高速基因放大偵測(cè)裝置制造方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種高速基因放大裝置，包括：可實(shí)現(xiàn)更穩(wěn)定的溫度控制的附加機(jī)構(gòu)；包含導(dǎo)入可進(jìn)行RNA偵測(cè)的PCR反應(yīng)前的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序的預(yù)處理機(jī)構(gòu)；熔解曲線分析功能；及對(duì)液滴保持及光學(xué)測(cè)量最佳的芯片技術(shù)與PCR反應(yīng)的光學(xué)式測(cè)量功能。
【專(zhuān)利說(shuō)明】高速基因放大偵測(cè)裝置

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是關(guān)于一種高速基因放大裝置，其系使用了在基礎(chǔ)生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究、以及醫(yī)療現(xiàn)場(chǎng)，適于迅速進(jìn)行微量基因分析的研究或臨床試驗(yàn)的反應(yīng)容器；且有關(guān)一種基因分析，其系操作用以從例如以人類(lèi)為首的動(dòng)物或植物的基因體DNA、信使RNA等核堿基序列，高速偵測(cè)特定堿基序列的反應(yīng)裝置。

【背景技術(shù)】
[0002]聚合酶鏈鎖反應(yīng)(Polymerase chain react1n,以下簡(jiǎn)稱(chēng)為PCR。)系從各種種類(lèi)的核酸混合物，放大特定堿基序列的方法。通過(guò)至少重復(fù)一次如下步驟，可使特定核酸序列放大:于混合物中，加入從基因體DNA或信使RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)性DNA等的DNA模板、兩種以上的引物與熱安定性酶、鎂等的鹽類(lèi)、及4種脫氧核糖核苷酸三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，使核酸分離的步驟；使所述引物結(jié)合的步驟；及將引物已通過(guò)熱安定性酶而結(jié)合的核酸作為鑄模，使其雜交的步驟。通過(guò)令用于DNA放大反應(yīng)的反應(yīng)容器升溫、降溫，以進(jìn)行熱循環(huán)?？膳e出各種溫度變化用機(jī)構(gòu)，包括如下:以使用加熱器或帕耳帖(Peltier)組件、溫風(fēng)的熱交換,使包含樣本的反應(yīng)容器的溫度變化的機(jī)構(gòu)；通過(guò)令反應(yīng)容器交替接觸溫度不同的加熱器組塊或液體總線，以使溫度變化的機(jī)構(gòu)；及于具有不同溫度區(qū)的流路中，流入樣本而改變溫度的方法。作為現(xiàn)有的市售裝置中速度最快的裝置，例如Roche公司的偵測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x(Light Cycler)所具有的機(jī)構(gòu)，系于復(fù)數(shù)個(gè)玻璃毛細(xì)管的各者，導(dǎo)入試料、DNA聚合酶、作為引物的DNA斷片及測(cè)量用熒光標(biāo)記色素，通過(guò)吹以例如55°C與95°C兩種溫度等，溫度與欲令其變化的液滴溫度相同的溫風(fēng)，使該毛細(xì)管內(nèi)的微量液滴的溫度變化，同時(shí)對(duì)該玻璃毛細(xì)管照射熒光色度的激發(fā)光，測(cè)量所獲得的熒光強(qiáng)度。通過(guò)該等方法，可重復(fù)使樣本的溫度變化。
[0003]又，已報(bào)告一種流體沖突熱循環(huán)器裝置，其通過(guò)使流體噴射往試料含有區(qū)的外壁沖突，來(lái)控制試料溫度(日本特表2001-519224(專(zhuān)利文獻(xiàn)I))。因此，本
【發(fā)明者】等人為了進(jìn)行比以往更高速的PCR，開(kāi)發(fā)了照射對(duì)水異常具有吸收的波長(zhǎng)的紅外線，高速轉(zhuǎn)換微小水滴的溫度的技術(shù)，以及利用循環(huán)水，通過(guò)與循環(huán)水的熱交換，可超高速進(jìn)行溫度循環(huán)的超高速PCR裝置(日本特開(kāi)2008-278791、日本特開(kāi)2009-118798、W02010/113990、W02011/105507(專(zhuān)利文獻(xiàn) 2 ?5))。
[0004]先行技術(shù)文獻(xiàn)
[0005]專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0006]專(zhuān)利文獻(xiàn)1:日本特表2001-519224
[0007]專(zhuān)利文獻(xiàn)2:日本特開(kāi)2008-278791
[0008]專(zhuān)利文獻(xiàn)3:日本特開(kāi)2009-118798
[0009]專(zhuān)利文獻(xiàn)4:W02010/113990
[0010]專(zhuān)利文獻(xiàn)5:TO2011/105507


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]發(fā)明所欲解決的問(wèn)題
[0012]如上述，若采用現(xiàn)有技術(shù)，在伴隨有急遽的溫度變化而重復(fù)復(fù)數(shù)種溫度之間的循環(huán)時(shí)，難以達(dá)成如下事項(xiàng):1)嚴(yán)密的溫度控制；2)安定的溫度維持 '及3)往目標(biāo)溫度移動(dòng)時(shí)，不發(fā)生過(guò)沖。例如采用加熱器或帕耳帖組件時(shí)，溫度變化速度若甚緩慢，每秒為數(shù)。C程度，或由于發(fā)熱與熱傳導(dǎo)的關(guān)系，在達(dá)到目標(biāo)溫度的過(guò)程中，為了高速成為目標(biāo)溫度，若無(wú)過(guò)沖則難以使溫度變化。又，基本上若利用固體中的熱傳導(dǎo)，則于熱源與表面之間形成熱梯度，不能進(jìn)行嚴(yán)密的控制。又，在樣本觸及加熱器或帕耳帖組件的瞬間，熱量流失，至表面溫度回復(fù)到預(yù)定溫度為止發(fā)生了延遲。又，使反應(yīng)槽接觸不同的加熱器或液體總線時(shí)，移動(dòng)用機(jī)構(gòu)甚為復(fù)雜，難以控制加熱器或液體總線的溫度。進(jìn)而言之，于具有不同溫度區(qū)的流路中，流入樣本的方法，具有流路本身的表面溫度會(huì)隨著樣本的移動(dòng)而變化，難以控制溫度的問(wèn)題。又，吹以溫風(fēng)來(lái)進(jìn)行溫度變化時(shí)，由于空器的熱容量少，須吹以大量空氣，而且同樣由于空氣的熱容量少，因此不易采用電熱線等，以1°C為單位，嚴(yán)密控制所吹空氣的最終吹出溫度。
[0013]本
【發(fā)明者】們截至目前自行開(kāi)發(fā)了一種反應(yīng)控制裝置，其系為了連續(xù)供給一定的熱量，利用恒定的紅外光照射或高速回流的溫水，可對(duì)目標(biāo)物始終供給能量，可進(jìn)行正確的溫度控制、溫度測(cè)定及迅速的升溫、降溫。進(jìn)而通過(guò)于該裝置組合熒光偵測(cè)系統(tǒng)，開(kāi)發(fā)了一種高速PCR偵測(cè)裝置，其系使用隨著PCR反應(yīng)所造成的DNA放大，熒光強(qiáng)度會(huì)增加的熒光色素，安裝有實(shí)時(shí)偵測(cè)該放大反應(yīng)的熒光偵測(cè)方法(專(zhuān)利文獻(xiàn)2?5)。
[0014]于本發(fā)明，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)一步改善以往的發(fā)明，目的在于提供一種可進(jìn)行更正確的溫度控制、溫度測(cè)定與迅速的升溫、降溫的基因反應(yīng)控制裝置。
[0015]解決問(wèn)題的技術(shù)手段
[0016]有鑒于上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種包括可實(shí)現(xiàn)更穩(wěn)定的溫度控制的附加機(jī)構(gòu)的高速反應(yīng)控制裝置(例如:高速PCR裝置)，及使用該裝置的基因分析或基因放大方法。
[0017]亦即，本發(fā)明提供以下裝置及方法。
[0018][I] —種基因分析或基因放大用裝置，包括:反應(yīng)槽(react1n vessel),包括用以裝入含核酸的樣本液的I個(gè)或復(fù)數(shù)個(gè)孔(well)；
[0019]熱沉(heat sink)或熱交換槽(heat exchange chamber)；
[0020]該熱沉或該熱交換槽的溫度控制裝置(temperature controller),用于上述熱沉或熱交換槽保持在第I溫度；
[0021]熱電組件(thermoelectric element),配置于上述熱沉或上述熱交換槽與上述反應(yīng)槽之間，中介上述熱沉或熱交換槽與上述反應(yīng)槽的間的熱移動(dòng)；及
[0022]熱電組件控制裝置(thermoelectric element controller),通過(guò)控制上述熱電組件的動(dòng)作(operat1n)，令上述反應(yīng)槽的溫度，在上述第I溫度與第2溫度之間變化；
[0023]使得在上述熱電組件的動(dòng)作為關(guān)閉(OFF)時(shí)，上述反應(yīng)槽的溫度成為上述第I溫度。
[0024][2]如上述[I]的裝置,其中上述第I溫度為核酸的延長(zhǎng)反應(yīng)溫度；
[0025]上述第2溫度為(i)核酸的變性溫度，或?yàn)?ii)核酸的變性溫度或核酸的退火溫度。
[0026][3]如上述[I]或[2]的裝置，其中上述溫度控制裝置包括:
[0027]⑴溫度傳感器；
[0028](ii)熱電線，用以加溫上述熱沉；及
[0029](iii)回授控制機(jī)構(gòu)，根據(jù)來(lái)自上述溫度傳感器的上述熱沉的溫度信息，控制對(duì)上述熱電線的電力供給。
[0030][4]如上述[I]或[2]的裝置，其中上述溫度控制裝置系通過(guò)令上述預(yù)定溫度液體，回流于保持有利用管狀流路而流體連接于上述熱交換槽的預(yù)定溫度液體的液體儲(chǔ)存槽與上述熱交換槽之間，來(lái)控制上述熱交換槽的溫度。
[0031][5]如上述[I]?[4]中任一項(xiàng)的裝置，其中上述熱電組件控制裝置包括:
[0032]溫度傳感器；及
[0033]計(jì)算機(jī)，根據(jù)來(lái)自上述溫度傳感器的上述反應(yīng)槽的溫度信息，來(lái)控制上述熱電組件的動(dòng)作。
[0034][6]如上述[I]?[5]中任一項(xiàng)的裝置，其中上述熱電組件為帕耳帖(Peltier)組件。
[0035][7]如上述[I]?[6]中任一項(xiàng)的裝置，其中為了提高上述熱電組件與上述反應(yīng)槽的間的熱移動(dòng)效率，進(jìn)一步包括配置于上述熱電組件與上述反應(yīng)槽之間的熱傳導(dǎo)用薄板。
[0036][8]如上述[I]?[7]中任一項(xiàng)的裝置，其中上述反應(yīng)槽的底面及壁面系由厚度I微米至100微米，從鋁、鎳、鎂、鈦、鉬、金、銀及銅所組成的群組中選擇的金屬或硅所形成。
[0037][9]如上述[I]?[8]中任一項(xiàng)的裝置，其中上述樣本液的量系每一孔為數(shù)十μ L以下。
[0038][10]如上述[I]?[9]中任一項(xiàng)的裝置,其中使上述樣本液中含有熒光色素時(shí),進(jìn)一步備有熒光偵測(cè)裝置，用以與上述反應(yīng)槽的溫度切換連動(dòng)而偵測(cè)上述孔內(nèi)的上述熒光色素所發(fā)出的熒光，測(cè)定熒光強(qiáng)度的時(shí)間變化。
[0039][11]如上述[I]?[10]中任一項(xiàng)的裝置,其中進(jìn)一步包括反應(yīng)槽套體,用以防止配置于上述孔的樣本液滴蒸發(fā)而密閉覆蓋，且用以防止冷凝。
[0040][12]如上述[11]的裝置，其中上述反應(yīng)槽套體進(jìn)一步包括孔洞或光學(xué)窗，容易測(cè)定來(lái)自該反應(yīng)槽套體內(nèi)的上述樣本的光學(xué)訊號(hào)；該光學(xué)窗包括光學(xué)上透明的發(fā)熱體。
[0041][13]如上述[I]?[9]中任一項(xiàng)的裝置，其中于上述反應(yīng)槽的上述各孔的樣本配置場(chǎng)所，配置有支柱(柱體(Pillar))，樣本液蒸發(fā)防止用的密封劑以被該柱體支撐的方式覆蓋于該孔，通過(guò)該柱體，防止測(cè)定中的上述樣本液附著于上述蒸發(fā)防止用的密封劑。
[0042][14] 一種使用如上述[I]?[13]中任一項(xiàng)的裝置進(jìn)行PCR的方法，包含如下步驟:
[0043](a)將含核酸的樣本液配置于孔的步驟；
[0044](b)將反應(yīng)槽的溫度，從作為第I溫度的核酸的延長(zhǎng)反應(yīng)溫度，切換為作為第2溫度的(i)核酸的變性溫度或(ii)核酸的變性溫度或核酸的退火溫度的步驟；
[0045](C)接著將上述反應(yīng)槽的溫度，從上述第2溫度切換為上述第I溫度的步驟；以及
[0046](d)以預(yù)定的時(shí)間間隔，將步驟(b)及步驟(C)重復(fù)預(yù)定次數(shù)的步驟；
[0047]上述反應(yīng)槽的溫度從上述第2溫度對(duì)上述第I溫度的切換，系通過(guò)關(guān)閉上述熱電組件的動(dòng)作來(lái)進(jìn)行。
[0048][15]如上述[14]的方法，其中于上述步驟(d)，將步驟(b) (ii)及步驟(C)重復(fù)預(yù)定次數(shù)時(shí)，以預(yù)定的時(shí)間間隔，重復(fù)交替進(jìn)行如下動(dòng)作:
[0049]將上述反應(yīng)槽的溫度，從作為上述第I溫度的核酸的延長(zhǎng)反應(yīng)溫度，切換為上述(b) (ii)作為第2溫度的核酸的變性溫度，以及接著將上述反應(yīng)槽的溫度，從該核酸的變性溫度切換為上述第I溫度；
[0050]將上述反應(yīng)槽的溫度，從作為上述第I溫度的核酸的延長(zhǎng)反應(yīng)溫度，切換為上述
(b)(ii)作為第2溫度的核酸的退火溫度，以及接著將上述反應(yīng)槽的溫度，從該核酸的退火溫度切換為上述第I溫度。
