具有葉中較低硝酸鹽含量的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及可以用于制備轉(zhuǎn)基因植物的遺傳構(gòu)建體。構(gòu)建體可以具有降低植物特別是植物的葉中硝酸鹽濃度的能力，和誘導(dǎo)衰老樣表型的能力。本發(fā)明擴(kuò)展至用這種構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物本身。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法和涉及在植物中降低硝酸鹽含量的方法。本發(fā)明還涉及已用遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的收獲的植物葉(例如煙草葉)和涉及包含這種收獲的植物葉的多種煙草制品(諸如吸煙制品)。
【專利說明】具有葉中較低硝酸鹽含量的轉(zhuǎn)基因植物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及可以用于制備轉(zhuǎn)基因植物的遺傳構(gòu)建體。構(gòu)建體可以具有降低植物特 別是植物的葉中硝酸鹽濃度的能力。本發(fā)明擴(kuò)展至用此類構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因 植物本身。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法和在植物中降低硝酸鹽含量的方法。本發(fā) 明還提供用于改變植物氨基酸概況的方法。本發(fā)明還涉及已用遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的收獲的植 物葉（例如煙草葉）和包含此類收獲的植物葉的各種煙草制品（諸如吸煙制品）。
[0002] 背景 氮同化對于植物生長具有根本重要性。在植物所需的所有礦物質(zhì)營養(yǎng)物中，氮是最大 豐度需要的。在田間植物攝取的氮的主要形式是硝酸鹽和氨，其是氮肥的主要組分。根據(jù) 可用性，植物從土壤中攝取硝酸鹽或銨離子。硝酸鹽在充分氧化的非酸性土壤中會更豐富， 而銨會在酸性或積水土壤中占優(yōu)勢。對煙草生長參數(shù)的實(shí)驗清楚地表明，相對生長速率、葉 綠素含量、葉面積和根面積響應(yīng)于漸增的硝酸鹽供應(yīng)而急劇增加。
[0003] 植物已經(jīng)發(fā)展了高效氮攝取系統(tǒng)以處理耕種土壤的硝酸鹽含量的巨大變化。植物 根通過特定硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NTR)的作用攝取硝酸鹽和氨，所述硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NTR)被 分為兩個基因家族，NRT1基因家族和NRT2基因家族。兩個基因家族共存于植物中，并且它 們被認(rèn)為協(xié)作作用，以便從土壤中攝取硝酸鹽，以協(xié)助將其分布到整個植物中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞。 然而，一旦在細(xì)胞內(nèi)，關(guān)于用于將硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)至不同的細(xì)胞區(qū)室的機(jī)制知之甚少。
[0004] 進(jìn)入細(xì)胞后，據(jù)信，硝酸鹽在液泡中積累，導(dǎo)致高達(dá)50 mM的濃度，這比細(xì)胞質(zhì)內(nèi) 發(fā)現(xiàn)的硝酸鹽濃度高25倍。液泡硝酸鹽有助于維持胞質(zhì)硝酸鹽的穩(wěn)態(tài)。AtCLC-a(陰離 子/質(zhì)子交換蛋白），其屬于擬南芥CLC蛋白家族，已經(jīng)顯示其在液泡硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作 用。AtCLC-a是已知的硝酸鹽-質(zhì)子交換蛋白，并且負(fù)責(zé)將硝酸鹽裝填至液泡中。擬南芥中 AtCLC-a的敲除導(dǎo)致其硝酸鹽積累能力相比于野生型植物降低50%。這表明存在也可以負(fù) 責(zé)將硝酸鹽裝填至植物液泡中的額外基因。
[0005] 已經(jīng)在擬南芥中鑒定了七種CLC蛋白家族的同源物，并且它們被稱為AtCLC-a至 AtCLC-g?；谛蛄型恍?，AtCLC-a、-b、-c、-d和-g各自定義與哺乳動物CLCs的亞家族 具有最高同源性的單獨(dú)的系統(tǒng)發(fā)生分支。AtCLCs在植物中廣泛表達(dá)。然而，這些蛋白的功 能作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有被理解。
[0006] 除了 AtCLC-a以外，據(jù)信AtCLC-c是植物中硝酸鹽積累途徑的主要組分。擬南芥 植物的枝芽，其含有AtCLC-c的轉(zhuǎn)座子插入，具有相比于野生型植物的根部較低的硝酸鹽 濃度。然而，不像AtCLC-a突變體，AtCLC-c突變體的根部也具有相比于野生型植物改變的 氯化物濃度，這表明AtCLC-c表現(xiàn)出比AtCLC-a更低的陰離子特異性。此外，AtCLC-d，其在 植物細(xì)胞的反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)中表達(dá)，并且與V型ATP酶共定位，據(jù)信在植物根部的發(fā)育中 發(fā)揮作用。以下發(fā)現(xiàn)支持這一點(diǎn)：擬南芥植物中的無功能的AtCIC-d突變體的T-DNA插入 損害根部生長，對氯離子含量、硝酸鹽含量或細(xì)胞形態(tài)具有很少或沒有影響。
[0007] -旦在細(xì)胞中，硝酸鹽在細(xì)胞溶膠中被胞質(zhì)酶硝酸鹽還原酶（NR)還原為亞硝酸 鹽。然后新形成的亞硝酸鹽被轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體中，并被亞硝酸還原酶（NiR)迅速還原為銨。 然后銨進(jìn)入谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶循環(huán)（GS/GOGAT)，在那里它被并入氨基酸庫中。 亞硝酸鹽從細(xì)胞溶膠轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體中的機(jī)制是未知的。已經(jīng)假設(shè)，被動擴(kuò)散可能負(fù)責(zé)其 進(jìn)入葉綠體中，并且這可以部分地由于在葉綠體的表面上表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的存在，諸如： (i) CsNitrl (黃瓜（Cucumis sativus)亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）-已經(jīng)在黃瓜葉綠體外被 的內(nèi)膜上鑒定的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；（ii) Atlg68570 - CsNitrl的直向同源物。擬南芥中 Atlg68570多肽的非功能形式的過表達(dá)引起轉(zhuǎn)基因植物中相比于野生型植物中亞硝酸鹽的 過度積累；和（iii) AtCLC-e -葉綠體內(nèi)類囊體膜的表面上表達(dá)的擬南芥CLC蛋白家族成 員。從擬南芥植物敲除導(dǎo)致相比于野生型植物細(xì)胞的硝酸鹽積累的降低和轉(zhuǎn)基因擬 南芥植物內(nèi)亞硝酸鹽積累的增加。
[0008] 然而，擬南芥的細(xì)胞溶膠內(nèi)亞硝酸鹽的相對低濃度使得被動擴(kuò)散不太可能是負(fù)責(zé) 亞硝酸鹽進(jìn)入葉綠體的機(jī)制。此外，難以得出是否AtCLC-e實(shí)際上在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)硝酸鹽流 量中發(fā)揮作用的結(jié)論，因為從擬南芥敲除AtCLC-e也影響還牽涉細(xì)胞內(nèi)硝酸鹽水平的調(diào)節(jié) 的幾個其它基因的表達(dá)。
[0009] 硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、和硝酸鹽和亞硝酸鹽還原酶的活性調(diào)節(jié)在整個植物中控制主要 氮同化中是關(guān)鍵的，且對于植物的生長和發(fā)育具有顯著影響。當(dāng)具有較少同化儲存的硝酸 鹽的光合能力時，或作為土壤中高硝酸鹽水平的結(jié)果，高水平的硝酸鹽在低溫和/或太陽 輻射（例如，在冬季期間的溫室作物中）期間積累。硝酸鹽水平的增加可以具有許多有害 后果，不僅在植物生長的方面，而且在消耗植物的人或動物健康以及環(huán)境后果的方面。硝酸 鹽積累的許多不利后果通過產(chǎn)生亞硝酸鹽所介導(dǎo)。
[0010] 因此，為了防止過度硝酸鹽積累，一種策略可以是降低植物中的硝酸鹽儲存。這 可以通過改變植物液泡內(nèi)硝酸鹽儲存來進(jìn)行，并且在煙草工業(yè)是有用的。如圖1所示，眾 所周知煙草葉中殘留的氮有助于形成亞硝胺。具體而言，硝酸鹽和亞硝酸鹽在烤葉（cured leaf)中充當(dāng)煙草特異性亞硝胺（TSNA)形成的前體。
[0011] 在煙草工業(yè)中，煙草葉的處理涉及去除被認(rèn)為充當(dāng)硝酸鹽儲存器官的烤葉的葉柄 和中脈，其缺乏味道且TSNA較高。
[0012] 此外，亞硝胺在胃中的形成是由于內(nèi)源性亞硝化作用?？谇患?xì)菌將食物和飲料中 消耗的硝酸鹽化學(xué)還原為亞硝酸鹽，所述亞硝酸鹽在胃的酸性環(huán)境中可以形成亞硝基化 齊[J。這些與胺反應(yīng)產(chǎn)生亞硝胺，且引起DNA鏈斷裂或DNA的交聯(lián)。與過量的硝酸鹽有關(guān)的 另一個問題是高鐵血紅蛋白的形成，其產(chǎn)生藍(lán)嬰綜合征（blue baby syndrome),其中血紅 蛋白的攜氧能力被亞硝酸鹽所阻斷，在嬰兒中引起化學(xué)窒息。
[0013] 作為這些健康問題的后果，根據(jù)收獲的時間，許多監(jiān)管機(jī)構(gòu)已對于綠葉蔬菜諸如 菠菜和萵苣中允許的硝酸鹽的量設(shè)置了限制（例如歐洲委員會法規(guī)653/2003)。這些限制 已經(jīng)導(dǎo)致任何具有高硝酸鹽含量的產(chǎn)品不能出售。因此，已經(jīng)存在通過管理含氮化肥的或 改進(jìn)的種植業(yè)系統(tǒng)的應(yīng)用而進(jìn)行降低植物的硝酸鹽含量的努力。一些機(jī)構(gòu)也已經(jīng)對于飲用 水中硝酸鹽的量設(shè)置了限制。
[0014] 因此，存在對于用于減輕植物中與硝酸鹽積累有關(guān)的不利影響的方法的需要?？?慮到這一點(diǎn)，本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一系列遺傳構(gòu)建體，其可用于轉(zhuǎn)基因植物的制備中，所述 轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出令人驚訝的降低的硝酸鹽濃度。
[0015] 發(fā)明概述 因此，根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了遺傳構(gòu)建體，其包含與編碼作為具有硝酸鹽轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白活性的陰離子/質(zhì)子交換蛋白的多肽的編碼序列可操作連接的啟動子，條件是該啟 動子不是花椰菜花葉病毒35S啟動子。
