具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽以及編碼其的多核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有葡萄糖醛酸酯酶活性的分離的多肽、催化結(jié)構(gòu)域，以及編碼這些多肽或催化結(jié)構(gòu)域的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包括這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體以及宿主細(xì)胞連同生產(chǎn)和使用這些多肽或催化結(jié)構(gòu)域的方法。
【專利說(shuō)明】具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽以及編碼其的多核苷酸
[0001] 序列表的引用
[0002] 本申請(qǐng)包括一個(gè)計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，將其通過(guò)引用結(jié)合在此。
[0003] 發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽、催化結(jié)構(gòu)域、結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及編碼 這些多肽、催化結(jié)構(gòu)域、或結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包括這些多核苷酸的核酸 構(gòu)建體、載體、和宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)和使用這些多肽、催化結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法。
[0005] 相關(guān)技術(shù)說(shuō)明
[0006] 可以在水解和/或發(fā)酵之前對(duì)纖維素材料或包含木聚糖的材料進(jìn)行預(yù)處理。優(yōu)選 在水解前進(jìn)行預(yù)處理?？商娲?，可以同時(shí)用酶水解進(jìn)行預(yù)處理，以釋放可發(fā)酵糖，例如葡 萄糖、木糖、和/或纖維二糖。在多數(shù)情況下，預(yù)處理步驟自身導(dǎo)致將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵 糖（即使在沒(méi)有酶的情況下）。
[0007] 預(yù)處理的目的是提高生產(chǎn)速率連同水解步驟中釋放的糖的總產(chǎn)率。在化學(xué)預(yù)處理 (像例如酸預(yù)處理或堿預(yù)處理）的情況下，預(yù)處理的類型將對(duì)木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)性組分具有 不同影響，并且因此取決于預(yù)處理方法，用于水解步驟的酶組合物可能不同。本方法的目標(biāo) 是改善經(jīng)預(yù)處理的包含木聚糖的材料的水解。
[0008] 本發(fā)明提供具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽和編碼這些多肽的多核苷酸。使用具 有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽提供了用于改善特別是含木聚糖材料的水解的方法。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明涉及具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽，該多肽選自下組，該組由以下各項(xiàng) 組成：
[0011] (a) -種多肽，該多肽與SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少80%、至少85%、至少 90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%、至少99%、或100%序列一致性；或
[0012] 與SEQ ID N0:4的成熟多肽具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%、或100%序列一致性；或
[0013] 與SEQ ID N0:6的成熟多肽具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%、或100 %序列一致性；
[0014] (b)由一種多核苷酸編碼的一種多肽，該多核苷酸在高嚴(yán)謹(jǐn)度條件或非常高嚴(yán)謹(jǐn) 度條件下與（i)SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列、（ii)其CDNA序列、或（iii) (i)或（ii) 的全長(zhǎng)互補(bǔ)體雜交；或
[0015] 或在非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與（iv)SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼序列、（V)其CDNA 序列、或（vi) (iv)或（V)的全長(zhǎng)互補(bǔ)體雜交；
[0016] 或在非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與（vii)SEQ ID N0:5的成熟多肽編碼序列、（viii)其 cDNA序列、或（ix) (vii)或（viii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)體雜交；
[0017] (c)由一種多核苷酸所編碼的一種多肽，該多核苷酸與SEQ ID NO: 1的成熟多肽 編碼序列或其cDNA序列具有至少80%、至少85%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少 92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% 序列一致性；或
[0018] 與SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少90%、至少91%、 至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或 100 %序列一致性；或
[0019] 與SEQ ID N0:5的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少85%、至少90%、至 少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%或100%序列一致性；或
[0020] (d)SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6的成熟多肽的一種變體，該變體在 一個(gè)或多個(gè)位置處包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0021] (e) (a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一個(gè)片段，該片段具有葡萄糖醛酸酯酶活性。
[0022] 在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明涉及包括如上所述的具有葡萄糖醛酸酯酶活性的肽的 組合物。
[0023] 在又另一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)如上所述的具有葡萄糖醛酸酯酶活 性的肽的方法和或包括如上所述的具有葡萄糖醛酸酯酶活性的的肽的組合物和/或重組 宿主細(xì)胞。
[0024] 另外，本發(fā)明涉及用編碼如上所述的具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的多核苷酸 轉(zhuǎn)化的一種轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞。
[0025] 此外，本發(fā)明的一個(gè)另外的相關(guān)的方面涉及一種產(chǎn)生親本細(xì)胞的突變體的方法， 該方法包括使編碼如上所述的具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的多核苷酸失活，這導(dǎo)致該 突變體比該親本細(xì)胞產(chǎn)生的該多肽少。
[0026] 本發(fā)明還涉及一個(gè)雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，該RNA(dsRNA)分子包括編碼 如上所述的具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的一種分離的多核苷酸的一個(gè)子序列，其中 任選地該dsRNA是一種siRNA或一種miRNA分子，以及抑制具有葡萄糖醛酸酯酶活性的 多肽在細(xì)胞中的表達(dá)的方法，該方法包括向該細(xì)胞給予或在該細(xì)胞中表達(dá)該雙鏈抑制性 RNA(dsRNA)分子，以及涉及通過(guò)所述方法產(chǎn)生的細(xì)胞。
[0027] 在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明涉及編碼一種信號(hào)肽的一種分離的多核苷酸、包括該 信號(hào)肽的重組宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)一種蛋白的方法，其中對(duì)包括該信號(hào)肽的重組宿主細(xì)胞 進(jìn)行培養(yǎng)并回收該蛋白。具體地，本發(fā)明的信號(hào)肽包括SEQ ID N0:2的氨基酸1至17或 SEQ ID N0:4的氨基酸1至17或SEQ ID N0:6的氨基酸1至20或由其組成。
[0028] 本發(fā)明還涉及用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，這些方法包括：在具有葡萄糖 醛酸酯酶活性的多肽的存在下，用一種酶組合物處理該纖維素材料。
[0029] 本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括：(a)在具有葡萄糖醛酸酯酶活性 的多肽的存在下，用一種酶組合物對(duì)一種纖維素材料進(jìn)行糖化；(b)用一種或多種發(fā)酵微 生物對(duì)糖化的纖維素材料進(jìn)行發(fā)酵，以產(chǎn)生該發(fā)酵產(chǎn)物；并且（c)從發(fā)酵中回收該發(fā)酵產(chǎn) 物。
[0030] 本發(fā)明還涉及對(duì)纖維素材料進(jìn)行發(fā)酵的方法，這些方法包括用一種或多種發(fā)酵微 生物對(duì)該纖維素材料進(jìn)行發(fā)酵，其中該纖維素材料是在具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的 存在下用酶組合物進(jìn)行糖化。
[0031] 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0032] 圖1顯示在β_葡聚糖酶和β_木糖苷酶的酶促背景上添加四種葡萄糖醛酸酯 酶之后對(duì)經(jīng)預(yù)處理的玉米纖維的轉(zhuǎn)化百分率的影響的比較研究。樣品：樣品Α，一色齒毛菌 (C.unicolor) (SEQ ID Ν0:2);樣品 Β，里氏木霉（SEQ ID Ν0:4);樣品 C，球毛殼菌（SEQ ID NO:6)〇
[0033] 圖2顯示在β-葡聚糖酶和β-木糖苷酶的酶促背景上添加四種葡萄糖醛酸 酯酶之后對(duì)葡糖醛酸（g/kg DM)的釋放的影響的比較研究。樣品：樣品Α，一色齒毛菌 (C.unicolor) (SEQ ID N0:2);樣品 B，里氏木霉（SEQ ID N0:4);樣品 C，球毛殼菌（SEQ ID NO:6)〇
[0034] 定義
[0035] 纖維素分解活性術(shù)語(yǔ)"纖維素分解活性"意指水解一種纖維素材料的生物 活性。用于測(cè)量纖維素分解活性的兩種基本方法包括：（1)測(cè)量總纖維素分解活性， 以及⑵測(cè)量個(gè)體纖維素分解活性（葡聚糖內(nèi)切酶、纖維二糖水解酶、和β_葡糖苷 酶），如在張（Zhang)等人，對(duì)纖維素酶改進(jìn)的展望：篩選和選擇策略（Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies), 2006,生物技術(shù)進(jìn)展 (Biotechnology Advances) 24:452-481中綜述。通常使用不溶性底物對(duì)總纖維素分解活 性進(jìn)行測(cè)定，包括沃特曼一號(hào)（Whatman Ml)濾紙、微晶纖維素、細(xì)菌纖維素、藻類纖維素、 棉花、經(jīng)過(guò)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素等。最常用的總纖維素分解活性測(cè)定法是使用沃特曼一 號(hào)濾紙作為底物的濾紙測(cè)定法。該測(cè)定是由國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC)(高斯 (Ghose)，1987,纖維素酶活性的測(cè)量（Measurement of cellulase activities)，純粹與應(yīng) 用化學(xué)（Pure Appl.Chem. )59:257-68)確立的。
[0036] 出于本發(fā)明的目的，通過(guò)測(cè)量在以下條件下由一種或多種纖維素分解酶進(jìn)行的纖 維素材料水解的增加來(lái)測(cè)定纖維素分解酶活性：l_2〇mg的纖維素分解蛋白/g于PCS中的 纖維素，在50°C -65°C下持續(xù)3-7天，與未添加纖維素分解蛋白的對(duì)照水解相比較。典型 條件為：1ml反應(yīng)，洗滌或未洗滌的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸鈉 （pH 5)，lmM MnS04， 50°C -65°C，72小時(shí)，通過(guò)AMINEX? HPX-87H柱（伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)室有限公司，美國(guó)加州赫拉克 勒斯）進(jìn)行的糖分析。
[0037] 內(nèi)切葡聚糖酶：術(shù)語(yǔ)"內(nèi)切葡聚糖酶"意指一種內(nèi)切-1，4-(1，3 ;1，4)_ β -D-葡聚 糖4-葡聚糖水解酶（E. C. 3. 2. 1. 4)，其催化纖維素、纖維素衍生物（如羧甲基纖維素和羥 乙基纖維素）、地衣多糖中的l，4-i3-D-糖苷鍵和混合β-1，3葡聚糖如谷類β-D-葡聚 糖或木葡聚糖以及含有纖維素組分的其他植物材料中的β_1，4鍵的內(nèi)切水解?？梢酝ㄟ^(guò) 測(cè)量底物粘度的減小，或通過(guò)還原糖測(cè)定確定還原端增加來(lái)確定內(nèi)切葡聚糖酶活性（張等 人，2006,生物技術(shù)進(jìn)展24:452-481)。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)高斯，1987,純粹與應(yīng)用化學(xué) 59:257-268的程序，在pH 5、40°C下，使用羧甲基纖維素（CMC)作為底物，確定內(nèi)切葡聚糖 酶活性。
[0038] 纖維二糖水解酶：術(shù)語(yǔ)"纖維二糖水解酶"是指一種l，4-i3_D-葡聚糖纖維二 糖水解酶（E.C. 3. 2. 1.91)，其催化纖維素、纖維寡糖、或任何含β-1，4-連接的葡萄糖 的聚合物中的l，4-i3-D-糖苷鍵水解，從該鏈的還原端或非還原端釋放纖維二糖（泰里 (Teeri)，1997,晶態(tài)纖維素降解：纖維二糖水解酶功能的新見(jiàn)解（Crystalline cellulose degradation:New insight into the function of cellobiohydrolases),生物技術(shù)趨 勢(shì)（Trends in Biotechnology) 15:160-167 ;泰里（Teeri)等人，1998,里氏木霉纖維二糖 水解酶：為何對(duì)晶態(tài)纖維素如此有效？（Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose ?)，生物化學(xué)學(xué)會(huì)學(xué)報(bào)（Biochem. Soc. Trans. )26:173-178)。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)范·帝伯赫（van Tilbeurgh)等人，1982， 歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)（FEBS Letters) ,149:152-156以及范?帝伯赫和克萊森斯 (Claeyssens)，1985,歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)，187:283-288所述的程序，使用一種熒光二 糖衍生物4-甲基傘形酮基-β -D-乳糖在pH 5、40°C下確定纖維二糖水解酶活性。
[0039] β -葡糖苷酶：術(shù)語(yǔ)" β -葡糖苷酶"意指一種β -D-葡糖苷葡糖水解酶 (E. C. 3. 2. 1. 21)，其催化末端非還原性β -D-葡萄糖殘基的水解，并釋放β -D-葡萄糖。 出于本發(fā)明的目的，根據(jù)文丘里（Venturi)等人，2002,來(lái)自嗜熱毛殼菌嗜糞變種的胞外 β-D-葡糖苷酶：產(chǎn)生、純化以及一些生物化學(xué)特性（Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum:production, purification and some biochemical properties),基礎(chǔ)微生物學(xué)雜志（J. Basic Microbiol. )42:55-66 描述的基 本程序確定β-葡糖苷酶活性。一個(gè)單位的β-葡糖苷酶定義為在40°C、pH 5下，在含有 0. 01%TWEEN? 20的100mM檸檬酸鈉中從作為底物的ImM對(duì)硝基苯基-β -D-吡喃葡萄 糖苷每分鐘產(chǎn)生1. 〇微摩爾的對(duì)硝基苯酚。
[0040] 纖維素分解增強(qiáng)活性：術(shù)語(yǔ)"纖維素分解增強(qiáng)活性"意指由一種GH61多肽催化的 生物活性，該GH61多肽增強(qiáng)具有纖維素分解活性的酶對(duì)纖維素材料的水解。出于本發(fā)明 的目的，通過(guò)在以下條件下測(cè)量來(lái)自由纖維素分解酶水解纖維素材料的還原糖的增加或纖 維二糖與葡萄糖總量的增加來(lái)測(cè)定纖維素分解增強(qiáng)活性 ：l_5〇mg總蛋白/g于PCS中的纖 維素，其中總蛋白由50% -99. 5% w/w纖維素分解蛋白和0. 5% -50% w/w具有纖維素分 解增強(qiáng)活性的GH61多肽的蛋白構(gòu)成，在50°C _65°C持續(xù)1-7天，與不具有纖維素分解增強(qiáng) 活性的相等總蛋白裝載的對(duì)照水解（l-50mg纖維素分解蛋白/g于PCS中的纖維素）相比 較。在一個(gè)優(yōu)選方面，使用在總蛋白質(zhì)重量的3%的米曲霉（Aspergillus oryzae) β -葡糖 苷酶（根據(jù)W0 02/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生）或總蛋白質(zhì)重量的3%的煙曲霉β-葡 糖苷酶（如W0 2002/095014中所描述在米曲霉中重組產(chǎn)生）的纖維素酶蛋白負(fù)載量存 在的情況下CELLUCLAST? 1.5L(諾維信公司（Novozymes A/S)，丹麥巴格斯瓦爾德 (Bagsvaerd, Denmark))的混合物作為纖維素分解活性的來(lái)源。
[0041] 具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽通過(guò)將達(dá)到相同的水解程度所需要的纖維 素分解酶的量降低優(yōu)選至少1. 01倍、更優(yōu)選至少1. 05倍、更優(yōu)選至少1. 10倍、更優(yōu)選至少 1. 25倍、更優(yōu)選至少1. 5倍、更優(yōu)選至少2倍、更優(yōu)選至少3倍、更優(yōu)選至少4倍、更優(yōu)選至 少5倍、甚至更優(yōu)選至少10倍、以及最優(yōu)選至少20倍，來(lái)增強(qiáng)由具有纖維素分解活性的酶 催化的纖維素材料的水解。
[0042] 家族61糖苷水解酶：術(shù)語(yǔ)"家族61糖苷水解酶"或"家族GH61"或"GH61" 意指根據(jù)亨利薩特（Henrissat) B.，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分 類(A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities)，生物化學(xué)雜志（Biochem.J. )280:309-316 ;和亨利薩特B.和貝洛赫 (Bairoch)A.，1996,修正糖基水解酶的基于序列的分類（Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases)，生物化學(xué)雜志 316:695-696 屬于糖苷水解酶家 族61的多肽。
[0043] 木聚糖降解活性：術(shù)語(yǔ)"木聚糖降解活性"或"木聚糖分解活性"意指水解含有木 聚糖的材料的生物活性。用于測(cè)量木聚糖分解活性的兩種基本方法包括：（1)測(cè)量總木聚 糖分解活性，并且（2)測(cè)量單獨(dú)的木聚糖分解活性（內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯 呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、以及α-葡萄糖醛酸酯 酶）。木聚糖分解酶測(cè)定的最近進(jìn)展總結(jié)于若干出版物中，這些出版物包括：別雷（Biely) 和普喬爾德（Puchard)，木聚糖分解酶測(cè)定的最近進(jìn)展（Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes)，2006,食品與農(nóng)業(yè)科學(xué)雜志（Journal of the Science of Food and Agriculture)86(ll) :1636-1647 ;斯帕尼科瓦（Spanikova)和別雷，2006,葡萄糖醒 酸酯酶_由產(chǎn)生的新型碳水化合物酯酶裂裙菌（Schizophyllum commune) (Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune),歐洲 生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)580 (19) :4597-4601 ;赫爾曼（Herrmann)、沃散斯卡（Vrsanska)、尤 日奇科娃（Jurickova)、赫西（Hirsch)、另ij雷、以及庫(kù)比切克（Kubicek)，1997,里氏木霉 的β-D-木糖苷酶是一種多功能β-D-木聚糖木糖水解酶（The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase),生物化學(xué)雜 志 321:375-381。
[0044] 總木聚糖降解活性可以通過(guò)測(cè)定由不同類型的木聚糖（包括例如燕麥（oat spelt)木聚糖、山毛櫸木木聚糖、以及落葉松木木聚糖）形成的還原糖，或通過(guò)光度法 測(cè)定從不同共價(jià)染色的木聚糖釋放的染色的木聚糖片段來(lái)測(cè)量。最常見(jiàn)的總木聚糖 分解活性測(cè)定基于由聚合4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖產(chǎn)生的還原糖，如描述于別雷，別 雷，Poutanen(坡泰恩），1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity(用于木聚糖酶活性測(cè)定的多個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)試方法），Journal of Biotechnology (生物技術(shù)雜志）23(3) :257-270 中。
[0045] 出于本發(fā)明的目的，通過(guò)測(cè)量在以下典型條件下由一種或多種木聚糖降解酶引 起的樺木木聚糖（西格瑪化學(xué)有限公司（Sigma Chemical Co.，Inc.)，美國(guó)密蘇里州圣 路易斯（St. Louis，M0, USA))水解的增加來(lái)確定木聚糖降解活性：1ml反應(yīng)、5mg/ml底物 (總固體）、5mg木聚糖分解蛋白/g底物、50mM乙酸鈉 （pH 5)、50°C、24小時(shí)，使用如里弗 (Lever) ,1972,用于碳水化合物的比色測(cè)定的新反應(yīng)（A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates)，分析生物化學(xué)47:273-279所描述的對(duì)輕基苯甲酸醜 肼（PHBAH)測(cè)定進(jìn)行糖分析。
[0046] 木聚糖酶：術(shù)語(yǔ)"木聚糖酶"意指1，4- β -D-木聚糖-木糖水解酶（E. C. 3. 2. 1. 8)， 其催化木聚糖中的1，4-β -D-木糖苷鍵的內(nèi)切水解。為了本發(fā)明的目的，使用樺木木聚糖 作為底物確定木聚糖酶活性。一個(gè)單位的木聚糖酶定義為在50°C、pH 5下的初始期水解 中，在含有0. 01 % TWEEN? 20的50mM乙酸鈉中從作為底物的2g樺木木聚糖每公升每 分鐘產(chǎn)生1.〇μ摩爾還原糖（以如里弗（LeVer)，1972,用于碳水化合物的比色測(cè)定的新反 M (A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates),分析生物化 學(xué)（Anal. Biochem) 47:273-279所述的葡萄糖當(dāng)量測(cè)量）。
[0047] β -木糖苷酶：術(shù)語(yǔ)"β -木糖苷酶"意指一種β-D-木糖苷木糖水解酶 (E. C. 3. 2. 1. 37)，其催化短β (1 - 4)-木寡糖的外水解，以從非還原性末端去除連續(xù)的 D-木糖殘基。出于本發(fā)明的目的，一個(gè)單位的β-木糖苷酶定義為在40°C、pH 5下在含有 0. 01%TWEEN? 20的100mM檸檬酸鈉中從作為底物的ImM對(duì)硝基苯基-β -D-木糖苷每 分鐘產(chǎn)生1. 0微摩爾的對(duì)硝基苯酚。
[0048] 乙酰木聚糖酯酶：術(shù)語(yǔ)"乙酰木聚糖酯酶"的意思是一種羧酸酯酶（EC3. 1. 1. 72)， 其催化乙?；跃酆夏揪厶恰⒁阴；咎?、乙酰化葡萄糖、α -萘基乙酸酯、和對(duì)硝基苯基 乙酸酯的水解。為了本發(fā)明的目的，用〇. 5mM對(duì)硝基苯基乙酸酯作為底物，在含有0. 01 % TWEEN?20的50mM乙酸鈉（pH5. 0)中，對(duì)乙酰木聚糖酯酶的活性進(jìn)行測(cè)定。一個(gè)單位的乙酰 木聚糖酯酶被定義為，在pH 5, 25°C，每分鐘能夠釋放1 μ mol對(duì)硝基酚根陰離子的酶的量。
[0049] 阿魏酸酯酶：術(shù)語(yǔ)"阿魏酸酯酶"意指4-羥基-3-甲氧基肉桂酰基-糖水解酶（EC 3. 1.1. 73)，其催化4-羥基-3-甲氧基肉桂?；ò⑽乎；┗鶊F(tuán)從酯化的糖（其在"天 然"底物中通常為阿拉伯糖）的水解，以產(chǎn)生阿魏酸酯（4-羥基-3-甲氧基肉桂酸酯）。阿 魏酸酯酶（Feruloyl esterase)也被稱為阿魏酸酯酶（ferulic acid esterase)、輕基肉 桂?；ッ?、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I、或FAE-II。為了本發(fā)明的目 的，使用〇. 5mM對(duì)硝基苯阿魏酸酯作為底物在50mM乙酸鈉中在pH 5. 0對(duì)阿魏酰酯酶的活 性進(jìn)行測(cè)定。一個(gè)單位的阿魏酸酯酶等于，在pH 5, 25°C，每分鐘能夠釋放1 μ mol的對(duì)硝基 酚根陰離子的酶的量。
[0050] α-葡糖醛酸糖苷酶：術(shù)語(yǔ)"α-葡糖醛酸糖苷酶"是指可催化α-D-葡萄 糖苷酸水解成為D-葡萄糖醛酸酯和醇的一種α-D-葡萄糖苷酸葡萄糖醛酸水解酶 (EC 3. 2. 1. 139)。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)德弗里斯（de Vries)，1998,細(xì)菌學(xué)雜志 (J.Bacteriol. ) 180:243-249來(lái)測(cè)定α-葡糖醛酸糖苷酶活性。一個(gè)單位的α-葡糖醛酸 糖苷酶等于能夠在pH 5、40°C下每分鐘釋放1微摩爾的葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶 的量。
[0051] 本發(fā)明的這些多肽具有SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6的成熟多肽 的至少60%，例如至少70%、至少80%、至少90%、至少92%、至少93%、至少94%、至少 95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %或至少100 %的葡萄糖醛酸酯酶活性。