[0051]與上述「可實(shí)現(xiàn)更穩(wěn)定的溫度控制的附加機(jī)構(gòu)」相關(guān)連，本發(fā)明的反應(yīng)溫度控制裝置所具有的機(jī)構(gòu)，系于短時(shí)間內(nèi)，實(shí)現(xiàn)例如一般的PCR反應(yīng)中所用的3種溫度，亦即變性溫度(以下稱(chēng)為高溫)、退火溫度(以下稱(chēng)為低溫)、以及延長(zhǎng)反應(yīng)溫度(以下稱(chēng)為中溫)，尤其高速且穩(wěn)定提供因應(yīng)所欲使其反應(yīng)的DNA鏈長(zhǎng)度，而需要加長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間等調(diào)整的延長(zhǎng)反應(yīng)溫度。亦即，例如于本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，提供一種高速基因放大裝置，其具有如下機(jī)構(gòu):(1)熱容量大的熱沉，控制為穩(wěn)定于中溫；(2)供給熱以將該熱沉溫度維持在一定的電熱線，或者以一定溫度進(jìn)行中溫液體的高速循環(huán)的機(jī)構(gòu)；(3)DNA反應(yīng)芯片，配置有進(jìn)行DNA延長(zhǎng)反應(yīng)的試料；(4)容器，收放DNA反應(yīng)芯片，具有針對(duì)將芯片上面溫度維持在75V以上的熒光觀察區(qū)的波長(zhǎng)，在光學(xué)上呈透明的觀察窗；(5)帕耳帖組件等熱移動(dòng)機(jī)構(gòu)，配置于上述DNA反應(yīng)芯片與熱沉之間，可主動(dòng)使熱移動(dòng)；及(6)偵測(cè)DNA反應(yīng)芯片上的液體的熒光強(qiáng)度變化的機(jī)構(gòu)。熱沉使用熱容量大的材料及電熱線等發(fā)熱源時(shí)，熱沉材料宜使用熱容量大且熱傳導(dǎo)性高的金屬(例如鋁、杜拉鋁、金、銀、鎢、尼泊爾黃銅、鎂、鑰、鈹，及使用該等元素的合金)。又，可與熱沉同等使用的物，亦可使用利用了設(shè)定為中溫的高速循環(huán)液體的熱交換槽。該情況下，不僅可使用只包括I個(gè)儲(chǔ)存槽的高速液體回流型反應(yīng)控制裝置，亦可于本身包括可支持2溫度或3溫度PCR的2或3個(gè)儲(chǔ)存槽的高速液體回流型反應(yīng)控制裝置，只使用設(shè)定為中溫的I個(gè)儲(chǔ)存槽。又，關(guān)于承載試料的DNA反應(yīng)芯片，可直接利用發(fā)明人在以前申請(qǐng)的高速液體回流型PCR裝置(W02010/113990)的反應(yīng)容器構(gòu)成。
[0052]發(fā)明的效果
[0053]使用中溫?zé)岢粱驘峤粨Q槽來(lái)控制反應(yīng)槽溫度的本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)可舉出如下:1)針對(duì)中溫可實(shí)現(xiàn)嚴(yán)密的溫度控制、2)針對(duì)中溫可實(shí)現(xiàn)安定的溫度控制、3)往中溫移動(dòng)時(shí)不會(huì)過(guò)沖。關(guān)于可解決溫度過(guò)沖問(wèn)題，由于具有大的熱容量的熱沉或熱交換槽的溫度大致一定，因此反應(yīng)槽表面的溫度與熱沉或熱交換槽的溫度大致可于瞬間平衡。于本發(fā)明，與熱沉或熱交換槽相比較，反應(yīng)槽及樣本的熱容量微乎其微，又，就熱電組件(帕耳帖組件)的動(dòng)作來(lái)看，熱沉或熱交換槽的溫度穩(wěn)定，又，由于該穩(wěn)定點(diǎn)的溫度(中溫)位于高溫與低溫的中間，因此相對(duì)于以往從室溫開(kāi)始動(dòng)作的帕耳帖組件控制型基因放大裝置，移動(dòng)至高溫或低溫時(shí)的熱移動(dòng)量最小，又，只要熱沉或熱交換槽的溫度穩(wěn)定，即容易估計(jì)往高溫或低溫的溫度變化動(dòng)作所需的電流量。又，即便因帕耳體組件的動(dòng)作，從熱沉或熱交換槽局部地逸失熱，由于熱沉或熱交換槽的熱容量充分大，因此基本上仍不會(huì)發(fā)生熱梯度。當(dāng)然，帕耳帖組件等熱電組件關(guān)閉(OFF)時(shí)，反應(yīng)槽溫度不會(huì)超過(guò)熱沉或熱交換槽的溫度。依據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可于0.5秒內(nèi)使溫度變化30°C以上。因此，若依據(jù)本發(fā)明，可極為縮短溫度變化所需的時(shí)間，例如可比現(xiàn)有的裝置，顯著縮短用以完成PCR反應(yīng)的總時(shí)間。
[0054]本發(fā)明可提供如下優(yōu)點(diǎn):無(wú)須如現(xiàn)有的液體回流型反應(yīng)控制裝置，為了進(jìn)行2溫度或3溫度PCR而需要閥等切換稼動(dòng)部，用以使來(lái)自不同的2溫度或3溫度的各液體儲(chǔ)存槽的液體，交替循環(huán)至熱交換槽?；蛘?，使用包括可支持2溫度或3溫度的復(fù)數(shù)個(gè)儲(chǔ)存槽的液體回流型反應(yīng)控制裝置，來(lái)實(shí)施本發(fā)明時(shí)，可提供如下優(yōu)點(diǎn):可容易實(shí)現(xiàn)使用閥等切換機(jī)構(gòu)，于不同的復(fù)數(shù)種溫度設(shè)定中溫。
[0055]附圖簡(jiǎn)單說(shuō)明
[0056]圖1系表示高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置(例如:PCR裝置)的全體構(gòu)成的模式圖。
[0057]圖2系高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置所使用的熱交換槽的概略圖。
[0058]圖3系表示本發(fā)明的裝置所使用的反應(yīng)槽形態(tài)及冷凍干燥試藥的溶解方法的模式圖。
[0059]圖4系表示本發(fā)明的裝置所使用的圓柱型反應(yīng)套體及其對(duì)熱交換槽的安裝方法的模式圖。
[0060]圖5系表示高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置所使用的閥的切換順序的模式圖。
[0061]圖6系表示使用高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置進(jìn)行關(guān)于(A)溫度變化的數(shù)據(jù)、及(B)PCR反應(yīng)的結(jié)果的圖。
[0062]圖7系表示本發(fā)明的裝置所使用的載玻片型反應(yīng)套體及其對(duì)熱交換槽的安裝方法的模式圖。
[0063]圖8系表示高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置所使用的滑動(dòng)型活塞閥的驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)的模式圖。
[0064]圖9系表示高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置所使用的滑動(dòng)型活塞閥的驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)的模式圖。
[0065]圖10系表示高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置所使用的旋轉(zhuǎn)式閥的驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)的模式圖。
[0066]圖11系表示高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置所使用的隔膜的溫度變化機(jī)構(gòu)的模式圖。
[0067]圖12系表示高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置所使用的溫度設(shè)定型閥的驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)的模式圖。
[0068]圖13系利用高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置的構(gòu)成一例，來(lái)表示DNA反應(yīng)芯片的配置、上面的溫度控制、以及熒光偵測(cè)方法的一個(gè)實(shí)施例的模式圖。
[0069]圖14系利用高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置的反應(yīng)槽構(gòu)成的一個(gè)實(shí)施例，來(lái)表示DNA反應(yīng)芯片的配置、上面的溫度控制、以及熒光偵測(cè)方法的一個(gè)實(shí)施例的模式圖。
[0070]圖15系利用高速液體回流型的反應(yīng)槽中的反應(yīng)槽芯片的搬運(yùn)系統(tǒng)以及進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的裝置構(gòu)成的一個(gè)實(shí)施例，來(lái)表示DNA反應(yīng)芯片的配置、上面的溫度控制、以及熒光偵測(cè)方法的一個(gè)實(shí)施例的模式圖。
[0071]圖16系表不本發(fā)明的反應(yīng)槽的試料的突光偵測(cè)方法的構(gòu)成的一個(gè)實(shí)施例的模式圖。
[0072]圖17系表不本發(fā)明的反應(yīng)槽的試料的突光偵測(cè)方法的構(gòu)成的一個(gè)實(shí)施例的模式圖。
[0073]圖18系表示本發(fā)明的反應(yīng)槽的構(gòu)造的一個(gè)實(shí)施例的模式圖。
[0074]圖19系表示本發(fā)明的反應(yīng)槽的構(gòu)造的一個(gè)實(shí)施例及偵測(cè)方法的一個(gè)實(shí)施例的模式圖。
[0075]圖20系表示本發(fā)明的反應(yīng)槽的構(gòu)造的一個(gè)實(shí)施例的模式圖。
[0076]圖21系表示高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置的構(gòu)成的一個(gè)實(shí)施例的模式圖。
[0077]圖22系表示光加熱型的反應(yīng)控制裝置的構(gòu)成的一個(gè)實(shí)施例的模式圖。
[0078]圖23系表示光加熱型的反應(yīng)控制裝置的構(gòu)成的一個(gè)實(shí)施例的ND濾光片的穿透率的角度相依性的模式圖。
[0079]圖24系表示本發(fā)明的構(gòu)成的一個(gè)實(shí)施例的模式圖。
[0080]圖25系模式性表示本發(fā)明的DNA試料的溫度變化與帕耳帖組件的動(dòng)作的圖。
[0081]詳細(xì)說(shuō)明
[0082]用以實(shí)施發(fā)明的實(shí)施例
[0083]以下一面參考附圖，一面說(shuō)明有關(guān)本發(fā)明的實(shí)施例，該等實(shí)施例為例示，本發(fā)明的范圍不得受到該等實(shí)施例所限定。
[0084]圖1系表示高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置的一個(gè)實(shí)施例的全體構(gòu)成的模式圖。該反應(yīng)控制裝置典型上包括:反應(yīng)槽(react1n vessel) 1、反應(yīng)槽套體2、熱交換槽(heatexchange vessel) 3、液體儲(chǔ)存槽(liquid reservoir tank) 4、熱源 5、攪拌裝置 6、泵 7、切換閥8、旁通流路9、及輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10。較宜進(jìn)一步包括:熒光偵測(cè)器201、及用以送出控制訊號(hào)203的控制分析部202、及光學(xué)窗(或孔洞)204。
[0085]于較佳實(shí)施例，液體儲(chǔ)存槽4系通過(guò)微量液體可移動(dòng)于槽間的細(xì)連結(jié)管15所連接，以使得不會(huì)在液體高速循環(huán)中，各槽中液體的高度產(chǎn)生差異，水位高度差異導(dǎo)致壓力差產(chǎn)生。又，為了以短時(shí)間實(shí)現(xiàn)熱交換，如圖1所示，從各儲(chǔ)存槽4始終通過(guò)泵7來(lái)使液體循環(huán)，不誘導(dǎo)至熱交換槽3時(shí)，仍通過(guò)切換閥8，將液體誘導(dǎo)至旁通流路9，亦使其始終循環(huán)。又，循環(huán)液體系配管如下:在回到儲(chǔ)存槽4前，通過(guò)輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10進(jìn)行微調(diào)而回流，使其成為與儲(chǔ)存槽4的液體溫度相同的溫度。在此，輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10被裝入有加溫機(jī)構(gòu)及冷卻機(jī)構(gòu)，通過(guò)帕耳帖(Peltier)組件等實(shí)現(xiàn)加溫與冷卻雙方，或使用阻抗加熱機(jī)構(gòu)的加溫系統(tǒng)與空氣散熱片型的冷卻機(jī)構(gòu)均可。又，液溫傳感器16配置于各儲(chǔ)存槽4及各輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10，依據(jù)來(lái)自該等傳感器的溫度信息，可控制熱源5及輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10，以使液溫成為各所需溫度。在此，液溫傳感器宜使用由直接接觸液體也不會(huì)腐蝕的材料所形成的熱阻器、或經(jīng)防蝕被覆的熱電偶等。
[0086]又，于較佳實(shí)施例，于各儲(chǔ)存槽，在來(lái)自熱源的熱供給產(chǎn)生水蒸汽等氣體，從而發(fā)生儲(chǔ)存槽內(nèi)的壓力上升時(shí)，為了防止槽損壞，且為了防止起因于氣體壓力差，經(jīng)由連結(jié)管而產(chǎn)生液面高度，配置了有效將產(chǎn)生的氣體排出至槽外的壓力泄閥2003。
[0087]反應(yīng)槽I典型上系由具有復(fù)數(shù)個(gè)凹坑(孔(well))的鋁、鎳、或者金的薄板等所構(gòu)成。為了提高熱傳導(dǎo)性，凹坑區(qū)的薄板厚度宜比周?chē)〉貥?gòu)成，典型上為10至30微米程度的厚度，但不限定于此。為了整體上確保強(qiáng)度，相鄰凹坑間的區(qū)域宜加厚，典型上厚度在100微米至500微米的范圍，但不限于此。反應(yīng)槽I典型上固定于四角、圓形等形狀的反應(yīng)槽套體2的底面而一體地形成。反應(yīng)槽I及反應(yīng)槽套體2典型上對(duì)于熱交換槽3可拆裝地構(gòu)成(參考圖4)。