[0016] 如實(shí)施例中所述，本發(fā)明人已經(jīng)研究了植物中氮的再動員（remobilization)，目 的在于開發(fā)表現(xiàn)出（特別在葉中）硝酸鹽濃度降低的植物。本發(fā)明人制備了許多遺傳構(gòu)建 體（參見圖2)，其中將編碼具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的陰離子/質(zhì)子交換蛋白蛋白的基因 置于啟動子的控制下，所述啟動子不是CAMV 35S啟動子。然而，啟動子可以是組成型啟動 子或組織特異性啟動子。
[0017] 在一個實(shí)施方案中，構(gòu)建體中的編碼序列可以編碼擬南芥陰離子/質(zhì)子交換蛋白 CLC-b。編碼擬南芥CLC-b陰離子/質(zhì)子交換蛋白的一個實(shí)施方案的cDNA序列在本文中作 為SEQ ID No. 1提供，如下： . 1 .?Η _ . .. Α-.Η-Μ-'.- 1.'-- . . ; ι' ; . -Η > . /' ιΗ.?-：' : .Η' :Λ. .' i i .* ".V AΑ:A ...w ... , -- ,-- λ % " -% ^ -- ----. -- % - %· - -,-'?·% Pt ^ ^ . ^ / -- ￠-- " ^ -v .-V - -- e \ ft .. . , , 5 r- · h- - , · . . . I.n . r4. . - ' . ......r?.. -. i ^?ΑΓκ'-.ΑΑΑΑΓ?Λ . \' A.AA· ?. ： '. A·"' ^ J' ?A . A·.' i ^ ^. . "!AAA J- 'i r!. ' 1'. ' . ^ ?： W , - ... ^ γ?Λ . ι'." , /'.f . J V\ Λ ,.,:…AAA ,·ν - A A-i -v - . ., , 1 -. v -? , -, .. -. % .. e-\ i --. 紅： % - ^ - - y - - -. - ^ . . .* . d ...- -:·........,-- ' --, , , Η. , · i κγ, , h, ,· i , . ,-i' -, - - - ' . · - . AA .....二：....：：A - ： : - ：r： / ^ .".xlArK . !,? .v： *ΛΛ.Α-'?'：' , , Λ . Ai /A- *r, Jf-J,' .Γ： A: */-. />·.- v' .'ij· . i'r，, Λ' ' ,',n .i PA A -.''：1?' 'Λ :-="hh.A5- r- ' ： A ；Ai :/-. . f：-'- A -："A A;.':. ：'"ArV.' ?Γ'：·；' - '.：^Λ ...........,...1 . : ,......ι ..? .... , ' " i. ......I ,:i. 1:, ..1.. Ill :i, , ' .1 , '1 '1 _ .1: _ _ "" ：, .,.. .1. , ?, , ... :,, ............... ,., 1 ' 1 , ................ _ . _ 11 , . .1: 1:, , .. , . : ,"" 'i , - j- .：. .1... j · w-. !'， ?. . r., . . ·- ;,i ? j4,'- .. ,; -, h.'.V : - . , -.. r%.-.氣... ι - i... . . m~\\λ - . , ^ '"?-""：3Λ·',? J Γ-·? SS">'-y"r1''7A'1 . ：'" Γ："?-/'?*ν 1'·."：-1'：\(' 1'?" '； V：1 Γλπ?ΑΑ·'~ Γ Γ 1 - 1 ~ e ι- - ii ι · S? ι*?ι1 ! · . . i 產(chǎn)1l . .. .i a .. . i -. ?i ....i. - . t * *- . fi * . ..11 ! - ι I .. -i. 47 ~ fi 6*^.' ： ' ' l? "? ..... ι:. , .? ....... .: :ι: , "ι ........ , ...... ι . ·?Ι 1.. . ... . ...... ι:. ? 11 1 , "? 1 ,'"l 1 ...... 1 "? , ::. ?. ?： 1 ： ,"? ,? ... . ? 1 ：, i. , 1 ι： I, ,..... ....... 1 , 1 1 ? j . - η ? Λ - .y：·".- -, . - '.t1. Λ-h·,- ^ . ?% > ?'..,-,-"n o - . .r.! .r- . ^r - ? - ' ,!'. - ^ λ . I ? ? - . \.:.Λ ? -. ' l-h'"· v'·-'/', .'S'-f'r-' S ,'j\ fV" Ρ"Λ--"! "Λ ,； --Λ-.' ' r'- ^?tW /' ,'s^h i'-1 / ? f S ?e i*% .... a i' i e - - t - . - *- * - - - t"t -1°% . · - *- ...... i .. - a^*- l? . - . t.. -R*. .. i * a - * - . l - * * l? -Ih-h'.·'· .''-J. f'J'j... ' ?. Aft:./·.· - . .▲... A.": _ ·' A...、A . ·.'. _ wV.'A _.…A ~ v , B , /"?' -"s-' " -:v-'-S'· /ft/- 丨' i....- n η'A'., rv.i - - * ** - - - ··· - - h^'A' '- h'.. - m m - - :A, -f - . . 〇 .....rV ?-u. . . V r ·： --. . ..--... λ ^ ^ λ·-.· ^ ^ ^ -. ^ ''.? . .'·.· '.-.k ..'It.. -Ai'. A .'f-.C '... li . [Λ___ -..^ - 1 ^ '/-. .Vs ^ - ~h ^ '-y'-' r.1 ."Λ .- : '.-. ： h., λ ... .·'.>-τ ^ 'Λ-,? ?·- ., -.η·-.-i'-i'-, .-.- , - .-. v .-. ι"% , - .- ' .： .·： ·-. ' ' -· ·- .-. r,-.----. .-' ?''5-. -η r. \i' -. .-.,' ·-" '.Λ.*?4 . . ..' ..ι _ A\. _ 氣..:π _ π . -.. A?-i.?!：, it if,'-. ·.- _ ._ *'i. AsY- -** / .,h ^ / -.. -Λ '-A / /ν'-.'^'-.-ΛΛΛΛ'Γ,' ,.·1 J' .·/?, ： Vv.. - * //ΛΛ; ?h., l·,. .."A- Λ'-? ^ -"Λ.. 'i'...-. ?-'? _ A^*.：； ：；* ： -；- / _ ,v-：: - - A*- ；ΑΛ ；；：; ?ΛΛ ：； _ * ：>：,Α _ - ：-Α?：.*..：ΑΛ：；'*'* - -: Vi*：'·："-； _ -·*：； -； A : 二Λ : l:. __ ...j」Λ --1 .?ΑΛ '.Ait ?*< ?Λ*' -1-'.ΓΑ .?Λ ,'·-'Λ ? . J·- ?，,?κ ?Α ΛΛ·-.!:. ? ! ΑΑ· ! J Α-.~κ! / -'ΑΑ1 ? .?·-.? '? '. i-j/VV- ；^-Γ ；：： " " ?Α . ：^；Α . ΑκΑ*：?. *?ΑΛΑΛΛμΛ *"*Α ,. V *Λ>.**,Γν .iA* /·..* A.-J .*<.*·.*·, * "Α8.?·*ν ',. .. .'>.τ·,? _''.?ΑΑΑ·-iA.!ΛΑ'.'A·-.'AAl' _ · .>:?_-ν."·.'·..I'·-.' . 'JΑΛΑ_ ：._"?.] .'/* _ ：JA -- " ** - - - ' - ..1. . ρ·. ... .1-"- ........-.*% Ρ . - - - Ρ -.6.------ >- - ->- ...... - - . · . ·-. i-'J. \ .：-* ,Η .Η'.. ,Η'. ·.. . , ?-. !- - . - ' ,'-,.'ν a/-',·..：-4,' ..· . ' >' . . , ;4.. ...... = I1 Γ r . ' ? - ：-- '.***, , 1 Ι:- ·Λ . ... · Γ- - : .. Λ?·,---*： - - ' f-u.A ··- . ' Λ' ' 1^,-Λ -. CCI^GiGGrAGGGATC* IJU^CCACiACAG-GA-CC*AAGGGCAr.^CAACAi.i rCTAAGCCΓΓiCC 1CrCi" Γ .1 /-, A A AP, . ： 'p.' ? r*. A '.?-·].? ,?；'A.h A Λ CA Cf-. . . .'.Λ
[SEQ ID No.ij
[0018] 擬南芥CLC-b陰離子/質(zhì)子交換蛋白的多肽序列在本文中作為SEQ ID No. 2提供， 如下： r'γ? ; ],!?·〇 ^ ：：：：；!i3r； VΝΓ-- 7.7Γ：Γ'Κ ；ν"Γ： ； ,：?〇?ν； ；νΚΛ；i Η'： ；.5： 3'L/?I,：/CΛΚ^/?; Η ： ΚF： i,i' ?r1 ； ；S Κ--Γ?^ΚΗΓ^,^ΚΚ^5Κ；;Γ；ν!,α? /γ ；,^：：；；ν - ；.Κ, ^： ：?； Λ ； ；.. ： ；V： ：Kl,i. AVrHr l, ? VI",：UML·,·：：/·,!iu：： L/；L'/Λ? /^：：； r Ai:\ ：： . rx： _ ΚΛ: L： iC ,； 1：·；?1?：?· CA： ?*：^ ..,· K ./::. 2. - :::Δ ,.. ΛΛ1 ^ ：：：：：2/·Λ：：ν"Λ：^ KSi-*V^?\ VLtr 17Λ.?；,<νΚ；：；Λ；^：.·ΛΚΛ ? .? Λ ；r7V；_ki：：t ^ fc： .CM：：；；"'K"： C L K:+ KL Mi· L. ,* 5 h V. -. Y _ ? h .... - L - - F ^ ^ i 1Κ V L L S L I" \' S L t ：' S V ：：： L ? C L ? ^AKC K L: C1 ?5 C ^ L i￡ ^ C i' ： ；! C K S C ： ? ?· Κζ>1· J J ：： i *K C : ? JILL h 7i.i.i；：VHPiiA7K!ii^ ：i：-.ti7i:tJh!· VH;：S：.W.!· r v：,Y\； , ：/：：：：,i· ；> ；： , n：l5$r；Lr i,I:； ； ?*νΛη 〇 v^7h!4L,Cfu^H：：Sv VS i/：/iV"：；AAA;i?CSE4bEC VK;,：；￥, J- /；K. ° ,/>?： v -/a；?；? firs , Yl ^, , i,HJ,K：：：： /-,? i:fc [::vvKR：l , v ：：)； ；,：：： , i，·：：*；； V p：K /S;'i ^ '/Γ 7 i, Κ ? j., · V Η ? i /士 P V i ?: Κ Λ l·· /. V- : ,Λ.,.…Λ：；Κ；,Η^；^ l.RAH ：, V}v/；.KKHW r 7KKKK： ΚΚλΚ /KtKi L L;v7i_ _ 3Λ?ΗΚΗ? /L III·。./Li* Κ?· /C Lr·,!·.L.b..V1S...：3：：Π ：；：?r/. L. Κ?L -：h/;?：^ζ：·Λt r^1KSΚλ：：：：K . t?v fSEQ ID No.al
