骨膜素基因的表達(dá)抑制核酸分子、骨膜素基因的表達(dá)抑制方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供抑制骨膜素基因的表達(dá)的新分子。骨膜素基因的表達(dá)抑制核酸分子的特征在于，包含由序列號1?19中的任一個堿基序列構(gòu)成的核苷酸作為骨膜素基因的表達(dá)抑制序列。利用本發(fā)明的表達(dá)抑制核酸分子，能夠抑制骨膜素基因的表達(dá)，因此能夠用于例如起因于骨膜素基因的表達(dá)的眼病，具體來說能夠用于增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變或黃斑變性等的治療。
【專利說明】骨膜素基因的表達(dá)抑制核酸分子、骨膜素基因的表達(dá)抑制 方法及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及成為眼病的原因的骨膜素（PeriOStin)基因的表達(dá)抑制核酸分子、骨 膜素基因的表達(dá)抑制方法及其用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，伴隨著糖尿病患者的增加，作為并發(fā)癥之一的糖尿病視網(wǎng)膜病變 (Diabetic Retinopathy :DR)患者正在增加。糖尿病視網(wǎng)膜病變根據(jù)疾病分期而分 類為單純糖尿病視網(wǎng)膜病變、前增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變和增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變 (Proliferative Diabetic Retinopathy JDR)。其中，增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變不僅存在 視力降低，而且有可能會失明。
[0003] 另外，作為眼病，老年性黃斑變性（Age-related Macular Degeneration :AMD)等 黃斑變性也同樣地成為問題。黃斑變性是因年齡增長或壓力等原因而出現(xiàn)黃斑變性、視力 降低的疾病。該疾病在嚴(yán)重時也有可能導(dǎo)致失明。
[0004] 這些眼病的起因是，脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜陷于缺氧狀態(tài)等，為了補(bǔ)充氧，在視網(wǎng)膜上下形 成新生血管。由于新生血管脆弱，因而容易破裂出血，所出的血液會遮蔽光程，因而視力降 低。另外，所述新生血管發(fā)展為被稱作增殖組織的纖維膜，由于該原因，還有可能產(chǎn)生牽引 性視網(wǎng)膜脫離。并且，若該狀態(tài)持續(xù)、反復(fù)而嚴(yán)重化，則有可能導(dǎo)致失明（專利文獻(xiàn)1)。因 此，關(guān)于這些眼病，要求提供能夠成為治療藥的新的候補(bǔ)物質(zhì)。
[0005] 有文獻(xiàn)報道，這些眼病與骨膜素基因的表達(dá)有關(guān)（非專利文獻(xiàn)1)。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007] 專利文獻(xiàn)
[0008] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開2011 - 220969號公報
[0009] 非專利文獻(xiàn)
[0010] 非專利文獻(xiàn) I :S. Yoshida et al.，Investigative Ophthalmology&Visual Science，2011，Vol. 52, No. 8


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 發(fā)明要解決的問題
[0012] 因此，本發(fā)明的目的在于提供可抑制骨膜素基因的表達(dá)的新分子、以及提供使用 了該分子的表達(dá)抑制方法和眼病的治療方法等用途。
[0013] 用于解決問題的方案
[0014] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的骨膜素基因的表達(dá)抑制核酸分子的特征在于，包含 下述（asl)、（as2)或（as3)的核苷酸作為骨膜素基因的表達(dá)抑制序列。
[0015] (asl)由序列號1?19中的任一個堿基序列構(gòu)成的核苷酸；
[0016] (as2)由所述（asl)的堿基序列中缺失、置換和/或添加了一個或多個堿基的堿基 序列構(gòu)成的、具有骨膜素基因的表達(dá)抑制功能的核苷酸；
