -種在權(quán)利要求9描述的生物體中表達(dá)所述酶的方法。
11. 權(quán)利要求10所述的表達(dá)的酶用于合成頭孢茵素的用途。
12. 與權(quán)利要求3具有顯著序列同一'丨生的酶，其中權(quán)利要求1的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置 在所述第二種酶的類似位置上被修飾。
13. -種生成任何a-酮戊二酸依賴的頭孢茵素羥化酶的發(fā)酵條件，其中誘導(dǎo)前溫度 保持在25°C或更低，誘導(dǎo)后12-20小時(shí)收集細(xì)胞以及誘導(dǎo)OD6tltol在120-180范圍內(nèi)；優(yōu)選 120-150。
14. 一種制備任何如權(quán)利要求1或6所述的a -酮戊二酸依賴的頭孢茵素羥化酶的方 法，其中通過(guò)通過(guò)使用具有二乙氨乙基官能團(tuán)的基質(zhì)或通過(guò)通過(guò)加入PEI以沉淀所述蛋白 或通過(guò)使用硫酸銨進(jìn)行分級(jí)分離或通過(guò)所述方法的結(jié)合從細(xì)胞裂解物中部分純化所述酶。
15. -種制備式（I)的化合物的方法，所述方法包括在水性介質(zhì)中使式（II)的化合物 與權(quán)利要求1或權(quán)利要求6所要求保護(hù)的酶反應(yīng)。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述反應(yīng)是在以下條件下進(jìn)行：溫度為5-25°C的范圍，pH 保持在6-8之間，在存在a -酮戊二酸、抗壞血酸和硫酸亞鐵的情況下。
17. 基本上如本文中參照說(shuō)明書所描述的突變型羥化酶。
【文檔編號(hào)】C12N9/02GK104364376SQ201380013446
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2013年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月10日
【發(fā)明者】M·杜瑞拉加, R·提拉姆斯, K·C·米斯拉, T·施南薩姆比, C·M·克里什納, P·拉甲瑟卡蘭, S·薩布拉瑪尼, K·D·塞爾瓦杰, N·巴拉克里什南, S·拉維庫(kù)瑪查克拉瓦西, A·南楚加曼德亞加根 申請(qǐng)人:幽蘭化學(xué)醫(yī)藥有限公司