[0052] α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶：術(shù)語(yǔ)" a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶"意指一種a -L-阿拉 伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶（EC 3. 2. 1. 55)，其催化a -L-阿拉伯糖苷中的末端非還原 性α-L-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。該酶對(duì)α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有（1，3)_和/或 (1，5)_鍵的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿 拉伯呋喃糖苷酶還被稱為阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿 拉伯呋喃糖苷酶、多糖a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a -L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯 糖苷酶、或α-L-阿拉伯聚糖酶。出于本發(fā)明的目的，使用每ml的100mM乙酸鈉 （pH 5) 中5mg的中等粘度小麥阿拉伯糖基木聚糖（麥格酶國(guó)際愛(ài)爾蘭股份有限公司（Megazyme International Ireland, Ltd.)，愛(ài)爾蘭威克洛郡布瑞公司（Bray, Co. Wicklow, Ireland)以 總體積200 μ 1在40°C下持續(xù)30分鐘，接著通過(guò)AMINEX? HPX-87H柱色譜（伯樂(lè)實(shí)驗(yàn) 室有限公司（Bio-Rad Laboratories, Inc.)，美國(guó)加州赫拉克勒斯（Hercules, CA, USA)進(jìn) 行阿拉伯糖分析來(lái)測(cè)定a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
[0053] 纖維素材料：該纖維素材料可以是包括纖維素的任何材料。生物質(zhì)的初生細(xì)胞壁 中的主要多糖是纖維素，第二豐富的是半纖維素，而第三豐富的是果膠。細(xì)胞停止生長(zhǎng)后產(chǎn) 生的次生細(xì)胞壁也包含多糖，并且它通過(guò)與半纖維素共價(jià)交聯(lián)的聚合木質(zhì)素得到強(qiáng)化。纖 維素是脫水纖維二糖的均聚物，因此是一種線性i3-(l-4)_D-葡聚糖，而半纖維素包括多 種化合物，如具有一系列取代基以復(fù)雜支鏈結(jié)構(gòu)存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚 糖、以及甘露聚糖。盡管纖維素一般為多態(tài)的，但發(fā)現(xiàn)其在植物組織中主要以平行葡聚糖鏈 的不溶性晶體基質(zhì)存在。半纖維素通常氫鍵合至纖維素以及其他半纖維素，這有助于穩(wěn)定 細(xì)胞壁基質(zhì)。
[0054] 纖維素通常見(jiàn)于例如植物的莖、葉、殼、皮、以及穗軸，或樹(shù)的葉、枝、以及木材中。 纖維素材料可以是，但不限于：草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙、以 及紙漿和造紙廠殘余物（參見(jiàn)，例如，維色洛戈?duì)枺╓iselogel)等人，1995,于生物乙醇手 冊(cè)（Handbook on Bioethanol)(查爾斯· E ·懷曼（Charles E. Wyman)編輯），第 105-118 頁(yè)，泰勒弗朗西斯出版集團(tuán)（Taylor&Francis)，華盛頓特區(qū)（Washington D.C.);懷曼 (Wyman)，1994,生物資源技術(shù)（Bioresource Technology)50:3_16;林德（Lynd)，1990,應(yīng) 用生物化學(xué)與生物技術(shù)（Applied Biochemistry and Biotechnology)24/25:695_719; 莫思爾（Mosier)等人，1999,木質(zhì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化的最近進(jìn)展（Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics)，生物化學(xué)工程 / 生物技術(shù)的進(jìn)展（Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology)，T·謝伯（T.Scheper)主編，第 65 卷，第 23-40 頁(yè)，紐約斯普林格出版社（Springer-Verlag，New York)。在此應(yīng)該理解的是，纖維素可以處 于木素纖維素，在混合基質(zhì)中包含木質(zhì)素、纖維素、和半纖維素的植物細(xì)胞壁材料的形式。 在一個(gè)優(yōu)選方面，該纖維素材料是木質(zhì)纖維素。
[0055] 在一個(gè)方面，纖維素材料是草本材料。在另一個(gè)方面，纖維素材料是農(nóng)業(yè)殘余物。 在另一個(gè)方面，纖維素材料是林業(yè)殘余物。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是城市固體廢 物。在另一個(gè)方面中，纖維素材料是廢紙。在另一個(gè)方面中，纖維素材料是紙漿和造紙廠殘 余物。
[0056] 在另一個(gè)方面中，纖維素材料是玉米秸桿。在另一個(gè)方面中，纖維素材料是玉米纖 維。在另一個(gè)方面中，纖維素材料是玉米芯。在另一個(gè)方面中，纖維素材料是橘皮。在另一 個(gè)方面中，纖維素材料是稻草。在另一個(gè)方面中，纖維素材料是小麥桿。在另一個(gè)方面，纖 維素材料是柳枝稷。在另一個(gè)方面中，纖維素材料是芒草。在另一個(gè)方面中，纖維素材料是 甘蔗渣。
[0057] 在另一個(gè)方面中，纖維素材料是微晶纖維素。在另一個(gè)方面中，纖維素材料是細(xì)菌 纖維素。在另一個(gè)方面中，纖維素材料是海藻纖維素。在另一個(gè)方面中，纖維素材料是棉短 絨。在另一個(gè)方面，纖維素材料是無(wú)定形磷酸處理的纖維素。在另一個(gè)方面中，纖維素材料 是濾紙。
[0058] 纖維素材料可以按原樣使用或可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法進(jìn)行預(yù)處理，如在 此所描述。在一個(gè)優(yōu)選方面，纖維素材料進(jìn)行了預(yù)處理。
[0059] 預(yù)處理的玉米秸桿：術(shù)語(yǔ)"PCS"或"預(yù)處理的玉米秸桿"是指通過(guò)用熱和稀硫酸處 理源自玉米秸桿的纖維素材料。
[0060] 含有木聚糖的材料：術(shù)語(yǔ)"含有木聚糖的材料"意指包含含有β-α-4)連接的木 糖殘基主鏈的植物細(xì)胞壁多糖的任何材料。陸生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-D-吡喃木 糖主鏈的雜聚物，其通過(guò)短的碳水化合物鏈分支。它們包括D-葡糖醛酸或其4-0-甲基醚、 L-阿拉伯糖、和/或不同的低聚糖，這些低聚糖由D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖、以 及D-葡萄糖構(gòu)成?？梢詫⒛揪厶穷愋偷亩嗵欠殖赏茨揪厶牵╤omoxylan)和異源木聚糖 (heteroxylan)，包括葡糖醛酸木聚糖、（阿拉伯糖）葡糖醛酸木聚糖、（葡糖醛酸）阿糖基 木聚糖、阿糖基木聚糖、以及復(fù)雜的異源木聚糖。參見(jiàn)，例如，埃伯林格羅瓦（Ebringerova) 等人，2005,聚合物科學(xué)進(jìn)展（Adv. Polym. Sci.) 186:1-67。
[0061] 在本發(fā)明的方法中，可以使用含有木聚糖的任何材料。在一個(gè)優(yōu)選方面，含有木聚 糖的材料是木質(zhì)纖維素。
[0062] 等位基因變體：術(shù)語(yǔ)"等位基因變體"意指占用同一染色體位點(diǎn)的一種基因的兩個(gè) 或更多個(gè)替代形式中的任一者。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，并且可以導(dǎo)致群體內(nèi)的多 態(tài)性?；蛲蛔兛梢允庆o默的（在所編碼的多肽中沒(méi)有改變）或可編碼具有改變的氨基酸 序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
[0063] 結(jié)合結(jié)構(gòu)域：術(shù)語(yǔ)"結(jié)合結(jié)構(gòu)域"例如"纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域"是指介導(dǎo)酶結(jié)合至纖 維素底物的非晶區(qū)域的酶的區(qū)域。纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)典型地發(fā)現(xiàn)于葡萄糖醛酸酯酶 的N-末端或C-末端末尾。
[0064] 催化結(jié)構(gòu)域：術(shù)語(yǔ)"催化結(jié)構(gòu)域"意指一種酶的含有該酶的催化機(jī)構(gòu)的區(qū)域。
[0065] cDNA:術(shù)語(yǔ)"cDNA"是指可以通過(guò)得自真核或原核細(xì)胞的成熟的、剪接的mRNA分子 的反轉(zhuǎn)錄而制備的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于對(duì)應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。早先 的初始RNA轉(zhuǎn)錄本是mRNA的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mRNA之前要經(jīng)一系列的步驟 進(jìn)行加工，包括剪接。
[0066] 編碼序列：術(shù)語(yǔ)"編碼序列"意指直接指定一個(gè)多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編 碼序列的邊界一般由一個(gè)開(kāi)放閱讀框架決定，該開(kāi)放閱讀框架從一個(gè)起始密碼子（如ATG、 GTG或TTG)開(kāi)始并且以一個(gè)終止密碼子（如TAA、TAG或TGA)結(jié)束。編碼序列可以是一種 基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。
[0067] 控制序列：術(shù)語(yǔ)"控制序列"是指表達(dá)編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸所必需的 核酸序列。每個(gè)控制序列對(duì)于編碼該多肽的多核苷酸來(lái)說(shuō)可以是原生的（即，來(lái)自相同基 因）或外源的（即，來(lái)自不同基因），或相對(duì)于彼此是原生的或外源的。此類控制序列包括 但不限于前導(dǎo)子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列、以及轉(zhuǎn)錄終止子。至少， 控制序列包括啟動(dòng)子，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。出于引入有利于將這些控制序列與編碼 一種多肽的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點(diǎn)的目的，這些控制序列可以提供 有多個(gè)接頭。
[0068] 表達(dá)：術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于：轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修 飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。
[0069] 表達(dá)載體：術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"意指一種直鏈或環(huán)狀DNA分子，該分子包括編碼一種 多肽的一種多核苷酸并且可操作地連接至提供用于其表達(dá)的控制序列。
[0070] 片段：術(shù)語(yǔ)"片段"是指具有從成熟多肽或結(jié)構(gòu)域的氨基和/或羧基端刪除的一個(gè) 或多個(gè)（例如，若干個(gè)）氨基酸的一種多肽或一個(gè)催化或纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；其中該片段 具有葡萄糖醛酸酯酶或纖維素結(jié)合活性。在一個(gè)方面，一個(gè)片段包括SEQ ID NO:2、SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6的成熟多肽的氨基酸數(shù)目的至少85%、90%、以及95%。
[0071] 宿主細(xì)胞：術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"意指易于用包括本發(fā)明的一種多核苷酸的一種核酸構(gòu) 建體或表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類型。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"涵蓋由于復(fù)制 期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。
[0072] 分離的或純化的：術(shù)語(yǔ)"分離的"或"純化的"意指從其中去除與其天然相關(guān)的至少 一種組分的多肽或多核苷酸。例如，如通過(guò)SDS-PAGE確定的，多肽可以是至少1 %純，例如 至少5 %純、至少10 %純、至少20 %純、至少40 %純、至少60 %純、至少80 %純、至少90 %純 或至少95%純，并且如通過(guò)瓊脂糖電泳確定的，多核苷酸可以是至少1%純，例如至少5% 純、至少10 %純、至少20 %純、至少40 %純、至少60 %純、至少80 %純、至少90 %純、或至少 95%純。
[0073] 成熟多肽：術(shù)語(yǔ)"成熟多肽"意指在翻譯和任何翻譯后修飾（例如N-端加工、C-端 截短、糖基化、磷酸化等）之后處于其最終形式的多肽。在一個(gè)方面，如使用預(yù)測(cè)SEQ ID NO:2的氨基酸1至17、SEQ ID NO:4的氨基酸1至17、SEQ ID NO:4的氨基酸21至690或 SEQIDN0:6的氨基酸l至20是信號(hào)肽的信號(hào)P(SignalP)(尼爾森（Nielsen)等人，1997， 蛋白質(zhì)工程（Protein Engineering)10:l-6)預(yù)測(cè)的，該成熟多肽是SEQ ID N0:2的氨基酸 1至474、SEQ ID N0:4的氨基酸1至460或SEQ ID N0:6的氨基酸1至392。本領(lǐng)域中已 知的是，一個(gè)宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生由同一多核苷酸表達(dá)的兩種或更多種不同成熟多肽（即， 具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸）的混合物。
[0074] 成熟多肽編碼序列：術(shù)語(yǔ)"成熟多肽編碼序列"意指編碼具有葡萄糖醛酸酯酶活 性的一種成熟多肽的一種多核苷酸。在一個(gè)方面，基于預(yù)測(cè)SEQ ID NO: 1的核苷酸1至66、 SEQ ID N0:3的核苷酸1至60、SEQ ID N0:5的核苷酸1至45和SEQ ID N0:7的核苷酸1 至81編碼信號(hào)肽的信號(hào)P (SignalP)程序（尼爾森等人，1997,同上），該成熟多肽編碼序列 是SEQIDN0:1的核苷酸1至 2544、SEQIDN0:3的核苷酸1至 2526、SEQIDN0:5的核苷 酸1至2508、SEQ ID N0:7的核苷酸1至2124或其cDNA序列。
[0075] 核酸構(gòu)建體：術(shù)語(yǔ)"核酸構(gòu)建體"意指單鏈或雙鏈核酸分子，其分離自天然存在的 基因，或其被修飾成以本來(lái)在自然界中不存在的方式含有核酸的區(qū)段，或其為合成的，其包 括一個(gè)或多個(gè)控制序列。
[0076] 可操作地連接：術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"意指一種配置，其中一個(gè)控制序列相對(duì)于一 種多核苷酸的編碼序列放置在一個(gè)適當(dāng)位置處，以使得控制序列指引編碼序列的表達(dá)。
[0077] 序列一致性：兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)"序列 一致性"描述。
[0078] 出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟件套件 (The European Molecular Biology Open Software Suite)，賴斯（Rice)等人，2000,遺傳 學(xué)趨勢(shì)（Trends Genet.) 16:276-277)(優(yōu)選5. 0. 0版或更新版本）的Needle程序中所實(shí) 施的尼德?tīng)柭?翁施（Needleman-Wunsch)算法（尼德?tīng)柭臀淌?970,分子生物學(xué)雜志 (J. Mol. Biol. )48:443-453)來(lái)測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性。使用的這些參數(shù) 是空位開(kāi)放罰分10、空位延伸罰分0. 5,以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩 陣。尼德?tīng)枠?biāo)注的"最長(zhǎng)的一致性"的輸出（使用-非簡(jiǎn)化選項(xiàng)獲得）被用作百分比一致 性，并且如下計(jì)算：
[0079](一致的殘基X 100V(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù)）
[0080] 出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟件套 件，賴斯等人，2000,同上）（優(yōu)選5. 0. 0版或更新版本）的Needle程序中所實(shí)施的尼德?tīng)?曼-翁施算法（尼德?tīng)柭臀淌?970,同上）來(lái)測(cè)定兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的序 列一致性。使用的這些參數(shù)是空位開(kāi)放罰分10、空位延伸罰分0. 5以及EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩陣。尼德?tīng)枠?biāo)注的"最長(zhǎng)的一致性"的輸出（使用-非簡(jiǎn)化 選項(xiàng)獲得）被用作百分比一致性，并且如下計(jì)算：
[0081] (一致的脫氧核糖核苷酸X 100V(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù)）
[0082] 子序列：術(shù)語(yǔ)"子序列"意指使一個(gè)或多個(gè)（例如，若干個(gè)）核苷酸從成熟多肽編 碼序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸，其中該子序列編碼具有葡萄糖醛酸酯酶活性 的一個(gè)片段。在一個(gè)方面，一個(gè)子序列包含SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6的 成熟多肽的氨基酸數(shù)目的至少85 %、90 %、以及95 %。
[0083] 變體：術(shù)語(yǔ)"變體"是指包括改變（即在一個(gè)或多個(gè)位置處取代、插入、和/或刪 除一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)）氨基酸殘基）的具有葡萄糖醛酸酯酶活性的一個(gè)多肽。取代 意指占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸被一個(gè)不同的氨基酸置換；缺失意指除去占據(jù)一個(gè)位置的氨基 酸；并且插入意指與占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸相鄰來(lái)添加一個(gè)或多個(gè)（例如，若干個(gè)）氨基 酸，例如1-5個(gè)氨基酸。
[0084] 發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明
[0085] 具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽
[0086] 本發(fā)明涉及具有葡萄糖醛酸酯酶活性的分離的多肽，該多肽選自下組，該組由以 下各項(xiàng)組成：
[0087] (a)與SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少80%序列一致性的一種多肽；
[0088] (b)由一種多核苷酸編碼的一種多肽，該多核苷酸在高或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與 (i)SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列、（ii)其cDNA序列、或（iii) (i)或（ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ) 體雜交；
[0089] (c)由與SEQ ID NO: 1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%序列一 致性的一種多核苷酸編碼的一種多肽；
[0090] (d) SEQ ID N0:2的成熟多肽的一種變體，該變體在一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)）位 置處包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0091] (e) (a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一個(gè)片段，該片段具有葡萄糖醛酸酯酶活性。
[0092] 本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的多肽的分離的多核苷酸；核酸構(gòu)建體；重組表達(dá)載 體；包括這些多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；以及產(chǎn)生這些多肽的方法。
[0093] 本發(fā)明還涉及編碼包括SEQ ID N0:2的氨基酸1至17或由其組成的信號(hào)肽的一種 多核苷酸、編碼包括SEQ ID N0:2的氨基酸101至474或由其組成的前肽的一種多核苷酸、 或編碼包括SEQ ID N0: 2的氨基酸1至474或由其組成的信號(hào)肽和前肽的一種多核苷酸， 其每一者被可操作地連接至編碼一種蛋白質(zhì)的基因；涉及核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體、以及包括 這些多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；以及涉及產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)的方法。
[0094] 本發(fā)明涉及具有葡萄糖醛酸酯酶活性的分離的多肽，該多肽選自下組，該組由以 下各項(xiàng)組成：
[0095] (a)與SEQ ID N0:4的成熟多肽具有至少80%序列一致性的一種多肽；
[0096] (b)由一種多核苷酸編碼的一種多肽，該多核苷酸在高或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與 (i)SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼序列、（ii)其cDNA序列、或（iii) (i)或（ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ) 體雜交；
[0097] (c)由與SEQ ID N0:4的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%序列一 致性的一種多核苷酸編碼的一種多肽；
[0098] (d) SEQ ID N0:4的成熟多肽的一種變體，該變體在一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)）位 置處包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0099] (e) (a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一個(gè)片段，該片段具有葡萄糖醛酸酯酶活性。
[0100] 本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的多肽的分離的多核苷酸；核酸構(gòu)建體；重組表達(dá)載 體；包括這些多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；以及產(chǎn)生這些多肽的方法。
[0101] 本發(fā)明還涉及編碼包括SEQ ID N0:4的氨基酸1至17或由其組成的信號(hào)肽的一種 多核苷酸、編碼包括SEQ ID N0:4的氨基酸17至460或由其組成的前肽的一種多核苷酸、 或編碼包括SEQ ID N0:4的氨基酸1至460或由其組成的信號(hào)肽和前肽的一種多核苷酸， 其每一者被可操作地連接至編碼一種蛋白質(zhì)的基因；涉及核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體、以及包括 這些多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；以及涉及產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)的方法。
[0102] 本發(fā)明涉及具有葡萄糖醛酸酯酶活性的分離的多肽，該多肽選自下組，該組由以 下各項(xiàng)組成：
[0103] (a)與SEQ ID N0:6的成熟多肽具有至少80%序列一致性的一種多肽；
[0104] (b)由一種多核苷酸編碼的一種多肽，該多核苷酸在高或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與 (i)SEQ ID N0:6的成熟多肽編碼序列、（ii)其cDNA序列、或（iii) (i)或（ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ) 體雜交；
[0105] (c)由與SEQ ID N0:6的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%序列一 致性的一種多核苷酸編碼的一種多肽；
[0106] (d) SEQ ID N0:6的成熟多肽的一種變體，該變體在一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)）位 置處包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0107] (e) (a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一個(gè)片段，該片段具有葡萄糖醛酸酯酶活性。
[0108] 本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的多肽的分離的多核苷酸；核酸構(gòu)建體；重組表達(dá)載 體；包括這些多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；以及產(chǎn)生這些多肽的方法。
[0109] 本發(fā)明還涉及編碼包括SEQ ID N0:6的氨基酸1至20或由其組成的信號(hào)肽的一種 多核苷酸、編碼包括SEQ ID N0:6的氨基酸21至392或由其組成的前肽的一種多核苷酸、 或編碼包括SEQ ID N0:6的氨基酸1至392或由其組成的信號(hào)肽和前肽的一種多核苷酸， 其每一者被可操作地連接至編碼一種蛋白質(zhì)的基因；涉及核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體、以及包括 這些多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；以及涉及產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)的方法。
[0110] 本發(fā)明還涉及抑制表達(dá)或者產(chǎn)生與序列SEQ ID:N0:2、SEQ ID N0:4、或SEQ ID N0:6 中任一項(xiàng)具有至少 68%，例如像 70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或 100%序列 一致性的一種或多種肽的方法。
[0111] 另外，本發(fā)明涉及一種用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括：在具有葡萄糖醛 酸酯酶的多肽的存在下，用一種酶組合物處理該纖維素材料，該多肽與序列SEQ ID:N0:2、 SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6 中任一項(xiàng)具有至少68%，例如像70%、75%、80%、85%、90%、 95%、99%或100%序列一致性。
[0112] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少80%，例如至 少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的分離的多肽，這些分離的多肽具有葡 萄糖醛酸酯酶活性。在一個(gè)方面，這些多肽與SEQ ID N0:2的成熟多肽只有不超過(guò)十個(gè)氨基 酸不同，例如九個(gè)氨基酸、八個(gè)氨基酸、七個(gè)氨基酸、六個(gè)氨基酸、五個(gè)氨基酸、四個(gè)氨基酸、 三個(gè)氨基酸、兩個(gè)氨基酸、或一個(gè)氨基酸。
[0113] 本發(fā)明的多肽優(yōu)選地包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列或其等位基因變體或由其組 成；或是其具有葡萄糖醛酸酯酶活性的片段。在另一個(gè)方面，多肽包括SEQ ID N0:2的成熟 多肽或由其組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸101至474或由 其組成。