[0019] 上述序列中的*是指序列的3'末端的終止密碼子，并且對于表達(dá)的終止是需要 的。多肽可以包含如SEQ ID No. 2所述的氨基酸序列，或其功能變體或片段或直向同源物。 因此，編碼作為具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的陰離子/質(zhì)子交換蛋白的多肽的編碼序列，可 以包含基本上如SEQ ID No. 1所述的核酸序列，或其功能變體或片段或直向同源物。
[0020] 啟動子可以能夠誘導(dǎo)RNA聚合酶與編碼具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的多肽的編碼 序列的結(jié)合且開始使其轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的構(gòu)建體中的啟動子可以是組成型的、非組成型的、組 織特異性的、發(fā)育調(diào)節(jié)型或誘導(dǎo)型/阻遏型的啟動子。
[0021] 組成型啟動子在植物發(fā)育期間持續(xù)地指導(dǎo)基因在整個植物的各個部分的表達(dá)，盡 管基因可能在所有細(xì)胞類型中無法以相同的水平表達(dá)。已知組成型啟動子的實(shí)例包括與 水稻肌動蛋白1基因（Zhang等人，1991，Plant Cell, 3，1155-65)和玉米泛素1基因 (Cornejo 等人，1993，Plant Molec. Biol·, 23，567-581)相關(guān)的那些。在本發(fā)明中特別 優(yōu)選組成型啟動子，諸如香石竹蝕環(huán)病毒（Carnation Etched Ring Virus, CERV)啟動子 (Hull 等人，1986，EMB0J·，5，3083-3090)。
[0022] 組織特異性啟動子是指導(dǎo)基因在植物的一個（或幾個）部分中表達(dá)，通常在那些 植物部分的整個生命期間的表達(dá)的啟動子。組織特異性啟動子的類別通常還包括其特異性 不是絕對的啟動子，即，它們也可以在除優(yōu)選的組織以外的組織中指導(dǎo)以較低水平的表達(dá)。 本領(lǐng)域已知的組織特異性啟動子的實(shí)例包括與馬鈴薯塊莖中表達(dá)的馬鈴薯塊莖儲藏蛋白 (patatin)基因和小麥、大麥或玉米胚乳中表達(dá)的高分子量麥谷蛋白基因相關(guān)的啟動子。
[0023] 發(fā)育調(diào)節(jié)型的啟動子指導(dǎo)在植物發(fā)育期間的特定的時間，例如在衰老期間，植物 的一個或多個部分中基因表達(dá)的變化。該基因在其它時間在該植物部分中可以以不同（通 常較低）水平表達(dá)，且也可以在其它植物部分中表達(dá)。
[0024] 誘導(dǎo)型啟動子能夠響應(yīng)于誘導(dǎo)物而指導(dǎo)基因表達(dá)。在誘導(dǎo)物不存在的情況下，基 因?qū)⒉槐磉_(dá)。誘導(dǎo)物可以對啟動子序列直接作用，或者可以通過抵消阻遏分子的效果而起 作用。誘導(dǎo)物可以是化學(xué)試劑，諸如代謝物、蛋白、生長調(diào)節(jié)劑、或有毒元素、生理脅迫諸如 熱、損傷、或滲透壓、或病原體或害蟲作用的間接后果。發(fā)育調(diào)節(jié)型的啟動子可以描述為對 由植物產(chǎn)生的內(nèi)源性誘導(dǎo)物或?qū)υ谥参锏纳芷谥械奶囟c(diǎn)的環(huán)境刺激響應(yīng)的特定類 型的誘導(dǎo)型啟動子。已知的誘導(dǎo)型啟動子的實(shí)例包括損傷響應(yīng)、溫度響應(yīng)、和化學(xué)誘導(dǎo)相關(guān) 的啟動子。
[0025] 啟動子可以從不同來源包括動物、植物、真菌、細(xì)菌和病毒而獲得，且不同啟動子 可以在不同組織中以不同效率起作用。也可以合成地構(gòu)建啟動子。因此，合適的啟動子的 實(shí)例包括香石竹蝕環(huán)病毒（CERV)啟動子、豌豆質(zhì)體藍(lán)素啟動子、核酮糖二磷酸羧化酶-加 氧酶（rubisco)啟動子、胭脂氨酸合成酶啟動子、葉綠素 a/b結(jié)合啟動子、高分子量麥谷蛋 白啟動子、α，β-麥醇溶蛋白啟動子、大麥醇溶蛋白啟動子、馬鈴薯塊莖儲藏蛋白啟動子、 或衰老特異性啟動子。例如，合適的衰老特異性啟動子可以是源自衰老相關(guān)基因（SAG)的 啟動子，且可以選自 SAG12、SAG13、SAG101、SAG21 和 SAG18。
[0026] 優(yōu)選地，啟動子是CERV啟動子，如圖2中所述的構(gòu)建體中所示。香石竹蝕環(huán)病毒 (CERV)啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的（Hull等人，EMB0J.，5，3083-3090)。編碼CERV 啟動子的DNA序列長度為232bp，且在本文中被稱為如下SEQ ID No. 3 : ' . ...... ' . . .... " I 1" . .... ' ........ |"· .. .... . .1. ........ .. .... . ......... ...... |\, . ...... ,.. . I'.,. ..... ......" ' .Λ. ? ' .V ... ., ' ,.. ... , 1.. ,..,.....1... ,'M ...... ,.. ..... , ,? .... .... .... ,..., ,.. .1.. ,....., .1.. ,.. ,.. .1.. ........... , ,.. .,., ,? .1.. , I. I. II. L .1.:1 II. I I .:. ' .Ill I： .1 ：i： ,, ... '...........' ：i ?ι ：? ?：? ?： ?ι ii ,,, ... I. ' ' ,：i ? Γ, ii . ' ：i ：r T , 1' 1 I i' 1 I I................I............. I.......................... ?..........：............ I..................... ：" "I ........................ I .....廣…..-n..二…..以".以.……......η- 〇 1.. . . .. I ........, I. I. .. . . .11 .. . .. ...II,. .11 I'. Ml, M. I I I 1.1 . .11. ,.. i ,........ \ .r. f, , ./ '..fi --. J ^ . ---- . , . .SUt.AU. . J Hi. . i k ￡1-. .... iSEQ !D N0.3J
[0027] 因此，本發(fā)明構(gòu)建體中的啟動子可包含基本上如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列 或其功能變體或功能片段。CERV啟動子可以從花椰菜花葉病毒屬（Cauliovirus)或顯示花 椰菜花葉病毒（cauliovirus)跡象的植物物種諸如香石竹(即 康乃馨）獲得。在啟動子是CERV啟動子的實(shí)施方案中，應(yīng)理解的是，啟動子可包含SEQ ID N〇:3的堿基1-232中的每一個。然而，啟動子的功能變體或功能片段也可用于本發(fā)明的遺 傳構(gòu)建體。
[0028] "啟動子的功能變體或功能片段"可以是啟動子的衍生物或部分，其在功能上足以 起始與之可操作連接的任何編碼區(qū)的表達(dá)。例如，在啟動子是以CERV啟動子為基礎(chǔ)的實(shí)施 方案中，技術(shù)人員應(yīng)理解的是可對SEQ ID No:3進(jìn)行修飾，或者可能只需要CERV啟動子的 部分，使得其仍將起始構(gòu)建體中的基因表達(dá)。
[0029] 可通過評價轉(zhuǎn)錄酶是否與推定的啟動子區(qū)域結(jié)合，并然后引起編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄成具有 硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的多肽，來容易地鑒定啟動子的功能變體和功能片段。或者，可通過在 與編碼區(qū)結(jié)合時對啟動子進(jìn)行誘變，并評價基因表達(dá)是否可以發(fā)生，來檢測此類功能變體 和片段。
[0030] 編碼作為具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的陰離子/質(zhì)子交換蛋白的多肽的編碼序列 可以源自任何合適的來源，諸如植物。編碼序列可以源自合適的植物來源，例如源自擬南芥 屬物種 5/7/7.)、稻屬物種（ftTZa 5/7/7.)、楊屬物種 5/7/7.)或煙草屬 物種 〇Vicoiia/?a 沙/?·)。編碼序列可以源自擬南芥 稻 saiira)、歐洲山楊或煙草〇Vicoiia/?a iaAaca?)?？梢岳斫?，直向同源 物是不同物種中通過物種形成從共同的祖先基因進(jìn)化且保留相同功能的基因或蛋白。
[0031] 本發(fā)明人已經(jīng)生成了其中CERV啟動子已經(jīng)用于驅(qū)動擬南芥陰離子/質(zhì)子交換蛋 白蛋白CLC-b的表達(dá)的構(gòu)建體。
[0032] 在用本發(fā)明的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物中，與（優(yōu)選在相同條件下生長的）野生型植物 (即其還沒有用本發(fā)明的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化）中的硝酸鹽濃度相比，構(gòu)建體可以能夠使硝酸鹽濃 度降低至少 5%、10%、15%、18%、20%、32%、35%、38%、40%、50%、60% 或 63%。
[0033] 在用構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物中，與（優(yōu)選在相同條件下生長的）野生型植物中的NNK 濃度相比，構(gòu)建體可以能夠使4-(甲基亞硝氨基）-1-(3-吡啶基）-1-丁酮（NNK)濃度降低 至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、61%、62%、65%、69%、71% 或 75%。
[0034] 在用構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物中，與（優(yōu)選在相同條件下生長的）野生型植物中的NNN 濃度相比，構(gòu)建體可以能夠使N-亞硝基降煙堿（NNN)濃度降低至少10%、20%、30%、40%、50%、 60%、70%、71%、75%、78%、80%、82%、84%、85%、88%、90% 或 94%。
[0035] 在用構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物中，與（優(yōu)選在相同條件下生長的）野生型植物中的NAT 濃度相比，構(gòu)建體可以能夠使N-亞硝基新煙堿（NAT)濃度降低至少5%、6%、10%、20%、23%、 24%、30%、40%、46%、45%、48%、50%、60%、70%、80% 或 85%。
[0036] 在用構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物中，與（優(yōu)選在相同條件下生長的）野生型植物中的總 TSNA濃度相比，構(gòu)建體可以能夠使總煙草特異性亞硝胺（TSNA)的濃度降低至少10%、20%、 30%、40%、50%、56%、60%、64%、65%、70% 或 75%。
[0037] 優(yōu)選地，在（優(yōu)選在相同條件下生長的）來自TO、T1和/或T2植物群體的植物的 葉或莖中，構(gòu)建體可以能夠降低選自包括硝酸鹽、NNK、NNN、NAT和總TSNA的化合物的任何 化合物的濃度。