[0017] (as3)由與所述（asl)的堿基序列具有90%以上的同源性的堿基序列構(gòu)成的、具 有骨膜素基因的表達(dá)抑制功能的核苷酸。
[0018] 本發(fā)明的組合物的特征在于，其包含本發(fā)明的所述表達(dá)抑制核酸分子。
[0019] 本發(fā)明的眼病用藥物的特征在于，其包含本發(fā)明的所述表達(dá)抑制核酸分子。
[0020] 本發(fā)明的抑制方法的特征在于，其為骨膜素基因的表達(dá)抑制方法，其使用本發(fā)明 的所述表達(dá)抑制核酸分子。
[0021] 本發(fā)明的眼病的治療方法的特征在于，其包括將本發(fā)明的所述表達(dá)抑制核酸分子 投與患者的步驟。
[0022] 發(fā)明的效果
[0023] 利用本發(fā)明的表達(dá)抑制核酸分子，能夠進(jìn)行骨膜素基因的表達(dá)抑制。因此，本發(fā)明 對于骨膜素基因的表達(dá)成為原因的眼病、例如增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變或黃斑變性等各種 眼病的治療有效。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1是示出本發(fā)明的核酸分子的一例的示意圖。
[0025] 圖2是示出本發(fā)明的核酸分子的另一例的示意圖。
[0026] 圖3是示出本發(fā)明的核酸分子的另一例的示意圖。
[0027] 圖4是示出本發(fā)明的核酸分子的另一例的示意圖。
[0028] 圖5是示出本發(fā)明的實施例1中的體外的骨膜素基因表達(dá)量的相對值的圖。
[0029] 圖6是本發(fā)明的實施例2的結(jié)果，（A)是示出小鼠的眼的纖維性增殖組織的體積 的圖，（B)是示出小鼠的眼的新生血管的體積的圖。
[0030] 圖7是示出本發(fā)明的實施例3中的體外的骨膜素基因表達(dá)量的相對值的圖。
[0031] 圖8是示出本發(fā)明的實施例4中的體外的骨膜素基因表達(dá)量的相對值的圖。
[0032] 圖9是示出本發(fā)明的實施例4中的體外的骨膜素基因表達(dá)量的相對值的圖。
[0033] 圖10是示出本發(fā)明的實施例5中的體外的骨膜素基因表達(dá)量的相對值的圖。

【具體實施方式】
[0034] 只要沒有特別提及，則本說明書中使用的用語能夠以該【技術(shù)領(lǐng)域】中通常所用的含 義使用。
[0035] 〈表達(dá)抑制核酸分子〉
[0036] 如前所述，本發(fā)明的表達(dá)抑制核酸分子（下文中也稱為"本發(fā)明的核酸分子"）的 特征在于，其為表達(dá)抑制用的核酸分子，包括下述（asl)、（as2)或（as3)的核苷酸作為骨膜 素基因的表達(dá)抑制序列。
[0037] (asl)由序列號1?19中的任一個堿基序列構(gòu)成的核苷酸；
[0038] (as2)由所述（asl)的堿基序列中缺失、置換和/或添加了一個或多個堿基的堿基 序列構(gòu)成的、具有骨膜素基因的表達(dá)抑制功能的核苷酸；
[0039] (as3)由與所述（asl)的堿基序列具有90%以上的同源性的堿基序列構(gòu)成的、具 有骨膜素基因的表達(dá)抑制功能的核苷酸。
[0040] 下文中，將所述（asl)、（as2)或（as3)的核苷酸稱為as核苷酸，分別稱為asl核 苷酸、as2核苷酸、as3核苷酸。
[0041] 本發(fā)明中，對骨膜素基因的表達(dá)的抑制沒有特別限制，例如，可以為基因轉(zhuǎn)錄自身 的抑制，也可以為通過分解基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物而進(jìn)行的抑制。另外，骨膜素基因的表達(dá)的抑制 例如可以為具有本來的功能的骨膜素蛋白質(zhì)的表達(dá)的抑制，在蛋白質(zhì)被表達(dá)的情況下，所 述蛋白質(zhì)例如可以為所述功能被抑制的蛋白質(zhì)，也可以為所述功能缺失的蛋白質(zhì)。
[0042] 所述表達(dá)抑制序列例如可以為由所述as核苷酸構(gòu)成的序列，也可以為包含所述 as核苷酸的序列。
[0043] 對所述表達(dá)抑制序列的長度沒有特別限制，例如，為18?32堿基長、優(yōu)選為19? 30堿基長、更優(yōu)選為19、20、21堿基長。本發(fā)明中，例如，堿基數(shù)的數(shù)值范圍公開了屬于該 范圍的全部正整數(shù)，例如"1?4堿基"的記載是指公開了"1、2、3、4堿基"的全部（以下相 同）。
[0044] 下面示出所述asl核苷酸的序列。需要說明的是，由所述序列號1?19的堿基序 列構(gòu)成的核苷酸、由所述核苷酸構(gòu)成的表達(dá)抑制序列、包含所述核苷酸的表達(dá)抑制序列、和 包含所述核苷酸的核酸分子分別還有時用以下所示的名稱（序列號前的名稱）表示。

【權(quán)利要求】