[0114] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID N0:4的成熟多肽具有至少95%，例如至少 96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列一致性的分離的多肽，該分離的多肽 具有葡萄糖醛酸酯酶活性。在一個(gè)方面，這些多肽與SEQ ID N0:4的成熟多肽只有不超過(guò) 十個(gè)氨基酸不同，例如九個(gè)氨基酸、八個(gè)氨基酸、七個(gè)氨基酸、六個(gè)氨基酸、五個(gè)氨基酸、四 個(gè)氨基酸、三個(gè)氨基酸、兩個(gè)氨基酸、或一個(gè)氨基酸。
[0115] 本發(fā)明的多肽優(yōu)選地包括SEQ ID N0:4的氨基酸序列或其等位基因變體或由其組 成；或是其具有葡萄糖醛酸酯酶活性的片段。在另一個(gè)方面，多肽包括SEQ ID N0:4的成熟 多肽或由其組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO:4的氨基酸94至460或由其 組成。
[0116] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID N0:6的成熟多肽具有至少92%，例如至 少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列 一致性的分離的多肽，這些分離的多肽具有葡萄糖醛酸酯酶活性。在一個(gè)方面，這些多肽與 SEQ ID N0:6的成熟多肽只有不超過(guò)十個(gè)氨基酸不同，例如九個(gè)氨基酸、八個(gè)氨基酸、七個(gè) 氨基酸、六個(gè)氨基酸、五個(gè)氨基酸、四個(gè)氨基酸、三個(gè)氨基酸、兩個(gè)氨基酸、或一個(gè)氨基酸。
[0117] 本發(fā)明的多肽優(yōu)選地包括SEQ ID N0:6的氨基酸序列或其等位基因變體或由其組 成；或是其具有葡萄糖醛酸酯酶活性的片段。在另一個(gè)方面，多肽包括SEQ ID N0:6的成熟 多肽或由其組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO:6的氨基酸21至392或由其 組成。
[0118] 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及由一種多核苷酸編碼的具有葡萄糖醛酸酯酶活性 的分離的多肽，該多核苷酸在非常低嚴(yán)謹(jǐn)度條件、低嚴(yán)謹(jǐn)度條件、中嚴(yán)謹(jǐn)度條件、中高嚴(yán)謹(jǐn) 度條件、高嚴(yán)謹(jǐn)度條件、或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與以下各項(xiàng)雜交：（i)SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5的成熟多肽編碼序列，（ii)其cDNA序列，或（iii)⑴或（ii)的全長(zhǎng) 互補(bǔ)體（薩姆布魯克（Sambrook)等人，1989,分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（Molecular Cloning, A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港（Cold Spring Harbor)，紐約）。
[0119] 可以使用 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5或其子序列，以及SEQ ID N0:2、 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6的多肽或其片段來(lái)設(shè)計(jì)核酸探針以便根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法鑒 定和克隆編碼來(lái)自不同屬或物種的菌株的具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的DNA。具體而 言，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，使用這類探針與感興趣的細(xì)胞的基因組DNA或cDNA雜交， 以便鑒別和分離其中的對(duì)應(yīng)基因。這類探針可以明顯短于完整序列，但是長(zhǎng)度應(yīng)為至少15， 例如至少25、至少35、或至少70個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，該核酸探針的長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷 酸，例如長(zhǎng)度為至少200個(gè)核苷酸、至少300個(gè)核苷酸、至少400個(gè)核苷酸、至少500個(gè)核苷 酸、至少600個(gè)核苷酸、至少700個(gè)核苷酸、至少800個(gè)核苷酸、或至少900個(gè)核苷酸。DNA 和RNA探針都可使用。典型地將探針進(jìn)行標(biāo)記（例如，用3午、3!1、355、生物素、或抗生物素蛋 白），以檢測(cè)相應(yīng)的基因。本發(fā)明涵蓋此類探針。
[0120] 可以針對(duì)與以上描述的探針雜交并且編碼出具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的 DNA對(duì)由這類其他菌株制備的基因組DNA或cDNA庫(kù)進(jìn)行篩選。來(lái)自這類其他菌株的基因 組DNA或其他DNA可以通過(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其他分離技術(shù)來(lái)分離。來(lái)自 文庫(kù)的DNA或分離的DNA可轉(zhuǎn)移到并固定在硝酸纖維素或其他適合的載體材料上。為鑒定 與SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5或其子序列同源的克隆或DNA，該運(yùn)載體材料 優(yōu)選地在DNA印跡法中使用。
[0121] 出于本發(fā)明的目的，雜交指示該多核苷酸在非常低到非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與對(duì)應(yīng) 于以下各項(xiàng)的經(jīng)過(guò)標(biāo)記的核酸探針雜交：（i)SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5;(ii) SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5 的成熟多肽編碼序列；（iii)cDNA序列；（iv)其全 長(zhǎng)補(bǔ)體；或（v)其子序列。在這些條件下，核酸探針雜交的分子可以使用例如X-射線膠片 而進(jìn)行檢測(cè)。
[0122] 在另一個(gè)方面，該核酸探針是編碼SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6的多 肽，其成熟多肽，或其片段的多核苷酸。在另一個(gè)方面，該核酸探針是SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:5 或其 cDNA 序列。
[0123] 對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，非常低嚴(yán)謹(jǐn)度條件被定義為最佳地， 遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA 印跡（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0.3%SDS、200 毫克 / ml剪切并變性的鮭魚(yú)精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交12至24小時(shí)12至24小時(shí)。 載體材料最終使用2X SSC、0. 2% SDS，在45°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0124] 對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，低嚴(yán)謹(jǐn)度條件被定義為最佳地，遵循 標(biāo)準(zhǔn) DNA 印跡（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0.3% SDS、200 毫克/ml 剪切并變性的鮭魚(yú)精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使 用2X SSC、0. 2% SDS，在50°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0125] 對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，中嚴(yán)謹(jǐn)度條件被定義為最佳地，遵循 標(biāo)準(zhǔn) DNA 印跡（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0. 3% SDS、200 毫克 /ml 剪切并變性的鮭魚(yú)精子DNA和35%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使 用2X SSC、0. 2% SDS，在55°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0126] 對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件被定義為最佳地，遵 循標(biāo)準(zhǔn) DNA 印跡（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0. 3% SDS、200 毫克 / ml剪切并變性的鮭魚(yú)精子DNA和亦或35%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交12至24小時(shí)。載體材 料最終使用2X SSC、0. 2% SDS，在60°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0127] 對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，高嚴(yán)謹(jǐn)度條件被定義為最佳地，遵循 標(biāo)準(zhǔn) DNA 印跡（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0. 3% SDS、200 毫克 /ml 剪切并變性的鮭魚(yú)精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使 用2X SSC、0. 2% SDS，在65°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0128] 對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件被定義為最佳地， 遵循標(biāo)準(zhǔn) DNA 印跡（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0.3% SDS、200 毫克 /ml剪切并變性的鮭魚(yú)精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交12至24小時(shí)。載體材料最 終使用2X SSC、0. 2% SDS，在70°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0129] 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及由與SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5的 成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的多核苷酸編碼的具有葡萄糖醛酸酯酶 活性的分離多肽。
[0130] 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6的成熟 多肽的變體，這些變體在一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)）位置處包括取代、缺失和/或插入。優(yōu) 選地，氨基酸改變的性質(zhì)較小，也就是說(shuō)不會(huì)顯著影響蛋白質(zhì)折疊和/或活性的保守氨基 酸取代或插入；典型地是1個(gè)至大約30個(gè)氨基酸的小段缺失；小段氨基或羧基末端延伸， 例如氨基末端的甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個(gè)殘基的小段接頭肽；或通過(guò)改變凈電荷 或另一功能而協(xié)助純化的小段延伸，例如多組氨酸區(qū)段、抗原表位、或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0131] 保守取代的實(shí)例是在下組的范圍內(nèi)：堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸及組氨酸）、酸 性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）、極性氨基酸（谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水性氨基酸（亮 氨酸、異亮氨酸及纈氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸）及小氨基酸（甘 氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸及甲硫氨酸）。一般不會(huì)改變特異性活性的氨基酸取代是本 領(lǐng)域已知的并且例如由11.諾伊拉特（他1^ &也）和1?丄.希爾（把11)，1979在蛋白質(zhì)（11^ Proteins)，學(xué)術(shù)出版社（Academic Press)，紐約中描述。常見(jiàn)取代是Ala/Ser、Val/Ile、 Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/ Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和 Asp/Gly〇
[0132] 可替代地，氨基酸改變具有這樣一種性質(zhì)：改變多肽的物理化學(xué)特性。例如，氨基 酸改變可以提高多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最適pH，等等。
[0133] 可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的程序，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變（坎寧漢 (Cunningham)和威爾斯（Wells)，1989,科學(xué)（Science) 244:1081-1085)來(lái)鑒定多膚中的 必需氨基酸。在后一項(xiàng)技術(shù)中，在該分子中的每個(gè)殘基處引入單個(gè)丙氨酸突變，并且對(duì)所 得突變體分子的葡萄糖醛酸酯酶活性進(jìn)行測(cè)試以鑒別對(duì)于該分子的活性至關(guān)重要的氨基 酸殘基。還參見(jiàn)，希爾頓（Hilton)等人，1996,生物化學(xué)雜志271:4699-4708。也可結(jié)合假 定接觸位點(diǎn)氨基酸的突變，如通過(guò)以下技術(shù)例如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射、或光親和標(biāo) 記進(jìn)行確定的對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行物理學(xué)分析，從而確定酶的活性位點(diǎn)或其他生物學(xué)相互作用。參 見(jiàn)，例如，德弗斯（de Vos)等人，1992,科學(xué)255:306-312 ;史密斯（Smith)等人，1992,分子 生物學(xué)雜志224:899-904 ;烏樂(lè)達(dá)維爾（Wlodaver)等人，1992,歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào) 309:59-64。還可以從與相關(guān)多肽的比對(duì)來(lái)推斷鑒別必需氨基酸。
[0134] 使用已知的誘變、重組和/或改組方法、隨后進(jìn)行一個(gè)相關(guān)的篩選程序可以做出 單一或多種氨基酸取代、缺失和/或插入并對(duì)其進(jìn)行測(cè)試，這些相關(guān)的篩選程序例如由 Reidhaar-Olson (瑞德哈爾-奧爾森）和 Sauer (薩奧爾），1988,科學(xué) 241:53-57 ;Bowie (鮑 依）和薩奧爾，1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊）86:2152-2156 ;W0 95/17413;或者WO 95/22625所描述的那些。其他可以使用的方法包括易錯(cuò)PCR、噬菌體展 不（例如洛曼（Lowman)等人，1991，生物化學(xué)（Biochemistry) 30:10832-10837 ;美國(guó)專利 號(hào)5, 223, 409 ;W0 92/06204)以及區(qū)域定向誘變（德比什爾（Derbyshire)等人，1986,基因 (Gene) 46:145;內(nèi)爾（Ner)等人，1988, DNA 7:127)。
[0135] 可以結(jié)合誘變/改組方法與高通量自動(dòng)化篩選方法來(lái)檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克 隆的、誘變的多肽的活性（內(nèi)斯等人，1999,自然生物技術(shù)17:893-896)。編碼活性多肽的誘 變的DNA分子可以回收自宿主細(xì)胞，并且使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)其進(jìn)行迅速測(cè)序。這些 方法允許迅速確定多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性。
[0136] 在一個(gè)實(shí)施例中，引入SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6的成熟多肽中的 氨基酸取代、缺失和/或插入的數(shù)目不超過(guò)10個(gè)，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9個(gè)。
[0137] 該多肽可以是一種雜合多肽，其中一種多肽的一個(gè)區(qū)域在另一種多肽的一個(gè)區(qū)域 的N-末端或C-末端處融合。
[0138] 該多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一種多肽在本發(fā)明多肽的 N-末端或C-末端處融合。通過(guò)將編碼另一多肽的多核苷酸融合到本發(fā)明的多核苷酸而 產(chǎn)生融合多肽。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并包括連接編碼多肽的編碼 序列，這樣使得它們?cè)诳騼?nèi)并且使得融合多肽的表達(dá)處于相同的一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子和終止 子的控制下。還可以使用內(nèi)含肽技術(shù)構(gòu)建融合多肽，其中在翻譯后產(chǎn)生融合多肽（庫(kù)珀 (Cooper)等人，1993,歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志12:2575-2583 ;道森（Dawson)等人，1994， 科學(xué) 266:776-779)。
[0139] 融合多肽可以在兩個(gè)多肽之間進(jìn)一步包括一個(gè)切割位點(diǎn)。在融合蛋白分泌 之時(shí)，該位點(diǎn)被切割，從而釋放出這兩個(gè)多肽。切割位點(diǎn)的實(shí)例包括但不局限于在以 下文獻(xiàn)中披露的位點(diǎn)：馬丁（Martin)等人，2003,工程微生物和生物技術(shù)雜志（J. Ind. Microbiol. Biotechnol.) 3:568-576 ;斯瓦蒂娜（Svetina)等人，2000，生物技術(shù)雜志 (J.Biotechnol.) 76:245-251 ;拉斯馬森-威爾遜（Rasmussen-Wilson)等人，1997， 應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)（Appl. Environ. Microbiol. )，63:3488-3493 ;沃德（Ward)等 人，1995，生物技術(shù)（Biotechnology) 13:498-503 ;以及孔特雷拉斯（Contreras)等 人，1991，生物技術(shù)（Biotechnology) 9:378-381 ;伊頓（Eaton)等人，1986，生物化學(xué) (Biochemistry) 25:505-512 ;柯林斯-瑞思（Collins-Racie)等人，1995，生物技術(shù) 13:982-987 ;卡特（Carter)等人，1989,蛋白質(zhì)：結(jié)構(gòu)、功能以及遺傳學(xué)（Proteins:Struc ture, Function, and Genetics) 6:240-248 ;以及史蒂文斯（Stevens)，2003,世界藥物發(fā)現(xiàn) (Drug Discovery World)4:35-48〇
[0140] 具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的來(lái)源
[0141] 本發(fā)明的具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽可以從任何屬的微生物獲得。出于本發(fā) 明的目的，如在此結(jié)合一種給定的來(lái)源使用的術(shù)語(yǔ)"從...中獲得"應(yīng)意指由多核苷酸編碼 的多肽是由該來(lái)源或者由其中已經(jīng)插入來(lái)自該來(lái)源的多核苷酸的一種菌株產(chǎn)生的。在一個(gè) 方面，獲得自給定來(lái)源的多肽被分泌到細(xì)胞外。
[0142] 該多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，該多肽可以是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多肽，如具 有葡萄糖醒酸酯酶活性的芽孢桿菌屬（Bacillus)、梭菌屬（Clostridium)、腸球菌屬 (Enterococcus)、土芽抱桿菌屬（Geobacillus)、乳酸桿菌屬屬（Lactobacillus)、乳球菌 屬（Lactococcus)、海洋芽抱桿菌屬（Oceanobacillus)、葡萄球菌屬（Staphylococcus)、 鏈球菌屬（Streptococcus)、或鏈霉菌屬（Streptomyces)多肽；或一種革蘭氏陰性細(xì)菌 多肽，如彎曲桿菌屬（Campylobacter)、大腸桿菌（E.coli)、黃桿菌屬（Flavobacterium) (例如約氏黃桿菌（Flavobacterium johnsoniae))、梭桿菌屬(Fusobacterium)、螺旋桿 菌屬（Helicobacter)、泥桿菌屬（Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬（Neisseria)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、沙門(mén)氏菌屬（Salmonella)或脲原體屬（Ureaplasma)多肽。
[0143] 在一個(gè)方面，該多肽是嗜堿芽孢桿菌（Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢 桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)、短芽抱桿菌（Bacillus brevis)、環(huán)狀芽抱桿菌 (Bacillus circulans)、克勞氏芽抱桿菌（Bacillus clausii)、凝結(jié)芽抱桿菌（Bacillus coagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽抱桿菌（Bacillus firmus)、燦爛芽抱桿菌（Bacillus lautus)、遲 緩芽抱桿菌（Bacillus lentus)、地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)、巨大芽抱 桿菌（Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、或蘇云金芽抱桿 菌（Bacillus thuringiensis)多月太。
[0144] 在另一個(gè)方面，該多肽是似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌、或馬鏈球菌獸瘟 亞種多肽。
[0145] 在另一個(gè)方面，該多肽是不產(chǎn)色鏈霉菌、阿維鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、灰色鏈絲菌、 或變鉛青鏈霉菌多肽。
[0146] 該多肽還可以是真菌多肽。例如，該多肽可以是酵母多肽，例如假絲酵母 屬（Candida)、克魯維酵母屬（Kluyveromyces)、畢赤酵母屬（Pichia)、酵母菌屬 (Saccharomyces)、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母屬（Yarrowia) 多肽；或絲狀真菌多肽，例如枝頂孢霉屬（Acremonium)、傘菌屬（Agaricus)、鏈格孢 屬（Alternaria)、曲霉屬（Aspergillus)、短梗霉屬（Aureobasidium)、葡萄座腔菌 屬（Botryospaeria)、擬錯(cuò)菌屬（Ceriporiopsis)、毛 _ 殼屬（Chaetomidium)、金抱 子菌屬（Chrysosporium)、麥角菌屬（Claviceps)、旋孢腔菌屬（Cochliobolus)、鬼傘 屬（Coprinopsis)、乳白蟻屬（Coptotermes)、棒囊殼屬（Corynascus)、隱叢赤殼菌屬 (Cryphonectria)、隱球菌屬（Cryptococcus)、色二抱屬（Diplodia)、黑耳屬（Exidia)、 線黑粉酵母屬（Filibasidium)、鐮刀菌屬（Fusarium)、赤霉屬（Gibberella)、全鞭毛蟲(chóng) 屬（Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬（Humicola)、耙齒菌屬（Irpex)、蘑燕屬（Lentinula)、 小腔球菌屬（Leptospaeria)、梨抱菌屬（Magnaporthe)、黑果菌屬（Melanocarpus)、 多孔菌屬（Meripilus)、毛霉屬（Mucor)、毀絲霉屬（Myceliophthora)、新美鞭菌 屬（Neocallimastix)、脈抱菌屬（Neurospora)、擬青霉屬（Paecilomyces)、青霉菌 屬（Penicillium)、平革菌屬（Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬（Piromyces)、某真菌屬 (Poitrasia)、假黑盤(pán)菌屬（Pseudoplectania)、假披發(fā)蟲(chóng)屬（Pseudotrichonympha)、 根毛霉菌屬（Rhizomucor)、裂糟菌屬（Schizophyllum)、柱頂孢屬（Scytalidium)、踝 節(jié)菌屬（Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus)、梭孢殼霉屬（Thielavia)、彎頸 霉屬（Tolypocladium)、木霉屬（Trichoderma)、長(zhǎng)毛盤(pán)菌屬（Trichophaea)、輪枝孢屬 (Verticillium)、小包腳燕屬（Volvariella)或炭角菌屬（Xylaria)多肽。
[0147] 在另一個(gè)方面，該多肽是卡爾斯伯酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克魯 維酵母、諾地酶母、或卵形酵母多肽。