[0088]導(dǎo)入于熱交換槽3的液體的溫度，系由配置于液體儲(chǔ)存槽4內(nèi)部的熱源5控制。為了從熱源5表面迅速取得熱，使液體儲(chǔ)存槽4內(nèi)部的溫度均勻，宜包括攪拌機(jī)構(gòu)6。液體儲(chǔ)存槽4中的液體系由泵7導(dǎo)引至流路內(nèi)部。通過(guò)切換閥8，液體被導(dǎo)引至熱交換槽3，或被導(dǎo)引至旁通流路9，不經(jīng)過(guò)熱交換槽3而直接回到液體儲(chǔ)存槽4。根據(jù)需要，通過(guò)輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10縝密地控制，將循環(huán)中變化的液體溫度，修正為與儲(chǔ)存槽4內(nèi)的設(shè)定溫度相同的溫度之后排出，抑制液體儲(chǔ)存槽4內(nèi)部的溫度變動(dòng)。
[0089]導(dǎo)入于熱交換槽3的液體亦可使用水，但不限定于此，只要是熱容量大，且黏性低的液體(例如:液體氨)，可使用任意的物。其中，從安全性的觀點(diǎn)來(lái)看，宜使用非毒性、非可燃性的液體。又，例如通過(guò)使用沸點(diǎn)高于水的液體，以確實(shí)使樣本液成為100 °c，或者通過(guò)使用凝固點(diǎn)低于水的液體，可一面防止循環(huán)于裝置內(nèi)的液體凝固，一面亦可確實(shí)進(jìn)行到水凝固點(diǎn)為止的溫度變化。
[0090]較宜如圖1所示，于反應(yīng)槽套體2配置熒光色素的激發(fā)光以及熒光會(huì)穿透的光學(xué)窗204，以便可針對(duì)I個(gè)或復(fù)數(shù)個(gè)反應(yīng)槽的各者，測(cè)量由于反應(yīng)槽I內(nèi)的樣本液的反應(yīng)而變化的樣本液中的熒光色素的熒光強(qiáng)度變化。又，通過(guò)配置熒光偵測(cè)器201，可測(cè)量已測(cè)量到的各反應(yīng)槽I的熒光強(qiáng)度的時(shí)間變化。于圖1的實(shí)施例，于復(fù)數(shù)個(gè)熒光偵測(cè)器201各個(gè)的內(nèi)部，具備激發(fā)光照射機(jī)構(gòu)及熒光偵測(cè)機(jī)構(gòu)，例如可采用進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，可獨(dú)立測(cè)量滴下不同引物、或不同樣本液的復(fù)數(shù)個(gè)反應(yīng)槽I各個(gè)不同的PCR放大信息的構(gòu)成。又，由熒光偵測(cè)器201取得的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)系由控制分析部202記錄，具有估計(jì)通過(guò)PCR反應(yīng)所得的樣本液內(nèi)的DNA量、或者mRNA量的功能。進(jìn)而言之,于控制分析部202,具有通過(guò)取得切換閥8的切換信息，從熒光強(qiáng)度的時(shí)間變化，來(lái)估計(jì)閥切換后的樣本液的溫度變化是否達(dá)到目標(biāo)溫度的功能，以及亦具有根據(jù)該結(jié)果控制閥切換的功能。此系利用熒光色素普遍所具有基于水分子運(yùn)動(dòng)的熒光消光是取決于液溫，從熒光強(qiáng)度就單位時(shí)間來(lái)看的變化量小或者為零而估計(jì)，尤其在確認(rèn)使DNA改質(zhì)的高溫狀態(tài)達(dá)成時(shí)甚為有效。
[0091]又，于圖1所示的實(shí)施例，表示了于各反應(yīng)槽I配置I個(gè)偵測(cè)器的構(gòu)成，但搭配組合熒光激發(fā)用光源及冷卻CCD攝像機(jī)等可量化偵測(cè)熒光的攝像機(jī)，以測(cè)量復(fù)數(shù)個(gè)反應(yīng)槽I的熒光強(qiáng)度變化亦可?；蛘撸谑褂脭?shù)目少于反應(yīng)槽I的偵測(cè)器時(shí)，通過(guò)將可高速移動(dòng)于X-Y面的機(jī)械式驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)，與偵測(cè)器搭配組合，來(lái)測(cè)量所有反應(yīng)槽I的熒光強(qiáng)度亦可。
[0092]又，樣本液容量系每一孔可使用0.1 μ L?10yL的范圍，但不限于此。較佳的樣本液容量系每一孔為0.1?數(shù)十(例如90、80、70、60、50、40、30、20、10) μ L，但根據(jù)需要，進(jìn)一步以低容量，例如每一孔使用0.5yL?10 μ L、每一孔使用I μ L?5 μ L、每一孔使用I μ L?2 μ L等亦適宜。于孔中除了樣本液以外，亦可含有用以防止樣本液蒸發(fā)的礦物油等。礦物油容量宜為數(shù)μ L(例如:3?4μ?程度，但不限定于此，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，當(dāng)然可依孔大小或樣本量適當(dāng)變更。
[0093]圖2系高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置所使用的熱交換槽3的概略圖。作為基本構(gòu)成，熱交換槽3包括:導(dǎo)入不同溫度的液體的進(jìn)口 A(Il)、進(jìn)口 Β(12)。又，熱交換槽3包括用以使熱交換槽3的液體，回到液體儲(chǔ)存槽4的復(fù)數(shù)個(gè)出口、出口 Α(13)及出口 B(14)。分別而言，圖2Α系模式性表示從進(jìn)口 A(ll)，導(dǎo)入來(lái)自液體儲(chǔ)存槽4的某溫度的液體，并從出口 Α(13)排出的狀況；圖2Β系模式性表示從進(jìn)口 B (12)，導(dǎo)入來(lái)自液體儲(chǔ)存槽4的某溫度的液體，并從出口 B(14)排出的狀況。進(jìn)口的數(shù)目不限定于2，可準(zhǔn)備與欲使樣本液溫度變化的復(fù)數(shù)種溫度一致的數(shù)目，且為2溫度份量以上的復(fù)數(shù)個(gè)進(jìn)口。例如欲達(dá)成3溫度系統(tǒng)時(shí)，進(jìn)口的數(shù)目為3個(gè)。出口的數(shù)目亦與進(jìn)口的情況相同，不限定于2。再者，圖2中的箭頭系大致表示于熱交換槽3導(dǎo)入或從熱交換槽3排出的液體流動(dòng)方向。
[0094]循環(huán)于熱交換槽3與液體儲(chǔ)存槽4之間的液體總?cè)莘e，系考慮用于循環(huán)的液體的流速、液體的熱容量或溫度的穩(wěn)定性等，例如為了實(shí)現(xiàn)反應(yīng)槽3的溫度變化的高速性與溫度穩(wěn)定性，將流速設(shè)在每秒1mL以上時(shí)，一般為數(shù)十mL以上的總?cè)萘浚藶?0mL以上，更宜為200mL以上，進(jìn)而最宜為300mL以上。容積上限可考慮裝置的可搬性等來(lái)適當(dāng)設(shè)定。
[0095]熱交換槽3的容量宜為每孔的樣本量的約10倍以上，更宜約為100倍以上，若約為1000倍以上最適宜。典型上，熱交換槽的容量系對(duì)于I孔約為0.0lmL?10mL，更宜約為0.05mL ?數(shù) mL (例如 9、8、7、6、5、4、3、2、ImL)，最宜約為 0.1mL ?2mL。
[0096]圖3系表示本發(fā)明的裝置所使用的反應(yīng)槽形態(tài)及冷凍干燥試藥的溶解方法的模式圖?？墒褂酶鞣N形狀的反應(yīng)槽或孔，圖3A為一個(gè)實(shí)施例，分別表示了與熱交換槽3的液體相接的面如下:平坦的反應(yīng)槽A (21);半球狀的反應(yīng)槽B (22);三角錐狀的反應(yīng)槽C (23)；球狀的反應(yīng)槽D (24);及于球狀凹坑中具有圓錐狀構(gòu)筑物，可保持液滴的安定位置與擴(kuò)大接觸面積的反應(yīng)槽C’(231)。若考慮熱傳導(dǎo)效率，本領(lǐng)域技術(shù)人員當(dāng)可容易理解與熱交換槽的液體相接的面的面積越大，效率越佳。
[0097]反應(yīng)所需的試藥若預(yù)先冷凍干燥，較為便利。如圖3B所示，可于反應(yīng)槽26的底部，預(yù)先調(diào)制冷凍干燥試藥25。又，若于分注樣本時(shí)所用的分注芯片27內(nèi)部，預(yù)先形成栓塞狀的冷凍干燥試藥25，則可通過(guò)上下移動(dòng)樣本液28，使試藥容易溶解于樣本中。又，于尼龍纖維等成束的纖維珠29表面，預(yù)先形成冷凍干燥試藥25，通過(guò)插入于反應(yīng)槽26內(nèi)部的樣本28中攪拌，亦可溶解冷凍干燥試藥。
[0098]圖4系表示本發(fā)明的裝置所使用的圓柱型反應(yīng)套體32及其對(duì)熱交換槽37的安裝方法的模式圖。由于直接處理由薄膜所構(gòu)成的反應(yīng)槽，較為不便，因此如圖4A所示，若將反應(yīng)槽31固定于反應(yīng)槽套體32，較為便利。反應(yīng)槽套體32宜以隔熱性材質(zhì)的聚苯乙烯、聚碳酸酯、PEEK、壓克力等來(lái)形成。又，對(duì)反應(yīng)槽31的迅速且高精度的升溫、降溫而言，期望盡量壓低與反應(yīng)槽31的結(jié)合面積(例如:5_2以下)。
[0099]圖4B系作為將反應(yīng)槽31安裝于熱交換槽37的一個(gè)實(shí)施例，表示于反應(yīng)槽套體32表面，預(yù)先形成螺紋槽34，將反應(yīng)槽套體32旋入熱交換槽37的反應(yīng)槽承口 33的方法。如圖4B所示，為了保持水密性，宜于開(kāi)口部安裝封材35。圖4C進(jìn)一步表示其他安裝方法。如圖4C所示，亦可采用錐形狀反應(yīng)槽套體36，僅以壓力安裝于熱交換槽38。
[0100]圖5系表示高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置所使用的閥的切換順序的模式圖。表示了用以于反應(yīng)槽導(dǎo)入液體的進(jìn)口閥A(41)、進(jìn)口閥B(43)、用以導(dǎo)引至外部的出口閥A(42)及出口閥B(44)。從進(jìn)口閥A(41)導(dǎo)引的液體系從出口閥A(42)回到液體儲(chǔ)存槽4，從進(jìn)口閥A(43)導(dǎo)引的液體系從出口閥B(44)回到別的液體儲(chǔ)存槽4。通過(guò)交互輪替該兩種狀態(tài)，可使反應(yīng)槽中的樣本反應(yīng)。進(jìn)而期望的閥切換方法，除了上述兩種狀態(tài)以外，通過(guò)一瞬間同時(shí)開(kāi)放進(jìn)口閥B(43)與出口閥A(42)，或進(jìn)口閥A(41)與出口閥B(44)，可抑制不同溫度的液體混合，容易進(jìn)行各個(gè)系統(tǒng)的液體儲(chǔ)存槽的溫度控制。
[0101]液體循環(huán)速度并未特別限定，一般約為ImL/秒?10mL/秒，更宜為5mL/秒?50mL/秒，最宜為7mL/秒?15mL/秒。為了使儲(chǔ)存槽中的溫度不降低而循環(huán)至熱交換槽3，液體宜通過(guò)泵7，始終從儲(chǔ)存槽以10mL/S以上的高速循環(huán)。
[0102]圖6A系表示從有關(guān)通過(guò)使用上述機(jī)構(gòu)可實(shí)現(xiàn)的溫度控制的數(shù)據(jù)所得的線圖。如圖6A所示，可于1.5秒的短時(shí)間，使溫度從60°C升溫至92°C或回到60V。圖6B系表示實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果的線圖。進(jìn)行PCR時(shí)的溶液條件如下。以反應(yīng)緩沖劑1.0yL、2mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP) I μ L、25mM 硫酸鎂 1.2 μ L、10 % 胎牛血清 0.125 μ L、SYBR Green I
0.5 μ L、引物兩種各 0.6 μ L、殺菌水 3.725 μ L、KOD plus polymerase 0.25yL、基因體DNA 1.0yL的比率混合。溫度條件首先以95°C進(jìn)行10秒，接著將95°C I秒、60°C 3秒的溫度變化進(jìn)行40循環(huán)。液體循環(huán)速度約為1mL/秒。
[0103]圖7系表示有關(guān)本發(fā)明的裝置所使用的反應(yīng)槽59及反應(yīng)槽套體51對(duì)熱交換槽的拆裝方法的變化。反應(yīng)槽59展伸于載玻片型反應(yīng)槽套體51而安裝(圖7A)。將該載玻片型反應(yīng)槽套體51安裝于熱交換槽時(shí)，可沿著導(dǎo)軌53，使反應(yīng)槽套體51往橫向滑動(dòng)，推壓于封材54而固定(圖7B)。又，亦可將載玻片型反應(yīng)槽套體51插入于玻片承口 55，活用鉸鏈56推壓于封材57 (圖7C)。
[0104]圖8系表示高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置所使用的閥切換機(jī)構(gòu)的變化的模式圖，其表示與圖5不同的滑動(dòng)型活塞閥的驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)。作為改變反應(yīng)槽66的溫度的閥機(jī)構(gòu)，使用可往左右滑動(dòng)的活塞65。于活塞65的左側(cè)，從進(jìn)口 iU61)對(duì)熱交換槽67導(dǎo)入液體，從出口 A(62)導(dǎo)引至外部。于活塞65的右側(cè)，從進(jìn)口 B (63)對(duì)熱交換槽67導(dǎo)入液體，從出口B (64)導(dǎo)引至外部。若活塞65對(duì)于反應(yīng)槽66往右滑動(dòng),貝U反應(yīng)槽66會(huì)與從進(jìn)口 A(61)導(dǎo)入的液體的溫度達(dá)到平衡，反之，若往左側(cè)滑動(dòng)，則會(huì)與從進(jìn)口 B(63)導(dǎo)入的液體的溫度達(dá)到平衡。又，活塞65位于反應(yīng)槽66的正下方時(shí),液體可不漏泄而拆下反應(yīng)槽66?；钊?5宜由隔熱性良好的材料制作，或內(nèi)部宜成為空洞，充滿(mǎn)氣體，亦或成為真空狀態(tài)。再者，圖8中的箭頭大致表示液體的流動(dòng)方向。
[0105]圖9系表示高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置所使用的活塞閥的活塞的驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)的數(shù)種變化。一方法系活塞71與活塞桿72成為一體，從外部直接運(yùn)作的方法(圖9A)。其他方法系以鐵、鎳等強(qiáng)磁性材料制作活塞73，或于其他材料制作的活塞內(nèi)部，裝入磁鐵74。于外部設(shè)置電磁線圈75，通過(guò)控制電流來(lái)使活塞73左右滑動(dòng)(圖9B)。進(jìn)一步的方法亦可通過(guò)控制進(jìn)口側(cè)的壓力或出口的流體阻抗，利用活塞76兩側(cè)的壓力差，使活塞76往左右滑動(dòng)(圖9C)。再者，圖9中的刷白箭頭表示活塞的運(yùn)動(dòng)方向，涂黑箭頭表示流體的流向，通過(guò)箭頭方向大致表示流體的流動(dòng)方向，通過(guò)箭頭粗細(xì)大致表示流量。