[0038] 在位于植物上的下部、中部或上部位置的葉中，構(gòu)建體可以能夠降低任何這些化 合物（即硝酸鹽，參與氮同化的氨基酸，總TSNA、NNN、NAT或NNK)的濃度。"下部位置"可 以意味著植物的下部的三分之一（例如，從植物基部的第4或第5片葉），"上部位置"可以 意味著植物的上部的三分之一（例如，從植物基部的第14或第15片葉），且"中部位置"可 以意味著植物的下部和上部位置之間的中間三分之一（例如，從植物基部的第10或第11 片葉）。在采樣時，葉的總數(shù)為約20。
[0039] 本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體可呈表達(dá)盒的形式，其可以適合用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼 陰離子/質(zhì)子交換蛋白的編碼序列。本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體其無需整合到載體中便可導(dǎo)入宿 主細(xì)胞。例如，可將可以是核酸分子的遺傳構(gòu)建體并入脂質(zhì)體或病毒顆粒內(nèi)?；蛘撸赏ㄟ^ 合適的方法（例如直接胞吞攝?。⒓兓暮怂岱肿樱ɡ绮缓M蛋白的DNA或裸DNA) 直接插入宿主細(xì)胞中?？赏ㄟ^轉(zhuǎn)染、感染、顯微注射、細(xì)胞融合、原生質(zhì)體融合或彈道轟擊 (ballistic bombardment),將遺傳構(gòu)建體直接導(dǎo)入宿主受試者（例如植物）的細(xì)胞?；蛘?， 可使用粒子槍將本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞中?；蛘?，可將遺傳構(gòu)建體包含在 用于在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組載體內(nèi)。
[0040] 因此，在第二個方面，提供包含根據(jù)第一個方面的遺傳構(gòu)建體的重組載體。
[0041] 重組載體可以是質(zhì)粒、粘?；蚴删w。此類重組載體高度可用于用本發(fā)明的遺傳 構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞和復(fù)制其中的表達(dá)盒。技術(shù)人員應(yīng)理解的是，本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體可 與許多類型的骨架載體組合用于表達(dá)目的。骨架載體可以是雙元載體（binary vector),例 如可在大腸桿菌（/?. coJ7)和根癌土壤桿菌兩者中復(fù)制的 載體。例如，合適的載體可以是pBIN質(zhì)粒，諸如pBIN19 (BevanM·，1984，Nucleic Acids Research 12:8711-21)。
[0042] 除了啟動子（例如CERV)以外，重組載體還可包括多種其它功能元件和編碼具有 硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的陰離子/質(zhì)子交換蛋白的編碼序列。例如，可設(shè)計重組載體，使得載 體在宿主細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中自主復(fù)制。在這種情況下，在重組載體中可能需要誘導(dǎo)或調(diào)節(jié) DNA復(fù)制的元件?；蛘撸稍O(shè)計重組載體,使得重組載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中。在這 種情況下，設(shè)想有利于靶向整合（例如通過同源重組）的DNA序列。
[0043] 重組載體還可包含編碼在克隆方法中可用作選擇標(biāo)記物的基因的DNA，即能夠選 出已被轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并且能夠選出包含整合異源DNA的載體的細(xì)胞。載體還可包含 參與調(diào)節(jié)編碼序列的表達(dá)或者用于將表達(dá)的多肽靶向宿主細(xì)胞特定部分（例如葉綠體）的 DNA。因此，第二個方面的載體可包含至少一個選自以下的其它元件：選擇標(biāo)記物基因（例 如抗生素抗性基因）；多肽終止信號；和蛋白靶向序列（例如葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽）。
[0044] 合適的標(biāo)記基因的實(shí)例包括抗生素抗性基因，諸如賦予對卡那霉素、遺傳霉 素（G418)和潮霉素八Ajy-B)抗性的基因；除草劑抗性基因，諸如賦予對草 銨膦（phosphinothricin)和基于磺胺類的除草劑抗性的基因（分別為Aar和; EP-A-242246、EP-A-0249637);以及篩選標(biāo)記物，諸如β-葡糖醛酸糖苷酶（GB2197653)、螢 光素酶和綠色熒光蛋白（GFP)。標(biāo)記物基因可受第二啟動子控制，所述第二啟動子允許在細(xì) 胞（其可在種子中或不在種子中）中表達(dá)，從而允許在植物發(fā)育的任何階段選出含有標(biāo)記 物的細(xì)胞或組織。合適的第二啟動子是土壤桿菌屬的胭脂氨酸合成酶基 因的啟動子和來源于編碼35S花椰菜花葉病毒（CaMV)轉(zhuǎn)錄物的基因的啟動子。然而，可以 采用任何其它合適的第二啟動子。
[0045] 可使用實(shí)施例中描述的克隆程序制備本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體的各個實(shí)施方案，其可 概括如下?？墒褂煤线m的引物，例如SEQ ID No's 4和5,通過PCR從cDNA模板擴(kuò)增編碼 陰離子/質(zhì)子交換蛋白的基因的cDNA形式。然后可采用瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。然 后，可將PCR產(chǎn)物連接入合適的載體（例如，以商品名Τ0Ρ0 pCR8從Invitrogen可得的載 體）用于克隆目的?？墒箶y帶PCR產(chǎn)物的載體在合適的宿主（諸如大腸桿菌）中生長。使 用合適的引物對顯示正確的限制性酶消化模式的大腸桿菌菌落和質(zhì)粒中的插入物進(jìn)行測 序。
[0046] 可培養(yǎng)攜帶pCR8-T0P0 jicki的cDNA的大腸桿菌菌落以產(chǎn)生適量的各種質(zhì)粒， 然后可對質(zhì)粒進(jìn)行純化。隨后可消化質(zhì)粒以釋放編碼基因的DNA片段，然后可將 該片段克隆至攜帶合適啟動子（例如CERV啟動子）的載體，諸如pBNP質(zhì)粒（van Engelen 等人，1995，Transgenic Research, 4:288-290)。
[0047] 獲得的構(gòu)建體，含有CERV啟動子并被命名為CRVAtCLC-b。根據(jù)第二個方 面的載體的實(shí)施方案基本上可如圖2所示。本發(fā)明人相信，他們已經(jīng)首次開發(fā)了使用轉(zhuǎn)基 因植物中外源陰離子/質(zhì)子交換蛋白基因的表達(dá)而降低植物葉中硝酸鹽濃度的方 法。
[0048] 因此，在第三個方面，提供了使試驗植物的葉中硝酸鹽濃度降低至低于在相同條 件下培養(yǎng)的野生型植物葉中對應(yīng)的硝酸鹽濃度的方法，該方法包括：_ (i) 用根據(jù)第一個方面的遺傳構(gòu)建體或根據(jù)第二個方面的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和 (ii) 從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生植物。
[0049] 在本發(fā)明的第四個方面，提供了產(chǎn)生以比在相同條件下培養(yǎng)的對應(yīng)野生型植物更 高的速率將硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)出葉的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括?α) 用根據(jù)第一個方面的遺傳構(gòu)建體或根據(jù)第二個方面的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞； 和 (ii)從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生植物。
[0050] 在第五個方面，提供了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括將編碼作為具有 硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的陰離子/質(zhì)子交換蛋白的多肽的外源基因引入未修飾的植物，其中相對 于未修飾的植物的葉中硝酸鹽的濃度，外源基因編碼的陰離子/質(zhì)子交換蛋白的表達(dá)降低 了轉(zhuǎn)基因植物的葉中的硝酸鹽濃度。
[0051] 與植物的其余部分有關(guān)的葉的位置（即，其是否被認(rèn)為是在"下部"位置、"頂部" 位置或"中間"位置內(nèi)）對于煙草種植者是重要的。葉的生理學(xué)，和因此，葉的質(zhì)量和味道 與其在植物內(nèi)的位置強(qiáng)烈相關(guān)。當(dāng)植物接近開花時，發(fā)生被稱為再動員（remobilization) 的過程，其涉及營養(yǎng)物諸如氨基酸和含氮化合物從植物的基部轉(zhuǎn)運(yùn)至植物的頂部。再動員 的營養(yǎng)物將被用作用于種子產(chǎn)生的能量源。因此，下部葉將具有與植物的上部葉相比不同 的氮含量，這通過不同的氨基酸概況說明。下部葉被稱為"源葉（source leaves)"，且頂部 葉被稱為"槽葉（sink leaves)"。中部葉是完全展開的成熟綠葉。
[0052] 關(guān)于一些植物，諸如煙草，通過去除植物的頭狀花序，可以生成葉營養(yǎng)物代謝的改 變。這些變化允許再動員的營養(yǎng)物在葉片中被使用，并導(dǎo)致葉變厚，葉總體生長和產(chǎn)生富含 氮的次生代謝物，其中許多是后來在烤葉中發(fā)現(xiàn)的味道的前體。因此，可以使用本發(fā)明的構(gòu) 建體來改變轉(zhuǎn)基因植物的味道。
[0053] 如圖3中顯示，本發(fā)明人驚奇地觀察到本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體還可以能夠相比于在 相同條件下生長的野生型植物中發(fā)現(xiàn)的對應(yīng)葉調(diào)節(jié)（即，增加和/或降低）轉(zhuǎn)基因植物的 在上部、中部或下部位置發(fā)現(xiàn)的葉中已知參與硝酸鹽代謝的某些氨基酸（例如Gin、Asn、 Asp、Glu和/或Pro)的濃度。
[0054] 因此，在第六個方面，提供了相比于在相同條件下培養(yǎng)的野生型植物的對應(yīng)葉的 氨基酸概況調(diào)節(jié)參與試驗植物的葉的氮同化的氨基酸概況的方法，該方法包括?α) 用根據(jù)第一個或第二個方面的遺傳構(gòu)建體或根據(jù)第三個方面的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì) 胞；和 (ii)從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生植物。