[0148] 在另一個(gè)方面，該多肽是解纖維枝頂孢霉（Acremonium cellulolyticus)、 棘抱曲霉（Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉（Aspergillus awamori)、臭曲霉 (Aspergillus foetidus)、煙曲霉（Aspergillus fumigatus)、日本曲霉（Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米 曲霉（Aspergillus oryzae)、狹邊金孢子菌（Chrysosporium inops)、嗜角質(zhì)金孢子 菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、租金抱子菌（Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicumΛ 熱帶金抱子菌（Chrysosporium tropicum)、帶紋金抱子菌（Chrysosporium zonatum)、 桿抱狀嫌抱（Fusarium bactridioides)、谷類嫌抱（Fusarium cerealis)、庫(kù)威嫌 抱（Fusarium crookwellense)、大刀嫌抱（Fusarium culmorum)、禾谷嫌抱（Fusarium graminearum)、禾赤嫌抱（Fusarium graminum)、異抱嫌抱（Fusarium heterosporum)、 合歡木嫌抱（Fusarium negundi)、尖嫌抱（Fusarium oxysporum)、多枝嫌抱（Fusarium reticulatum)、粉紅嫌抱（Fusarium roseum)、接骨木嫌抱（Fusarium sambucinum)、膚 色嫌抱（Fusarium sarcochroum)、擬分枝抱嫌抱（Fusarium sporotrichioides)、硫色 嫌抱（Fusarium sulphureum)、圓嫌抱（Fusarium torulosum)、擬絲抱嫌抱（Fusarium trichothecioides)、壤片嫌抱（Fusarium venenatum)、灰腐質(zhì)霉（Humicola grisea)、特 異腐質(zhì)霉（Humicola insolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉（Humicola lanuginosa)、白耙齒菌（Irpex lacteus)、米黑毛霉（Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉（Myceliophthora thermophila)、粗糖鏈 抱菌（Neurospora crassa)、黃灰青霉、繩狀青霉菌（Penicillium funiculosum)、產(chǎn)紫青霉 菌（Penicillium purpurogenum)、黃抱原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium)、無(wú) 色梭抱殼霉（Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、白毛梭抱殼霉（Thielavia albopilosa)、澳洲梭抱殼霉（Thielavia austral e ins is)、Thielavia fimeti、小抱梭抱 殼霉（Thielavia microspora)、卵抱梭抱殼霉（Thielavia ovispora)、秘魯梭抱殼霉 (Thielavia peruviana)、毛梭抱殼霉（Thielavia setosa)、瘤抱梭抱殼霉（Thielavia spededonium)、耐熱梭抱殼（Thielavia subthermophila)、土生梭抱殼霉（Thielavia terrestris)、哈茨木霉（Trichoderma harzianum)、康寧木霉（Trichoderma koningii)、長(zhǎng) 枝木霉（Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉（Trichoderma reesei)、或綠色木霉 (Trichoderma viride)多月太。
[0149] 將理解的是，對(duì)于以上提到的物種而言，本發(fā)明涵蓋完全狀態(tài)和不完全狀態(tài) (perfect and imperfect states)二者、以及其他分類學(xué)等效物，例如無(wú)性型，而不管它們 已知的物種名稱是什么。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易地識(shí)別適當(dāng)?shù)刃锏纳矸荨?br> [0150] 這些物種的株系可以容易地在許多培養(yǎng)物保藏中心為公眾所獲得，如美國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)、德國(guó)微生物菌種保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷蘭菌種保藏中心（Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、以及美國(guó)農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心北方地區(qū)研究中心 (NRRL)。
[0151] 可以使用上述探針，從其他來(lái)源包括從自然界（例如，土壤、堆肥、水，等等）分離 的微生物鑒定并獲得該多肽。用于從自然生境分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。然后可 以通過(guò)類似地篩選另一微生物的基因組DNA或cDNA文庫(kù)或混合的DNA樣品來(lái)獲得編碼該 多肽的多核苷酸。一旦用這種或這些探針檢測(cè)到編碼一種多肽的多核苷酸，就可以通過(guò)使 用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的的技術(shù)分離或克隆該多核苷酸（參見(jiàn)，例如，薩姆布魯 克（Sambrook)等人，1989,見(jiàn)上文）。
[0152] 結(jié)構(gòu)域
[0153] 本發(fā)明還涉及催化結(jié)構(gòu)域。
[0154] 在一個(gè)實(shí)施例中，該催化結(jié)構(gòu)域與SEQ ID N0:2的氨基酸101至474具有至少 80%，例如至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或 100%的序列一致性。在一個(gè)方面，該催化結(jié)構(gòu)域包括與SEQ ID N0:2的氨基酸101至474 有十個(gè)氨基酸不同，例如九個(gè)氨基酸、八個(gè)氨基酸、七個(gè)氨基酸、六個(gè)氨基酸、五個(gè)氨基酸、 四個(gè)氨基酸、三個(gè)氨基酸、兩個(gè)氨基酸、或一個(gè)氨基酸不同的氨基酸序列。
[0155] 該催化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地包括SEQ ID N0:2的氨基酸101到474或其等位基因變體或 由其組成；或?yàn)槠渚哂衅咸烟侨┧狨ッ富钚缘钠巍?br> [0156] 在另一個(gè)實(shí)施例中，該催化結(jié)構(gòu)域是由在非常低嚴(yán)謹(jǐn)度條件、低嚴(yán)謹(jǐn)度條件、中嚴(yán) 謹(jǐn)度條件、中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件、高嚴(yán)謹(jǐn)度條件、或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件（如以上定義的）下與 以下雜交的多核苷酸編碼的：（i)SEQ ID N0:1的核苷酸33至1457,（ii)其cDNA序列，或 (iii) (i)或（ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)體（薩姆布魯克（Sambrook)等人，1989,同上）。
[0157] 在另一個(gè)實(shí)施例中，該催化結(jié)構(gòu)域是由與SEQ ID NO: 1的核苷酸33至1457或其 cDNA序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %序列一致性的多核苷 酸所編碼的。
[0158] 在另一個(gè)方面，編碼該催化結(jié)構(gòu)域的多核苷酸包括SEQ ID NO: 1的核苷酸33至 1457或由其組成。
[0159] 在另一個(gè)實(shí)施例中，該催化結(jié)構(gòu)域是SEQ ID N0:2的氨基酸101到474的一個(gè)變 體，該變體在一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)）位置處包括取代、缺失和/或插入。在一個(gè)實(shí)施例 中，引入SEQ ID N0:2的氨基酸101到474的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數(shù)目 是10個(gè)，例如1、2、3、4、5、6、8或9個(gè)。
[0160] 在一個(gè)實(shí)施例中，該催化結(jié)構(gòu)域與SEQ ID N0:4的氨基酸94至460具有至少95%， 例如至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列一致性。在一個(gè)方面，該催 化結(jié)構(gòu)域包括與SEQ ID N0:4的氨基酸94至460有十個(gè)氨基酸不同，例如九個(gè)氨基酸、八 個(gè)氨基酸、七個(gè)氨基酸、六個(gè)氨基酸、五個(gè)氨基酸、四個(gè)氨基酸、三個(gè)氨基酸、兩個(gè)氨基酸、或 一個(gè)氨基酸不同的氨基酸序列。
[0161] 該催化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地包括SEQ ID N0:4的氨基酸94到460或其等位基因變體或 由其組成；或?yàn)槠渚哂衅咸烟侨┧狨ッ富钚缘钠巍?br> [0162] 在另一個(gè)實(shí)施例中，該催化結(jié)構(gòu)域是由在非常低嚴(yán)謹(jǐn)度條件、低嚴(yán)謹(jǐn)度條件、中嚴(yán) 謹(jǐn)度條件、中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件、高嚴(yán)謹(jǐn)度條件、或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件（如以上定義的）下與 以下雜交的多核苷酸編碼的：（i)SEQIDN0:3的核苷酸81至 1463，（ii)其cDNA序列，或 (iii) (i)或（ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)體（薩姆布魯克（Sambrook)等人，1989,同上）。
[0163] 在另一個(gè)實(shí)施例中，該催化結(jié)構(gòu)域是由與SEQ ID N0:3的核苷酸81至1463或其 cDNA序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %序列一致性的多核苷 酸所編碼的。
[0164] 在另一個(gè)方面，編碼該催化結(jié)構(gòu)域的多核苷酸包括SEQ ID N0:3的核苷酸81至 1463或由其組成。
[0165] 在另一個(gè)實(shí)施例中，該催化結(jié)構(gòu)域是SEQ ID N0:4的氨基酸94到460的一個(gè)變體， 該變體在一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)）位置處包括取代、缺失和/或插入。在一個(gè)實(shí)施例中， 引入SEQ ID N0:4的氨基酸94到460的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數(shù)目是10 個(gè)，例如 1、2、3、4、5、6、8 或 9 個(gè)。
[0166] 在一個(gè)實(shí)施例中，該催化結(jié)構(gòu)域與SEQ ID N0:6的氨基酸26至392具有至少90%， 例如至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列一致性。在一 個(gè)方面，該催化結(jié)構(gòu)域包括與SEQ ID N0:6的氨基酸26至392有十個(gè)氨基酸不同，例如九 個(gè)氨基酸、八個(gè)氨基酸、七個(gè)氨基酸、六個(gè)氨基酸、五個(gè)氨基酸、四個(gè)氨基酸、三個(gè)氨基酸、兩 個(gè)氨基酸、或一個(gè)氨基酸不同的氨基酸序列。
[0167] 該催化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地包括SEQ ID N0:6的氨基酸26到392或其等位基因變體或 由其組成；或?yàn)槠渚哂衅咸烟侨┧狨ッ富钚缘钠巍?br> [0168] 在另一個(gè)實(shí)施例中，該催化結(jié)構(gòu)域是由在非常低嚴(yán)謹(jǐn)度條件、低嚴(yán)謹(jǐn)度條件、中嚴(yán) 謹(jǐn)度條件、中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件、高嚴(yán)謹(jǐn)度條件、或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件（如以上定義的）下與 以下雜交的多核苷酸編碼的：（i)SEQ ID N0:5的核苷酸235至1491，（ii)其cDNA序列，或 (iii) (i)或（ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)體（薩姆布魯克（Sambrook)等人，1989,同上）。
[0169] 在另一個(gè)實(shí)施例中，該催化結(jié)構(gòu)域是由與SEQ ID N0:5的核苷酸235至1491或其 cDNA序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %序列一致性的多核苷 酸所編碼的。
[0170] 在另一個(gè)方面，編碼該催化結(jié)構(gòu)域的多核苷酸包括SEQ ID N0:5的核苷酸235至 1491或由其組成。
[0171] 在另一個(gè)實(shí)施例中，該催化結(jié)構(gòu)域是SEQ ID N0:6的氨基酸25到392的一個(gè)變體， 該變體在一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)）位置處包括取代、缺失和/或插入。在一個(gè)實(shí)施例中， 引入SEQ ID N0:6的氨基酸26到392的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數(shù)目是10 個(gè)，例如 1、2、3、4、5、6、8 或 9 個(gè)。
[0172] 本發(fā)明還涉及分離的多肽，所述分離的多肽包括選自下組的催化結(jié)構(gòu)域，該組由 以下各項(xiàng)組成：葡萄糖醛酸酯酶（EC 2. 4. 1. 17)
[0173] (a)與SEQ ID N0:2的氨基酸101至474具有至少80%序列一致性的一個(gè)催化結(jié) 構(gòu)域；
[0174] (b)由一種多核苷酸編碼的一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，該多核苷酸在高或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條 件下與（i)SEQ ID N0:1的核苷酸33至1457、（ii)其cDNA序列、或（iii)⑴或（ii)的全 長(zhǎng)互補(bǔ)體雜交；
[0175] (c)由與SEQ ID NO: 1的核苷酸33至1457或其cDNA序列具有至少80%序列一 致性的一種多核苷酸編碼的一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域；
[0176] (e)在一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)）位置處包括取代、刪除、和/或插入的SEQ ID NO: 2的氨基酸101至474的變體；以及
[0177] (f)具有葡萄糖醛酸酯酶活性的（a)、(b)、（c)、（d)或（e)的催化結(jié)構(gòu)域的一個(gè)片 段。
[0178] 本發(fā)明還涉及分離的多肽，所述分離的多肽包括選自下組的催化結(jié)構(gòu)域，該組由 以下各項(xiàng)組成：葡萄糖醛酸酯酶（EC 2. 4. 1. 17)
[0179] (a)與SEQ ID N0:4的氨基酸94至460具有至少80%序列一致性的一個(gè)催化結(jié) 構(gòu)域；
[0180] (b)由一種多核苷酸編碼的一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，該多核苷酸在高或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條 件下與（i)SEQ ID N0:3的核苷酸81至1463、（ii)其cDNA序列、或（iii)⑴或（ii)的全 長(zhǎng)互補(bǔ)體雜交；
[0181] (c)由與SEQ ID N0:3的核苷酸81至1463或其cDNA序列具有至少80%序列一 致性的一種多核苷酸編碼的一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域；
[0182] (e)SEQ ID N0:4的氨基酸94至460的一種變體，該變體在一個(gè)或多個(gè)（例如若干 個(gè)）位置處包括取代、刪除、和/或插入；以及
[0183] (f)具有葡萄糖醛酸酯酶活性的（a)、(b)、（c)、（d)或（e)的催化結(jié)構(gòu)域的一個(gè)片 段。
[0184] 本發(fā)明還涉及分離的多肽，所述分離的多肽包括選自下組的催化結(jié)構(gòu)域，該組由 以下各項(xiàng)組成：葡萄糖醛酸酯酶（EC 2. 4. 1. 17)
[0185] (a)與SEQ ID N0:6的氨基酸48至392具有至少80%序列一致性的一個(gè)催化結(jié) 構(gòu)域；
[0186] (b)由一種多核苷酸編碼的一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，該多核苷酸在高或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條 件下與（i)SEQ ID N0:5的核苷酸235至1491、（ii)其cDNA序列、或（iii)⑴或（ii)的 全長(zhǎng)互補(bǔ)體雜交；
[0187] (c)由與SEQ ID N0:5的核苷酸235至1491或其cDNA序列具有至少80%序列一 致性的一種多核苷酸編碼的一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域；
[0188] (d) SEQ ID N0:6的成熟多肽的一種變體，該變體在一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)）位 置處包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0189] (e)SEQ ID N0:6的氨基酸21至392的一種變體，該變體在一個(gè)或多個(gè)（例如若干 個(gè)）位置處包括取代、刪除、和/或插入；以及
[0190] (f)具有葡萄糖醛酸酯酶活性的（a)、(b)、（c)、（d)或（e)的催化結(jié)構(gòu)域的一個(gè)片 段。
[0191] 本發(fā)明還涉及纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0192] 在另一個(gè)實(shí)施例中，該纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域是由在非常低嚴(yán)謹(jǐn)度條件、低嚴(yán)謹(jǐn)度條 件、中嚴(yán)謹(jǐn)度條件、中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件、高嚴(yán)謹(jǐn)度條件、或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件（如以上定義 的）下與以下雜交的多核苷酸編碼的：（i)SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5的核苷 酸，（ii)其cDNA序列，或（iii)⑴或（ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)體（薩姆布魯克（Sambrook)等人， 1989,同上）。
[0193] 在另一個(gè)實(shí)施例中，該纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域是SEQ ID N0:2的一個(gè)變體，該變體在 一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)）位置處包括取代、缺失和/或插入。在一個(gè)方面，引入SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6的氨基酸取代、缺失和/或插入的數(shù)目是10個(gè)，例如1、 2、3、4、5、6、8、或 9 個(gè)。
[0194] 可操作地連接到該纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的催化結(jié)構(gòu)域可以來(lái)自水解酶、異構(gòu)酶、連 接酶、裂解酶、氧化還原酶或轉(zhuǎn)移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫 酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi) 切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖 苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶（mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化 物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β -木糖 苷酶。編碼催化結(jié)構(gòu)域的多核苷酸可以從任何原核、真核或其他來(lái)源獲得。
[0195] 多核苷酸
[0196] 本發(fā)明還涉及編碼如以上所述的本發(fā)明的多肽、催化結(jié)構(gòu)域或纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域 的分離的多核苷酸。
[0197] 用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并且包括分離自基 因組DNA或cDNA或其組合。來(lái)自基因組DNA的多核苷酸的克隆可以例如通過(guò)使用眾所周 知的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)或用以對(duì)具有共有的結(jié)構(gòu)特征的克隆的DNA片段進(jìn)行檢測(cè)的表達(dá) 庫(kù)抗體篩選來(lái)實(shí)現(xiàn)。參見(jiàn)例如，伊尼斯（Innis)等人，1990, PCR:方法和應(yīng)用指南（PCR:A Guide to Methods and Application),學(xué)術(shù)出版社，紐約?？梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增程序例 如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LCR)、連接激活轉(zhuǎn)錄（LAT)和基于多核苷酸的擴(kuò)增（NASBA)。這些多核 苷酸可以從任何相關(guān)的微生物克隆，并且因此，例如可以是該多核苷酸的多肽編碼區(qū)的等 位基因或物種變體。
[0198] 編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的修飾對(duì)于合成實(shí)質(zhì)上類似于該多肽的多肽可以是 必需的。術(shù)語(yǔ)"基本上類似于"該多肽是指該多肽的非天然發(fā)生的形式。這些多肽可能以 某種工程化方式而不同于從其天然來(lái)源分離的多肽，例如在比活性、熱穩(wěn)定性、pH最佳值 等方面不同的變體。這些變體可以基于以SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5的成 熟多肽編碼序列、或其cDNA序列（例如其子序列）形式呈現(xiàn)的多核苷酸，和/或通過(guò)引入 不會(huì)改變?cè)摱嚯牡陌被嵝蛄校珜?duì)應(yīng)于預(yù)定用于產(chǎn)生該酶的宿主有機(jī)體的密碼子用法的 核苷酸取代，或通過(guò)引入可以產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代來(lái)構(gòu)建。對(duì)于核苷酸取代 的一般描述，參見(jiàn)例如福德（Ford)等人，1991，蛋白表達(dá)與純化（Protein Expression and Purification) 2:95-107。
[0199] 核酸構(gòu)建體
[0200] 本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，這些核酸構(gòu)建體包括可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)控制 序列的本發(fā)明的多核苷酸，在與控制序列相容的條件下，這些控制序列指導(dǎo)編碼序列在合 適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
[0201] 可以按多種方式操縱多核苷酸，以提供多肽的表達(dá)。取決于表達(dá)載體，在其插入載 體以前操縱多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重組DNA方法修飾多核苷酸的技術(shù) 是本領(lǐng)域熟知的。
[0202] 控制序列可以是啟動(dòng)子序列，S卩，被宿主細(xì)胞識(shí)別以對(duì)編碼本發(fā)明的多肽的多核 苷酸進(jìn)行表達(dá)的一種多核苷酸。啟動(dòng)子序列包括介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。該啟動(dòng) 子可以是在選擇的宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變型、截短型及雜 合型啟動(dòng)子，并且可以是由編碼與該宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因獲 得。
[0203] 用于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例 是從以下各項(xiàng)中獲得的啟動(dòng)子：解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因（amyQ)、地衣芽孢桿菌 α-淀粉酶基因（amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因（penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀 粉酶基因（amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因（sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基 因、大腸桿菌lac操縱子、大腸桿菌trc啟動(dòng)子（埃貢（Egon)等人，1988,基因69:301-315)、 天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂水解酶基因（dagA)、以及原核β -內(nèi)酰胺酶基因（維拉-卡馬洛夫 (Villa-Kamaroff)等人，1978,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊75:3727-3731)、以及tac啟動(dòng)子（德 波爾（DeBoer)等人，1983,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊80:21-25)。另外的啟動(dòng)子描述于吉爾伯 特（Gilbert)等人，1980,科學(xué)美國(guó)人（Scientific American)242:74_94 中的"來(lái)自重組 細(xì)菌的有用蛋白"（"Useful proteins from recombinant bacteria"）、以及薩姆布魯克 (Sambrook)等人，1989,見(jiàn)上文。
[0204] 用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例 是從以下各項(xiàng)的基因獲得的啟動(dòng)子：構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸 穩(wěn)定性α -淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶（glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉堿性 蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶（W0 96/00787)、鑲片鐮孢淀粉 葡糖苷酶（W0 00/56900)、鑲片鐮孢 Daria (W0 00/56900)、鑲片鐮孢 Quinn (W0 00/56900)、 曼赫根毛霉（Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖 苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、 里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶Π 、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木 霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β -木糖苷酶、以 及NA2_tpi啟動(dòng)子（來(lái)自編碼中性α-淀粉酶的曲霉屬基因的一種修飾的啟動(dòng)子，其中未 翻譯的前導(dǎo)子已被來(lái)自編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶的曲霉屬基因的未翻譯的前導(dǎo)子替代；非限制 性實(shí)例包括來(lái)自編碼中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修飾的啟動(dòng)子，其中未翻譯的前導(dǎo)子 已被來(lái)自編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶的構(gòu)巢曲霉或米曲霉基因的未翻譯的前導(dǎo)子替代）；及其突 變型、截短型、以及雜合型啟動(dòng)子。