[0106]圖10系表不聞速液體回流型的反應(yīng)控制裝置所使用的閥切換機(jī)構(gòu)的其他實(shí)施例。旋轉(zhuǎn)閥81插入于剖面呈圓形的熱交換槽83內(nèi)部，而所述旋轉(zhuǎn)閥81系由結(jié)合有作為旋轉(zhuǎn)軸的棒82的傾斜的橢圓形板材所組成。旋轉(zhuǎn)閥81系將熱交換槽83分隔為左右，通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)軸82，可將從熱交換槽的右部或左部導(dǎo)入的液體，導(dǎo)引至反應(yīng)槽84。圖10的旋轉(zhuǎn)閥81的形狀為傾斜的平板，但亦可為其他螺旋螺紋等形狀，若通過(guò)使旋轉(zhuǎn)軸旋轉(zhuǎn)，可產(chǎn)生同樣的效果即可。再者，圖10中的涂黑箭頭表示旋轉(zhuǎn)軸82的旋轉(zhuǎn)方向，刷白箭頭大致表示液體的流動(dòng)狀況。
[0107]圖11系表示通過(guò)閥以外的構(gòu)造來(lái)置換液體的構(gòu)造。熱交換槽98系由隔膜A(95)及隔膜B(96)所區(qū)隔。從隔膜A(95)導(dǎo)入的液體系通過(guò)出口 A(92)導(dǎo)出至外部。由于隔膜的存在，不會(huì)從進(jìn)口 B(93)或出口 B(94)導(dǎo)出(圖11A)。從進(jìn)口 A(91)導(dǎo)入的液體的壓力凌駕于從進(jìn)口 B(93)導(dǎo)入的液體的壓力時(shí)，通過(guò)將隔膜A(95)及隔膜B(96)往左側(cè)推出，從進(jìn)口 A(91)導(dǎo)入的液體的熱會(huì)傳至反應(yīng)槽97 (圖11B)。從進(jìn)口 A(91)及進(jìn)口 B (93)導(dǎo)入的液體的壓力關(guān)系為相反時(shí)，反應(yīng)槽97的溫度會(huì)與從進(jìn)口 B (93)導(dǎo)入的液體的溫度達(dá)到平衡狀態(tài)(圖11C)。隔膜宜由耐熱橡膠等耐熱性良好的薄膜制作。再者，圖11中的箭頭大致表示液體的流動(dòng)方向。
[0108]圖12系表示高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置所使用的溫度設(shè)定型閥的進(jìn)一步其他驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)的模式圖。在此，可設(shè)定的溫度不限定于兩種溫度。于圖12表示可將反應(yīng)槽的溫度設(shè)定為3種以上的構(gòu)造。于熱交換槽103，插入側(cè)面形成有溝槽102的轉(zhuǎn)閥101。于轉(zhuǎn)閥101兩側(cè)，設(shè)有進(jìn)口及出口。例如從進(jìn)口 A(104)導(dǎo)入的液體系經(jīng)過(guò)流路108而流入溝槽102，對(duì)反應(yīng)槽109傳熱的后，從出口 A(105)導(dǎo)引至外部。相對(duì)于此，從進(jìn)口 B (106)導(dǎo)入的液體不與反應(yīng)槽109相接，從出口 B (107)導(dǎo)引至外部。然而，通過(guò)旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)閥101，可使得從任意進(jìn)口導(dǎo)入的液體與反應(yīng)槽相接(圖12C)。通過(guò)伴隨著經(jīng)過(guò)時(shí)間111而旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)閥101，可如圖12C的線圖所示令溫度110變化。轉(zhuǎn)閥101宜由隔熱性材料制作。
[0109]圖13系針對(duì)省略了高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置的3溫度型系統(tǒng)的控制系統(tǒng)部分的描述，表示一個(gè)實(shí)施例的全體構(gòu)成的模式圖。用以引起高速PCR反應(yīng)的反應(yīng)控制裝置在典型上包括:反應(yīng)槽(react1n vessel) I ;反應(yīng)槽套體2,防止來(lái)自外部對(duì)于反應(yīng)槽上的PCR反應(yīng)液滴的污染及液滴蒸發(fā)；熱交換槽(heat exchange vessel) 3,導(dǎo)入有熱交換用的高速循環(huán)液；3個(gè)液體儲(chǔ)存槽(liquid reservoir tank)4,以個(gè)別的溫度保持3種溫度的液體；以及對(duì)于各儲(chǔ)存槽包括:熱源5、攪拌裝置6、泵7、切換閥8、旁通流路9、及輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10。為了實(shí)現(xiàn)高速PCR，從各個(gè)儲(chǔ)存槽，液體系往液體流動(dòng)方向18的箭頭方向循環(huán)，于接頭90，從各儲(chǔ)存槽經(jīng)各切換閥而接合有流路，誘導(dǎo)至通往熱交換槽3的流路而構(gòu)成，又，從熱交換槽3流出的液體亦于下游側(cè)的接頭90，分支成通往各儲(chǔ)存槽的回流流路，使位于熱交換槽3的上游側(cè)及下游側(cè)雙方的各分支流路的各切換閥8同時(shí)連動(dòng)，為了高溫、中溫、低溫的各儲(chǔ)存槽4的任一儲(chǔ)存槽液體的循環(huán)而切換，可瞬間將對(duì)于熱交換槽3導(dǎo)入的高速循環(huán)液體切換為高溫、中溫、低溫的任一溫度。在此，于圖13，為了便于理解而模式性表示裝置構(gòu)成及配管配置，因此各零件間的配管長(zhǎng)度并未表示如實(shí)際長(zhǎng)度，但連結(jié)接頭90與各切換閥8的間的管長(zhǎng)度，為使高速液體量幾乎無(wú)殘留，宜采鄰接于接頭90的方式配置切換閥8。又，為了使從各儲(chǔ)存槽4供給至熱交換槽3的高速循環(huán)液體的溫度下降維持在最小限度，應(yīng)使得從各儲(chǔ)存槽4通往熱交換槽3的流路長(zhǎng)度成為最小長(zhǎng)度，在構(gòu)成上嵌入于各儲(chǔ)存槽4與熱交換槽3之間的零件，宜為僅嵌入有切換閥8的兩個(gè)零件(機(jī)構(gòu))的最少數(shù)目的零件嵌入。另，關(guān)于從熱交換槽3回流至各儲(chǔ)存槽4的流路長(zhǎng)度，即使稍長(zhǎng)，由于會(huì)在通過(guò)下游輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10進(jìn)行溫度補(bǔ)正后回流至儲(chǔ)存槽4，因此不構(gòu)成問(wèn)題。又’泵7的配置位置為了確實(shí)于熱交換槽3維持流速，供給高速循環(huán)液體，而且不對(duì)熱交換槽3供給時(shí)，通過(guò)切換閥瞬間且確實(shí)經(jīng)過(guò)輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10回流至各儲(chǔ)存槽，宜將泵7配置于各儲(chǔ)存槽4與供給至熱交換槽4的上游側(cè)的切換閥8之間，配置成始終從儲(chǔ)存槽4直接「壓出」高速回流液體的構(gòu)成。又，為了將從各儲(chǔ)存槽4對(duì)熱交換槽3供給的高速循環(huán)液體的溫度下降維持在最小限度，該等流路的流路內(nèi)徑宜為2mm以上。
[0110]于圖1的實(shí)施例中亦已說(shuō)明，于各儲(chǔ)存槽及各輔助溫度控制機(jī)構(gòu)，配置有測(cè)量液體溫度的液溫傳感器16，根據(jù)該傳感器16的各信息，可將各儲(chǔ)存槽4的熱源5的溫度控制、及通過(guò)各輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10的液體溫度，微調(diào)成與儲(chǔ)存槽4的溫度相同的溫度。又，通過(guò)導(dǎo)入該輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10，可使儲(chǔ)存槽4的溫度緩沖功能成為最小，可將儲(chǔ)存槽4的容量，亦即循環(huán)液體量保持在最小。又，于本實(shí)施例，相對(duì)于圖1實(shí)施例的2溫度PCR反應(yīng),可實(shí)現(xiàn)分別對(duì)應(yīng)于改質(zhì)、退火、延長(zhǎng)3種狀態(tài)的3溫度PCR反應(yīng)而構(gòu)成。在此，有關(guān)高溫、中溫、低溫3溫度的控制，就高溫而言，(圖13，中央儲(chǔ)存槽4)為了變性而保持95°C以上的高溫，因此儲(chǔ)存槽溫度僅利用加溫系統(tǒng)即足夠，但就中溫、低溫儲(chǔ)存槽而言，有時(shí)須根據(jù)使用酶的種類(lèi)，進(jìn)行其反應(yīng)溫度，亦即儲(chǔ)存槽溫度的微調(diào)。在此，可通過(guò)來(lái)自熱源的熱量供給，容易地實(shí)現(xiàn)各儲(chǔ)存槽4內(nèi)的液體溫度上升，而降低溫度時(shí)，例如可通過(guò)附加于儲(chǔ)存槽4的輔助溫度放熱機(jī)構(gòu)17來(lái)降低液溫。該輔助溫度放熱機(jī)構(gòu)17僅于欲使儲(chǔ)存槽4內(nèi)的液體溫度降低時(shí)動(dòng)作，采用通過(guò)嵌入機(jī)構(gòu)內(nèi)的泵系統(tǒng)，以高速吸入儲(chǔ)存槽內(nèi)的液體，并通過(guò)嵌入有空冷式或帕耳帖組件等冷卻機(jī)構(gòu)的流路的程序，來(lái)使液體的熱量放熱，直到最后確認(rèn)成為通過(guò)設(shè)置于儲(chǔ)存槽4內(nèi)的液溫傳感器16所設(shè)定的液溫為止，可進(jìn)行液體冷卻。
[0111]因此，各儲(chǔ)存槽4的液體如圖1至圖6的說(shuō)明所描述，從熱源5對(duì)儲(chǔ)存槽4供給熱，通過(guò)溫度傳感器16的回授控制，將各儲(chǔ)存槽的溫度保持在高溫(熱改質(zhì)溫度)、中溫(延長(zhǎng)反應(yīng)溫度)、低溫(退火反應(yīng)溫度)。又，由于以高于室溫的高溫進(jìn)行溫度控制，因此為了有效進(jìn)行熱對(duì)流，熱源位置宜配置于儲(chǔ)存槽4的底面，而且不僅使儲(chǔ)存槽4內(nèi)的液體溫度進(jìn)行熱對(duì)流，為了使其高速成為均溫，通過(guò)攪拌機(jī)構(gòu)6等使得液體的溫度分布成為一樣的機(jī)構(gòu)進(jìn)行動(dòng)作，以使溫度成為均溫而構(gòu)成。然后，從各儲(chǔ)存槽4，始終以例如流速1mL/秒，通過(guò)泵6排出液體，不通過(guò)配置于該泵的后段的切換閥8，將液體誘導(dǎo)至熱交換槽3時(shí)，使其通過(guò)旁通流路9而回流至輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10，將液體溫度微調(diào)成儲(chǔ)存槽4的設(shè)定溫度后，回流至儲(chǔ)存槽4。亦即，進(jìn)行儲(chǔ)存槽4 —泵7 —切換閥8 —輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10 —儲(chǔ)存槽4的循環(huán)，預(yù)先完成準(zhǔn)備態(tài)勢(shì)。另，在欲使反應(yīng)槽I的溫度變化為該液體溫度時(shí)，將泵7后段的切換閥8往熱交換槽3方向切換，且亦開(kāi)關(guān)從熱交換槽3排出的液體流動(dòng)方向的切換閥8，循環(huán)如儲(chǔ)存槽4 —泵7 —切換閥8 —熱交換槽3 —切換閥8 —輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10 —儲(chǔ)存槽4，使反應(yīng)槽I的溫度變化為與預(yù)定的儲(chǔ)存槽4的液體溫度相同的溫度。
[0112]又，于3個(gè)儲(chǔ)存槽4，由于在該切換程序中，液體回流會(huì)發(fā)生些許的量偏差，因此在獨(dú)立運(yùn)用3個(gè)儲(chǔ)存槽時(shí)，于重復(fù)反應(yīng)程序中，于液面高度產(chǎn)生差異，可能發(fā)生液體從槽溢出，或從3個(gè)槽的送液速度產(chǎn)生差異。為了處置此問(wèn)題，亦可設(shè)置連結(jié)管15，作為輔助性使液面高度齊平的機(jī)構(gòu)。該連結(jié)管15的目的在于使液面高度齊平，并不以積極移動(dòng)不同溫度的液體作為目的，因此宜為充分細(xì)的管。又，其配置位置宜為各儲(chǔ)存槽4的底面附近。