[0055] 在第七個方面，提供了相比于從在相同條件下培養(yǎng)的野生型植物采集的對應(yīng)的收 獲的葉的氨基酸概況調(diào)節(jié)參與從轉(zhuǎn)基因植物采集的收獲的葉的氮同化途徑的氨基酸概況 的方法，其中所述葉是從由根據(jù)第四或第五個方面的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物收獲的。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明，參與植物和它們的葉的氮同化途徑的氨基酸可以包含谷氨酰胺 (Gin)、天冬酰胺（Asn)、天冬氨酸（Asp)、谷氨酸（Glu)或脯氨酸（Pro)，所以可以調(diào)節(jié)這些 氨基酸的任何概況或任何或所有這些氨基酸。
[0057] 在用該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物中，與在相同條件下生長的野生型植物中至少一種氨基 酸的濃度相比，該構(gòu)建體可以能夠使參與氮同化途徑的至少一種氨基酸的濃度降低或增加 至少 10%、20%、30%、40%、50%、56%、60%、64%、65%、70% 或 75%。
[0058] 優(yōu)選地，該構(gòu)建體導(dǎo)致氨基酸濃度的降低。優(yōu)選地，與在相同條件下生長的野生型 植物中發(fā)現(xiàn)的對應(yīng)葉相比，該構(gòu)建體可以能夠降低轉(zhuǎn)基因植物的葉（優(yōu)選中部葉）中氨基 酸 Glu、Asp、Pro、Gin 和 / 或 Asn 的濃度。
[0059] 在第八個方面，提供了包含根據(jù)第一個方面的遺傳構(gòu)建體或根據(jù)第二個方面的載 體的轉(zhuǎn)基因植物。
[0060] 在第九個方面，提供了包含編碼作為具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的陰離子/質(zhì)子交 換蛋白的多肽的外源基因的轉(zhuǎn)基因植物，其中與未修飾的植物葉中的硝酸鹽濃度相比，轉(zhuǎn) 基因植物葉中的硝酸鹽濃度降低。
[0061] 在第十個方面，提供了編碼作為具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的陰離子/質(zhì)子交換蛋 白的多肽的外源核酸序列用于通過用所述外源核酸序列轉(zhuǎn)化植物而降低植物葉中的硝酸 鹽濃度的用途。
[0062] 術(shù)語"未修飾的植物"可以意味著在用本發(fā)明的外源基因或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化前的植物。 因此未修飾的植物可以是野生型植物。
[0063] 術(shù)語"外源基因"可以意味著被轉(zhuǎn)化至未修飾的植物中的基因來自外部來源，即來 自與被轉(zhuǎn)化的物種不同的物種。外源基因可以具有與未修飾植物中編碼陰離子/質(zhì)子交換 蛋白的內(nèi)源基因基本上相同或不同的核酸序列。外源基因可以源自編碼基因或 其直向同源物的cDNA序列。外源基因可以形成嵌合基因，其可以本身構(gòu)成根據(jù)第一個方面 的遺傳構(gòu)建體。外源基因可以編碼具有基本上如SEQ ID N〇:2所述的氨基酸序列的陰離子 /質(zhì)子交換蛋白，或其功能變體或片段或直向同源物。外源基因可以包含基本上如SEQ ID No: 1所述的核苷酸序列，或其功能變體或片段或直向同源物。
[0064] 本發(fā)明的方法和用途可以包括用根據(jù)第一個方面的遺傳構(gòu)建體、根據(jù)第二個方面 的載體或本文所述的外源基因轉(zhuǎn)化試驗植物細(xì)胞或未修飾的植物細(xì)胞。
[0065] 因此，在第十一個方面，提供了包含根據(jù)第一個方面的遺傳構(gòu)建體或者根據(jù)第二 個方面的重組載體的宿主細(xì)胞。
[0066] 細(xì)胞可以是植物細(xì)胞。細(xì)胞可采用已知技術(shù)用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體、載體或外源 基因轉(zhuǎn)化。用于將遺傳構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的合適方法可包括通過本領(lǐng)域已知方法（例如 EP-A-0116718和EP-A-0270822中所述方法），利用土壤桿菌屬所攜帶的卸甲（disarmed) Ti-質(zhì)粒載體。另一種方法可以是轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體，這涉及先除去細(xì)胞壁并導(dǎo)入核酸，然 后重新形成細(xì)胞壁。隨后可使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生長成植物。
[0067] 優(yōu)選地且有利地，本發(fā)明的方法和用途不損害生成的試驗或轉(zhuǎn)基因植物的健康或 適用性。
[0068] 本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因或試驗植物可包括十字花科（Brassicaceae family)，諸如蕓苔 屬物種spp.)。植物可以是歐洲油菜(Srassica (油菜（oilseed rape))。 轉(zhuǎn)基因或試驗植物的其它實(shí)例包括禾本科（family Poales)，諸如小麥族物種 spp.)。植物可以是小麥屬物種spp.)(小麥）。提高小麥的籽粒蛋白含量可導(dǎo) 致包含小麥的食品（諸如面包）的體積增加。
[0069] 本發(fā)明的合適轉(zhuǎn)基因或試驗植物的其它實(shí)例可以包括爺科（Solanaceae)植物， 其包括例如曼陀羅（jimson weed)、爺子、風(fēng)爺（mandrake)、顛爺（deadly nightshade)(顛 爺（belladonna))、辣椒（capsicum)(辣椒（paprika)、辣椒（chilli pepper))、馬鈴薯和 煙草。爺科的合適屬的一個實(shí)例是煙草屬煙草屬的合適種可稱為煙草植物， 簡稱煙草。
[0070] 根據(jù)本發(fā)明的合適的轉(zhuǎn)基因植物或試驗植物的進(jìn)一步實(shí)例可以包括多葉作物，諸 如菊科（Asteraceae family)的植物，例如，其包括萵苣（萵苣（Lactuca sativa))。另一 個實(shí)例可以包括藜科（Chenopodiaceae family)的植物，其包括菠菜（Spinacia oleracea) 和甜菜（Beta vulgaris),即分別為菠菜（spinach)和甜菜（chards)。
[0071] 可以如下用本發(fā)明的構(gòu)建體、載體和外源基因轉(zhuǎn)化煙草。
[0072] 采用基本上按Horsch等人（Science 227 :1229-1231,1985)所述的葉盤共培養(yǎng)方 法轉(zhuǎn)化煙草 iaAaca?)。
[0073] 可從7周齡的煙草植物采摘最幼嫩的兩片展開的葉，可在8% Domestos?中進(jìn)行表 面滅菌10分鐘，用無菌蒸餾水洗滌（3次清洗）次?？捎?號木塞鉆孔器切取葉盤，并放于 含有（根據(jù)本發(fā)明的）合適雙元載體的土壤桿菌懸浮液中持續(xù)約2分鐘。可在兩張無菌濾 紙間將盤片輕輕吸干。可將10個盤片放在MS 3%蔗糖+ 2. 2μΜ BAP + 0. 27μΜ NAA平板 上，然后可將其在生長室中培育2天。可將盤片轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充了 500 g/1頭孢噻肟和100 g/ 1卡那霉素的MS + 3%蔗糖+ 2. 2μΜ BAP + 0.27 μΜ NAA的平板中。2周后，可將盤片轉(zhuǎn)移 到上述培養(yǎng)基的新平板上。再過2周后，可將葉盤轉(zhuǎn)移到含有補(bǔ)充了 500 mg/1頭孢噻肟和 100 mg/1卡那霉素的LS + 3%蔗糖+ 0. 5μΜ BAP的平板上。每兩周可將葉盤轉(zhuǎn)移到新鮮 培養(yǎng)基中。在枝條出現(xiàn)時，可將其切下，并轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充了 500 mg/1頭孢噻肟的LS +3%蔗糖 + 0. 5μΜ BAP的廣口瓶中。大約3周后，可將廣口瓶中的枝條轉(zhuǎn)移到LS + 3%蔗糖+ 250 mg/1頭孢噻肟中。再過3-4周后，可將植物轉(zhuǎn)移到LS + 3%蔗糖（無抗生素），并生根。一 旦植物生根，便將其轉(zhuǎn)移到溫室的土壤中。
[0074] 在第十二個方面，提供可根據(jù)第六個或第九個方面的轉(zhuǎn)基因植物獲得的植物繁殖 產(chǎn)物（plant propagation product) 〇
[0075] "植物繁殖產(chǎn)物"可以是取自植物中的任何植物物質(zhì)，自其可產(chǎn)生其它植物。合適 地，植物繁殖產(chǎn)物可為種子。植物繁殖產(chǎn)物可以優(yōu)選地包含本發(fā)明的構(gòu)建體或載體或外源 基因。
[0076] 在本發(fā)明的第十三個方面，提供與采自培養(yǎng)在相同條件下的野生型植物的收獲的 葉中相應(yīng)的硝酸鹽水平相比含有較低硝酸鹽水平的收獲的葉，其中所述葉自根據(jù)第六個或 第九個方面的轉(zhuǎn)基因植物收獲，或者由根據(jù)第四個或第五個方面的方法產(chǎn)生。
[0077] 在本發(fā)明的第十四個方面，提供包含獲自突變體煙草植物的硝酸鹽降低的煙草的 煙草產(chǎn)品，所述突變體煙草植物包含第一個方面的構(gòu)建體或第二個方面的載體，所述突變 體能夠降低其葉中的硝酸鹽濃度。
[0078] 優(yōu)選的是，煙草產(chǎn)品中的煙草從其衍生的突變體煙草植物包含本發(fā)明的構(gòu)建體、 載體或外源基因。
[0079] 煙草產(chǎn)品可以是無煙煙草產(chǎn)品，諸如鼻煙。煙草產(chǎn)品可以是可通過嘴遞送的口服 煙草產(chǎn)品。煙草產(chǎn)品可以是潮濕的，且可以是濕鼻煙（snus)。然而，煙草產(chǎn)品也可以是吸煙 制品。
[0080] 因此，在第十五個方面，提供了吸煙制品，其包含獲自突變體煙草植物的硝酸鹽降 低的煙草，所述突變體煙草植物包含第一個方面的構(gòu)建體或第二個方面的載體，所述突變 體能夠降低其葉中的硝酸鹽濃度。
[0081] 硝酸鹽降低的煙草可包括其中硝酸鹽濃度小于培養(yǎng)在相同條件下的野生型植物 中的相應(yīng)濃度的煙草。此類吸煙制品可包含獲自突變體煙草植物的煙草，所述煙草植物可 以已用根據(jù)本發(fā)明第一個方面的遺傳構(gòu)建體或者根據(jù)第二個方面的載體或外源基因轉(zhuǎn)化。 優(yōu)選地，突變體煙草植物包含陰離子-質(zhì)子交換蛋白AtCLC-b (其可以包含基本上如SEQ ID No. 2所述的氨基酸序列），或其功能變體或片段或直向同源物。ATCLC-b可以包含基本上如 SEQ ID No. 1所述的核苷酸序列，或其功能變體或片段或直向同源物。
[0082] 術(shù)語"吸煙制品"可包括可點(diǎn)燃抽吸的產(chǎn)品，諸如不論是基于煙草、煙草衍生物、膨 脹煙草（expanded tobacco)、再造煙草或煙草代用品的卷煙、香煙、雪茄和小雪茄，以及加 熱無燃燒產(chǎn)品（heat-not-burn products)。
[0083] 應(yīng)理解的是，本發(fā)明擴(kuò)展至基本上包含本文提及的任何序列的氨基酸或核酸序列 (包括其功能變體或功能片段）的任何核酸或肽或其變體、衍生物或類似物。術(shù)語"基本上 氨基酸/多核苷酸/多肽序列"、"功能變體"和"功能片段"，可以是與本文提及的任一個序 列的氨基酸/多核苷酸/多肽序列有至少40%序列同一性的序列，例如與如SEQ ID No. 1標(biāo) 識的基因（其編碼陰離子/質(zhì)子交換蛋白的一個實(shí)施方案）有40%同一性，或與如SEQ ID No. 2標(biāo)識的多肽（即陰離子/質(zhì)子交換蛋白的一個實(shí)施方案）有40%同一性。