[0205] 在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子從以下的基因獲得：釀酒酵母烯醇酶（ΕΝ0-1)、釀酒 酵母半乳糖激酶（GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ADH1/GAP、ADH2/ GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶（ΤΡΙ)、釀酒酵母金屬硫蛋白（CUP1)、以及和釀酒酵母3-磷 酸甘油酸激酶。羅馬諾斯（Romanos)等人，1992,《酵母》（Yeast)8:423-488描述了酵母宿 主細(xì)胞的其他有用的啟動(dòng)子。
[0206] 控制序列也可以是被宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的合適轉(zhuǎn)錄終止子序列。終止子序 列與編碼多肽的多核苷酸的3'-末端可操作地連接。在選擇的宿主細(xì)胞中有功能的任何終 止子可以用于本發(fā)明中。
[0207] 絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的：構(gòu)巢曲霉鄰氨基 苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α -葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢鐮刀 菌胰蛋白酶樣蛋白酶。
[0208] 用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子從以下基因獲得：釀酒酵母烯醇酶、釀酒酵母細(xì) 胞色素 C (CYC1)、以及釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。用于酵母宿主細(xì)胞的其他有用的終 止子由羅馬努斯等人，1992,見(jiàn)上文描述。
[0209] 控制序列還可以是一個(gè)合適的前導(dǎo)子序列，當(dāng)被轉(zhuǎn)錄時(shí)是對(duì)于通過(guò)宿主細(xì)胞來(lái)翻 譯而言重要的mRNA的一個(gè)非翻譯區(qū)。該前導(dǎo)子序列與編碼多肽的多核苷酸的5' -末端可 操作地連接?？梢允褂迷谶x擇的宿主細(xì)胞中具有功能的任何前導(dǎo)子序列。
[0210] 用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)子從以下基因獲得：米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu) 巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。
[0211] 適用于酵母宿主細(xì)胞的前導(dǎo)子從以下基因獲得：釀酒酵母烯醇酶（EN0-1)、釀酒 酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子、以及釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫 酶（ADH2/GAP)。
[0212] 控制序列還可以是一種聚腺苷酸化序列，可操作地連接至該多核苷酸的3' -末端 并且當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)由宿主細(xì)胞識(shí)別為將聚腺苷酸殘基添加至所轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號(hào)的序列?？?以使用在選擇的宿主細(xì)胞中具有功能的任何聚腺苷酸化序列。
[0213] 絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選的聚腺苷酸化序列是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的：米曲 霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖孢鐮刀菌胰蛋白酶樣 蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶。
[0214] 有用于酵母宿主細(xì)胞的有用的聚腺苷酸化序列由郭（Guo)和舍曼（Sherman)， 1995,分子細(xì)胞生物學(xué)（Mol. Cellular Biol. ) 15:5983-5990 描述。
[0215] 控制序列也可以是編碼與多肽的N-端連接并指導(dǎo)多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌通路的信 號(hào)肽的信號(hào)肽編碼區(qū)。多核苷酸的編碼序列的5' -端可以固有地包括在翻譯閱讀框架中 與編碼多肽的編碼序列的區(qū)段天然地連接的一個(gè)信號(hào)肽編碼序列。可替代地，編碼序列 5末端可以包括對(duì)于該編碼序列是外源的信號(hào)肽編碼序列。在編碼序列不天然地包含信 號(hào)肽編碼序列的情況下，可能需要外源信號(hào)肽編碼序列?？商娲?，外源信號(hào)肽編碼序列可 簡(jiǎn)單地替換天然的信號(hào)肽編碼序列以便增強(qiáng)該多肽的分泌。然而，可以使用指導(dǎo)表達(dá)的多 肽進(jìn)入選擇的宿主細(xì)胞的分泌途徑中的任何信號(hào)肽編碼序列。
[0216] 用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼序列是從以下基因獲得的信號(hào)肽編碼序列： 芽孢桿菌屬NCIB 11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌 β -內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶（nprT、nprS、 nprM)、以及枯草芽孢桿菌prsA。其他信號(hào)序列由西莫寧（Simonen)和帕爾瓦（Palva)， 1993,微生物評(píng)論（Microbiological Reviews) 57:109-137 描述。
[0217] 用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼序列是從以下基因獲得的信號(hào)肽編碼 序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、 特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶、以及曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0218] 有用于酵母宿主細(xì)胞的有用的信號(hào)肽是從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的 基因獲得。其他有用的信號(hào)肽編碼序列由羅馬努斯等人，1992,見(jiàn)上文描述。
[0219] 該控制序列還可以是編碼位于多肽的N-末端處的前肽的一個(gè)前肽編碼序 列。生成的多肽被稱為前體酶（proenzyme)或多肽原（或者在一些情況下被稱為酶原 (zymogen))。多肽原通常是無(wú)活性的并且可以通過(guò)從該多肽原上催化切割或自動(dòng)催化切割 前肽而被轉(zhuǎn)化成一種活性多肽。前肽編碼序列可以從以下各項(xiàng)的基因獲得：枯草芽孢桿菌 堿性蛋白酶（aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶（nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶（W0 95/33836)、曼 赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及釀酒酵母α因子。
[0220] 在多肽的Ν-末端處信號(hào)肽序列和前肽序列都存在的情況下，前肽序列定位成緊 鄰多肽的Ν-末端并且信號(hào)肽序列定位成緊鄰前肽序列的Ν-末端。
[0221] 還可以希望添加調(diào)節(jié)序列，這些調(diào)節(jié)序列相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)調(diào)節(jié)多肽的表 達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激而引起基因的表達(dá)開(kāi)啟或關(guān)閉的那些，包括 調(diào)節(jié)化合物的存在。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)序列包括lac、tac、以及trp操縱子系統(tǒng)。在酵母 中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、 米曲霉TAKA α -淀粉酶啟動(dòng)子、以及米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子。調(diào)節(jié)序列的其他實(shí)例是允 許基因擴(kuò)增的那些。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括在氨甲蝶呤存在下被擴(kuò)增的二氫葉 酸還原酶基因以及用重金屬擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼該多肽的多核苷 酸將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。
[0222] 表達(dá)載體
[0223] 本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的多核苷酸、啟動(dòng)子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)的重組 表達(dá)載體。不同的核苷酸和控制序列可以連接在一起以產(chǎn)生一個(gè)重組表達(dá)載體，這一重組 表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)便利的限制酶切位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)處插入或取代編碼 該變體的多核苷酸。可替代地，通過(guò)將該多核苷酸或者包括該序列的核酸構(gòu)建體插入到用 于表達(dá)的適當(dāng)載體中可以表達(dá)該多核苷酸。在產(chǎn)生表達(dá)載體時(shí)，編碼序列是位于該載體中， 以使得該編碼序列與用于表達(dá)的適當(dāng)控制序列可操作地連接。
[0224] 重組表達(dá)載體可以是任何載體（例如，質(zhì)粒或病毒），其能夠方便地進(jìn)行重組DNA 程序，并且能夠引起多核苷酸的表達(dá)。載體的選擇將典型地取決于該載體與有待引入該載 體的宿主細(xì)胞的相容性。該載體可以是一種線性的或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。
[0225] 載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色 體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微染色體、或人工染色體。該載體可以包含用于確保自 我復(fù)制的任何裝置?？商娲?，該載體可以是這樣一種載體，當(dāng)它被引入該宿主細(xì)胞中時(shí)， 被整合到基因組中并且與其中已整合了它的一個(gè)或多個(gè)染色體一起復(fù)制。此外，可以使用 單一載體或質(zhì)?；騼蓚€(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒（這些載體或質(zhì)粒共同包含有待引入到宿主 細(xì)胞的基因組中的總DNA)或轉(zhuǎn)座子。
[0226] 該載體優(yōu)選包含允許容易選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞或類似細(xì)胞的一個(gè) 或多個(gè)選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是一種基因，該基因的產(chǎn)物提供了殺生物劑抗性或病毒抗 性、重金屬抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型、等。
[0227] 細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是來(lái)自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予 抗生素抗性（例如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、或四環(huán)素抗性）的標(biāo)記。酵母宿主細(xì) 胞的適合的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在絲狀真菌宿主 細(xì)胞中使用的可選擇標(biāo)記包括但不局限于amdS (乙酰胺酶）、argB (鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移 酶）、bar (草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶）、hph (潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶）、niaD (硝酸還原酶）、pyrG (乳 清苷-5' -磷酸脫羧酶）、sC(硫酸腺嘌呤基轉(zhuǎn)移酶）、以及trpC(鄰氨基苯甲酸合酶）、連 同其等效物。優(yōu)選在曲霉屬細(xì)胞中使用的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水 鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus) bar 基因。
[0228] 載體優(yōu)選含有允許載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因 組自主復(fù)制的一個(gè)或多個(gè)元件。
[0229] 對(duì)于整合到該宿主細(xì)胞基因組中，該載體可以依靠編碼該多肽的多核苷酸序列或 者通過(guò)同源或非同源重組整合到該基因組中的該載體的任何其他元件?？商娲?，該載體 可以包含用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組而整合到宿主細(xì)胞基因組中的一個(gè)或多個(gè)染色體中的一 個(gè)或多個(gè)精確位置處的另外的多核苷酸。為了增加在精確位置處整合的可能性，這些整合 的元件應(yīng)包含足夠數(shù)量的核酸，例如100至10, 〇〇〇個(gè)堿基對(duì)、400至10, 000個(gè)堿基對(duì)、以 及800至10, 000個(gè)堿基對(duì)，這些堿基對(duì)與對(duì)應(yīng)的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源 重組的可能性。這些整合元件可以是與宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)的靶序列同源的任何序列。此 夕卜，這些整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。另一方面，該載體可以通過(guò)非同 源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。
[0230] 對(duì)于自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含使該載體能夠在所討論的宿主細(xì)胞中自主復(fù) 制的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可以是在細(xì)胞中起作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù)語(yǔ) "復(fù)制起點(diǎn)"或"質(zhì)粒復(fù)制子"意指使質(zhì)粒或載體能夠在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。
[0231] 細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177、 以及PACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，以及允許在芽孢桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pUB110、pE194、pTA1060、以 及ρΑΜβ 1的復(fù)制起點(diǎn)。
[0232] 用于在酵母宿主細(xì)胞中使用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)、ARS1、ARS4、 ARS1與CEN3的組合、以及ARS4與CEN6的組合。
[0233] 適用于絲狀真菌細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是ΑΜΑ1和ANS1(格姆斯（Gems)等 人，1991，基因（Gene)98:61_67;卡倫（Cullen)等人，1987，核酸研究（Nucleic Acids Res. ) 15:9163-9175 ;W0 00/24883)。AMA1基因的分離和包括該基因的質(zhì)粒或載體的構(gòu)建 可根據(jù)W0 00/24883披露的方法完成。
[0234] 可以將本發(fā)明的多核苷酸的多于一個(gè)的拷貝插入到宿主細(xì)胞中以增加多肽的產(chǎn) 生。通過(guò)將序列的至少一個(gè)另外的拷貝整合到宿主細(xì)胞基因組中或者通過(guò)包含一個(gè)與該多 核苷酸的可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因可以獲得增加的多核苷酸拷貝數(shù)目，其中通過(guò)在適當(dāng)選 擇性試劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞可以選擇包含選擇性標(biāo)記基因的經(jīng)擴(kuò)增的拷貝的細(xì)胞、以及由 此該多核苷酸的另外的拷貝。
[0235] 用于連接以上所描述的元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的程序是本領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員熟知的（參見(jiàn)，例如，薩姆布魯克等人，1989,同上文）。
[0236] 宿主細(xì)胞
[0237] 本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，這些重組宿主細(xì)胞包括本發(fā)明的多核苷酸，該多核 苷酸可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)控制序列，該一個(gè)或多個(gè)控制序列指導(dǎo)本發(fā)明的多肽的產(chǎn) 生。將包含多核苷酸的構(gòu)建體或載體引入到宿主細(xì)胞中，這樣使得該構(gòu)建體或載體被維持 作為染色體整合體或作為自主復(fù)制的染色體外載體，如早前所描述。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"涵蓋 由于復(fù)制期間發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。宿主細(xì)胞的選擇在很大 程度上取決于編碼該多肽的基因及其來(lái)源。
[0238] 該宿主細(xì)胞可以是有用于重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的任何細(xì)胞，例如原核細(xì)胞或真 核細(xì)胞。
[0239] 原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括但 不局限于芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、土芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢 桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬以及鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不局限于彎曲桿菌 屬、大腸桿菌、黃桿菌屬、梭桿菌屬、螺旋桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、假單孢菌屬、沙門(mén) 氏菌屬、以及脲原體屬。
[0240] 細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌細(xì)胞，包括但不限于：嗜堿芽孢桿菌、解淀粉 芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦 爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿 菌、枯草芽孢桿菌、以及蘇云金芽孢桿菌的細(xì)胞。
[0241] 細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞，包括但不限于：似馬鏈球菌、釀膿鏈球 菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種的細(xì)胞。
[0242] 細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞，包括但不限于：不產(chǎn)色鏈霉菌、阿維鏈 霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、灰色鏈霉菌以及變鉛青鏈霉菌細(xì)胞。
[0243] 通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（參見(jiàn)例如，常（Chang)和科恩（Cohen)，1979,分子和普通 遺傳學(xué)（Mol.Gen.Genet.)168:lll-115)，使用感受態(tài)細(xì)胞（參見(jiàn)，例如，楊格（Young) 和斯皮宰曾（Spizizen)，1961，細(xì)菌學(xué)雜志（J.Bacteriol. )81:823-829 ;或者杜博楠 (Dubnau)和大衛(wèi)多夫-阿貝爾森（Davidoff-Abelson)，1971，分子生物學(xué)雜志（J.Mol. Biol. )56:209-221)、電穿孔（參見(jiàn)，例如，茂川（Shigekawa)和道爾（Dower)，1988,生物技 術(shù)（Biotechniques)6:742-751)、或者接合（參見(jiàn)，例如凱勒（Koehler)和索恩（Thorne), 1987,細(xì)菌學(xué)雜志（J.BacterioU 169:5271-5278)可以實(shí)現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬 細(xì)胞中。可以通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（參見(jiàn)，例如，哈那汗（Hanahan)，1983,分子生物學(xué)雜志 166:557-580)或者電穿孔（參見(jiàn)，例如，道爾（Dower)等人，1988,核酸研究16:6127-6145) 實(shí)現(xiàn)DNA到大腸桿菌細(xì)胞中的引入?？梢酝ㄟ^(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔（參見(jiàn)，例如貢（Gong) 等人，2004，F(xiàn)olia Microbiol. (Praha) 49:399-405)、接合（參見(jiàn)，例如馬卓德（Mazodier) 等人，1989,細(xì)菌學(xué)雜志171:3583-3585)或轉(zhuǎn)導(dǎo)（參見(jiàn)，例如伯克（Burke)等人，2001，美國(guó) 國(guó)家科學(xué)院院刊98:6289-6294)實(shí)現(xiàn)向鏈霉菌屬細(xì)胞中引入DNA?？梢酝ㄟ^(guò)如下方式實(shí)現(xiàn) 將DNA引入到假單胞菌屬細(xì)胞中：電穿孔（參見(jiàn)，例如，蔡（Choi)等人，2006,微生物學(xué)方法 雜志（J.Microbiol.Methods)64:391_397)、或接合（參見(jiàn)，例如，皮內(nèi)多（Pinedo)和斯梅 茨（Smets)，2005,應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)（Appl. Environ. Microbiol.) 71:51-57)。可以通過(guò) 如下方式實(shí)現(xiàn)將DNA引入鏈球菌屬細(xì)胞中：天然感受態(tài)（參見(jiàn)，例如，佩里（Perry)和藏滿 (Kuramitsu)，1981，傳染與免疫（Infect. Immun. )32:1295-1297)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（參見(jiàn)，例 如，卡特（Catt)和約里克（Jollick)，1991，微生物（Microbios)68:189-207)、電穿孔（參 見(jiàn)，例如，布克萊（Buckley)等人，1999,應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)65:3800-3804)、或接合（參 見(jiàn)，例如，克萊懷爾（Clewell)，1981，微生物學(xué)綜述（Microbiol. Rev. )45:409-436)。然而， 可以使用本領(lǐng)域已知的用于將DNA引入宿主細(xì)胞中的任何方法。
[0244] 宿主細(xì)胞還可以是真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物、或真菌細(xì)胞。
[0245] 宿主細(xì)胞可以是真菌細(xì)胞。如在此所用的"真菌"包括子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、壺 菌門(mén)和接合菌門(mén)（如霍克斯沃思（Hawksworth)等人在安-倍氏菌物辭典（Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi),第 8 版，1995，國(guó)際 CAB,大學(xué)出版社，劍橋 (Cambridge),英國(guó)中所定義的）以及卵菌門(mén)（Oomycota)(如在霍克斯沃思（Hawksworth) 等人，1995,見(jiàn)上文，第171頁(yè)中所引用的）和所有有絲分裂孢子真菌（霍克斯沃思 (Hawksworth)等人，I" 5,見(jiàn)上文）。
[0246] 該真菌宿主細(xì)胞可以是酵母細(xì)胞。如在此使用，"酵母"包括產(chǎn)子囊酵母（內(nèi)孢霉 目）、產(chǎn)擔(dān)子酵母以及屬于半知菌類（芽生菌）的酵母。由于酵母的分類在將來(lái)可能改變， 為了本發(fā)明的目的，酵母應(yīng)如在酵母生物學(xué)與活性（Biology and Activities of Yeast) (斯金納（Skinner)，F(xiàn). A.，帕斯莫爾（Passmore)，S. M.和達(dá)文波特（Davenport)，R. R.編 著，應(yīng)用細(xì)菌學(xué)研討會(huì)系列第 9 期（Soc.App.Bacteriol. Symposium Series No. 9),1980) 中所述進(jìn)行定義。
[0247] 酵母宿主細(xì)胞可以是假絲酵母屬、漢遜酵母屬（Hansenula)、克魯維酵母屬、畢 赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、或耶氏酵母屬細(xì)胞，如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis)、卡爾斯伯酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克魯維酵母、諾地酵母、卵形 酵母、或解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica)細(xì)胞。
[0248] 真菌宿主細(xì)胞可以是絲狀真菌細(xì)胞。"絲狀真菌"包括真菌門(mén)（Eumycota)和卵菌 門(mén)的亞門(mén)（如由霍克斯沃思等人，1995,見(jiàn)上文所定義）的所有絲狀形式。絲狀真菌通常 的特征在于由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、以及其他復(fù)雜多糖構(gòu)成的菌絲體 壁。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)菌絲延長(zhǎng)，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母（如釀酒酵母）的 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)單細(xì)胞菌體的出芽（budding)，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。
[0249] 絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管菌屬、擬蠟菌屬、金 孢子菌屬、鬼傘菌屬、革蓋菌屬、隱球菌屬、線黑粉酵母屬（Filibasidium)、鐮刀菌屬、腐質(zhì) 霉屬、稻瘟菌屬、毛霉菌屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌 屬、白腐菌屬、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼菌屬、彎頸 霉屬、檢囷屬、或木霉屬的細(xì)胞。