[0113]使用3溫度的儲(chǔ)存槽4進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，與圖6B的2溫度時(shí)的PCR反應(yīng)相同，使用典型例來(lái)說(shuō)明本裝置系統(tǒng)的動(dòng)作。在此，以如下步驟進(jìn)行3溫度PCR反應(yīng)。首先，作為初始反應(yīng)，使溫度成為94°C以上，以進(jìn)行反應(yīng)的雙股DNA進(jìn)行熱改質(zhì)，從設(shè)定為95°C或96°C的高溫儲(chǔ)存槽4，將高溫液體回流10秒以上，使反應(yīng)槽I的溫度成為94°C以上達(dá)10秒以上。在此，設(shè)定上述高溫儲(chǔ)存槽4的溫度，使得進(jìn)行熱變性時(shí)的溫度，即使于反應(yīng)槽I整體的溫度分布產(chǎn)生差異時(shí)，溫度最低處的溫度仍為94°C以上。藉此，制備單鏈DNA，并且依酶類(lèi)而定，活化PCR反應(yīng)所需的酶類(lèi)。接著，使引物與DNA特殊結(jié)合的退火步驟，通過(guò)來(lái)自為使反應(yīng)槽溫度約略成為60°C而設(shè)定液溫為60°C的低溫儲(chǔ)存槽4的液體回流，使得反應(yīng)槽I的溫度成為60°C,將該循環(huán)進(jìn)行I秒，最后是通過(guò)耐熱性DNA聚合酶的互補(bǔ)DNA鏈的延長(zhǎng)反應(yīng),為使反應(yīng)槽I約略成為72°c，于設(shè)定為中溫的儲(chǔ)存槽4的溫度成為72°C的條件下，將中溫的儲(chǔ)存槽4的液體循環(huán)進(jìn)行3秒，于延長(zhǎng)結(jié)束時(shí)，再次進(jìn)行熱變性步驟，以來(lái)自高溫儲(chǔ)存槽4的95°C液體的循環(huán)I秒，使得反應(yīng)槽I的溫度進(jìn)展至94°C以上的溫度，接著以低溫60°C I秒、中溫72°C 3秒的反應(yīng)作為I循環(huán)，重復(fù)反應(yīng)約略40循環(huán)，藉此可進(jìn)行作為目標(biāo)的DNA序列區(qū)的放大。在此，為了實(shí)際上使得溫度不從儲(chǔ)存槽4的溫度發(fā)生下降，須以對(duì)于送液至熱交換槽3充分的高速，使液體回流。于本實(shí)施例，液體的循環(huán)速度約為1mL/秒，以防止溫度下降的形式，可進(jìn)行溫度變化。又，于上述實(shí)施例，退火溫度系依設(shè)計(jì)的引物，與最佳引物的結(jié)合溫度會(huì)有不同，因此宜利用后述的熔解曲線分析，算出最佳的退火溫度，于該溫度，設(shè)定低溫儲(chǔ)存槽4的溫度。又，于上述實(shí)施例，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為3秒，但不限定于此，通過(guò)從DNA聚合酶的延長(zhǎng)速度與目標(biāo)序列尺寸的關(guān)系算出，可適當(dāng)決定設(shè)定時(shí)間。例如由代表性的Taq聚合酶所造成的DNA延長(zhǎng)速度，在70°C時(shí)，約為60核苷酸/秒，因此在該酶的情況下，以3秒的延長(zhǎng)反應(yīng)，可放大150?180堿基長(zhǎng)的目標(biāo)區(qū)。因此，為了有效實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的裝置系統(tǒng)下的高速PCR反應(yīng)，宜將目標(biāo)區(qū)集中于數(shù)百堿基長(zhǎng)而進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，根據(jù)目的選擇最佳的DNA聚合酶，盡量使用進(jìn)行高速反應(yīng)的聚合酶。
[0114]又，以上述3溫度進(jìn)行循環(huán)時(shí)，可搭配組合終點(diǎn)型測(cè)量與采實(shí)際時(shí)間(實(shí)時(shí))的放大測(cè)量的至少兩種測(cè)量法。于圖1亦已表示，于本發(fā)明的高速基因放大裝置，可嵌入光學(xué)偵測(cè)系統(tǒng)，就光學(xué)上監(jiān)測(cè)目標(biāo)基因產(chǎn)物的放大。一般使用由于被帶進(jìn)稱(chēng)為嵌入劑型的雙鏈DNA的氫結(jié)合區(qū)，熒光強(qiáng)度會(huì)大幅變化的熒光色素進(jìn)行測(cè)量時(shí)，就量化地測(cè)量產(chǎn)物量而言，目標(biāo)DNA產(chǎn)物為雙鏈系甚為重要。因此，終點(diǎn)型由于可于反應(yīng)結(jié)束后測(cè)量，因此宜于反應(yīng)結(jié)束后，在可于雙鏈DNA狀態(tài)下測(cè)量的溫度范圍內(nèi)，令其穩(wěn)定而測(cè)量，或者于最后放大循環(huán)結(jié)束后，立即測(cè)定熒光強(qiáng)度，通過(guò)與放大反應(yīng)開(kāi)始前的熒光強(qiáng)度比較分析，來(lái)估計(jì)由雙鏈DNA所造成的熒光強(qiáng)度的放大量。在此，作為重要的注意點(diǎn)，由于熒光色素會(huì)有溶液中的熒光強(qiáng)度取決于溶液溫度而變化的熱熒光消光現(xiàn)象，因此測(cè)量時(shí)的溫度務(wù)必以相同溫度進(jìn)行，此甚為重要。
[0115]另，于實(shí)際時(shí)間測(cè)量，從估計(jì)各放大循環(huán)的放大量來(lái)看，須于各循環(huán)測(cè)量。各循環(huán)的測(cè)量時(shí)序宜于上述延長(zhǎng)反應(yīng)接近結(jié)束，熱變性正要開(kāi)始前測(cè)量。在此，同樣為了排除熱熒光消光的影響，在各循環(huán)測(cè)量時(shí)的溶液溫度宜設(shè)為相同溫度。又，于一般稱(chēng)為T(mén)aqMan探針?lè)?，使用具?’_3’核酸外切酶功能的DNA聚合酶、及為了對(duì)應(yīng)熒光能量移動(dòng)而嵌入有給體熒光色素與受體熒光色素的探針DNA片段而測(cè)量時(shí)，由于5’ -3’核酸外切酶反應(yīng)是于DNA聚合酶的延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)進(jìn)展，因此于終點(diǎn)型，將測(cè)量開(kāi)始前的給體熒光色素與受體熒光色素，于各自的熒光波長(zhǎng)測(cè)定熒光強(qiáng)度后，進(jìn)行基因放大反應(yīng)，于結(jié)束后，將給體熒光色素與受體熒光色素，于各自的熒光波長(zhǎng)測(cè)定熒光強(qiáng)度后，量化地偵測(cè)探針DNA實(shí)際上被酶所分解的程度，藉此可分析目標(biāo)堿基序列的有無(wú)。在此，同樣為了排除熱熒光消光的影響，測(cè)量時(shí)的溶液溫度宜設(shè)為相同溫度。另，于實(shí)際時(shí)間側(cè)量，探針DNA片段的分解反應(yīng)若于聚合酶的延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)進(jìn)展之后，各放大循環(huán)的延長(zhǎng)反應(yīng)結(jié)束時(shí)，或者熱變性時(shí)，進(jìn)行退火時(shí)的給體熒光色素的波長(zhǎng)與受體警告色素的波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度測(cè)量即可。其中，在此作為應(yīng)留意點(diǎn)，同樣為了排除熱熒光消光的影響，測(cè)量時(shí)的溶液溫度宜設(shè)為相同溫度。
[0116]又，使用于本發(fā)明的高速PCR反應(yīng)的反應(yīng)槽I可為拋棄式芯片，因此進(jìn)行交換時(shí)，須采取排出充滿(mǎn)于熱交換槽3中的液體,成為無(wú)液體狀態(tài)后,取下反應(yīng)槽套體2,然后取下反應(yīng)槽I的程序。因此，于圖13所示的實(shí)施例，配置為空氣的流入管2001夾住閥(切換閥)8而與熱交換槽3接觸，又，熱交換槽3的液體的排出管2002同樣經(jīng)過(guò)閥(切換閥)8、液體排出泵6，連接于通往儲(chǔ)存槽4的I個(gè)輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10的循環(huán)路徑。實(shí)際上，于使用3溫度的儲(chǔ)存槽4的液體進(jìn)行基因放大反應(yīng)等時(shí)，裝設(shè)于管2001、2002的2個(gè)閥8被關(guān)閉，不會(huì)對(duì)來(lái)自3個(gè)儲(chǔ)存槽4的液體的回流造成影響。于基因放大反應(yīng)結(jié)束的階段，切換與3個(gè)儲(chǔ)存槽4結(jié)合的6個(gè)切換閥8，不與本熱交換槽3進(jìn)行液體交換而切離，其后將連接于管2001、2002的各個(gè)的閥8予以連接，使用泵7，將熱交換槽3內(nèi)部的液體送液至例如低溫用的儲(chǔ)存槽4的輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10，熱交換槽3內(nèi)部能以空氣來(lái)充滿(mǎn)。如此之后，交換反應(yīng)槽1，重新裝上別的反應(yīng)槽1，封閉連接于管2001、2002的切換閥8，當(dāng)從出自?xún)?chǔ)存槽4的回流系統(tǒng)開(kāi)始將液體送液時(shí)，熱交換槽3內(nèi)被液體充滿(mǎn)，可重開(kāi)一般的基因放大反應(yīng)。
[0117]進(jìn)而言之，于本發(fā)明的裝置，通過(guò)利用進(jìn)行液體溫度控制的機(jī)構(gòu)，亦可進(jìn)行熔解曲線測(cè)定。進(jìn)行熔解曲線分析時(shí)，例如對(duì)反應(yīng)槽I的反應(yīng)液，連續(xù)從65至95°C，以ramprate0.1 TC /sec給予溫度變化，一面以設(shè)置于反應(yīng)槽I內(nèi)的液溫傳感器，監(jiān)測(cè)反應(yīng)槽I的溫度，一面使用如圖1所示的光學(xué)測(cè)量模塊，測(cè)量當(dāng)時(shí)反應(yīng)槽I的PCR反應(yīng)液的嵌入劑熒光色素的強(qiáng)度變化等，可測(cè)量溫度與熒光強(qiáng)度的相關(guān)熔解曲線分析的測(cè)量。此時(shí)，例如使用圖13的3個(gè)儲(chǔ)存槽4中嵌入了輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10的儲(chǔ)存槽，首先降低儲(chǔ)存槽內(nèi)的液溫，直到成為預(yù)定的低溫側(cè)的開(kāi)始溫度。接著，對(duì)儲(chǔ)存槽內(nèi)的熱源逐漸些許加施熱量，一面以溫度傳感器16進(jìn)行測(cè)量，一面進(jìn)行恰為0.1 TC /sec程度的溫度上升的熱量供給，在此同時(shí)，對(duì)熱交換槽3供給該儲(chǔ)存槽的液體。從熱交換槽3返回的液體系以輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10，調(diào)整成與儲(chǔ)存槽的溫度相同的溫度。然后，最后作為最終溫度，若達(dá)到95°C，為了降低儲(chǔ)存槽內(nèi)的液溫，再次通過(guò)輔助溫度放熱機(jī)構(gòu)17，將液體溫度降低至當(dāng)初設(shè)定的溫度即可。
[0118]于圖1亦已說(shuō)明，反應(yīng)槽I系由反應(yīng)槽套體2保持在密閉狀態(tài)。于較佳實(shí)施例,反應(yīng)槽套體2系根據(jù)由溫度傳感器16測(cè)量的溫度數(shù)據(jù)，通過(guò)嵌入于反應(yīng)槽套體2的加熱器始終保持在75°C以上。通過(guò)利用該加熱器加熱，防止套體內(nèi)的水蒸汽在套體的內(nèi)表面冷凝，藉此，套體內(nèi)的水蒸汽保持在一定，其結(jié)果，反應(yīng)槽的液滴即使以無(wú)添加礦物油等的暴露狀態(tài)的液滴狀態(tài)來(lái)配置，仍可不蒸發(fā)且于50?97°C的范圍內(nèi)進(jìn)行溫度變化。
[0119]又，同樣地，熔解曲線分析用的溫度控制手法，亦可為了以不同于PCR反應(yīng)的溫度，來(lái)保持于一定溫度而采用。藉此，亦可針對(duì)反應(yīng)槽的PCR反應(yīng)液,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。例如亦能以50°C的液體溫度，使液體回流10分鐘以上，藉此從RNA對(duì)DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后，將該儲(chǔ)存槽的溫度調(diào)整為一般進(jìn)行PCR反應(yīng)的溫度，連續(xù)從反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進(jìn)展至PCR反應(yīng)。
[0120]具體上接續(xù)于反轉(zhuǎn)錄步驟而進(jìn)行的基因放大反應(yīng)的步驟，包括單步操作(反轉(zhuǎn)錄與放大在I個(gè)管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行)或二步操作(反轉(zhuǎn)錄與放大在個(gè)別的管內(nèi)進(jìn)行)兩種步驟，在此以單步操作為例來(lái)表示操作程序的一個(gè)實(shí)施例。作為對(duì)于短目標(biāo)的單步RT-PCR用反轉(zhuǎn)錄酶，例如使用Tth DNA Polymerase(Roche)時(shí)，該反應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度為55?70°C，因此(I)將低溫儲(chǔ)存槽的溫度設(shè)定為低于一般退火溫度的50?60°C，使該低溫儲(chǔ)存槽4的液體以30分鐘程度回流至熱交換槽3，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，接著(2)通過(guò)高溫儲(chǔ)存槽4，對(duì)熱交換槽3使94°C以上的液體回流約2分鐘，進(jìn)行初始熱變性，其后，(3)作為放大循環(huán)，以3秒循環(huán)進(jìn)行如下程序及反應(yīng):通過(guò)來(lái)自高溫儲(chǔ)存槽4的94°C以上的液體進(jìn)行I秒以上的熱變性程序，接著是對(duì)應(yīng)于來(lái)自為了退火用而進(jìn)行了溫度調(diào)整的低溫儲(chǔ)存槽4的引物特性，通過(guò)45?66°C的液體所進(jìn)行的退火程序，然后是配合中溫儲(chǔ)存槽4的酶特性，通過(guò)68?70°C的液體進(jìn)行延長(zhǎng)反應(yīng)。于該實(shí)施例中，3種不同溫度的儲(chǔ)存槽4的I種溫度，調(diào)整為對(duì)于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)最佳的溫度，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，再次重設(shè)定為對(duì)于PCR反應(yīng)最佳的溫度，進(jìn)行3溫度基因放大反應(yīng)，亦可同樣附加對(duì)于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)最佳的溫度的第4儲(chǔ)存槽4，進(jìn)行上述程序。
[0121]圖14系表示用以使反應(yīng)槽I具有上述熔解曲線分析的測(cè)量功能的其他手法的實(shí)施例之一。于該實(shí)施例，帕耳帖溫度控制機(jī)構(gòu)19配置于熱交換槽3的底面，在此，于帕耳帖溫度控制機(jī)構(gòu)19，貫通有PCR反應(yīng)用循環(huán)液體的流路管20，因此可同樣進(jìn)行上述圖13所述的高速PCR反應(yīng)用的液體循環(huán)，進(jìn)而于進(jìn)行熔解曲線分析時(shí)，使液體流路管20的液流18停止，通過(guò)帕耳帖溫度控制機(jī)構(gòu)19及熱交換槽3內(nèi)的溫度傳感器16，控制充滿(mǎn)于熱交換槽3的靜止液體的溫度，來(lái)進(jìn)行熔解曲線分析。又，該機(jī)構(gòu)同樣可用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。屆時(shí)，可由帕耳帖溫度控制機(jī)構(gòu)19提供對(duì)于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)最佳的溫度及時(shí)間，于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束時(shí)，使用圖1所示的2溫度基因放大裝置的構(gòu)成、或圖13所示的3溫度基因放大裝置的構(gòu)成，接著連續(xù)進(jìn)行聞速基因放大。