[0084] 還設(shè)想了與所提及的任何序列具有以下序列同一性的氨基酸/多核苷酸/多肽序 列：大于65%、更優(yōu)選大于70%、甚至更優(yōu)選大于75%、還更優(yōu)選大于80%的序列同一性。優(yōu) 選地，氨基酸/多核苷酸/多肽序列與所提及的任何序列有至少85%同一性，更優(yōu)選與本文 提及的任何序列有至少90%同一性、甚至更優(yōu)選至少92%同一性、甚至更優(yōu)選至少95%同一 性、甚至更優(yōu)選至少97%同一性、甚至更優(yōu)選至少98%同一性和最優(yōu)選至少99%同一性。
[0085] 技術(shù)人員應(yīng)理解如何計算2個氨基酸/多核苷酸/多肽序列之間的百分比同一 性。為了計算2個氨基酸/多核苷酸/多肽序列間的百分比同一性，首先必須準(zhǔn)備好2個 序列的比對，接著計算序列同一性值。2個序列的百分比同一性可根據(jù)以下方面采用不同的 值：（i)用于比對序列的方法，例如ClustalW、BLAST、FASTA、Smith_Waterman (在不同的程 序中執(zhí)行），或來自3D比較的結(jié)構(gòu)比對；和（ii)由比對方法所采用的參數(shù)，例如局部相對 于整體比對、所采用配對評分矩陣（例如BL0SUM62、PAM250、Gonnet等）和空位罰分，例如 功能型和常數(shù)。
[0086] 如果已完成了比對，則有許多不同的計算2個序列之間的百分比同一性的方法。 例如，一種可將同一性的數(shù)目除以：（i)最短序列的長度；（ii)比對的長度；（iii)序列的 平均長度；（iv)非空位位置的數(shù)目；或（iv)突出端以外的等同位置的數(shù)目。此外，應(yīng)理解 的是，百分比同一性還是強(qiáng)烈地長度依賴性的。因此，序列對越短，可預(yù)期越高的序列同一 性會偶然發(fā)生。
[0087] 因此，應(yīng)理解的是，蛋白質(zhì)或DNA序列的準(zhǔn)確比對是一個復(fù)雜過程。常用的多重 比對程序 ClustalW (Thompson 等人，1994，Nucleic Acids Research, 22,4673-4680; Thompson等人，1997，Nucleic Acids Research, 24,4876-4882)是用于產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白 質(zhì)或DNA的多重比對的優(yōu)選方法。ClustalW的合適參數(shù)可為如下：對于DNA比對：空位開 放罰分=15.0,空位延伸罰分=6. 66,且矩陣=同一性。對于蛋白質(zhì)比對：空位開放罰分 =10.0,空位延伸罰分=0.2,且矩陣=Gonnet。對于DNA和蛋白質(zhì)比對：ENDGAP = -1，且 GAPDIST = 4。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚，對于最佳序列比對可能需要改變這些參數(shù)和其它參 數(shù)。
[0088] 優(yōu)選地，然后由這樣的比對如（N/T)*100計算出2個氨基酸/多核苷酸/多肽序 列之間的百分比同一性計算值，其中N為其中序列具有相同殘基的位置的數(shù)目，且T為所比 較的包括空位但不包括突出端的位置總數(shù)。因此，用于計算2個序列之間的百分比同一性 的最優(yōu)選的方法包括（i)應(yīng)用ClustalW程序，采用一組合適參數(shù)（例如上文所述）準(zhǔn)備序 列比對；和（ii)將N值和T值插入下列公式：序列同一性=(N/T) *100。
[0089] 用于鑒定相似序列的替代方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。例如，基本相似的核苷酸 序列可由與SEQ ID No. 1所示序列或其互補(bǔ)序列在嚴(yán)格條件下雜交的序列編碼。所謂嚴(yán) 格條件，意指核苷酸在3x氯化鈉/檸檬酸鈉（SSC)中于約45°C與濾膜結(jié)合的DNA或RNA雜 交，接著在〇. 2x SSC/0. 1% SDS中于約20-65°C洗滌至少一次?；蛘?，基本相似的多肽可因 至少1個但少于5、10、20、50或100個氨基酸而不同于SEQ ID No. 2所示序列。
[0090] 由于遺傳密碼的簡并性，顯然，任何核酸序列可在基本上不影響由其編碼的蛋白 質(zhì)的序列的情況下被變化或改變，以提供其功能變體。合適的核苷酸變體是以下核苷酸變 體，其具有通過編碼相同氨基酸的不同密碼子在序列內(nèi)的取代從而產(chǎn)生沉默改變（Silent change)而改變的序列。其它合適的變體是具有同源核苷酸序列但包含通過不同密碼子的 取代而改變的全部或部分序列的變體，所述不同密碼子編碼與其取代的氨基酸具有類似生 物物理學(xué)性質(zhì)的側(cè)鏈的氨基酸以產(chǎn)生保守改變。例如小的非極性、疏水性氨基酸，包括甘氨 酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。大的非極性、疏水性氨基酸包括 苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。極性的中性氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和 谷氨酰胺。帶正電荷的（堿性）氨基酸包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷的（酸性） 氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此應(yīng)理解的是，何種氨基酸可被具有相似生物物理學(xué)性 質(zhì)的氨基酸替代，且技術(shù)人員將知道編碼這些氨基酸的核苷酸序列。
[0091] 為了解決本領(lǐng)域中的各種問題和進(jìn)展，本公開的整體通過說明的方式顯示了其中 要求保護(hù)的一個或多個發(fā)明可被實(shí)施的多個實(shí)施方案，并且為降低轉(zhuǎn)基因植物葉中的硝酸 鹽濃度提供了優(yōu)異的方法。本公開的優(yōu)點(diǎn)和特征僅僅是實(shí)施方案的代表性樣本，而不是窮 舉的和/或排他的。呈現(xiàn)它們僅用于幫助理解和教導(dǎo)要求保護(hù)的特征。應(yīng)當(dāng)理解的是，本公 開的優(yōu)點(diǎn)、實(shí)施方案、實(shí)施例、功能、特征、結(jié)構(gòu)和/或其它方面不應(yīng)被認(rèn)為是對權(quán)利要求所 定義的公開內(nèi)容的限制或?qū)?quán)利要求的等同方案的限制，并且可以利用其它實(shí)施方案，并 且可以在不脫離本公開的范圍和/或精神的情況下進(jìn)行改變。各個實(shí)施方案可以合適地包 含所公開的要素、組分、特征、部分、步驟、方式等的各種組合，由其組成或基本上由其組成。 此外，本公開包括目前沒有要求保護(hù)、但可以在將來要求保護(hù)的其它發(fā)明。
[0092] 本文所述的全部特征（包括任何隨附的權(quán)利要求、摘要和附圖）和/或如此公開 的任何方法或過程的全部步驟都可以以任何組合與任何上述方面組合，其中這些特征和/ 或步驟的至少一些是互為排斥的組合除外。
[0093] 為了更好地理解本發(fā)明，并顯示可如何實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的實(shí)施方案，現(xiàn)參照附圖舉例 說明，其中： 圖1顯示各種煙草煙霧亞硝胺4-(甲基亞硝氨基）-1-(3-吡啶基）-1-丁酮（NNK)、 N-亞硝基降煙堿（NNN)、N-亞硝基新煙草堿（NAB)和N-亞硝基新煙堿（NAT)的化學(xué)結(jié)構(gòu)； 圖2是本發(fā)明被稱為pGNP024 0140 001的構(gòu)建體的一個實(shí)施方案的質(zhì)粒圖譜。該構(gòu) 建體包括在香石竹蝕環(huán)病毒（CERV)啟動子控制下的陰離子/質(zhì)子交換蛋白基因； 圖3顯示攜帶啟動子CERV ::CLCb構(gòu)建體的三個Tl株系（即4、7和8)的中部葉中的 氨基酸概況（野生型[WT] Virginia40充當(dāng)對照）；和 圖4顯示攜帶啟動子CERV: :CLCb構(gòu)建體的三個T1株系（即4、7和8)的中部葉中的 硝酸鹽濃度（野生型[WT] Virginia40充當(dāng)對照）。
[0094] 詳述和實(shí)施例 本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了構(gòu)建體，如圖2中所示，并已用它來生成轉(zhuǎn)基因植物株系，所述轉(zhuǎn) 基因植物株系在組成型啟動子香石竹蝕環(huán)病毒（CERV)啟動子（Hull等人，1986，EMBO J.，5，3083-3090)的控制下過表達(dá)陰離子/質(zhì)子交換蛋白基因擬南芥dc-辦。
[0095] 實(shí)施例1 -擬南芥陰離子/質(zhì)子奪換蛋白某閔的分離 在這些實(shí)驗中使用的擬南芥陰離子/質(zhì)子交換蛋白基因是
[0096] 引物設(shè)計 鑒定了編碼擬南芥陰離子/質(zhì)子交換蛋白CLC-b的全長基因組序列（序列的登錄號 為：AAD29679)。設(shè)計在PCR中用于分離基因組序列的引物，其在5'末端用4 bp間隔序列 和合適的限制性位點(diǎn)加尾。在片段的5'末端和3'末端生成aiii?限制性位點(diǎn)，以實(shí)現(xiàn)片段 克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中。
[0097] 技術(shù)人員將理解的是，可以設(shè)計并入引物的所需特征和可替代的限制性酶位點(diǎn)的 其它PCR引物。
[0098] 編碼CLC-b的擬南芥cDNA的分離 使用Qiagen RNA Easy試劑盒從3周齡植物的蓮座葉提取擬南芥哥倫比亞品種 var. Columbia) RNA。簡而言之，根據(jù)制造商的說明書使用 QIAGEN RNA easy試劑盒（QIAGEN Ltd.，Crawley，UK)從葉樣品提取RNA。這種方法提供了大量非 常干凈的適于基因分離和克隆策略的RNA。使用Retroscript第一鏈合成試劑盒（Ambion) 遵循制造商的說明書使用隨機(jī)引物從RNA樣品制備cDNA。
[0099] clc-b陰離子/質(zhì)子交換蛋白DNA片段的分離 擬南芥的序列是2355bp長（登錄號ADD29679)。用引物對SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5擴(kuò)增編碼擬南芥的cDNA，其在片段的5'末端生成ai妨限制性位點(diǎn)且在片 段的3'末端生成aiii?限制性位點(diǎn)。 jFJ?1 ? - - - - - . - ? ? - } \ ^ ...... _ __H I - - _ ^ L-! \'....... ISEQIDN0.4] lx |?|
[SEQlDNO.sl
[0100] 用于擬南芥的PCR條件 循環(huán)程序：1個循環(huán)的94°C持續(xù)5分鐘，隨后30個循環(huán)的94°C持續(xù)30秒，60°C持續(xù) 30秒，72°C持續(xù)2分鐘，這隨后為1個循環(huán)的72°C持續(xù)5分鐘，隨后保持在4°C。遵循制 造商的說明書使用Advantage 2聚合酶（Clonetech)分離條帶。使用SWAT無 UV試劑盒 (Invitrogen)通過在1% Tris Acetate EDTA (TAE)瓊脂糖結(jié)晶紫凝膠上運(yùn)行片段而實(shí)施 片段的凝膠純化。
[0101] 然后通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應(yīng)的等分試樣。沉淀反應(yīng)物，然后儲存。 然后如下所述將陰離子/交換蛋白DNA片段克隆到pCR8 Τ0Ρ0載體中（購自 Invitrogen)〇