[0250] 例如，絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢 曲霉、黑曲霉、米曲霉、煙管菌、干擬錯(cuò)菌、卡內(nèi)基擬錯(cuò)菌（Ceriporiopsiscaregiea)、 淺黃擬錯(cuò)孔菌、潘諾希塔擬錯(cuò)菌（Ceriporiopsispannocinta)、環(huán)帶擬錯(cuò) 菌（Ceriporiopsisrivulosa)、微紅擬錯(cuò)菌（Ceriporiopsissubrufa)、蟲(chóng)擬錯(cuò) 菌、狹邊金孢子菌（Chrysosporiuminops)、嗜角質(zhì)金孢子菌、拉克悼金孢子菌 (Chrysosporiumlucknowense)、奠狀金抱子菌（Chrysosporiummerdarium)、租金抱子菌、 女王杜香金孢子菌（Chrysosporiumqueenslandicum)、熱帶金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰蓋 鬼傘、毛云芝菌、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫(kù)威鐮孢、黃色鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、禾赤鐮孢、異 孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮刀菌、多枝鐮孢、粉紅鐮孢菌、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢 鐮刀菌、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮刀菌、鑲片鐮孢菌、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛 霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢原毛平革菌、射紋革菌、杏鮑菇、土生梭孢殼、 長(zhǎng)絨毛栓菌、變色栓菌（Trametes versicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉、 或綠色木霉的細(xì)胞。
[0251] 可以將真菌細(xì)胞通過(guò)涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、以及細(xì)胞壁再生的方 法以本身已知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的適合程序在EP 238023 和約爾頓（Yelton)等人，1984,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊81:1470-1474、以及克里斯滕森 (Christensen)等人，1988,生物 / 技術(shù)（Bio/Technology)6:1419_1422 中描述。用于轉(zhuǎn)化 鐮刀菌屬物種的適合方法由馬拉迪爾（Malardier)等人，1989,基因（Gene) 78:147-156、以 及W0 96/00787描述?？梢允褂糜扇缫韵挛墨I(xiàn)描述的程序轉(zhuǎn)化酵母：貝克爾（Becker)和瓜 倫特（Guarente)，在阿貝爾森（Abelson)，J.N.和西蒙（Simon), Μ· I.編，酵母遺傳學(xué)與分 子生物學(xué)指南，酶學(xué)方法（Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology)，第 194 卷，第 182-187 頁(yè)，學(xué)術(shù)出版社有限公司（Academic Press, Inc.)，紐 約；伊藤（11^〇)等人，1983，細(xì)菌學(xué)雜志（上1^(^61'；[01.) 153:163;以及哈尼恩（}1;[1111611)等 人，1978,美國(guó)科學(xué)院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 75:1920。
[0252] 產(chǎn)生方法
[0253] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，該方法包括：(a)培養(yǎng)細(xì)胞，該細(xì)胞處于其 野生型形式，在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下產(chǎn)生該多肽；以及（b)回收該多肽。在一個(gè)優(yōu) 選方面，該細(xì)胞是齒毛菌屬（針對(duì)SEQ ID N0:2)、木霉屬（針對(duì)SEQ ID N0:4)或毛殼菌屬 (針對(duì)SEQ ID N0:6)細(xì)胞。在一個(gè)更優(yōu)選方面，該細(xì)胞是一色齒毛菌（針對(duì)SEQ ID N0:2)、 里氏木霉（針對(duì)SEQ ID NO:4)或球毛殼菌（針對(duì)SEQ ID NO:6)。
[0254] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，該方法包括：(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的 條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞；以及（b)回收該多肽。
[0255] 使用本領(lǐng)域熟知的方法，在適合產(chǎn)生該多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。例如， 可以通過(guò)在適合的培養(yǎng)基中和在允許表達(dá)和/或分離該多肽的條件下，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，以 及在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵（包括連續(xù)，分批，分批補(bǔ)料，或固態(tài) 發(fā)酵）來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。該培養(yǎng)是使用本領(lǐng)域中已知的程序，在一種適合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)生，該 培養(yǎng)基包含碳和氮來(lái)源及無(wú)機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開(kāi)的組 成（例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中）制備。如果多肽分泌到該營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中， 那么可直接從培養(yǎng)基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可從細(xì)胞裂解液中進(jìn)行回 收。
[0256] 可以使用特異性針對(duì)該多肽的本領(lǐng)域已知的方法來(lái)檢測(cè)該多肽。這些檢測(cè)方法可 包括使用特異抗體、形成酶產(chǎn)物、或酶底物的消失。例如，可以使用酶測(cè)定來(lái)確定該多肽的 活性。
[0257] 可以使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)回收多肽。例如，可以通過(guò)常規(guī)程序，包括，但不局 限于離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)、或沉淀，從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收該多肽。
[0258] 可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法純化該多肽，該方法包括但不限于色譜法（例 如，離子交換色譜法、親和色譜法、疏水色譜法、聚焦色譜法和大小排阻色譜法）、電泳方法 (例如，制備性等電聚焦）、差別溶解度（例如，硫酸銨沉淀）、SDS-PAGE或提?。▍⒁?jiàn)，例如， 蛋白純化（Protein Purification)，編者 J. -C.詹森（Janson)和拉爾斯賴登（Lars Ryden)， VCH出版公司，紐約，1989)，以便獲得基本上純的多肽。
[0259] 在一個(gè)替代方面，沒(méi)有回收該多肽，而是將表達(dá)該多肽的本發(fā)明的宿主細(xì)胞用作 該多肽的來(lái)源。
[0260] 植物
[0261] 本發(fā)明還涉及分離的植物，例如轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，這些植物包括 本發(fā)明的多肽，從而表達(dá)并且產(chǎn)生可回收的量的多肽或結(jié)構(gòu)域。多肽或結(jié)構(gòu)域可從植物或 植物部分回收。作為替代方案，包括該多肽或結(jié)構(gòu)域的植物或植物部分可以按原樣用于改 善食品或飼料的質(zhì)量，例如改善營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、可口性及流變學(xué)特性，或破壞抗?fàn)I養(yǎng)因素。
[0262] 轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的（雙子葉植物）或單子葉的（單子葉植物）。單子葉 植物的實(shí)例是草例如草地早熟禾（藍(lán)草，早熟禾屬），飼草例如羊茅屬（Festuca)、黑麥草 屬（Lolium)，溫帶草例如剪股穎屬（Agrostis)和谷物例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、水稻、高 粱、和玉蜀黍（玉米）。
[0263] 雙子葉植物的實(shí)例是煙草、豆類（如羽扇豆（lupins)、馬鈴薯、糖甜菜（sugar beet)、豌豆、豆（bean)和大豆（soybean))、以及十字花科植物（十字花科（family Brassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及緊密相關(guān)的模型生物擬南芥）。
[0264] 植物部分的實(shí)例是莖、愈傷組織、葉、根、果實(shí)、種子、以及塊莖、以及包括這些部分 的獨(dú)立組織，例如，表皮、葉肉、薄壁組織（parenchyme)、維管組織、分生組織。特定植物細(xì)胞 區(qū)室，如葉綠體、質(zhì)外體（apoplast)、線粒體、液泡、過(guò)氧化物酶體以及細(xì)胞質(zhì)也被認(rèn)為是植 物部分。此外，任何植物細(xì)胞，無(wú)論是何種組織來(lái)源，都被認(rèn)為是植物部分。同樣地，植物部 分，如分離以有助于本發(fā)明的利用的特定組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如胚、胚乳、 糊粉和種皮。
[0265] 同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的是這類植物、植物部分以及植物細(xì)胞的子代。
[0266] 可以根據(jù)本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建表達(dá)該多肽或結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。簡(jiǎn) 而言之，通過(guò)將編碼該多肽或結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)構(gòu)建體結(jié)合到植物宿主基因組或葉 綠體基因組中并且將所得改性植物或植物細(xì)胞繁殖成轉(zhuǎn)基因的植物或植物細(xì)胞來(lái)構(gòu)建植 物或植物細(xì)胞。
[0267] 表達(dá)構(gòu)建體方便地是核酸構(gòu)建體，它包括編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的多核苷酸，該多核 苷酸可操作地與選擇的植物或植物部分中表達(dá)該多核苷酸所需的適當(dāng)調(diào)節(jié)序列連接。而 且，表達(dá)構(gòu)建體可包含用于鑒別整合了此表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記，和將此構(gòu) 建體引入所討論的植物所必需的DNA序列（后者取決于所用的引入DNA的方法）。
[0268] 例如基于希望在何時(shí)、何處、和怎樣表達(dá)該多肽或結(jié)構(gòu)域來(lái)確定調(diào)節(jié)序列，例如啟 動(dòng)子和終止子序列以及任選的信號(hào)序列或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的選擇。例如編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的基 因的表達(dá)可以是組成型的或誘導(dǎo)型的，或者可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn) 物可以被祀向至特定組織或植物部分，例如種子或葉。調(diào)節(jié)序列由例如塔格（Tague)等人， 1988,植物生理學(xué)（Plant Physiology)86:506 描述。
[0269] 對(duì)于組成型表達(dá)，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1、或稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子 (弗蘭克（Franck)等人，1980,細(xì)胞（Cell)21:285-294 ;克里斯滕森等人，1992,植物 分子生物學(xué)（Plant Mol. Biol.) 18:675-689;張（Zhang)等人，1991，植物細(xì)胞（Plant Cell)3:1155-1165)。器官特異性啟動(dòng)子可以是以下各項(xiàng)的啟動(dòng)子，例如來(lái)自貯藏庫(kù)組織 (例如種子、馬鈴薯塊莖、和果實(shí)）（Edwards (愛(ài)德華茲）和Coruzzi (科魯茲），1990, Ann. Rev. Genet.(遺傳學(xué)年鑒）24:275-303)，或來(lái)自代謝庫(kù)組織（例如分生組織）（Ito (伊 藤）等人，1994, Plant Mol. Biol.(植物分子生物學(xué)）24:863-878),種子特異性啟動(dòng)子， 例如來(lái)自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白啟動(dòng)子（Wu(吳）等人，1998, Plant Cell Physiol.(植物與細(xì)胞生理學(xué)）39:885-889),來(lái)自豆球蛋白Μ的蠶豆啟動(dòng)子和來(lái) 自蠶豆的未知種子蛋白基因（Conrad(康拉德）等人，1998, J. Plant Physiol.(植物生理 學(xué)雜志）152:708-711)，來(lái)自種子油體蛋白的啟動(dòng)子（Chen(陳）等人，1998, Plant Cell Physiol.(植物與細(xì)胞生理學(xué)）39:935-941)，來(lái)自歐洲油菜的C藏蛋白napA啟動(dòng)子，或本 領(lǐng)域已知的任何其他種子特異性啟動(dòng)子，例如，如在W0 91/14772中所述的。此外，啟動(dòng) 子可以是葉特異性啟動(dòng)子，例如來(lái)自水稻或番爺?shù)膔bcs啟動(dòng)子（Kyozuka(京冢）等人， 1993, Plant Physiol.(植物生理學(xué)）），102:991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基 因啟動(dòng)子（Mitra (密特拉）和Higgins (希金斯），1994, Plant Mol. Biol.(植物分子生物 學(xué)）26:85-93)，來(lái)自水稻的aldP基因啟動(dòng)子（Kagaya(加賀）等人，1995，Mol. Gen. Genet. (分子和普通遺傳學(xué)）248:668-674)，或傷口可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，例如馬鈴薯pin2啟動(dòng)子 (Xu(徐）等人，1993, Plant Mol. Biol.(植物分子生物學(xué)）22:573-588)。同樣，啟動(dòng)子可 通過(guò)非生物處理，例如溫度、干旱、或鹽度變化來(lái)誘導(dǎo)，或通過(guò)外源施加激活啟動(dòng)子的物質(zhì) (例如乙醇，雌激素，植物激素例如乙烯、脫落酸、和赤霉酸，以及重金屬）來(lái)誘導(dǎo)。
[0270] 還可使用啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件，從而在植物中達(dá)到多肽或結(jié)構(gòu)域的更高表達(dá)。例如， 啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件可以是位于啟動(dòng)子和編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列之間的內(nèi)含子。 例如Xu(徐）等人，1993,同上披露了使用水稻肌動(dòng)蛋白1基因的第一內(nèi)含子來(lái)增強(qiáng)表達(dá)。
[0271] 該選擇性標(biāo)記基因及該表達(dá)構(gòu)建體的任何其他部分可以選自本領(lǐng)域中可用的那 些。
[0272] 可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的常規(guī)技術(shù)將核酸構(gòu)建體結(jié)合到植物基因組中，這些常規(guī) 技術(shù)包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微注射、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化、以及電 穿孔（Gasser (加塞爾）等人，1990，Science (科學(xué)）244:1293 ;Potrykus (波特里庫(kù)斯）， 1990，Bio/Technology (生物 / 技術(shù)）8:535 ;Shimamoto (島本）等人，1989，Nature (自 然）338:274)。
[0273] 目前，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的所選方法（關(guān) 于綜述，請(qǐng)參見(jiàn)霍伊卡（Hooykas)和施爾伯魯特（Schilperoort)，1992,植物分子生物學(xué) 19:15-38)，并且還可被用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，雖然對(duì)于這些植物常常使用其他的轉(zhuǎn)化方 法。目前，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的所選方法是粒子（用轉(zhuǎn)化DNA涂覆的微觀的金或 鶴粒子）轟擊胚愈傷組織或發(fā)育中的胚（克里斯托（Christou)，1992,植物雜志（Plant J.) 2:275-281 ;島本，1994,生物技術(shù)當(dāng)前述評(píng)（Curr. Opin. Biotechnol.) 5:158-162 ;瓦西 爾（Vasil)等人，1992,生物 / 技術(shù) 10:667-674)。如 Omirulleh(奧米如列）等人，1993， Plant Molecular Biology(植物分子生物學(xué)）21:415-428中所述，單子葉植物轉(zhuǎn)化的替代 方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。根據(jù)本披露使用的另外的轉(zhuǎn)化方法包括美國(guó)專利號(hào)6, 395, 966 和7, 151，204中所述的那些（這二者都通過(guò)引用以其全文結(jié)合在此）。
[0274] 在轉(zhuǎn)化后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選出已并入了表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體，并使其再 生成為完整植物。通常設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化程序用于通過(guò)如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性 消除選擇基因：例如，使用帶有兩個(gè)獨(dú)立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或利用特異性重組酶位 點(diǎn)特異性地切除選擇基因。
[0275] 除用本發(fā)明的構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化特定植物基因型外，還可以通過(guò)使具有該構(gòu)建體的 植物與缺乏該構(gòu)建體的第二植物進(jìn)行雜交來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。例如，可以通過(guò)雜交將編碼 多肽或結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體引入特定植物品種中，無(wú)需總是直接地轉(zhuǎn)化該給定品種的植物。因 此，本發(fā)明不僅涵蓋了從根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞直接再生的植物，而且還涵蓋了這類 植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根據(jù)本發(fā)明制備的親本植物的任何代的后代。此 類后代可以包含根據(jù)本發(fā)明制備的DNA構(gòu)建體。雜交導(dǎo)致通過(guò)供體植物系與起始系交叉授 粉，將轉(zhuǎn)基因引入植物系。此類步驟的非限制性實(shí)例描述于美國(guó)專利號(hào)7, 151，204中。
[0276] 植物可以通過(guò)回交轉(zhuǎn)化方法生成。例如，植物包含被稱為回交轉(zhuǎn)化的基因型、種 系、近交體、或雜交體的植物。
[0277] 可以使用遺傳標(biāo)記以協(xié)助本發(fā)明的一種或多種轉(zhuǎn)基因從一個(gè)遺傳背景滲入到另 一個(gè)。標(biāo)記協(xié)助的選擇提供了相對(duì)于常規(guī)育種的優(yōu)勢(shì)，在于其可以用于避免由表型變異導(dǎo) 致的錯(cuò)誤。另外，遺傳標(biāo)記可以在具體雜交的個(gè)別后代中提供有關(guān)良種種質(zhì)相對(duì)程度的數(shù) 據(jù)。例如，當(dāng)具有所希望性狀并且另外具有非農(nóng)藝學(xué)所希望的遺傳背景的植物與良種親本 雜交時(shí)，可以使用遺傳標(biāo)記來(lái)選擇不僅具有感興趣的性狀，還具有相對(duì)較大比例所希望種 質(zhì)的后代。以此方式，使一種或多種性狀滲入特定遺傳背景所需的世代數(shù)得以最小化。
[0278] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽或結(jié)構(gòu)域的方法，該方法包括：(a)在有益于產(chǎn)生 多肽或結(jié)構(gòu)域的條件下，培養(yǎng)包括編碼該多肽或結(jié)構(gòu)域的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì) 胞，以及（b)回收該多肽或結(jié)構(gòu)域。
[0279] 葡萄糖醛酸酯酶活性的除去或降低
[0280] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生親本細(xì)胞的突變體的方法，該方法包括破壞或缺失編碼本發(fā)明 的多肽的多核苷酸或其部分，這導(dǎo)致突變體細(xì)胞比在相同條件下培養(yǎng)的親本細(xì)胞產(chǎn)生的多 肽少。
[0281] 可以使用本領(lǐng)域熟知的方法通過(guò)降低或消除該多核苷酸的表達(dá)來(lái)構(gòu)建突變體細(xì) 胞，例如插入、破壞、替換、或缺失。在一個(gè)優(yōu)選方面，將該多核苷酸失活。例如，待修飾或失 活的多核苷酸可以是活性必需的編碼區(qū)或其部分，或編碼區(qū)的表達(dá)所需的調(diào)節(jié)元件。這種 調(diào)節(jié)或控制序列的實(shí)例可以是啟動(dòng)子序列或其功能部分，即足以影響該多核苷酸的表達(dá)的 部分?？尚揎椀钠渌刂菩蛄邪ǖ痪窒抻谇皩?dǎo)子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號(hào)肽 序列、轉(zhuǎn)錄終止子、和轉(zhuǎn)錄激活因子。
[0282] 該多核苷酸的修飾或失活可以通過(guò)使親本細(xì)胞經(jīng)受誘變，并且選擇該多核苷酸的 表達(dá)被降低或消除的突變體細(xì)胞來(lái)進(jìn)行。所述誘變可以是特異的或隨機(jī)的，例如通過(guò)使用 適宜的物理或化學(xué)誘變劑、通過(guò)使用適宜的寡核苷酸、或通過(guò)對(duì)DNA序列PCR產(chǎn)生誘變來(lái)進(jìn) 行。此外，誘變可通過(guò)使用這些誘變劑的任意組合來(lái)進(jìn)行。
[0283] 適用于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線（UV)照射、羥胺、N-甲 基-Ν'-硝基-N-亞硝基胍（MNNG)、0-鄰甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲磺酸酯（EMS)、亞硫酸氫 鈉、甲酸和核苷酸類似物。
[0284] 當(dāng)使用這些試劑時(shí)，誘變一般是在適宜條件下在所選的誘變處理試劑的存在下通 過(guò)孵育有待誘變的親本細(xì)胞并篩選和/或選擇展示基因表達(dá)降低或不表達(dá)的突變體細(xì)胞 來(lái)進(jìn)行的。
[0285] 該多核苷酸的修飾或失活可以通過(guò)在基因中或在其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)節(jié)元件 中插入、取代、或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸來(lái)完成。例如，可插入或除去核苷酸從而形成終止 密碼子的引入、起始密碼子的除去、或開(kāi)放讀碼框的改變。這些修飾或失活可根據(jù)本領(lǐng)域已 知的方法通過(guò)定點(diǎn)誘變或PCR產(chǎn)生的誘變來(lái)完成。盡管原則上，修飾可以在體內(nèi)進(jìn)行，即直 接在表達(dá)待修飾的多核苷酸的細(xì)胞上進(jìn)行，但是優(yōu)選的是如下所示例地在體外進(jìn)行修飾。
[0286] 便利的消除或降低多核苷酸的表達(dá)的方法的實(shí)例是基于基因替換、基因缺失、或 基因破壞技術(shù)的。例如，在基因破壞方法中，將對(duì)應(yīng)于內(nèi)源多核苷酸的核酸序列在體外進(jìn)行 誘變以產(chǎn)生缺陷的核酸序列，然后將其轉(zhuǎn)化到親本細(xì)胞中以產(chǎn)生缺陷基因。通過(guò)同源重組， 該缺陷的核酸序列替換內(nèi)源多核苷酸。令人希望的是，缺陷的多核苷酸還編碼可用于選擇 其中該多核苷酸已經(jīng)被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記。在一個(gè)方面，用例如在此描述的那些 選擇性標(biāo)記來(lái)破壞該多核苷酸。
[0287] 本發(fā)明還涉及抑制具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽在細(xì)胞中的表達(dá)的方法，這些 方法包括向該細(xì)胞給予或在其中表達(dá)一種雙鏈RNA (dsRNA)分子，其中該dsRNA包括本發(fā)明 的多核苷酸的一個(gè)子序列。在一個(gè)優(yōu)選方面，該dsRNA長(zhǎng)約15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、 20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)或更多個(gè)雙核苷酸。
[0288] 該dsRNA優(yōu)選是一個(gè)小干擾RNA (siRNA)或微小RNA (miRNA)。在一個(gè)優(yōu)選方面，該 dsRNA是用于抑制轉(zhuǎn)錄的小干擾RNA。在另一個(gè)優(yōu)選方面，該dsRNA是用于抑制翻譯的微小 RNA。
[0289] 本發(fā)明還涉及此類雙鏈RNA (dsRNA)分子，包括用于抑制該多肽在細(xì)胞中的表達(dá) 的SEQ ID NO: 1的成熟多肽編碼序列的部分。雖然本發(fā)明不局限于任何具體的作用機(jī)制，但 是該dsRNA可以進(jìn)入一個(gè)細(xì)胞并且導(dǎo)致相似的或相同的序列的單鏈RNA (ssRNA)(包括內(nèi)源 mRNA)的降解。當(dāng)細(xì)胞被暴露于dsRNA時(shí)，來(lái)自同源基因的mRNA選擇性地被一種叫做RNA 干擾（RNAi)的過(guò)程所降解。
[0290] 本發(fā)明的dsRNA可以用于基因沉默。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的 dsRNAi來(lái)選擇性地降解RNA的方法?？梢栽隗w外、離體或體內(nèi)進(jìn)行該過(guò)程。在一個(gè)方面， 可以使用這些dsRNA分子來(lái)在細(xì)胞、器官或動(dòng)物中產(chǎn)生功能缺失突變。用于制備并使用 dsRNA分子選擇性降解RNA的方法在本領(lǐng)域中是熟知的；參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)6, 489, 127 ; 6, 506, 559 ;6, 511，824 ;以及 6, 515, 109。