1. 一種骨膜素基因的表達(dá)抑制核酸分子，其特征在于，包含下述（asl)、（as2)或（as3) 的核苷酸作為骨膜素基因的表達(dá)抑制序列， (asl)由序列號1?19中的任一個堿基序列構(gòu)成的核苷酸； (as2)由所述（asl)的堿基序列中缺失、置換和/或添加了一個或多個堿基的堿基序列 構(gòu)成的、具有骨膜素基因的表達(dá)抑制功能的核苷酸； (as3)由與所述（asl)的堿基序列具有90%以上的同源性的堿基序列構(gòu)成的、具有骨 膜素基因的表達(dá)抑制功能的核苷酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)抑制核酸分子，其特征在于，所述表達(dá)抑制核酸分子為 單鏈核酸分子， 從5'側(cè)至3'側(cè)依次包含5'側(cè)區(qū)域（Xe)、內(nèi)部區(qū)域⑵和3'側(cè)區(qū)域（Yc)， 所述內(nèi)部區(qū)域（Z)由內(nèi)部5'側(cè)區(qū)域（X)和內(nèi)部3'側(cè)區(qū)域（Y)連結(jié)而構(gòu)成， 所述5'側(cè)區(qū)域（Xe)與所述內(nèi)部5'側(cè)區(qū)域⑴互補(bǔ)， 所述3'側(cè)區(qū)域（Yc)與所述內(nèi)部3'側(cè)區(qū)域⑴互補(bǔ)， 所述內(nèi)部區(qū)域（Z)包含所述表達(dá)抑制序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中， 在所述5'側(cè)區(qū)域（Xe)與所述內(nèi)部5'側(cè)區(qū)域（X)之間具有連接子區(qū)域（Lx)， 介由所述連接子區(qū)域（Lx)連結(jié)所述5'側(cè)區(qū)域（Xe)和所述內(nèi)部5'側(cè)區(qū)域（X)， 在所述3'側(cè)區(qū)域（Yc)和所述內(nèi)部3'側(cè)區(qū)域（Y)之間具有連接子區(qū)域（Ly)， 介由所述連接子區(qū)域（Ly)連結(jié)所述3'側(cè)區(qū)域（Yc)和所述內(nèi)部3'側(cè)區(qū)域（Y)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中，所述連接子區(qū)域（Lx)和所述連接 子區(qū)域（Ly)由核苷酸殘基構(gòu)成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中，所述連接子區(qū)域（Lx)和所述 連接子區(qū)域（Ly)由非核苷酸殘基構(gòu)成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中，所述非核苷酸殘基包含吡咯烷骨 架和哌啶骨架中的至少一種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中，所述連接子區(qū)域（Lx)和所述 連接子區(qū)域（Ly)由下述式（I)表示，
所述式中， X1和X2各自獨(dú)立地為H2、0、S或NH ; Y1和Y2各自獨(dú)立地為單鍵、CH2、NH、0或S ; R3為與環(huán)A上的C-3、C-4、C-5或C-6鍵合的氫原子或取代基； L1為由n個原子構(gòu)成的亞烷基鏈，此處，亞烷基碳原子上的氫原子任選被OH、0Ra、NH 2、 NHRa、NRaRb、SH、或者SRa取代或不被取代，或者， L1為所述亞烷基鏈的一個以上碳原子被氧原子取代的聚醚鏈， 其中，Y1為NH、0或S的情況下，與Y1鍵合的L1的原子為碳，與OR 1鍵合的L1的原子為 碳，氧原子彼此不相鄰； L2為由m個原子構(gòu)成的亞烷基鏈，此處，亞烷基碳原子上的氫原子任選被OH、0R\ NH2、 NHRe、NReRd、SH或者SRe取代或者不被取代，或者， L2為所述亞烷基鏈的一個以上碳原子被氧原子取代的聚醚鏈， 其中，Y2為NH、0或S的情況下，與Y2鍵合的L2的原子為碳，與OR 2鍵合的L2的原子為 碳，氧原子彼此不相鄰； Ra、Rb、Re和Rd各自獨(dú)立地為取代基或保護(hù)基； 1為1或2 ; m為0?30的范圍的整數(shù)； n為0?30的范圍的整數(shù)； 環(huán)A中，所述環(huán)A上的C-2以外的1個碳原子任選被氮、氧或硫取代， 所述環(huán)A內(nèi)任選包含碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵， 所述區(qū)域（Xe)和所述區(qū)域（X)分別介由-OR1-或-OR2-與所述連接子區(qū)域（Lx)結(jié)合， 此處，R1和R2任選存在或不存在，在存在的情況下，R1和R2各自獨(dú)立地為核苷酸殘基 