[0102] 對擬南芥的連接反應(yīng) 取Ιμ? pCR8 TOPO與1 μι鹽溶液和4 μι PCR反應(yīng)物混合。混合物在室溫下放置 10 min。取4 μ 1連接反應(yīng)混合物與T0P10大腸桿菌細(xì)胞混合，然后在冰上放置5 min。在 42°C下對細(xì)胞進(jìn)行熱激，然后在冰上放置5分鐘。然后將細(xì)胞在250 μ 1 S0C中孵育2小 時。然后將細(xì)胞鋪板在含有壯觀霉素（lOOKg/ml)的瓊脂平板上，且在37°C下放置過夜。含 有質(zhì)粒的細(xì)胞生長成菌落。挑取10個單一菌落并在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并觀察每個基因序 列。對于每個單獨(dú)菌落進(jìn)行微量制備（Qiagen)并使用用和的限制性消化來確 定基因是否已經(jīng)并入PCR8-T0P0載體中。
[0103] 對于每種序列挑取含有預(yù)期大小的PCR片段的單個菌落。然后單個菌落生長，且 提取質(zhì)粒DNA用于序列分析。將這些送至Beckman Coulter用下面所示引物（即，SEQ ID No:6和SEQ ID No:7)進(jìn)行測序。 腿3剛- ? · _ ^ *i? ? i % ? X * ? *- - . ·..·-.·· ° ·，· · ?
[SE；Q1DMD.6] Mi：# (&!?>!) I ", ," , I, , "I ' , , I , ' I , , In , Λ ^ ^ i 'll \ : : ^ . - - - , >
[SEQ ID NO.?}
[0104] 序列分析 序列分析顯示所述克隆含有陰離子/交換蛋白基因 Jick-辦。
[0105] 實(shí)施例2 -用于煙草轉(zhuǎn)化的載體的構(gòu)津 編碼Atclc-b的cDNA克隆入雙元載體 將含有Hc-A基因的pCR8質(zhì)粒與pGBNPCERV Gateway目的載體（Invitrogen)連同LR 克隆酶（clonase) II酶混合物和TE緩沖液重組。將其在25°C孵育過夜，然后添加 ?μ?蛋 白酶Κ以停止反應(yīng)。轉(zhuǎn)化的載體隨后用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌電感受態(tài)細(xì)胞。ρΒΝΡ載體是從ρΒΝΡ 雙兀載體生成的自用（in-house)載體（van Engelen 等人，1995，Transgenic Research, 4:288-290)，其使用Gateway轉(zhuǎn)化試劑盒（Invitrogen)變得Gateway即用，其含有CERV啟 動子和胭脂氨酸合成酶終止子。在卡那霉素板上選擇含有該質(zhì)粒的細(xì)胞。然后分離克隆且 提取DNA，并通過限制性消化和隨后的測序進(jìn)行分析。
[0106] CERV啟動子是植物病毒的花椰菜花葉病毒組的組成型啟動子。其在1986年由 Hull等人分離且表征，是CaMV的特征（Hull等人，1986)，但與CaMV 35S啟動子具有很小 的序列相似性。
[0107] 產(chǎn)生了下列雙元載體：pGNP024 0140 001 (T1325)(參見圖2):香石竹蝕環(huán)病毒 (CERV)啟動子cDNA: Nos終止子。然后通過電穿孔將雙元載體轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿 菌LBA 4404中。這通過將40 μ?根癌土壤桿菌電感受態(tài)細(xì)胞和0. 5 μ g質(zhì)粒DNA混合且置 于預(yù)冷的小杯中而進(jìn)行。然后在1.5伏特、600歐姆和25 PFD將細(xì)胞電穿孔。將1 ml 2YT 培養(yǎng)基添加至小杯，將混合物傾入30 ml通用容器且在搖床中在28°C下培養(yǎng)2小時。然后 將100 μ 1細(xì)胞鋪板在卡那霉素（50 Pg/ml)和鏈霉素（100 Pg/ml)LB瓊脂平板上。放置 板以在28°C下孵育2天。
[0108] 實(shí)施例3 -煙草轉(zhuǎn)化 如Horsch等人所述，使用葉盤共培養(yǎng)的方法用pGNP024 0140 001轉(zhuǎn)化及PH2517 植物（Science 227: 1229-1231，1985)。從7周齡的煙草植物取最幼嫩的兩片展開的葉， 且在8% Domestos中進(jìn)行表面滅菌10分鐘，且用無菌蒸餾水洗滌3次。然后使用6號木塞 鉆孔器切取葉盤，且放置在轉(zhuǎn)化的土壤桿菌懸浮液中約兩分鐘。然后將盤片在兩片無菌濾 紙之間輕輕地吸干。將10片盤片置于MS 3%蔗糖+2. 2μΜ BAP + 0. 27μΜ NAA平板上，然后 將其在生長室中培養(yǎng)2天。然后將盤片轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充500 g/Ι頭孢噻肟和100 g/Ι卡那霉素 的 MS + 3% 蔗糖 + 2· 2μΜ BAP + 0· 27 μΜ NAA 的平板上。
[0109] 2周后將盤片轉(zhuǎn)移至上述培養(yǎng)基的新鮮板上。再兩周后，將葉盤轉(zhuǎn)移到含有補(bǔ)充 500 mg/1頭孢噻肟和100 mg/1卡那霉素的LS +3%蔗糖+ 0. 5μΜ ΒΑΡ的平板上。每2周將 葉盤轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基上。當(dāng)枝條出現(xiàn)時，將它們切除，且轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充500 mg/1頭孢噻肟 的LS +3%蔗糖+ 0. 5μΜ BAP的廣口瓶中。約3周后，將廣口瓶中的枝條轉(zhuǎn)移至LS + 3%蔗 糖+ 250 mg/1頭孢噻肟。再3-4周后，最終將植物轉(zhuǎn)移至LS + 3%蔗糖（無抗生素）中且 生根。一旦植物生根，將它們轉(zhuǎn)移至溫室中的土壤。
[0110] 實(shí)施例4 -煙草"中部"葉硝酸鹽含量的分析（T1棺株） 使用HPLC進(jìn)行野生型和轉(zhuǎn)基因 Virginia40植物中硝酸鹽和/或亞硝酸鹽水平的定 量。這種用于確定植物組織中的硝酸鹽濃度的方法描述于Sharma等人，2008 (Malaria Journal，7:pp71)。HPLC提供來自植物樣品的硝酸鹽和/或亞硝酸鹽水平的高度精確的測 量，還由于與方法相關(guān)的自動化水平的增加而降低了與操作危險試劑相關(guān)的擔(dān)憂。
[0111] 材料為： 運(yùn)行緩沖液：5mM K2HP04，25mM ΚΗ2Ρ04, pH3 提取緩沖液：5mM K2HP04, 25mM KH2P04, pH3。
[0112] 方法：首先，將2ml磷酸鹽緩沖液添加至250-300 mg研磨的葉材料并用研杵在研 缽中均質(zhì)化。這些比率可以根據(jù)硝酸鹽的預(yù)期水平進(jìn)行改變。然后將均質(zhì)物在+4°C以16000 rpm離心10分鐘。然后將lml上清液過濾通過注射器濾器（0. 2μΜ)進(jìn)入HPLC小瓶中。用 0 -1 mM(對硝酸鹽）和〇-10〇μΜ (對亞硝酸鹽）的濃度范圍構(gòu)建硝酸鹽和亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲 線。注射體積為2〇μ1。
[0113] 根據(jù)出峰時間（peak timing)進(jìn)行峰鑒定。取決于柱齡和許多其它因素，出峰時 間是可變的。因此，應(yīng)當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)品來評價峰位置并將其與樣品中的峰流出時間關(guān)聯(lián)。
[0114] 圖3中顯示的硝酸鹽結(jié)果顯示，存在攜帶本發(fā)明的CRV-AtClcb構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化植物 中葉硝酸鹽濃度的降低。盡管他們不希望被理論所束縛，但是發(fā)明人假設(shè)，AtClcb蛋白充 當(dāng)?shù)賱訂T物。這導(dǎo)致葉被耗盡硝酸鹽。
[0115] 實(shí)施例5 -煙草"中部"葉氨某酸含量的分析（T1棺株） 葉的生理學(xué)取決于其相對于植物的其余部分的位置。因此，煙草種植者當(dāng)考慮葉可具 有什么味道時必須記住該信息。
[0116] 在開花過程中，發(fā)生被稱為再動員（remobilization)的過程，其導(dǎo)致營養(yǎng)物諸如 氨基酸和含氮化合物從植物的基部轉(zhuǎn)運(yùn)出至植物的頂部。此外，再動員的營養(yǎng)物將被用作 用于種子產(chǎn)生的能量源。因此，下部和上部葉將具有不同的氮含量，這通過不同的氨基酸概 況說明。
[0117] 常規(guī)使用Phenomenex提供的EZ:Faast LC/MS試劑盒分析氨基酸。該試劑盒提 供以下試劑，所述試劑可消耗以允許從組織樣品同時衍生化氨基酸，從而使得它們可以在 QTrap LC/MS的單次運(yùn)行中進(jìn)行分離和檢測。
[0118] 該方法的原理為： 該程序由固相提取步驟和隨后的衍生化和液/液提取組成；衍生化的樣品然后通過液 相層析-質(zhì)譜法進(jìn)行分析。固相提取經(jīng)由吸附劑裝填的尖端進(jìn)行，所述吸附劑裝填的尖端 在允許干擾化合物流經(jīng)的同時結(jié)合氨基酸。然后將吸附劑上的氨基酸擠壓至樣品小瓶中， 并在室溫在水溶液中迅速地用試劑衍生化。衍生化的氨基酸伴隨地遷移至有機(jī)層，用于與 干擾化合物的額外分離。然后將有機(jī)層去除，蒸發(fā)，并重新溶解在含水流動相中，并在LC/MS 系統(tǒng)上進(jìn)行分析。
[0119] 所有試劑和供應(yīng)品（包括HPLC柱）都是試劑盒的組分。該程序的所有步驟都在 被用作方案的用戶手冊KH0-7337和KH0-7338中詳述。
[0120] 圖4總結(jié)了三個植物株系（即4、7和8 )中AtClcb過表達(dá)對Glu、Asp、Pro、Gin 和Asn(即，據(jù)信參與植物的氮同化途徑的氨基酸）的濃度的影響。該圖清楚地顯示，攜帶 AtClcb (陰離子/質(zhì)子交換蛋白）構(gòu)建體的植物表現(xiàn)出所有測量的氨基酸濃度的顯著降低 (相比于其野生型對應(yīng)物的中部葉）。
[0121] 鑒于試驗植物葉的硝酸鹽含量的降低（如實(shí)施例4中顯示）和分析的三個植物株 系的中部葉的氨基酸含量的降低，本發(fā)明人得出過表達(dá)CRV-AtClcb的植物的葉中可用于 TSNA形成的硝酸鹽降低的結(jié)論，這對于煙草植物將是明顯有利的。此外，氨基酸概況的操作 可以用來改變煙草的味道。
【權(quán)利要求】
1. 遺傳構(gòu)建體，其包含與編碼作為具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的陰離子/質(zhì)子交換蛋白 的多肽的編碼序列可操作連接的啟動子，條件是所述啟動子不是花椰菜花葉病毒35S。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳構(gòu)建體，其中所述啟動子是組成型的、非組成型的、組織 特異性的、發(fā)育調(diào)節(jié)型或誘導(dǎo)型/阻遏型的啟動子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的遺傳構(gòu)建體，其中所述啟動子是香石竹蝕環(huán)病 毒（CERV)啟動子、豌豆質(zhì)體藍(lán)素啟動子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶啟動子、胭脂氨酸 合成酶啟動子、葉綠素 a/b結(jié)合啟動子、高分子量麥谷蛋白啟動子、α，β -麥醇溶蛋白啟動 子、大麥醇溶蛋白啟動子、馬鈴薯塊莖儲藏蛋白啟動子、或衰老特異性啟動子。