[0122]圖15系表示本發(fā)明的連續(xù)拋棄式反應(yīng)槽I的利用方法的一個(gè)實(shí)施例，以及包括可進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)槽I的反應(yīng)槽部的一個(gè)實(shí)施例的模式圖。本發(fā)明的反應(yīng)槽I系如上述圖13的說(shuō)明所述，可作為拋棄式芯片來(lái)使用。此時(shí)，如圖15的A-A剖面圖所示，例如進(jìn)行高速基因放大反應(yīng)的反應(yīng)槽典型上通過(guò)包括:用以進(jìn)行PCR的反應(yīng)槽1，以固定反應(yīng)槽I的O型環(huán)1010等保證了隔熱性與密閉型的間隔件，夾住反應(yīng)槽I上下的反應(yīng)槽套體2與熱交換槽3，及用以搬運(yùn)反應(yīng)槽的導(dǎo)軌1011，可沿著導(dǎo)軌1011將復(fù)數(shù)個(gè)反應(yīng)槽I搬運(yùn)至反應(yīng)槽部1015。將反應(yīng)槽I用于反應(yīng)時(shí)，通過(guò)以反應(yīng)槽套體2與熱交換槽3夾住，通過(guò)O型環(huán)1010使反應(yīng)槽I固定，可從液體儲(chǔ)存槽4導(dǎo)入液體。另，搬運(yùn)時(shí)，通過(guò)使反應(yīng)槽套體2與熱交換槽3脫離反應(yīng)槽1，松開(kāi)O型環(huán)1010，可使反應(yīng)槽I的芯片沿著導(dǎo)軌1011移動(dòng)而交換。從圖15的A-A剖面圖可知，反應(yīng)槽套體2系為了就光學(xué)上觀察并測(cè)量配置于反應(yīng)槽I上的反應(yīng)液，可采取在光學(xué)上呈透明的構(gòu)成。此時(shí)，于2片薄的玻璃板1013之間，夾入ITO等通過(guò)阻抗有效引起發(fā)熱的透明電極1014，可對(duì)光學(xué)式觀測(cè)不造成妨礙且控制反應(yīng)槽套體2的溫度。尤其通過(guò)于內(nèi)側(cè)的玻璃板1013內(nèi)面設(shè)置溫度傳感器16，調(diào)整為75°C以上的溫度，可防止反應(yīng)槽套體2內(nèi)面冷凝，防止蒸汽壓變化，因該結(jié)果，可防止配置于反應(yīng)槽I上的反應(yīng)液蒸發(fā)。
[0123]又，通過(guò)于導(dǎo)軌1011上反應(yīng)槽部1015的前段，配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)槽部1016，可將RNA樣本反轉(zhuǎn)錄于cDNA，以后段的反應(yīng)槽部1015，進(jìn)行高速基因放大。于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)槽部1016，從圖15的B-B剖面圖亦可知，與反應(yīng)槽套體2相同構(gòu)成的套體，為了就光學(xué)上觀察并測(cè)量配置于反應(yīng)槽I上的反應(yīng)液，可采取在光學(xué)上呈透明的構(gòu)成。此時(shí)，于2片薄的玻璃板1013之間，夾入ITO等通過(guò)阻抗有效引起發(fā)熱的透明電極1014，可對(duì)光學(xué)式觀測(cè)不造成妨礙且控制套體內(nèi)部的溫度。尤其通過(guò)于內(nèi)側(cè)的玻璃板1013內(nèi)面設(shè)置溫度傳感器16，調(diào)整為75°C以上的溫度，可防止反應(yīng)槽套體2內(nèi)面冷凝，防止蒸汽壓變化，因該結(jié)果，可防止配置于反應(yīng)槽I上的反應(yīng)液蒸發(fā)。于反應(yīng)槽I的下面，配置有反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用溫度板1012，對(duì)反轉(zhuǎn)錄最佳的溫度設(shè)定于例如50°C的狀態(tài)下，通過(guò)緊貼于反應(yīng)槽1，以50°C使裝有PCR溶液的反應(yīng)槽I的板溫度反應(yīng)30分鐘程度，于反轉(zhuǎn)錄完畢時(shí)，其后通過(guò)讓導(dǎo)軌滑動(dòng)于反應(yīng)槽部1015，以開(kāi)始PCR。
[0124]圖16系表不本發(fā)明的多樣本的基因放大反應(yīng)的實(shí)時(shí)偵測(cè)方法的一個(gè)實(shí)施例的模式圖。本發(fā)明的反應(yīng)偵測(cè)裝置在典型上包括多孔反應(yīng)槽(react1n vessel) 1101、配置為數(shù)組狀的復(fù)數(shù)個(gè)反應(yīng)孔1102、及偵測(cè)裝置1201。通過(guò)使偵測(cè)裝置1201，于PCR反應(yīng)中往例如方向1202掃描，偵測(cè)反應(yīng)孔1102上的PCR樣本的熒光強(qiáng)度，藉此包括以數(shù)目少于反應(yīng)孔數(shù)的偵測(cè)器，測(cè)定全樣本中的熒光強(qiáng)度的功能。在此，如圖13的說(shuō)明亦已敘述，于采嵌入劑方式進(jìn)行熒光偵測(cè)時(shí)，宜于PCR的延長(zhǎng)反應(yīng)結(jié)束時(shí)，且于開(kāi)始熱變性前的雙鏈DNA狀態(tài)尚維持的時(shí)間內(nèi)測(cè)量。又，于TaqMan探針?lè)绞?，突光探針的PCR延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生量變化的突光探針量的熒光偵測(cè)時(shí)，從PCR延長(zhǎng)反應(yīng)結(jié)束后的時(shí)序，可于熱變性、退火階段的任一階段測(cè)量。其中，于任一情況下，為了比較測(cè)量熒光強(qiáng)度，宜使得含熒光色素的反應(yīng)液的溫度相同。此系為了防止由于具溫度相依性的熒光消光，即使反應(yīng)液內(nèi)的熒光色素量相同，因溫度不同導(dǎo)致熒光強(qiáng)度不同。
[0125]圖17系表不本發(fā)明的多樣本的基因放大反應(yīng)的實(shí)時(shí)偵測(cè)方法的一個(gè)實(shí)施例的模式圖。本發(fā)明的反應(yīng)偵測(cè)裝置在典型上包括多孔反應(yīng)槽1101、配置為數(shù)組狀的復(fù)數(shù)個(gè)反應(yīng)孔1102、及偵測(cè)探針1203。準(zhǔn)備與位于1101上的反應(yīng)孔1102的數(shù)目同量的偵測(cè)探針1203的數(shù)組，定點(diǎn)觀測(cè)PCR樣本的熒光強(qiáng)度，以便測(cè)量無(wú)分段的連續(xù)的時(shí)間變化，藉此可與圖16所示的掃描型不同，偵測(cè)連續(xù)的熒光強(qiáng)度變化。
[0126]圖18系作為用以使反應(yīng)槽I上的反應(yīng)液在PCR反應(yīng)中不干燥的手段，模式性地表示了將封入有為了防止載置于反應(yīng)孔1102上的樣本蒸發(fā)而封的封材1302，黏貼于反應(yīng)槽1101上的一個(gè)實(shí)施例。在此，為了使封材1302不與反應(yīng)孔1102中的樣本溶液1303相接，且于反應(yīng)液滴下時(shí)、搬運(yùn)時(shí)、PCR測(cè)定中，抑制樣本反應(yīng)液在孔內(nèi)的移動(dòng)，于各反應(yīng)孔的中心構(gòu)成有柱(柱體(pillar))1301的構(gòu)造的一個(gè)實(shí)施例。該柱1301采用由熱傳導(dǎo)性高的鋁等金屬的凸紋加工或附加而制作的構(gòu)造，或以光學(xué)上具穿透性的玻璃或塑料來(lái)制作。
[0127]藉此，5?1yL的PCR溶液不移動(dòng)于PCR反應(yīng)中，且可防止與密封劑相接。又，通過(guò)柱體可于更廣的表面積延展液滴，其結(jié)果，與單純于反應(yīng)槽1101的表面滴下反應(yīng)液的液滴的情況相比，可于更廣的表面積延展液滴，可更有效與熱交換槽交換反應(yīng)液溫度。又，柱體1301為光學(xué)上透明的塑料或PDMS等高分子構(gòu)造材料時(shí)，通過(guò)摻入會(huì)發(fā)出與實(shí)時(shí)PCR測(cè)定中偵測(cè)的波長(zhǎng)不同熒光的物質(zhì)，可作為校準(zhǔn)PCR的熒光強(qiáng)度的參考來(lái)使用。
[0128]圖19系表示于設(shè)置在反應(yīng)孔1102內(nèi)，由具光學(xué)性傳導(dǎo)性或光纖玻璃或塑料等材料形成的柱體1301表面，結(jié)合有DNA探針1306或引物，以使PCR反應(yīng)中的DNA可于附近雜交的一個(gè)實(shí)施例的模式圖。藉此，于有效進(jìn)行PCR反應(yīng)物放大時(shí),在柱體表面附近，DNA放大物有效結(jié)合，可利用柱體的光纖特性，以高于一般的偵測(cè)感度，將其熒光進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。發(fā)出熒光的手段可利用如圖19A所示，使用通過(guò)DNA雙鏈時(shí)嵌入，以發(fā)出熒光的SYBRGreen等嵌入劑1304的手段，或利用如圖19B所示，PCR反應(yīng)物1302雜交時(shí)，DNA的立體構(gòu)造崩解，藉此結(jié)合于DNA探針末端的熒光物質(zhì)1305發(fā)出熒光的熒光共鳴能量移動(dòng)(FRET)法的探針?lè)ǖ取；蛘?，于柱體1301表面或柱體1301中，導(dǎo)入熒光受體熒光色素，將嵌入劑作為給體熒光色素使用，藉此有效放大目標(biāo)DNA時(shí)，結(jié)合于柱表面的探針DNA與放大產(chǎn)物DNA結(jié)合，嵌入劑熒光有效產(chǎn)生于柱體表面，藉此亦可從柱的熒光發(fā)光來(lái)測(cè)量受體發(fā)光。此優(yōu)點(diǎn)若從以往采用嵌入劑的熒光強(qiáng)度變化的指針來(lái)觀察目標(biāo)DNA而言，通過(guò)熒光能量移動(dòng)，觀察受體熒光的發(fā)光信息的與別的嵌入劑熒光色素不同波長(zhǎng)的熒光，藉此可量化地測(cè)量，可實(shí)現(xiàn)噪聲更低的量化測(cè)量。
[0129]圖20系模式性地表示為了有效控制反應(yīng)液溶液，于反應(yīng)槽1101中，實(shí)現(xiàn)無(wú)法僅以現(xiàn)有的液滴滴下來(lái)實(shí)現(xiàn)，可于更廣的表面積與熱交換槽相接的反應(yīng)液的空間配置，通過(guò)微加工技術(shù)，于反應(yīng)槽中構(gòu)成反應(yīng)液的導(dǎo)入路徑及反應(yīng)區(qū)的一個(gè)實(shí)施例。本實(shí)施例所示的微流路型反應(yīng)槽1401系于上述圖1至19所示的實(shí)施例所用的熱傳道性良好的鋁薄板等的反應(yīng)槽1404上，黏著聚二甲基硅氧烷等具光學(xué)穿透性及彈性的材料所組成的流路形成用高分子1403。于該芯片配置有:樣本注入口 1405 ;微流路1402，通過(guò)毛細(xì)現(xiàn)象，從樣本注入口導(dǎo)入反應(yīng)液而通過(guò)；反應(yīng)液儲(chǔ)存槽1407，充滿(mǎn)反應(yīng)液；及空氣儲(chǔ)存槽，回收反應(yīng)液時(shí)按壓此，通過(guò)空氣壓從樣本注入口 1405回收反應(yīng)液。于該實(shí)施例，在將反應(yīng)液導(dǎo)入于注入口1405之后，以上述圖1或圖13所示的高速基因放大裝置進(jìn)行基因放大后，按壓樣本回收用空氣儲(chǔ)存槽1406，從樣本注入口 1405回收反應(yīng)液以5μ L以下較妥當(dāng)，宜將注入口 1405至反應(yīng)液儲(chǔ)存槽1407的容積抑制在5μ L以?xún)?nèi)。又，于上述實(shí)施例使用了空氣儲(chǔ)存槽，亦可如圖20Α-Α’剖面圖所示，將空氣儲(chǔ)存槽的位置設(shè)在樣本排出口 1408。此時(shí)，于反應(yīng)后的反應(yīng)液回收時(shí)，通過(guò)從樣本注入口 1405吹入空氣，可從樣本排出口 1408回收。又，于圖20的實(shí)施例，反應(yīng)液儲(chǔ)存槽1407的高度設(shè)定高于微流路1402，但為了更有效進(jìn)行熱交換，盡可能將反應(yīng)液儲(chǔ)存槽1407的高度設(shè)定較低，藉此可進(jìn)行更有效的PCR反應(yīng)。
[0130]圖21系針對(duì)圖13所示的實(shí)施例，作為溫度控制用液體的送液手段，模式性表示使用了注射泵1411時(shí)的一個(gè)實(shí)施例的。能以每秒1mL以上的流速進(jìn)行自動(dòng)送液及自動(dòng)吸液的注射泵1411表面，配置有熱源5，于注射泵中配置有溫度傳感器16，將溫度控制用的液體導(dǎo)入于熱交換槽3時(shí)，切換欲送液溫度的注射泵1411的切換閥8，從各注射泵經(jīng)接頭90而將液體導(dǎo)入于熱交換槽3。然后，從熱交換槽3返回的液體具如下功能:經(jīng)過(guò)接頭90及切換閥8而儲(chǔ)存于輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10，使液體回到與設(shè)定于注射泵1411內(nèi)的溫度相同的溫度后，回流至注射泵。然后，來(lái)自注射泵的送液結(jié)束，來(lái)自別的注射泵1411的其他溫度的送液開(kāi)始之際，使得切換閥8與注射泵1411及輔助溫度控制機(jī)構(gòu)10連接而進(jìn)行切換，將液體回收于注射泵1411內(nèi)而構(gòu)成。