或所述結(jié)構(gòu)（I)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2?7的任一項所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中，所述內(nèi)部區(qū)域（Z)的 堿基數(shù)（Z)、所述內(nèi)部5'側(cè)區(qū)域⑴的堿基數(shù)（X)、所述內(nèi)部3'側(cè)區(qū)域⑴的堿基數(shù)（Y)、 所述5'側(cè)區(qū)域（Xe)的堿基數(shù)（Xe)和所述3'側(cè)區(qū)域（Yc)的堿基數(shù)（Yc)滿足下述式（1) 和⑵的條件， Z = X+Y ? ? ? (1) Z 彡 Xc+Yc ? ? ? (2)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中，所述內(nèi)部5'側(cè)區(qū)域⑴的堿基數(shù) (X)與所述5'側(cè)區(qū)域（Xe)的堿基數(shù)（Xe)之差、所述內(nèi)部3'側(cè)區(qū)域⑴的堿基數(shù)⑴與所 述3'側(cè)區(qū)域（Yc)的堿基數(shù)（Yc)之差滿足下述條件， (a) 滿足下述式（11)和（12)的條件， X-Xc = 1、2 或 3 ? ? ? (11) Y-Yc = 0 ? ? ? (12) (b) 滿足下述式（13)和（14)的條件， X-Xc = 0 ? ? ? (13) Y-Yc = 1、2 或 3 ? ? ? (14) (c) 滿足下述式（15)和（16)的條件， X-Xc = 1、2 或 3 ? ? ? (15) Y-Yc = 1、2 或 3 ? ? ? (16) (d) 滿足下述式（17)和（18)的條件， X-Xc = 0 ? ? ? (17) Y-Yc = 0 ? ? ? (18)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1?9的任一項所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中，所述表達(dá)抑制序列 的長度為18?32堿基長。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1?9的任一項所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中，所述表達(dá)抑制核酸 分子的序列為選自由序列號83?97組成的組中的至少一個堿基序列。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中， 所述表達(dá)抑制序列進(jìn)一步具有突出序列， 在所述核苷酸的3'端附加有所述突出序列。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1或12所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中，所述表達(dá)抑制序列為包含所 述（asl)的核苷酸的、序列號20?38中的任一個堿基序列構(gòu)成的核苷酸，其中，n為正整 數(shù)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1、12和13的任一項所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中，所述表達(dá)抑制 序列的長度為18?32堿基長。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1和12?14的任一項所述的表達(dá)抑制核酸分子， 其進(jìn)一步具有與所述表達(dá)抑制序列退火的互補(bǔ)序列， 所述互補(bǔ)序列包含與所述表達(dá)抑制序列中的所述（asl)、（as2)或（as3)的核苷酸互補(bǔ) 的核苷酸。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中，所述互補(bǔ)序列中的所述核苷酸 為下述（si)、（s2)或（s3)的核苷酸， (si)由與所述（asl)的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核苷酸； (s2)由與所述（as2)的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核苷酸； (S3)由與所述（as3)的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核苷酸。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中，所述（si)的核苷酸為由序列號 39?57中的任一個堿基序列構(gòu)成的核苷酸。