4. 根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的遺傳構(gòu)建體，其中所述啟動子是香石竹蝕環(huán)病毒 (CERV)啟動子，任選地其中所述啟動子包含基本上如SEQ ID No. 3所述的核苷酸序列，或其 功能變體或功能片段。
5. 根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的遺傳構(gòu)建體，其中所述多肽包含基本上如SEQ ID No. 2所述的氨基酸序列，或其功能變體或片段或直向同源物。
6. 根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的遺傳構(gòu)建體，其中所述編碼序列包含基本上如SEQ ID No. 1所述的核酸序列，或其功能變體或片段或直向同源物。
7. 根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的遺傳構(gòu)建體，其中所述編碼序列源自擬南芥屬物種 5/7/7.)、稻屬物種 5/7/7.)、楊屬物種 5/7/7.)或煙草屬物種 iMcotiana spp.~)。
8. 根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的遺傳構(gòu)建體，其中所述編碼序列源自擬南芥 (Arabidopsis thaliana)、犧{Oryza sativa)、敗撕 \ \\\ 場{Populus tremuld)或懷尊 (/Vico tiana tabacurri)。
9. 重組載體，其包含根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的遺傳構(gòu)建體。
10. 使試驗植物的葉中硝酸鹽濃度降低至低于在相同條件下培養(yǎng)的野生型植物葉中對 應(yīng)的硝酸鹽濃度的方法，所述方法包括：_ (i) 用根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的構(gòu)建體的遺傳構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求9所述 的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和 (ii) 從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生植物。
11. 產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物以比在相同條件下培養(yǎng)的對應(yīng)野生型植 物更高的速率將硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)出葉，所述方法包括?α) 用根據(jù)權(quán)利要求 1-8 中任一項所述的構(gòu)建體的遺傳構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求 9 所述 的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和 (ii)從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生植物。
12. 用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括將編碼作為具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性 的陰離子/質(zhì)子交換蛋白的多肽的外源基因引入未修飾的植物，其中相對于所述未修飾的 植物的葉中的硝酸鹽濃度，由所述外源基因編碼的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)降低了所述轉(zhuǎn)基 因植物的葉中的硝酸鹽濃度。
13. 轉(zhuǎn)基因植物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的遺傳構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要 求9所述的載體。
14. 轉(zhuǎn)基因植物，其包含編碼作為具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的陰離子/質(zhì)子交換蛋白 的多肽的外源基因，并且其中與未修飾的植物葉中的硝酸鹽濃度相比，所述轉(zhuǎn)基因植物葉 中的硝酸鹽濃度降低。
15. 編碼作為具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的陰離子/質(zhì)子交換蛋白的多肽的外源核酸序 列用于通過用所述外源核酸序列轉(zhuǎn)化植物而降低植物葉中的硝酸鹽濃度的用途。
16. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物，或根據(jù)權(quán)利要 求15所述的用途，其中所述多肽包含基本上如SEQ ID No. 2所述的氨基酸序列，或其功能 變體或片段或直向同源物。
17. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物，或根據(jù)權(quán)利要 求15所述的用途，其中所述外源基因包含基本上如SEQ ID No. 1所述的核苷酸序列，或其 功能變體或片段或直向同源物。
18. 宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的遺傳構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求9 所述的載體。
19. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
20. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物，或根據(jù)權(quán)利要 求15所述的用途，其中所述植物來自十字花科，諸如蕓苔屬物種spp.)，且優(yōu)選 為歐洲油菜dassica (油菜）。
21. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物，或根據(jù)權(quán)利要 求15所述的用途，其中所述植物來自禾本科，諸如小麥族物種spp.)，且優(yōu)選 為小麥屬物種（Triiicw? spp.)(小麥）。
22. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物，或根據(jù)權(quán)利要 求15所述的用途，其中所述植物來自茄科，例如曼陀羅、茄子、風(fēng)茄、顛茄（顛茄）、辣椒（辣 椒、辣椒）、馬鈴薯或煙草。
23. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物，或根據(jù)權(quán)利要 求15所述的用途或，其中所述植物來自煙草屬，優(yōu)選煙草。
24. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物，或根據(jù)權(quán)利要 求15所述的用途，其中所述植物來自菊科的植物，其例如萵苣（萵苣（Lactuca sativa))， 或來自藜科的植物，其包括菠菜（Spinacia oleracea)和甜菜（Beta vulgaris)。
25. 植物繁殖產(chǎn)物，其可從根據(jù)權(quán)利要求13或權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物獲得。
26. 收獲的葉，其含有比從在相同條件下培養(yǎng)的野生型植物采集的收獲的葉中對應(yīng)的 硝酸鹽水平更低的硝酸鹽水平，其中所述葉是從根據(jù)權(quán)利要求13或權(quán)利要求14所述的或 通過根據(jù)權(quán)利要求11或權(quán)利要求12所述的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物收獲的。
27. 煙草產(chǎn)品，其包含從突變體煙草植物獲得的硝酸鹽降低的煙草，所述突變體煙草植 物包含根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求9所述的載體，所述突變 體能夠降低其葉中的硝酸鹽濃度。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的煙草產(chǎn)品，其中所述煙草產(chǎn)品是無煙煙草產(chǎn)品，諸如鼻煙， 或可通過嘴遞送的口服煙草產(chǎn)品，諸如濕鼻煙，或吸煙制品。
29. 吸煙制品，其包含從突變體煙草植物獲得的硝酸鹽降低的煙草，所述突變體煙草植 物包含根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求9所述的載體，所述突變 體能夠降低其葉中的硝酸鹽濃度。
30. 相比于在相同條件下培養(yǎng)的野生型植物的對應(yīng)葉的氨基酸概況，調(diào)節(jié)參與試驗植 物的葉的氮同化的氨基酸概況的方法，所述方法包括：_ (i) 用根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的遺傳構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求9所述的載體轉(zhuǎn) 化植物細(xì)胞；和 (ii) 從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生植物。
31. 相比于從在相同條件下培養(yǎng)的野生型植物采集的對應(yīng)的收獲的葉的氨基酸概況， 調(diào)節(jié)參與從轉(zhuǎn)基因植物采集的收獲的葉的氮同化途徑的氨基酸概況的方法，其中所述葉是 從由根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物收獲的。
32. 根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的方法，其中參與植物和它們的葉的氮同化途徑的氨 基酸可以包含谷氨酰胺（Gin)、天冬酰胺（Asn)、天冬氨酸（Asp)、谷氨酸（Glu)或脯氨酸 (Pro)〇
33. 根據(jù)權(quán)利要求30-32中任一項所述的方法，其中與在相同條件下生長的野生型植 物中至少一種氨基酸的濃度相比，所述構(gòu)建體能夠使用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物中參與氮 同化途徑的至少一種氨基酸的濃度降低或增加至少10%、20%、30%、40%、50%、56%、60%、64%、 65%、70% 或 75%。
34. 根據(jù)權(quán)利要求30-33中任一項所述的方法，其中與在相同條件下生長的野生型植 物中發(fā)現(xiàn)的對應(yīng)葉相比，所述構(gòu)建體能夠降低轉(zhuǎn)基因植物的中部葉中氨基酸Glu、Asp、Pro、 Gin和/或Asn的濃度。
【文檔編號】C12N15/82GK104203974SQ201380015387
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月20日
【發(fā)明者】P.勒萊, J-P.桑切斯坦布里諾, S.達(dá)文波特 申請人:英美煙草(投資)有限公司