[0291] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及在編碼該多肽的多核苷酸或其控制序列或編碼該多肽的沉默 基因中包括破壞或缺失的親本細(xì)胞的突變體細(xì)胞，這導(dǎo)致與親本細(xì)胞相比，該突變體細(xì)胞 產(chǎn)生的多肽少或不產(chǎn)生多肽。
[0292] 這些多肽缺陷的突變體細(xì)胞作為用于原生和異源多肽的表達(dá)的宿主細(xì)胞尤其有 用。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生原生或異源多肽的方法，包括：(a)在有益于產(chǎn)生該多肽 的條件下培養(yǎng)該突變體細(xì)胞；并且（b)回收該多肽。術(shù)語(yǔ)"異源多肽"是指對(duì)該宿主細(xì)胞來(lái) 說(shuō)不是原生的多肽，例如天然蛋白質(zhì)的變體。該宿主細(xì)胞可以包括多于一個(gè)拷貝的編碼該 原生或異源多肽的多核苷酸。
[0293] 可使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行培養(yǎng)和目的產(chǎn)物的純化。
[0294] 本發(fā)明用于生產(chǎn)基本上不含葡萄糖醛酸酯酶的產(chǎn)物的方法在真核多肽的生產(chǎn)中 是特別感興趣的，尤其是真菌蛋白質(zhì)，例如酶。葡萄糖醛酸酯酶缺陷的細(xì)胞還可用于表達(dá)藥 學(xué)感興趣的異源蛋白，例如激素、生長(zhǎng)因子、受體等。術(shù)語(yǔ)"真核多肽"不僅包括原生多肽， 還包括經(jīng)過(guò)氨基酸替代、缺失或添加的修飾或用以增強(qiáng)活性、熱穩(wěn)定性、pH耐受性等的其他 此類修飾的多肽，例如酶。
[0295] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的基本上不含葡萄糖醛酸酯酶 活性的蛋白產(chǎn)物。
[0296] 處理纖維素材料的方法
[0297] 本發(fā)明還涉及用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，該方法包括：在本發(fā)明的具有 葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的存在下，用一種酶組合物處理該纖維素材料。在一個(gè)優(yōu)選方 面，該方法進(jìn)一步包括對(duì)降解的或轉(zhuǎn)化的纖維素材料進(jìn)行回收。
[0298] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生一種發(fā)酵產(chǎn)物的方法，這些方法包括：(a)在本發(fā)明的具有葡 萄糖醛酸酯酶活性的多肽的存在下，用一種酶組合物使纖維素材料糖化；(b)用一種或多 種（若干種）發(fā)酵微生物發(fā)酵糖化的纖維素材料，以產(chǎn)生該發(fā)酵產(chǎn)物；并且（c)從發(fā)酵中回 收該發(fā)酵產(chǎn)物。
[0299] 本發(fā)明還涉及對(duì)纖維素材料進(jìn)行發(fā)酵的方法，該方法包括用一種或多種（若干 種）發(fā)酵微生物對(duì)纖維素材料進(jìn)行發(fā)酵，其中纖維素材料是在本發(fā)明的具有葡萄糖醛酸酯 酶活性的多肽的存在下用酶組合物糖化的。在一個(gè)優(yōu)選方面，發(fā)酵該纖維素材料產(chǎn)生一種 發(fā)酵產(chǎn)物。在另一個(gè)優(yōu)選方面，該方法進(jìn)一步包括從發(fā)酵中回收發(fā)酵產(chǎn)物。
[0300] 本發(fā)明的方法可被用于將一種纖維素材料糖化成可發(fā)酵糖，并且將這些可發(fā)酵糖 轉(zhuǎn)化成許多有用的物質(zhì)，例如燃料、飲用乙醇、和/或發(fā)酵產(chǎn)物（例如酸類、醇類、酮類、氣體 等）。由該纖維素材料產(chǎn)生所希望的發(fā)酵產(chǎn)物典型地涉及預(yù)處理、酶水解（糖化）、以及發(fā) 酵。
[0301] 根據(jù)本發(fā)明，可以使用本領(lǐng)域常規(guī)的過(guò)程來(lái)完成纖維素材料的加工。此外，可以使 用被配置為根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行操作的常規(guī)生物質(zhì)加工裝置來(lái)實(shí)施本發(fā)明的方法。
[0302] 分開(kāi)或同時(shí)的水解（糖化）和發(fā)酵包括但不限于：分開(kāi)水解和發(fā)酵（SHF)、同時(shí) 糖化和發(fā)酵（SSF)、同時(shí)糖化和共發(fā)酵（SSCF)、雜合的水解和發(fā)酵（HHF)、分開(kāi)水解和共 發(fā)酵（SHCF)、雜合的水解和共發(fā)酵（HHCF)，以及直接微生物轉(zhuǎn)化（DMC)。SHF使用分開(kāi) 的處理步驟以首先將纖維素材料酶促水解為可發(fā)酵糖，例如，葡萄糖、纖維二糖、纖維三 糖、以及戊糖，并且然后將這些可發(fā)酵糖發(fā)酵成乙醇。在SSF中，纖維素材料的酶水解和 糖發(fā)酵成乙醇被組合在一個(gè)步驟中（菲利皮迪斯· G. P. (Philippidis, G. P.)，1996,纖維 素生物轉(zhuǎn)化技術(shù)（Cellulose bioconversion technology),生物乙醇手冊(cè)：生產(chǎn)和利用 (Handbook on Bioethanol:Production and Utilization),懷曼 *C. E (Wyman, C. Ε·)編輯， 泰勒-弗朗西斯出版集團(tuán)（Taylor&Francis)，華盛頓特區(qū)（Washington, DC)，179-212))。 SSCF涉及多種糖的共發(fā)酵（希恩· J. (Sheehan, J.)和希默爾· Μ· (Himmel，Μ· )，1999,酶、 能量與環(huán)境：美國(guó)能源部研究和開(kāi)發(fā)生物乙醇活性的戰(zhàn)略性觀點(diǎn)（Enzymes, energy and the environment:A strategic perspective on the U. S. Department of Energy' s research and development activities for bioethanol),生物技術(shù)進(jìn)展（Biotechnol. Prog.) 15:817-827)。HHF涉及一個(gè)分開(kāi)的水解步驟，并且另外涉及一個(gè)同時(shí)糖化和水解步 驟，這些步驟可以在同一反應(yīng)器中進(jìn)行。HHF過(guò)程中的步驟可以在不同的溫度下進(jìn)行，即高 溫酶糖化，接著在發(fā)酵菌株能夠耐受的更低溫度下進(jìn)行SSF。DMC將全部三個(gè)過(guò)程（酶產(chǎn) 生、水解以及發(fā)酵）組合在一個(gè)或多個(gè)（若干個(gè)）步驟中，其中相同生物被用來(lái)產(chǎn)生用于將 纖維素材料轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的酶并且將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成最終產(chǎn)物（林德· L. R. (Lynd，L. 1〇、韋默*?.<1.0^1!^1'，？.<1.)，范澤爾*1!1.(似112 71，1!〇、以及普利特瑞斯*1· S. (Pretorius，I. S.)，2002,微生物纖維素利用：基礎(chǔ)與生物技術(shù)（Microbial cellulose utilization:Fundamentals and biotechnology)，微生物分子生物學(xué)綜述（Microbiol. Mol. Biol. Reviews) 66:506-577)。在此應(yīng)理解的是，本領(lǐng)域中已知的包括預(yù)處理、酶水解 (糖化）、發(fā)酵、或其組合的任何方法，可以用于實(shí)施本發(fā)明的方法。
[0303] 常規(guī)設(shè)備可以包括分批補(bǔ)料攪拌反應(yīng)器、分批攪拌反應(yīng)器、具有超濾的連續(xù)流攪 拌反應(yīng)器、和/或連續(xù)活塞流柱式反應(yīng)器（費(fèi)爾南達(dá).德.卡斯蒂柳斯.柯瑞芝（Fernanda de Castilhos Corazza)、弗拉維奧.法里亞.德.莫賴斯（FlcSvio Faria de Moraes)、 吉塞拉.瑪麗亞.扎寧（Gisella Maria Zanin)以及伊沃.雷特澤爾（Ivo Neitzel)， 2003,用于纖維二糖水解的分批補(bǔ)料反應(yīng)器的優(yōu)化控制（Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis)，科技學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）（Acta Scientiarum. Technology) 25:33-38 ;古薩科夫·Α·ν· (Gusakov，A.V.)和辛捏特西·Α·Ρ· (Sinitsyn，Α· Ρ.)，1985,纖維素的酶水解動(dòng)力學(xué)：1.分批反應(yīng)器加工的數(shù)學(xué)模型（Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose:1. A mathematical model for a batch reactor process)，酶與微生物技術(shù)（Enz. Microb. Technol. )7:346-352);摩擦反應(yīng)器（隆 *S. K. (Ryu，S. K.)和李· J. M. (Lee，J. Μ.)，1983,通過(guò)使用摩擦生物反應(yīng)器進(jìn)行的廢棄纖維素 的生物轉(zhuǎn)化（Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor), 生物技術(shù)與生物工程（Biotechnol.Bioeng. )25:53-65);或具有由電磁場(chǎng)引起的強(qiáng)烈攪拌 的反應(yīng)器（古薩科夫· A. V.、辛涅特西· A. P.、謝爾蓋· I. Y. (Davydkin，I. Y.)、謝爾蓋· V. Y.、普羅塔斯·〇. V. (PiOtas，0. V.)，1996,使用具有由電磁場(chǎng)引起的強(qiáng)烈攪拌的新型反應(yīng)器 增強(qiáng)酶纖維素水角軍（Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field)，應(yīng) 用生物化學(xué)與生物技術(shù)（Appl.Biochem.Biotechnol. )56:141-153)。另外的反應(yīng)器類型包 括：用于水解和/或發(fā)酵的流化床反應(yīng)器、升流層（upflow blanket)反應(yīng)器、固定化反應(yīng) 器、以及擠出機(jī)型反應(yīng)器。
[0304] 預(yù)處理。在本發(fā)明的方法的實(shí)踐中，可以使用本領(lǐng)域R知的仟何預(yù)處理方法來(lái)破 壞植物細(xì)胞壁的纖維素材料組分（錢(qián)德拉（Chandra)等人，2007,底物預(yù)處理：木質(zhì)纖維 素的有效酶水解的關(guān)鍵？（Substrate pretreatment:The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics ?)，生物化學(xué)工程 / 生物技術(shù)的進(jìn)展（Adv.Biochem. Engin./Biotechnol.) 108:67-93;蓋博（Galbe)和小林（Zacchi)，2007,用于高效生物乙 醇生產(chǎn)的木質(zhì)纖維素材料的預(yù)處理（Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production)，生物化學(xué)工程/生物技術(shù)的進(jìn)展108:41-65 ;亨德 里克斯（Hendriks)和季曼（Zeeman)，2009,用以增強(qiáng)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的消化性的預(yù)處 理(Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass)， 生物資源技術(shù)（Bioresource Technol.)100:10_18;莫熱（Mosier)等人，2005,用于木 質(zhì)纖維素生物質(zhì)的預(yù)處理的有前景技術(shù)的特征（Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass)，生物資源技術(shù) 96:673-686;塔希爾扎 德（Taherzadeh)和卡里米（Karimi)，2008,預(yù)處理木質(zhì)纖維素廢棄物以改善乙醇和生物 氣體產(chǎn)生：綜述（Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production:A review)，分子科學(xué)國(guó)際雜志（Int.J. of Mol. Sci. )9:1621-1651 ;楊 (Yang)和懷曼,2008,預(yù)處理：釋放低成本纖維素乙醇的關(guān)鍵（Pretreatment:the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol)，生物燃料、生物產(chǎn)品與生物精煉（Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.) 2:26-40) 〇
[0305] 纖維素材料也可以在預(yù)處理之前使用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行顆粒尺寸減縮、預(yù) 浸泡、潤(rùn)濕、洗滌、或調(diào)理。
[0306] 常規(guī)預(yù)處理包括但不局限于蒸汽預(yù)處理（用或不用爆發(fā)）、稀酸預(yù)處理、熱水預(yù)處 理、堿預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、濕爆發(fā)、氨纖維爆發(fā)、有機(jī)溶劑預(yù)處理、和生物預(yù)處理。 另外的預(yù)處理包括氨滲濾、超聲、電穿孔、微波、超臨界co 2、超臨界4〇、臭氧、以及Y輻射預(yù) 處理。
[0307] 可以在水解和/或發(fā)酵之前對(duì)纖維素材料進(jìn)行預(yù)處理。優(yōu)選在水解前進(jìn)行預(yù)處 理。可替代地，可以同時(shí)用酶水解進(jìn)行預(yù)處理，以釋放可發(fā)酵糖，例如葡萄糖、木糖、和/或 纖維二糖。在多數(shù)情況下，預(yù)處理步驟自身導(dǎo)致將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖（即使在沒(méi)有酶 的情況下）。
[0308] 蒸汽預(yù)處理。在蒸汽預(yù)處理中，加熱纖維素材料以破壞植物細(xì)胞壁組分，包括木質(zhì) 素、半纖維素、和纖維素以使纖維素和其他級(jí)分，例如半纖維素可接近酶。纖維素材料經(jīng)過(guò) 或穿過(guò)反應(yīng)容器，將蒸汽注入該反應(yīng)容器以增加溫度至所需溫度和壓力，并且將蒸汽保持 在其中持續(xù)希望的反應(yīng)時(shí)間。蒸汽預(yù)處理優(yōu)選在140°C -230°C，更優(yōu)選160°C -200°C，并且 最優(yōu)選170°C -190°C下執(zhí)行，其中最佳溫度范圍取決于化學(xué)催化劑的任意添加。蒸汽預(yù)處 理的停留時(shí)間優(yōu)選是1-15分鐘，更優(yōu)選3-12分鐘，并且最優(yōu)選4-10分鐘，其中最佳停留時(shí) 間取決于溫度范圍和化學(xué)催化劑的任意添加。蒸汽預(yù)處理允許相對(duì)較高的固體加載量，這 樣使得纖維素材料在預(yù)處理過(guò)程中通常僅變得潮濕。蒸汽預(yù)處理經(jīng)常與預(yù)處理后的材料的 爆發(fā)放料（explosive discharge)合并，這被稱為蒸汽爆發(fā)，即，快速急驟蒸發(fā)至大氣壓和 材料的湍流，以通過(guò)破碎增加可接觸的表面積（Duff (迪福）和Murray (默里），1996,生物 資源技術(shù)855:1-33 ;蓋爾貝和賽琪，2002, Appl. Microbiol. Biotechnol.(應(yīng)用微生物學(xué)與 生物技術(shù)）59:618-628 ;美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0020164730)。在蒸汽預(yù)處理過(guò)程中，半纖維素乙 ?；涣呀?，并且所得到的酸自催化半纖維素部分水解成單糖和寡糖。僅在有限的程度上 去除木質(zhì)素。
[0309] 經(jīng)常在蒸汽預(yù)處理之前添加催化劑，如H2S04或S0 2 (典型地0. 3 %至3 % w/w)， 這降低時(shí)間和溫度、增加回收率、并且改善酶水解（巴列斯特羅斯（Ballesteros)等人， 2006,應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)129-132:496-508 ;瓦爾加（Varga)等人，2004,應(yīng)用生物化 學(xué)與生物技術(shù)113-116:509-523 ;薩斯那（Sassner)等人，2006,酶與微生物技術(shù)（Enzyme Microb. Technol. )39:756-762)〇
[0310] 化學(xué)預(yù)處理：術(shù)語(yǔ)"化學(xué)處理"是指能促進(jìn)纖維素、半纖維素、和/或木質(zhì)素的分離 和/或釋放的任何化學(xué)預(yù)處理。適合的化學(xué)預(yù)處理方法的實(shí)例包括：（例如）稀酸預(yù)處理、 石灰預(yù)處理、濕氧化、氨纖維/冷凍爆發(fā)（AFEX)、氨滲濾（APR)、以及有機(jī)溶劑預(yù)處理。
[0311] 在稀酸預(yù)處理中，纖維素材料與稀酸（典型地是H2S04)和水混合，以形成漿液，由 蒸汽加熱至希望的溫度，并且在停留時(shí)間后急驟蒸發(fā)至大氣壓?？梢杂迷S多反應(yīng)器設(shè)計(jì)來(lái) 進(jìn)行稀酸預(yù)處理，例如，活可采用多種反應(yīng)器設(shè)計(jì)來(lái)進(jìn)行稀酸預(yù)處理，例如活塞流反應(yīng)器、 逆流反應(yīng)器或連續(xù)逆流收縮床反應(yīng)器（達(dá)夫（Duff)和默里（Murray)，1996,同上；謝爾 (Schell)等人，2004,生物資源技術(shù)（Bioresource Technol. )91:179-188 ;李（Lee)等人， 1999,生物化學(xué)工程 / 生物技術(shù)進(jìn)展（Adv. Biochem. Engin. /Biotechnol. )65:93-115)。
[0312] 還可以使用在堿性條件下的幾種預(yù)處理方法。這些堿性預(yù)處理包括但不限于：石 灰預(yù)處理、濕氧化、氨滲濾（APR)、以及氨纖維/冷凍爆發(fā)（AFEX)。
[0313] 用碳酸鈣、氫氧化鈉、或氨，在85 °C _150°C的低溫下進(jìn)行石灰預(yù)處理，并且 停留時(shí)間為從1小時(shí)到幾天（懷曼（Wyman)等人，2005,生物資源技術(shù)（Bioresource Technol. )96:1959-1966 ;莫熱（Mosier)等人，2005，生物資源技術(shù)（Bioresource Technol.)96:673-686)〇 W0 2006/11089U W0 2006/11899, W0 2006/11900,以及 TO 2006/110901披露了使用氨的預(yù)處理方法。
[0314] 濕氧化是一種熱預(yù)處理，其典型地在添加氧化劑（如過(guò)氧化氧或過(guò)壓 氧）的情況下在180°C至200°C下持續(xù)5-15分鐘進(jìn)行（施密特（Schmidt)和湯姆 森（Thomsen)，1998,生物資源技術(shù)64:139-151 ;帕羅內(nèi)（Palonen)等人，2004,應(yīng)用生 物化學(xué)與生物技術(shù)117:1-17 ;瓦爾加等人，2004,生物技術(shù)與生物工程（Biotechnol. Bioeng. )88:567-574 ;馬?。∕artin)等人，2006,化學(xué)技術(shù)與生物技術(shù)雜志（J.Chem. Technol. Biotechnol.) 81:1669-1677)。預(yù)處理優(yōu)選以1 %至40 %干物質(zhì)，更優(yōu)選2 %至 30%干物質(zhì)，并且最優(yōu)選5%至20%干物質(zhì)進(jìn)行，并且經(jīng)常通過(guò)添加堿如碳酸鈉來(lái)增加初 始pH。
[0315] 濕氧化預(yù)處理方法的修改，稱為濕爆發(fā)（濕氧化與蒸汽爆發(fā)組合）可以處理高 達(dá)30%的干物質(zhì)。在濕爆發(fā)中，在某一停留時(shí)間后，在預(yù)處理期間引入氧化劑（oxidizing agent)。然后通過(guò)急驟蒸發(fā)至大氣壓結(jié)束預(yù)處理（W0 2006/032282)。
[0316] 氨纖維爆發(fā)（AFEX)涉及在如90°C _100°C的中等溫度和如17至20bar的高壓下， 用液體或氣態(tài)氨處理纖維素材料5至10分鐘，其中干物質(zhì)含量可以高達(dá)60% (格拉帕里 (Gollapalli)等人，2002,應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)98:23-35;俊達(dá)瓦特（Chundawat)等 人，2007,生物技術(shù)與生物工程（Biotechnol. Bioeng. )96:219-231 ;阿里扎德（Alizadeh) 等人，2005,應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)121:1133-1141 ;泰莫里（Teymouri)等人，2005,生物 資源技術(shù)96:2014-2018)。AFEX預(yù)處理導(dǎo)致纖維素的解聚和半纖維素的部分水解。木質(zhì) 素-碳水化合物復(fù)合物被裂解。
[0317] 有機(jī)溶劑預(yù)處理通過(guò)使用含水乙醇（40% -60%乙醇）在160°C _200°C下萃 取30-60分鐘而將纖維素材料脫木質(zhì)素（潘（Pan)等人，2005,生物技術(shù)與生物工程 90:473-481 ;潘等人，2006,生物技術(shù)與生物工程94:851-861 ;庫(kù)拉比（Kurabi)等人，2005， 應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)121:219-230)。通常加入硫酸作為催化劑。在有機(jī)溶劑預(yù)處理 中，大部分半纖維素被去除。
[0318] 適合的預(yù)處理方法的其他實(shí)例由舍爾等人，2003,應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)，第 105-108卷，第69-85頁(yè)、和莫熱等人，2005,生物資源技術(shù)96:673-686、以及美國(guó)公開(kāi)申請(qǐng) 2002/0164730 描述。
[0319] 在一個(gè)方面，化學(xué)預(yù)處理優(yōu)選是以酸處理進(jìn)行，并且更優(yōu)選持續(xù)稀酸和/或弱酸 處理。酸通常是硫酸，但也可以使用其他酸，如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯 化氫、或其混合物。弱酸處理優(yōu)選在1-5,更優(yōu)選1-4,并且最優(yōu)選1-3的pH范圍內(nèi)進(jìn)行。在 一個(gè)方面，該酸濃度在優(yōu)選從〇. 01至20wt%酸，更優(yōu)選0. 05至10wt%酸，甚至更優(yōu)選0. 1 至5wt%酸，并且最優(yōu)選0. 2至2. Owt %酸的范圍中。使酸與纖維素材料相接觸，并在優(yōu)選 160°C _220°C，并且更優(yōu)選165°C _195°C范圍內(nèi)的溫度下保持從幾秒到幾分鐘，例如1秒至 60分鐘范圍內(nèi)的時(shí)期。
[0320] 在另一個(gè)方面，預(yù)處理是以氨纖維爆破步驟（AFEX預(yù)處理步驟）進(jìn)行。
[0321] 在另一方面，預(yù)處理在水性漿料中進(jìn)行。在優(yōu)選的方面，在預(yù)處理過(guò)程中纖維素材 料以優(yōu)選10_80wt %之間，更優(yōu)選20-70wt %之間，并且最優(yōu)選30-60wt %之間，例如50wt % 左右的量存在。預(yù)處理的纖維素材料可以不洗滌或使用本領(lǐng)域已知的任何方法洗滌，例如， 用水洗滌。
[0322] 機(jī)械預(yù)處理術(shù)語(yǔ)"機(jī)械預(yù)處理"是指各種類型的研磨或碾磨（例如，干磨、濕磨、或 振動(dòng)球磨）。
[0323] 物理預(yù)處理：術(shù)語(yǔ)"物理預(yù)處理"是指促進(jìn)纖維素、半纖維素、和/或木質(zhì)素從纖維 素材料中分離和/或釋放的任何預(yù)處理。例如，物理預(yù)處理可包括輻射（例如微波輻射）、 汽蒸/蒸汽爆發(fā)、水熱解及其組合。
[0324] 物理預(yù)處理可以包括高壓和/或高溫（蒸汽爆發(fā)）。在一個(gè)方面，高壓意指在優(yōu)選 約300至約600psi，更優(yōu)選約350至約550psi，并且最優(yōu)選約400至約500psi，例如450psi 左右的范圍中的壓力。在另一個(gè)方面，高溫意指在約100至約300°C，優(yōu)選約140至約235°C 范圍中的溫度。在一個(gè)優(yōu)選方面，在分批過(guò)程中，以蒸汽槍水解器系統(tǒng)（例如從順智公司 (Sunds Defibrator AB)，瑞典（Sweden)可獲得的 Sunds 水解器（Sunds Hydrolyzer))來(lái)進(jìn) 行機(jī)械預(yù)處理，該系統(tǒng)使用如上所定義的高壓和高溫。
[0325] 組合的物理和化學(xué)預(yù)處理纖維素材料可以物理地且化學(xué)地預(yù)處理。例如，該預(yù)處 理步驟可包括稀酸或弱酸預(yù)處理以及高溫和/或高壓處理。這些物理預(yù)處理和化學(xué)預(yù)處理 可以根據(jù)需要順序地進(jìn)行或同時(shí)進(jìn)行。也可以包括機(jī)械預(yù)處理。
[0326] 因此，在一個(gè)優(yōu)選方面，使纖維素材料經(jīng)受機(jī)械、化學(xué)或物理預(yù)處理、或其任何組 合，以促進(jìn)纖維素、半纖維素、和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。
[0327] 生物預(yù)處理：術(shù)語(yǔ)"生物預(yù)處理"是指促進(jìn)纖維素、半纖維素、和/或木質(zhì)素從纖 維素材料中分離和/或釋放的任何生物預(yù)處理。生物預(yù)處理技術(shù)可以涉及應(yīng)用溶解木質(zhì) 素的微生物（參見(jiàn)，例如，舒· T. -A. (Hsu, Τ· -A. )，1996,生物質(zhì)的預(yù)處理（Pretreatment of biomass),生物乙醇手冊(cè)：生產(chǎn)和利用，懷曼*C.E.編輯，泰勒-弗朗西斯出版集團(tuán)， 華盛頓特區(qū)，179-212;高希（Ghosh)和辛格（Singh)，1993,用于纖維素生物質(zhì)的酶/微 生物轉(zhuǎn)化的物理化學(xué)與生物處理（Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass),應(yīng)用微生物學(xué)進(jìn)展（Adv. Appl. Microbiol. )39:295-333 ;麥克米蘭· J.D. (McMillan, J.D·)，1994,預(yù)處理木質(zhì)纖 維素生物質(zhì)：綜述（Pretreating lignocellulosic biomass:a review)，用于燃料生產(chǎn) 的生物質(zhì)的酶轉(zhuǎn)化（Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production)，希默 爾· Μ. E.、貝克· J. 0.、以及奧弗倫· R. P. (Overend，R. P.)編輯，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)討論會(huì)系列 566 (ACS Symposium Series 566)，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)（American Chemical Society)，華盛頓 特區(qū)，第 15 章；貢· C. S. (Gong, C. S.)、卡奧· N. J. (Cao, N. J.)、杜· J. (Du, J.)、以及曹· G. T. (Tsao，G.T. )，1999，由可再生資源生產(chǎn)乙醇（Ethanol production from renewable resources)，生物化學(xué)工程/生物技術(shù)的進(jìn)展，舍佩爾· T.編輯，施普林格出版社德國(guó)海 德堡柏林（Berlin Heidelberg, Germany) ,65:207-241);奧爾森（Olsson)和哈恩-哈格 達(dá)爾（Hahn-Hagerdal)，1996,用于乙醇生產(chǎn)的木質(zhì)纖維素水解物的發(fā)酵（Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production),酶與微生物技術(shù)（Enz. Microb. Tech.) 18:312-331 ;以及瓦藍(lán)德（Vallander)和埃里克松（Eriksson)，1990，由 木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)乙醇：技術(shù)現(xiàn)狀（Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art),生物化學(xué)工程/生物技術(shù)的進(jìn)展42:63-95)。