18. 根據(jù)權(quán)利要求15?17的任一項所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中， 所述互補(bǔ)序列進(jìn)一步具有突出序列， 在所述核苷酸的5'端附加有所述突出序列。
19. 根據(jù)權(quán)利要求15?18的任一項所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中，所述互補(bǔ)序列為 包含所述（si)的核苷酸的、序列號58?76中的任一個堿基序列構(gòu)成的核苷酸，其中，n為 正整數(shù)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求12?19的任一項所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中，所述突出序列為 1?3堿基長。
21. 根據(jù)權(quán)利要求12?20的任一項所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中，所述表達(dá)抑制核 酸分子為由兩條單鏈構(gòu)成的雙鏈核酸分子，其反義鏈具有所述表達(dá)抑制序列，其有義鏈具 有所述互補(bǔ)序列。
22. -種組合物，其特征在于，其包含權(quán)利要求1?21的任一項所述的表達(dá)抑制核酸分 子。
23. -種眼病用藥物，其特征在于，其包含權(quán)利要求1?21的任一項所述的表達(dá)抑制核 酸分子。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的眼病用藥物，其中，所述眼病為選自由視網(wǎng)膜病變、黃斑變 性、翼狀胬肉、結(jié)膜炎、眼內(nèi)新生血管和眼的纖維瘢痕組成的組中的至少1種疾病。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的眼病用藥物，其中，所述視網(wǎng)膜病變?yōu)樵鲋承吞悄虿∫暰W(wǎng) 膜病變或增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變。
26. -種抑制方法，其特征在于，其為抑制骨膜素基因的表達(dá)的方法，使用權(quán)利要求 1?21的任一項所述的表達(dá)抑制核酸分子。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的抑制方法，其中，所述方法包括將所述表達(dá)抑制核酸分子 投與細(xì)胞、組織或器官的步驟。
28. 根據(jù)權(quán)利要求26或27所述的抑制方法，其中，在體內(nèi)或體外投與所述表達(dá)抑制核 酸分子。
29. -種眼病的治療方法，其特征在于，所述方法包括將權(quán)利要求1?21的任一項所述 的表達(dá)抑制核酸分子投與患者的步驟。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的治療方法，其中，所述眼病為選自由視網(wǎng)膜病變、黃斑變 性、翼狀胬肉、結(jié)膜炎、眼內(nèi)新生血管和眼的纖維瘢痕組成的組的至少1種疾病。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的治療方法，其中，所述視網(wǎng)膜病變?yōu)樵鲋承吞悄虿∫暰W(wǎng)膜 病變或增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變。
32. 根據(jù)權(quán)利要求1?21的任一項所述的表達(dá)抑制核酸分子，其用于眼病的治療。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中，所述眼病為選自由視網(wǎng)膜病變、 黃斑變性、翼狀胬肉、結(jié)膜炎、眼內(nèi)新生血管和眼的纖維瘢痕組成的組的至少1種疾病。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的表達(dá)抑制核酸分子，其中，所述視網(wǎng)膜病變?yōu)樵鲋承吞悄?病視網(wǎng)膜病變或增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變。
【文檔編號】C12N15/113GK104220598SQ201380018264
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月29日
【發(fā)明者】吉田茂生, 濱崎智洋, 石川桂二郎, 水谷隆之, 石橋達(dá)朗, 大木忠明, 中間崇仁 申請人:國立大學(xué)法人九州大學(xué), Aqua療法股份有限公司