[0131]圖22系表示為了反應(yīng)液的溫度控制，照射反應(yīng)液的水吸收強(qiáng)的紅外線，利用該吸收的溫度變化的一個(gè)實(shí)施例的。發(fā)明人已經(jīng)針對(duì)該聚焦紅外光吸收的高速PCR裝置技術(shù)，記載于日本特開(kāi)2008-278291，于圖22的本實(shí)施例，所采用的構(gòu)成系反應(yīng)液的溫度控制不以紅外雷射1510的強(qiáng)度控制來(lái)進(jìn)行，而使用連續(xù)為圓狀，穿透率階段性變化的漸變ND濾光片1515，及經(jīng)由軸體縝密控制該ND濾光片1514的角度的步進(jìn)馬達(dá)等馬達(dá)1513，通過(guò)使角度可高度變化，以使光強(qiáng)度高速變化。藉此不僅可達(dá)成急遽的溫度變化，而且通過(guò)設(shè)為各種一定旋轉(zhuǎn)各速度，不僅可正確且縝密進(jìn)行反應(yīng)液的每單位時(shí)間的溫度梯度，而且可將溫度變化自由編程。
[0132]圖22的本實(shí)施例的裝置構(gòu)成系以聚光透鏡1502，將來(lái)自照明用光源(鹵素?zé)舻?1501的可見(jiàn)光，為了可就光學(xué)上觀察自動(dòng)XY平臺(tái)1503上的反應(yīng)孔盤(pán)1507的各反應(yīng)液的狀態(tài)，經(jīng)由物鏡1508對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)，能以圖像觀察用攝像機(jī)(冷卻CXD等)1522來(lái)觀察。自動(dòng)XY平臺(tái)1503可通過(guò)X軸用馬達(dá)1504及Y軸用馬達(dá)1505驅(qū)動(dòng)，來(lái)觀察任意坐標(biāo)的孔。又，通過(guò)平臺(tái)加熱器1506，可控制反應(yīng)孔盤(pán)1507的溫度，成為例如退火溫度等PCR反應(yīng)中的最低溫度的溫度。另，紅外雷射1510可通過(guò)射束擴(kuò)束器1511、雷射遮斷器1512、漸變ND濾光片1515,以紅外雷射用分色鏡1509導(dǎo)入于顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)。又,漸變ND濾光片1515系其中心的軸體1514與步進(jìn)馬達(dá)等馬達(dá)1513相連接，藉此可利用漸變ND濾光片1515自由調(diào)整紅外雷射的穿透率。在此，關(guān)于漸變ND濾光片1515表面的ND的漸變模式，一般如圖23(a)所示，采用因應(yīng)其角度，以直線式ND = NDmax.( Θ / Θ mx)的關(guān)系變化者即可?；蛘撸ㄟ^(guò)取決于角度Θ，事先寫(xiě)入漸變的模式，藉此一面以一定的角速度旋轉(zhuǎn)，一面于水滴照射預(yù)定的穿透光強(qiáng)度的紅外線亦可。圖23(b)系以旋轉(zhuǎn)一圈時(shí)，用以進(jìn)行一般的3溫度PCR反應(yīng)的程序會(huì)成為I循環(huán)的方式來(lái)構(gòu)成漸變的I例。首先，從穿透光0%的狀態(tài)一口氣上升至100%的穿透，并使水滴溫度提高至95度以上的溫度，藉此進(jìn)行核酸的熱變性，接著使穿透光回到O%，以便預(yù)先使外部溫度從55度回復(fù)到60度程度的退火溫度，藉此水滴下將至退火溫度，進(jìn)而以ND濾光片圓盤(pán)的旋轉(zhuǎn),使得穿透光穿透例如30%程度,藉此可使水滴溫度變化為70度，PCR延長(zhǎng)反應(yīng)進(jìn)展。此時(shí)，在以一定角速度旋轉(zhuǎn)圓盤(pán)時(shí)，各穿透光的照射時(shí)間比可通過(guò)反應(yīng)于該漸變模式的空間配置來(lái)實(shí)現(xiàn)。為了量化測(cè)量反應(yīng)孔中的PCR反應(yīng)而進(jìn)行熒光反應(yīng)，于該光學(xué)系統(tǒng)，可將來(lái)自熒光激發(fā)用光源(水銀燈等)1517的激發(fā)光，經(jīng)由熒光激發(fā)光源用遮斷器1518、熒光激發(fā)光用投光透鏡1519，通過(guò)熒光激發(fā)光用分色鏡1516導(dǎo)入激發(fā)光，并經(jīng)由調(diào)整為不導(dǎo)入加熱用紅外雷射的波長(zhǎng)光以及激發(fā)光的攝像機(jī)用分色鏡1520、成像透鏡1521，通過(guò)冷卻CXD等圖像觀察用攝像機(jī)1522，量化地測(cè)量熒光強(qiáng)度而構(gòu)成。關(guān)于圖22所述的光學(xué)加熱法，可與上述圖1至21所述的手法靈活地搭配組合。
[0133]例如上述圖1至21的實(shí)施例，通過(guò)附加本圖22的光學(xué)加熱法，可不變更儲(chǔ)存槽4的溫度，簡(jiǎn)單地嵌入熔解曲線分析功能。具體而言，關(guān)于來(lái)自?xún)?chǔ)存槽4的高速循環(huán)液體的流動(dòng)，使最低溫度的液體預(yù)先循環(huán)，或于使高速循環(huán)液體的導(dǎo)入開(kāi)始前，對(duì)包含目標(biāo)核酸分子及嵌入劑功能的熒光色素的水滴，連續(xù)照射加熱用紅外雷射，此時(shí)，使得構(gòu)成為減光的漸變程度呈一次函數(shù)的線性(直線)減少的漸變ND濾光片1515，以水滴溫度充分安定追隨的程度的一定角速度旋轉(zhuǎn)，藉此可使水滴溫度直線地上升或下降。在此，關(guān)于上升，可于使其以ND大小減少的方向旋轉(zhuǎn)時(shí)實(shí)現(xiàn)，關(guān)于下降，可于使其以ND大小上升的方向旋轉(zhuǎn)時(shí)實(shí)現(xiàn)。通過(guò)以每秒0.1弧度以下的緩慢旋轉(zhuǎn)，記錄其角度信息及熒光強(qiáng)度變化，以便可通過(guò)采用以下所述從角度Θ的液滴溫度估計(jì)法，來(lái)獲得熒光強(qiáng)度的結(jié)果，可進(jìn)行熔解曲線分析。在此，溫度估計(jì)法系采用如下手法:將穿透光0%設(shè)為Θ = O弧度，穿透光100%設(shè)為Θ = 2 π弧度，預(yù)先調(diào)整照射光源的紅外線強(qiáng)度，使得照射穿透光100%時(shí)，水滴溫度會(huì)成為95度以上，一面原樣維持該調(diào)整過(guò)的熒光強(qiáng)度，一面旋轉(zhuǎn)漸變ND濾光片，以(Θ /2 ii ).(Tmax-Tmin)的關(guān)系式，從角度Θ的測(cè)定來(lái)估計(jì)水滴溫度。其中，在此，TmaxS穿透光100%的照射時(shí)的水滴溫度，Tmin為照射如的芽透光0%的水滴溫度。
[0134]或者，將本構(gòu)成與如圖23(b)所示的I系統(tǒng)高速回流系統(tǒng)搭配組合，亦可簡(jiǎn)單通過(guò)光學(xué)式光熱轉(zhuǎn)換，來(lái)實(shí)現(xiàn)高速PCR反應(yīng)，而前述I系統(tǒng)高速回流系統(tǒng)系于漸變ND濾光片的圓盤(pán)上，預(yù)先將穿透光的比率以Θ采一定速度旋轉(zhuǎn)作為前提，相依于Θ來(lái)配置，以便使得旋轉(zhuǎn)一圈時(shí)，一次或數(shù)次PCR反應(yīng)會(huì)結(jié)束，藉此使得目標(biāo)在于令液滴的最低溫度安定化的最低溫度的高速液體回流。在此，由于高速回流系統(tǒng)為I系統(tǒng)，因此無(wú)須嵌入上述圖1至21所記載的復(fù)雜切換閥或嵌入切換程序，而且儲(chǔ)存槽I個(gè)即足夠，可大幅簡(jiǎn)化構(gòu)成。
[0135]本發(fā)明還提供基因分析或基因放大用裝置，該裝置包括:反應(yīng)槽(react1nvessel),包括用以裝入含核酸的樣本液的I個(gè)或復(fù)數(shù)個(gè)孔(well);熱沉(heat sink)或熱交換槽(heat exchange chamber);熱沉或熱交換槽的溫度控制裝置(temperaturecontroller)(例如:溫度傳感器、熱電線、液體回流型溫度控制裝置)，將熱沉或熱交換槽保持在第I溫度而構(gòu)成；熱電組件(thermoelectric element)(例如:帕耳帖組件)，配置于熱沉或熱交換槽與反應(yīng)槽之間，中介熱沉或熱交換槽與反應(yīng)槽之間的熱移動(dòng)；及熱電組件控制裝置(thermoelectric element controller)(例如:溫度傳感器、計(jì)算機(jī)(例如:PC))，通過(guò)控制熱電組件的動(dòng)作(operat1n)，令反應(yīng)槽的溫度，在第I溫度與第2溫度之間變化；使得在熱電組件的動(dòng)作為關(guān)閉時(shí)，反應(yīng)槽的溫度成為第I溫度而構(gòu)成。
[0136]圖24系表示該類(lèi)本發(fā)明的基因分析或基因放大用裝置的構(gòu)成的非限定性的一個(gè)實(shí)施例的模式圖。圖24所示的本發(fā)明的實(shí)施例包括:DNA反應(yīng)芯片容器2401，用以保持含DNA的樣本；帕耳帖組件2403 ;熱傳導(dǎo)用薄板2402，用以提高帕耳帖組件2403與DNA反應(yīng)芯片容器2401之間的熱傳導(dǎo)效率；熱沉2404 ;熱電線2405，用以加熱熱沉2404 ;溫度傳感器2406，用以監(jiān)控DNA反應(yīng)芯片容器2401的溫度；溫度傳感器2407，用以監(jiān)控?zé)岢?404的溫度；觀察窗2408，用以觀察設(shè)于DNA反應(yīng)芯片容器2401的樣本；及熒光偵測(cè)模塊2409，用以經(jīng)由觀察窗2408，將樣本液中的樣本狀況進(jìn)行熒光觀察。
[0137]作為DNA反應(yīng)芯片容器2401，可直接使用前述液體回流型或光吸收加熱型反應(yīng)控制裝置所用的反應(yīng)容器構(gòu)成，以及光學(xué)熒光強(qiáng)度偵測(cè)系統(tǒng)。關(guān)于熱源，將控制在DNA延長(zhǎng)反應(yīng)溫度(中溫)的熱沉2404作為安定熱源使用，從該熱沉，經(jīng)由帕耳帖組件2403及使熱均質(zhì)傳遞于平面上的熱傳導(dǎo)用薄板2402(由包含鋁、杜拉鋁、金、銀、鎢、尼泊爾黃銅、鎂、鑰、鈹，及使用該等元素的合金的熱傳導(dǎo)性高的金屬或合金所構(gòu)成)，對(duì)DNA反應(yīng)芯片供給熱，能高速移動(dòng)至DNA變性溫度(高溫)，或使熱逸失而高速移動(dòng)至退火溫度(低溫)。溫度傳感器2406配置于被配置在反應(yīng)芯片正下的熱傳導(dǎo)用薄板2402上面，可實(shí)時(shí)監(jiān)控?zé)醾鲗?dǎo)板上面的反應(yīng)芯片的溫度，驅(qū)動(dòng)帕耳帖組件2403，以使該計(jì)測(cè)溫度與事先寫(xiě)入于程序的溫度經(jīng)時(shí)變化配置文件成為相同溫度。由于熱沉是由具有足以安定處于中溫的熱容量與熱傳導(dǎo)性的金屬等材料(例如:鋁、杜拉鋁、金、銀、鎢、尼泊爾黃銅、鎂、鑰、鈹，及使用該等元素的合金)所組成，因此從電熱線2405等可安定供給熱的模塊，監(jiān)控配置于熱沉的溫度傳感器2407的溫度，依據(jù)來(lái)自該傳感器2407的信息，通過(guò)溫度控制模塊(例如:回授控制機(jī)構(gòu))(電熱線等電流驅(qū)動(dòng)型熱源的情況下，此系控制電流量及極性，就液體回流型溫度控制裝置而言，此系具有對(duì)水溫加熱冷卻模塊傳送0N/0FF控制訊號(hào)的功能)，穩(wěn)定地將所需的熱供給至熱沉，保持中溫。本發(fā)明的最大特征在于通過(guò)將熱沉設(shè)定為中溫(備注:嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，為了將反應(yīng)槽或反應(yīng)容器設(shè)定為中溫，若考慮熱傳導(dǎo)損失，熱沉溫度可能從反應(yīng)容器的設(shè)定溫度往高溫或低溫側(cè)相當(dāng)偏離)，若使帕耳帖組件2403關(guān)閉，則可不過(guò)沖，且自律性地高速使得DNA反應(yīng)芯片的溫度，達(dá)到目標(biāo)的中溫的DNA延長(zhǎng)反應(yīng)溫度，以作為平衡溫度。一般而言，通過(guò)使用帕耳帖組件等回授控制組件持續(xù)供給熱，以維持一定溫度的手法，容易導(dǎo)致起因于回授控制的過(guò)沖或溫度振動(dòng)，且具有消耗電力非常大，由于連續(xù)的帕耳帖組件動(dòng)作而造成組件壽命縮短等問(wèn)題。另，如此通過(guò)關(guān)閉帕耳帖組件而可實(shí)現(xiàn)中溫的本發(fā)明，可于PCR反應(yīng)中最耗費(fèi)時(shí)間的PCR延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)關(guān)閉帕耳帖組件，又，無(wú)須使得在低溫側(cè)通過(guò)退火而結(jié)合的雙鏈DNA，冒著因溫度上升所造成的過(guò)沖而乖離的風(fēng)險(xiǎn)，即能以接近平衡點(diǎn)的形式達(dá)成延長(zhǎng)反應(yīng)溫度。又，由于高溫側(cè)的DNA變性溫度及低溫側(cè)的退火溫度為I秒程度短時(shí)間的帕耳帖組件動(dòng)作(變性反應(yīng)與退火反應(yīng))，且容許些許過(guò)沖，因此不須進(jìn)行嚴(yán)密的溫度控制，又，由于對(duì)DNA反應(yīng)芯片取出/置入熱的帕耳帖組件所接觸的熱源安定于中溫，因此關(guān)于用以達(dá)到目標(biāo)溫度所加施的電流量，亦可估計(jì)大約值。亦如上述液體回流型裝置例所示，DNA反應(yīng)芯片系于DNA反應(yīng)芯片容器2401的上面，配置有被配置了 ITO等發(fā)熱性透明電極的觀察窗2408，供給熱以使芯片上面的溫度成為75°C以上，藉此可防止芯片內(nèi)的試藥從底面蒸發(fā)及在容器上面冷凝，即使為微量的試藥反應(yīng)液，仍可使其不蒸發(fā)，以熒光偵測(cè)模塊2409偵測(cè)PCR反應(yīng)。
[0138]圖25系模式性表示實(shí)際上DNA反應(yīng)芯片中的試藥的反應(yīng)溫度(a)及對(duì)帕耳帖組件的電流施加例(b)。從圖可知，帕耳帖組件的動(dòng)作時(shí)間限于用以成為高溫及低溫的短時(shí)間動(dòng)作，又，成為低溫后往中溫的溫度變化，系通過(guò)熱沉對(duì)DNA反應(yīng)芯片的熱傳導(dǎo)所達(dá)成的熱平衡來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0139]若依據(jù)本發(fā)明，可進(jìn)行以高速令溫度變化的溫度控制。因此，就標(biāo)準(zhǔn)的PCR而言，例如變性溫度(高溫)設(shè)定為94°C，延長(zhǎng)溫度(中溫)設(shè)定為72°C，以及退火溫度(低溫)設(shè)定為55°C時(shí)，從中溫到高溫、高溫到中溫、中溫到低溫、以及低溫到中溫各個(gè)溫度變化所需時(shí)間，可成為例如2秒、I秒、0.9秒、0.8秒、0.7秒、0.6秒、0.5秒、0.4秒或0.3秒，亦或更短的時(shí)間。
[0140]于本實(shí)施例，例示了 3溫度PCR的情況，但同樣地，僅包括高溫及中溫的2溫度PCR，亦可同樣只以帕耳帖組件對(duì)高溫的開(kāi)啟/關(guān)閉(0N/0FF)來(lái)實(shí)現(xiàn)。又，關(guān)于熔解曲線分析或RT-PCR步驟，亦可通過(guò)使熱沉溫度緩慢變化來(lái)實(shí)現(xiàn)，或者通過(guò)溫度傳感器，一面回授控制帕耳帖組件對(duì)DNA反應(yīng)芯片的熱供給，一面緩慢使溫度變化來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0141]又，于本實(shí)施例雖使用熱沉及電熱線作為中溫?zé)嵩?，但于包括I個(gè)中溫液體儲(chǔ)存槽的高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置，或于諸如圖1、圖13、圖21所記載，可支持2溫度或3溫度的高速液體回流型的反應(yīng)控制裝置，亦可取代上述熱沉而使用設(shè)定為中溫的I個(gè)液體儲(chǔ)存槽及熱交換槽3。又，于包括可支持2溫度或3溫度的復(fù)數(shù)個(gè)儲(chǔ)存槽的液體回流型反應(yīng)控制裝置，具有中溫本身亦可有不同溫度變化的優(yōu)點(diǎn)。
[0142]產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0143]本發(fā)明系作為用以進(jìn)行要求嚴(yán)密控制樣本溫度的反應(yīng)的反應(yīng)裝置甚為有用。本發(fā)明亦作為用以進(jìn)行要求迅速變更樣本溫度的反應(yīng)的反應(yīng)裝置甚為有用。
[0144]本發(fā)明尤其作為可進(jìn)行高速、高精度、高放大率的PCR反應(yīng)的PCR裝置甚為有用。本發(fā)明的裝置亦可小型化，因此作為可攜式PCR裝置甚為有用。
[0145]符號(hào)說(shuō)明
[0146]I 反應(yīng)槽
[0147]2 反應(yīng)槽套體
[0148]3 熱交換槽
[0149]4 液體儲(chǔ)存槽
[0150]5 熱源
[0151]6 攪拌機(jī)構(gòu)
[0152]7 泵
[0153]8 切換閥
[0154]9 旁通流路
[0155]90接頭
[0156]10輔助溫度控制機(jī)構(gòu)
[0157]11進(jìn)口 A
[0158]12進(jìn)口 B
[0159]13出口 A
[0160]14出口 B
[0161]15連結(jié)管
[0162]16溫度傳感器
[0163]17輔助液體放熱裝置
[0164]18液體的流動(dòng)方向
[0165]19帕耳帖溫度控制機(jī)構(gòu)
[0166]20液體的流路管
[0167]2001 空氣的流入管
[0168]2002 熱交換槽的液體的排出管
[0169]2003 壓力泄閥
[0170]21、22、23、24、26、231 反應(yīng)槽
[0171]25冷凍干燥試藥
[0172]27分注管
[0173]28樣本
[0174]29纖維珠
[0175]31反應(yīng)槽
[0176]32反應(yīng)套體
[0177]33反應(yīng)槽承口
[0178]34螺紋槽
[0179]35封材
[0180]36錐形狀反應(yīng)槽套體
[0181]37,38 熱交換槽
[0182]41進(jìn)口閥 A
[0183]42出口閥 A
[0184]43進(jìn)口閥 B
[0185]44出口閥 B
[0186]51載玻片型反應(yīng)槽套體
[0187]52、58 熱交換槽的反應(yīng)槽承口
[0188]53導(dǎo)軌
[0189]54封材
[0190]55玻片承口
[0191]56鉸鏈
[0192]59反應(yīng)槽
[0193]61進(jìn)口 A
[0194]62出口 A
[0195]63進(jìn)口 B
[0196]64出口 B
[0197]65活塞
[0198]66反應(yīng)槽
[0199]67熱交換槽
[0200]71活塞
[0201]72活塞桿
[0202]73活塞
[0203]74磁鐵
[0204]75電磁線圈
[0205]76活塞
[0206]81旋轉(zhuǎn)閥
[0207]82旋轉(zhuǎn)軸
[0208]83熱交換槽
[0209]84反應(yīng)槽
[0210]91進(jìn)口 A
[0211]92出口 A
[0212]93進(jìn)口 B
[0213]94出口 B
[0214]95隔膜 A
[0215]96隔膜 B
[0216]97反應(yīng)槽
[0217]98熱交換槽
[0218]101 轉(zhuǎn)閥
[0219]102 溝槽
[0220]103 熱交換槽
[0221]104 進(jìn)口 A
[0222]105 出口 A
[0223]106 進(jìn)口 B
[0224]107 出口 B
[0225]108 流路
[0226]109 反應(yīng)槽
[0227]110溫度
[0228]111 經(jīng)過(guò)時(shí)間
[0229]201 熒光偵測(cè)器
[0230]202 控制分析部
[0231]203 控制訊號(hào)
[0232]204光學(xué)窗
[0233]1010O 型環(huán)
[0234]1011導(dǎo)軌
[0235]1012反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用溫度板
[0236]1013玻璃板
[0237]1014透明電極
[0238]1015反應(yīng)槽部
[0239]1016反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)槽部
[0240]1101反應(yīng)槽
[0241]1102反應(yīng)孔
[0242]1201突光偵測(cè)探針
[0243]1202熒光偵測(cè)探針的掃描方向
[0244]1203數(shù)組化的突光偵測(cè)探針
[0245]1301柱體
[0246]1302蒸發(fā)防止用封材
[0247]1303PCR 溶液
[0248]1304嵌入劑
[0249]1305熒光探針
[0250]1306DNA 探針
[0251]1401微流路型反應(yīng)槽
[0252]1402微流路
[0253]1403流路形成用高分子
[0254]1404反應(yīng)槽
[0255]1405樣本注入口
[0256]1406樣本回收用空氣儲(chǔ)槽
[0257]1407反應(yīng)液儲(chǔ)存槽
[0258]1408樣本排出口
[0259]1411樣本泵
[0260]1501照明用光源(鹵素?zé)舻?
[0261]1502聚光透鏡
[0262]1503自動(dòng)XY平臺(tái)
[0263]1504X軸用馬達(dá)
[0264]1505Y軸用馬達(dá)
[0265]1506平臺(tái)加熱器
[0266]1507反應(yīng)孔盤(pán)
[0267]1508物鏡
[0268]1509紅外雷射用分色鏡
[0269]1510紅外雷射
[0270]1511射束擴(kuò)束器
[0271]1512雷射遮斷器
[0272]1513馬達(dá)(步進(jìn)馬達(dá)等)
[0273]1514軸體
[0274]1515漸變ND濾光片
[0275]1516突光激發(fā)光用分色鏡
[0276]1517熒光激發(fā)用光源(水銀燈等)
[0277]1518熒光激發(fā)光源用遮斷器
[0278]1519熒光激發(fā)光用投光透鏡
[0279]1520攝像機(jī)用分色鏡
[0280]1521成像透鏡
[0281]1522圖像觀察用攝像機(jī)(C⑶等)
[0282]2401DNA反應(yīng)芯片容器
[0283]2402熱傳導(dǎo)用薄板
[0284]2403帕耳帖組件
[0285]2404熱沉
[0286]2405電熱線
[0287]2406、2407 溫度傳感器
[0288]2408觀察窗
[0289]2409熒光偵測(cè)模塊
【權(quán)利要求】
1.一種基因分析或基因放大用裝置，包括: 反應(yīng)槽，所述反應(yīng)槽包括用以裝入含核酸的樣本液的I個(gè)或復(fù)數(shù)個(gè)孔； 熱沉或熱交換槽； 所述熱沉或該熱交換槽的溫度控制裝置，用于將所述熱沉或所述熱交換槽保持在第I溫度; 熱電組件，配置于所述熱沉或所述熱交換槽與所述反應(yīng)槽的間，中介所述熱沉或熱交換槽與所述反應(yīng)槽的間的熱移動(dòng)；及 熱電組件控制裝置，通過(guò)控制所述熱電組件的動(dòng)作，令所述反應(yīng)槽的溫度，在所述第I溫度與第2溫度之間變化； 使得在前述熱電組件的動(dòng)作為關(guān)閉時(shí)，所述反應(yīng)槽的溫度成為所述第I溫度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中所述第I溫度為核酸的延長(zhǎng)反應(yīng)溫度； 所述第2溫度為(i)核酸的變性溫度，或?yàn)?ii)核酸的變性溫度或核酸的退火溫度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的裝置，其中所述溫度控制裝置包括: (i)溫度傳感器； (?)熱電線，用以加溫所述熱沉 '及 (iii)回授控制機(jī)構(gòu)，根據(jù)來(lái)自所述溫度傳感器的所述熱沉的溫度信息，控制對(duì)所述熱電線的電力供給。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的裝置，其中所述溫度控制裝置系通過(guò)令所述預(yù)定溫度液體，回流于保持有利用管狀流路而流體連接于所述熱交換槽的預(yù)定溫度液體的液體儲(chǔ)存槽與所述熱交換槽之間，來(lái)控制所述熱交換槽的溫度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的裝置，其中所述熱電組件控制裝置包括: 溫度傳感器；及 計(jì)算機(jī)，根據(jù)來(lái)自所述溫度傳感器的所述反應(yīng)槽的溫度信息，來(lái)控制所述熱電組件的動(dòng)作。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的裝置，其中所述熱電組件為帕耳帖組件。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的裝置，其中為了提高所述熱電組件與所述反應(yīng)槽之間的熱移動(dòng)效率，進(jìn)一步包括配置于所述熱電組件與所述反應(yīng)槽之間的熱傳導(dǎo)用薄板。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的裝置，其中所述反應(yīng)槽的底面及壁面系由厚度I微米至100微米，從鋁、鎳、鎂、鈦、鉬、金、銀及銅所組成的群組中選擇的金屬或硅所形成。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的裝置，其中所述樣本液的量系每一孔為數(shù)十微升以下。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的裝置，其中當(dāng)所述樣本液中含有熒光色素時(shí)，進(jìn)一步包括熒光偵測(cè)裝置，用以與所述反應(yīng)槽的溫度切換連動(dòng)而偵測(cè)所述孔內(nèi)的所述熒光色素所發(fā)出的熒光，用以測(cè)定熒光強(qiáng)度的時(shí)間變化。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的裝置，其中進(jìn)一步包括反應(yīng)槽套體，用以防止配置于所述孔的樣本液滴蒸發(fā)而密閉覆蓋，且用以防止冷凝。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的裝置，其中所述反應(yīng)槽套體進(jìn)一步包括孔洞或光學(xué)窗，用于測(cè)定來(lái)自該反應(yīng)槽套體內(nèi)的所述樣本的光學(xué)訊號(hào)；所述光學(xué)窗備有光學(xué)上透明的發(fā)熱體。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的裝置，其中于所述反應(yīng)槽的所述各孔的樣本配置場(chǎng)所，配置有支柱，樣本液蒸發(fā)防止用的密封劑以被該柱體支撐的方式覆蓋于所述孔，通過(guò)所述柱體，防止測(cè)定中的所述樣本液附著于所述蒸發(fā)防止用的密封劑。
14.一種使用根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的裝置進(jìn)行PCR的方法，包含如下步驟: (a)將含核酸的樣本液配置于孔的步驟； (b)將反應(yīng)槽的溫度，從作為第I溫度的核酸的延長(zhǎng)反應(yīng)溫度，切換為作為第2溫度的(i)核酸的變性溫度或(ii)核酸的變性溫度或核酸的退火溫度的步驟； (c)接著將所述反應(yīng)槽的溫度，從所述第2溫度切換為所述第I溫度的步驟；以及 (d)以預(yù)定的時(shí)間間隔，將步驟(b)及步驟(C)重復(fù)預(yù)定次數(shù)的步驟； 所述反應(yīng)槽的溫度從所述第2溫度向所述第I溫度的切換，系通過(guò)關(guān)閉所述熱電組件的動(dòng)作來(lái)進(jìn)行。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中于所述步驟(d)，將步驟(b)(ii)及步驟(c)重復(fù)預(yù)定次數(shù)時(shí)，以預(yù)定的時(shí)間間隔，重復(fù)交替進(jìn)行如下動(dòng)作: 將所述反應(yīng)槽的溫度，從作為所述第I溫度的核酸的延長(zhǎng)反應(yīng)溫度，切換為所述(b)(ii)作為第2溫度的核酸的變性溫度，以及接著將所述反應(yīng)槽的溫度，從所述核酸的變性溫度切換為所述第I溫度； 將所述反應(yīng)槽的溫度，從作為所述第I溫度的核酸的延長(zhǎng)反應(yīng)溫度，切換為所述(b)(ii)作為第2溫度的核酸的退火溫度，以及接著將所述反應(yīng)槽的溫度，從所述核酸的退火溫度切換為所述第I溫度。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104245915SQ201380018167
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月6日
【發(fā)明者】賢二 安田, 英之 寺薗, 賢徹 金, 服部　明弘 申請(qǐng)人:公益財(cái)團(tuán)法人神奈川科學(xué)技術(shù)研究院, 一般社團(tuán)法人片上席爾羅米克斯合伙, 國(guó)立大學(xué)法人東京醫(yī)科齒科大學(xué)