[0328] 趣化。在水解步驟（還稱為糖化）中，將（例如預(yù)處理的）纖維素材料水解，以將 纖維素以及可替代地還有半纖維素分解成可發(fā)酵糖，如葡萄糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿 拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶性寡糖。水解由酶組合物在本發(fā)明的具有葡萄糖醛酸 酯酶活性的一種多肽的存在下酶促進(jìn)行。該組合物可進(jìn)一步包括一種或多種（若干種）半 纖維素分解酶或木聚糖降解酶。還可順序地添加這些組合物的酶。
[0329] 酶水解優(yōu)選在易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的條件下、在合適的含水環(huán)境中執(zhí)行。 在一個(gè)優(yōu)選方面，水解在適合于一種或多種酶的活性，即對(duì)于該一種或多種酶來(lái)說(shuō)最佳的 條件下進(jìn)行。水解可以作為分批補(bǔ)料過(guò)程或連續(xù)過(guò)程進(jìn)行，其中將預(yù)處理的纖維素材料 (底物）逐漸補(bǔ)料至例如含酶的水解溶液中。
[0330] 糖化通常在受控的pH、溫度以及混合條件下在攪拌釜反應(yīng)器或發(fā)酵罐中進(jìn)行。適 合的處理時(shí)間、溫度以及pH條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如，糖化可以持續(xù) 長(zhǎng)達(dá)200小時(shí)，但是典型地進(jìn)行優(yōu)選約12至約96小時(shí)，更優(yōu)選約16至約72小時(shí)，并且最優(yōu) 選約24至約48小時(shí)。溫度在優(yōu)選約25°C至約70°C，更優(yōu)選約30°C至約65°C，并且更優(yōu)選 約40°C至約60°C，具體地約50°C的范圍中。pH在優(yōu)選約3至約8,更優(yōu)選約3. 5至約7,并 且最優(yōu)選約4至約6、具體地約pH 5的范圍中。干燥固體含量在優(yōu)選約5wt %至約50wt %， 更優(yōu)選約l〇wt%至約40wt%，并且最優(yōu)選約20wt%至約30wt%的范圍中。
[0331] 該酶組合物優(yōu)選地包括多種具有纖維素分解活性和/或木聚糖降解活性的酶。在 一個(gè)方面，該酶組合物包括一種或多種（若干種）纖維素分解酶。在另一個(gè)方面，該酶組合 物包括一種或多種（若干種）木聚糖降解酶。在另一個(gè)方面，該酶組合物包括一種或多種 (若干種）纖維素分解酶和一種或多種（若干種）木聚糖降解酶。
[0332] 該一種或多種（若干種）纖維素分解酶優(yōu)選是選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：內(nèi) 切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、以及葡糖苷酶。該一種或多種（若干種）木聚糖降解酶 優(yōu)選是選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋 喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。
[0333] 在另一個(gè)方面，該酶組合物進(jìn)一步或甚至進(jìn)一步包括一種具有纖維素分解增強(qiáng) 活性的多肽（參見(jiàn)，例如 W0 2005/074647、W0 2005/074656、以及 W0 2007/089290)。在 另一個(gè)方面，該酶組合物可進(jìn)一步或甚至進(jìn)一步包括一種或多種（若干種）另外的酶活 性以改善含纖維素材料的降解。優(yōu)選的另外的酶是半纖維素酶（例如α-D-葡糖醛酸糖 苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、內(nèi)切-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、a-半乳糖苷酶、內(nèi) 切-a -L-阿拉伯聚糖酶、β -半乳糖苷酶）、碳水化合物-酯酶（例如乙?；?木聚糖酯 酶、乙酰基-甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、葡萄糖醛酸酯酶）、果膠酶、蛋白酶、 木質(zhì)素分解酶（例如漆酶、錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、H202生產(chǎn)酶、氧化還原酶）、擴(kuò) 張蛋白、膨脹素、或其混合物。在本發(fā)明的方法中，可以在發(fā)酵之前或過(guò)程中，例如在糖化過(guò) 程中，或在發(fā)酵微生物的繁殖過(guò)程中或之后添加這一種或多種另外的酶。
[0334] 該酶組合物的一種或多種（若干種）組分可以是野生型蛋白、重組蛋白、或野生型 蛋白與重組蛋白的組合。例如，一種或多種（若干種）組分可以是用作宿主細(xì)胞以重組表達(dá) 該酶組合物的一種或多種（若干種）其他組分的細(xì)胞的原生蛋白質(zhì)。該酶組合物的一種或 多種（若干種）組分可以作為單組分產(chǎn)生，然后將這些單組分組合以形成該酶組合物。酶 組合物可以是多組分和單組分蛋白制劑的組合。
[0335] 用于本發(fā)明的方法中的酶可以處于適合用于此處所述的過(guò)程中的任何形式，例如 像去除或未去除細(xì)胞的粗發(fā)酵液、具有或不具有細(xì)胞碎片的細(xì)胞裂解液、半純化的或純化 的酶制劑、或作為酶來(lái)源的宿主細(xì)胞。酶組合物可以是干粉或顆粒、非塵顆粒、液體、穩(wěn)定化 的液體、或穩(wěn)定化的受保護(hù)的酶?？梢愿鶕?jù)已建立的方法例如通過(guò)添加如糖、糖醇或其它多 元醇等穩(wěn)定劑和/或乳酸，對(duì)液體酶制劑進(jìn)行穩(wěn)定化。
[0336] 酶和具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的最佳量取決于若干因素，包括但不限于： 多種纖維素分解酶組分的混合物，纖維素底物，纖維素底物的濃度，纖維素底物的一種或多 種預(yù)處理、溫度、時(shí)間、PH，以及發(fā)酵生物（例如，用于同時(shí)糖化和發(fā)酵的酵母）的納入。
[0337] 在一個(gè)優(yōu)選方面，一種或多種纖維素分解酶對(duì)纖維素材料的有效量是每g纖維素 材料約0. 5至約50mg、優(yōu)選約0. 5至約40mg、更優(yōu)選約0. 5至約25mg、更優(yōu)選約0. 75至約 20mg、更優(yōu)選約0· 75至約15mg、甚至更優(yōu)選約0· 5至約10mg、并且最優(yōu)選約2. 5至約10mg。
[0338] 在另一個(gè)優(yōu)選方面，具有α -葡糖醛酸糖苷酶活性的一種或多種多肽對(duì)纖維素材 料的有效量是每g纖維素材料約〇· 01至約50. Omg、優(yōu)選約0· 01至約40mg、更優(yōu)選約0· 01 至約30mg、更優(yōu)選約0. 01至約20mg、更優(yōu)選約0. 01至約10mg、更優(yōu)選約0. 01至約5mg、更 優(yōu)選約〇. 025至約1. 5mg、更優(yōu)選約0. 05至約1. 25mg、更優(yōu)選約0. 075至約1. 25mg、更優(yōu)選 約0. 1至約1. 25mg、甚至更優(yōu)選約0. 15至約1. 25mg、并且最優(yōu)選約0. 25至約1. Omg。
[0339] 在另一個(gè)優(yōu)選方面，具有葡萄糖醛酸酯酶活性的一種或多種多肽對(duì)一種或多種纖 維素分解酶的有效量是每g -種或多種纖維素分解酶約〇. 005至約1. 0g、優(yōu)選約0. 01至 約1. 〇g、更優(yōu)選約〇. 15至約0. 75g、更優(yōu)選約0. 15至約0. 5g、更優(yōu)選約0. 1至約0. 5g、甚 至更優(yōu)選約〇. 1至約〇. 5g、并且最優(yōu)選約0. 05至約0. 2g。
[0340] 這些酶可以源自于或得自于任何合適的來(lái)源，包括細(xì)菌、真菌、酵母、植物、或哺乳 動(dòng)來(lái)源。術(shù)語(yǔ)"獲得的"此處意指該酶可以是已從天然產(chǎn)生該酶作為原生酶的生物分離的。 術(shù)語(yǔ)"獲得的"在此還意指該酶可能已在宿主生物中采用在此所描的方法重組產(chǎn)生，其中重 組產(chǎn)生的酶對(duì)于宿主生物是原生的或外源的，或具有修飾的氨基酸序列，例如，具有一個(gè)或 多個(gè)（若干個(gè)）缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重組產(chǎn)生的酶為原生氨基酸序列的突變 體和/或片段，或通過(guò)本領(lǐng)域已知的核酸改組方法產(chǎn)生的酶。原生酶的含義中涵蓋天然變 體，而外源酶的含義中涵蓋重組（如通過(guò)定點(diǎn)誘變或改組）獲得的變體。
[0341] 具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，該多肽 可以是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多肽，如具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的芽孢桿菌屬、 鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳酸桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、土芽孢桿菌 屬、或海洋芽孢桿菌屬多肽；或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如具有纖維素分解酶活性或木聚糖降 解活性的大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門(mén)氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺旋桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌 屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、或脲原體屬多肽。
[0342] 在一個(gè)優(yōu)選方面，該多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的嗜堿芽孢 桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng) 芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜 熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、或蘇云金芽孢桿菌多肽。
[0343] 在另一個(gè)優(yōu)選方面，該多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的似馬鏈 球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種多肽。
[0344] 在另一個(gè)優(yōu)選方面，該多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的不產(chǎn)色 鏈霉菌、阿維鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、灰色鏈霉菌、或變鉛青鏈霉菌多肽。
[0345] 具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽還可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選 地是一種具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的酵母多肽，如假絲酵母屬（Candida)、 克魯維酵母屬（Kluyveromyces)、畢赤酵母屬（Pichia)、酵母菌屬（Saccharomyces)、 裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母屬（Yarrowia)多肽；或更優(yōu)選地 是一種具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的絲狀真菌多肽，如枝頂孢霉屬 (Acremonium)、傘菌屬（Agaricus)、鏈格抱屬（Alternaria)、曲霉屬（Aspergillus)、短 梗霉屬（Aureobasidium)、葡萄座腔菌屬（Botryospaeria)、擬錯(cuò)菌屬（Ceriporiopsis)、 毛 _ 殼屬（Chaetomidium)、金孢子菌屬（Chrysosporium)、麥角菌屬（Claviceps)、旋 孢腔菌屬（Cochliobolus)、鬼傘屬（Coprinopsis)、乳白蟻屬（Coptotermes)、棒囊殼 屬（Corynascus)、隱叢赤殼菌屬（Cryphonectria)、隱球菌屬（Cryptococcus)、色二抱 屬（Diplodia)、黑耳屬（Exidia)、線黑粉酵母屬（Filibasidium)、鐮刀菌屬（Fusarium)、 赤霉屬（Gibberella)、全鞭毛蟲(chóng)屬（Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬（Humicola)、 耙齒菌屬（Irpex)、蘑燕屬（Lentinula)、小腔球菌屬（Leptospaeria)、梨孢菌屬 (Magnaporthe)、黑果菌屬（Melanocarpus)、多孔菌屬（Meripilus)、毛霉屬（Mucor)、毀 絲霉屬（Myceliophthora)、新美鞭菌屬（Neocallimastix)、脈抱菌屬（Neurospora)、擬 青霉屬（Paecilomyces)、青霉菌屬（Penicillium)、平革菌屬（Phanerochaete)、瘤胃 壺菌屬（Piromyces)、某真菌屬（Poitrasia)、假黑盤(pán)菌屬（Pseudoplectania)、假披發(fā) 蟲(chóng)屬（Pseudotrichonympha)、根毛霉菌屬（Rhizomucor)、裂裙菌屬（Schizophyllum)、 柱頂孢屬（Scytalidium)、踝節(jié)菌屬（Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus)、梭 孢殼霉屬（Thielavia)、彎頸霉屬（Tolypocladium)、木霉屬（Trichoderma)、長(zhǎng)毛盤(pán)菌 屬（1'1'；[011(^1^63)、輪枝孢屬（￥61'1：；[0；[11；[11111)、小包腳燕屬（￥01￥31^6113)或炭角菌屬 (Xylaria)多肽。
[0346] 在一個(gè)優(yōu)選方面，該多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的卡爾斯伯 酵母、釀酒酵母、糖化酵母、格拉斯酵母、克魯維酵母、諾地酵母、或卵形酵母多肽。
[0347] 在另一個(gè)優(yōu)選方面，該多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的解纖維 枝頂孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜 角質(zhì)金抱子菌、Chrysosporium lucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporium merdarium、 狹邊金抱子菌（Chrysosporium inops)、租金抱子菌、Chrysosporium queenslandicum、 帶紋金孢子菌（Chrysosporium zonatum)、桿孢狀鐮孢、谷類鐮抱、庫(kù)威鐮孢、大刀鐮孢、 禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚 色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、灰腐質(zhì)霉、特異腐質(zhì)霉、 疏棉狀腐質(zhì)霉、白耙齒菌、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙鏈孢菌、繩狀青霉菌、產(chǎn)紫青霉菌、 黃抱平革菌、無(wú)色梭抱殼霉（Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、白毛梭抱 殼霉（Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢殼霉、Thielavia fimeti、小孢梭孢殼霉、卵孢梭 孢殼霉、秘魯梭孢殼霉（Thielavia peruviana)、瘤孢梭孢殼霉、毛梭孢殼霉、耐熱梭孢殼 (Thielavia subthermophila)、土生梭孢殼霉、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉、 綠色木霉、或褐孢長(zhǎng)毛盤(pán)菌（Trichophaea saccata)多肽。
[0348] 還可以使用具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽的化學(xué)修飾或蛋白 質(zhì)工程化的突變體。
[0349] 酶組合物的一種或多種（若干種）組分可以是重組組分，S卩，通過(guò)克隆編碼該單一 組分的DNA序列并且隨后用該DNA序列轉(zhuǎn)化細(xì)胞并且在宿主中表達(dá)產(chǎn)生（參見(jiàn)，例如，TO 91/17243和W0 91/17244)。優(yōu)選宿主是異源宿主（酶對(duì)于宿主而言是異源的），但是在某 些條件下，宿主還可以是同源宿主（酶對(duì)于宿主而言是原生的）。還可以通過(guò)純化來(lái)自發(fā)酵 液的這樣一種蛋白來(lái)制備單組分纖維素分解蛋白。
[0350] 適用于在本發(fā)明中使用的商業(yè)化纖維素分解蛋白制劑的實(shí)例包括例如 CELLIC?CTec (諾維信 A/S)、CELLUCLAST?(諾維信 A/S)、N0V0ZYM?188 (諾維信 A/S)、 CELLUZYME?(諾維信 A/S)、CEREFL0?(諾維信 A/S)、以及 ULTRAFL0?(諾維信 A/S)、 ACCELERASE? (杰能科公司（Genencor Int.))、LAMINEX? (杰能科公司）、SPEZYME?CP (杰 能科公司）、R〇HAMENT?7069W (羅姆公司（R6hm (;mhl 丨））、FIBREZYME? LDI (并矢 國(guó)際公司（Dyadic International, Inc·))、FIBREZYME? I.I5R(并矢國(guó)際公司）、或 VISCOSTAR? 150L(并矢國(guó)際公司）。按從固體的約0. 001至約5. Owt%，更優(yōu)選從固 體的約0. 025至約4. Owt %，最優(yōu)選從固體的約0. 005至約2. Owt %的有效量添加這些纖維 素酶。按固體的從約〇. 001至約5. Owt%，更優(yōu)選固體的從約0. 025至約4. Owt%，最優(yōu)選 固體的從約0. 005至約2. Owt%的有效量添加這些纖維素酶。
[0351] 可以在本發(fā)明的方法中使用的細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括但不限于：解纖維熱 酸菌（Acidothermus cellulolyticus)內(nèi)切葡聚糖酶（TO 91/05039 ;W0 93/15186 ;美國(guó)專 利號(hào) 5, 275, 944 ;W0 96/02551 ;美國(guó)專利號(hào) 5, 536, 655 ;W0 00/70031 ;W0 05/093050);褐 色高溫雙歧菌（Thermobifida fusca)內(nèi)切葡聚糖酶III (W0 05/093050);以及褐色高溫雙 歧菌內(nèi)切葡聚糖酶V(W0 05/093050)。
[0352] 可以用于本發(fā)明的方法的真菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括但不限于：里氏木霉內(nèi)切 葡聚糖酶 1(彭蒂萊（Penttila)等人，1986,基因 45:253-263 ;GENBANK? 登錄號(hào) M15665); 里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶Π (薩洛黑莫（Saloheimo)等人，1988,基因63:11-22;GENBANK? 登錄號(hào)M19373);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(奧卡達(dá)（Okada)等人，1988,應(yīng)用與環(huán)境微 生物學(xué)（Appl. Environ. Microbiol.)64:555-563, GENBANK? 登錄號(hào) AB003694);以及里 氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V (薩洛黑莫等人，1994,分子微生物學(xué)（Molecular Microbiology) 13:219-228, GENBANK?登錄號(hào)Z33381);棘孢曲霉內(nèi)切葡聚糖酶（黃（0oi)等人，1990,核 酸研究18:5884);川地曲霉（spergillus kawachii)內(nèi)切葡聚糖酶（坂元（Sakamoto)等 人，1995,當(dāng)代遺傳學(xué)（Current Genetics)27:435_439);胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovara)內(nèi)切葡聚糖酶（薩里拉赫蒂（Saarilahti)等人，1990,基因90:9-14);尖鐮 孢內(nèi)切葡聚糖酶（GENBANK?登錄號(hào)L29381);灰腐質(zhì)霉高溫變種內(nèi)切葡聚糖酶（GENBANK? 登錄號(hào)AB003107);熱白絲菌（Melanocarpus albomyces)內(nèi)切葡聚糖酶（GENBANK?登錄號(hào) MAL515703);粗糙鏈孢菌內(nèi)切葡聚糖酶（GENBANK?登錄號(hào)XM_324477);特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡 聚糖酶V ;嗜熱毀絲霉CBS 117. 65內(nèi)切葡聚糖酶；擔(dān)子菌綱（basidiomycete)CBS495. 95內(nèi) 切葡聚糖酶；擔(dān)子菌綱CBS 494. 95內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢殼霉NRRL 8126CEL6B內(nèi)切葡 聚糖酶；土生梭孢殼霉NRRL 8126CEL6C內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢殼霉NRRL 8126CEL7C內(nèi) 切葡聚糖酶；土生梭孢殼霉NRRL 8126CEL7E內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢殼霉NRRL 8126CEL7F 內(nèi)切葡聚糖酶；Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373CEL7A內(nèi)切葡聚糖酶；以及里氏 木霉菌株號(hào)VTT-D-80133內(nèi)切葡聚糖酶（GENBANK?登錄號(hào)M15665)。
[0353] 用于本發(fā)明的方法中的纖維二糖水解酶的實(shí)例包括但不限于：里氏木霉纖維二糖 水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、特異腐質(zhì)霉纖維二糖水解酶I、嗜熱毀絲霉纖維二 糖水解酶II、土生梭孢殼霉纖維二糖水解酶II (CEL6A)、嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶I、以 及嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶II。
[0354] 有用于本發(fā)明的方法中的β_葡糖苷酶的實(shí)例包括但不限于米曲霉β_葡糖苷 酶、煙曲霉菌β-葡糖苷酶、巴西青霉ΙΒΤ 20888 β-葡糖苷酶、黑曲霉β-葡糖苷酶、以及 棘孢曲霉β-葡糖苷酶。
[0355] 具有β -葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可根據(jù)W0 2002/095014獲得。具有β -葡糖 苷酶活性的煙曲霉菌多肽可根據(jù)W0 2005/047499獲得。具有β-葡糖苷酶活性的巴西青 霉多肽可根據(jù)W0 2007/019442獲得。具有β-葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可根據(jù)丹（Dan) 等人，2000,生物化學(xué)雜志（J. Biol. Chem. )275:4973-4980獲得。具有β-葡糖苷酶活性的 棘孢曲霉多肽可根據(jù)川口（Kawaguchi)等人，1996,基因（Gene) 173:287-288獲得。
[0356] β_葡糖苷酶可以是一種融合蛋白。在一個(gè)方面，β_葡糖苷酶是根據(jù) W02008/057637獲得的米曲霉β-葡糖苷酶變體BG融合蛋白或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋 白。
[0357] 其他內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、以及β_葡糖苷酶披露于使用根據(jù)以下 的分類的許多糖基水解酶家族中：亨利薩特· B. (Henrissat Β.)，1991，基于氨基酸序 列相似性的糖基水解酶的分類（A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities),生物化學(xué)雜志（Biochem.J.) 280:309-316;以 及亨利薩特· B.和貝洛赫· A. (Bairoch A.)，1996,修正糖基水解酶的基于序列的分類 (Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases),生物化學(xué)雜 志 316:695-696。
[0358] 可用在本發(fā)明中的其他纖維素分解酶描述于以下中：EP 495257、EP 531315、EP 531372,W0 1989/09259,W0 1994/07998,W0 1995/2447UW0 1996/11262,W0 1996/29397, TO 1996/034108、TO 1997/14804、TO 1998/08940、TO 1998/012307、TO 1998/13465、 TO 1998/015619、TO 1998/015633、TO 1998/028411、TO 1999/06574、TO 1999/10481、 TO 1999/025846、TO 1999/025847、TO 1999/031255、TO 2000/009707、TO 2002/050245、 W0 2002/0076792, W0 2002/101078, W0 2003/027306, W0 2003/052054, W0 2003/052055, W0 2003/052056, W0 2003/052057, W0 2003/052118, W0 2004/016760, W0 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, TO 2008/008793、美國(guó)專利號(hào)4, 435, 307、美國(guó)專利號(hào)5, 457, 046、美國(guó)專利號(hào)5, 648, 263、 美國(guó)專利號(hào)5, 686, 593、美國(guó)專利號(hào)5, 691，178、美國(guó)專利號(hào)5, 763, 254、以及美國(guó)專利號(hào) 5, 776, 757。
[0359] 在本發(fā)明的方法中，可以使用具有纖維素分解增強(qiáng)活性的任何GH61多肽。
[0360] 在一個(gè)第一個(gè)方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包括以下基序：
[0361] [ILMV]-P-X (4, 5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X (4) - [HNQ]和 [Fff]-[TF] -K-[AIV],
[0362] 其中X是任何氨基酸，X (4, 5)是處于4個(gè)或5個(gè)連續(xù)位置的任何氨基酸，并且X (4) 是處于4個(gè)連續(xù)位置的任何氨基酸。
[0363] 包括以上提到的基序的多肽可以進(jìn)一步包括：
[0364] H-X (1，2) -G-P-X (3) - [YW] - [AILMV]、
[0365] [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]、或
[0366] H-X (1，2) -G-P-X (3) - [YW] - [AILMV]以及[EQ] -X-Y-X (2) -C-X- [EHQN] - [FILV] -X-[ILV],
[0367] 其中X是任何氨基酸，X(l，2)是處于1個(gè)位置或2個(gè)連續(xù)位置的任何氨基酸，X (3) 是處于3個(gè)連續(xù)位置的任何氨基酸，并且X(2)是處于2個(gè)連續(xù)位置的任何氨基酸。在以上 基序中，采用可接受的IUPAC單一字母氨基酸縮寫(xiě)。
[0368] 在一個(gè)優(yōu)選方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽進(jìn)一步包括 H-X (1，2)-G-P-X (3) -[YW] -[AILMV]。在另一個(gè)優(yōu)選方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離 多肽進(jìn)一步包括[EQ] -X-Y-X (2) -C-X- [EHQN] - [FILV] -X- [ILV]。在另一個(gè)優(yōu)選方面，具有纖 維素分解增強(qiáng)活性的多肽進(jìn)一步包括H-X (1，2) -G-P-X (3) - [YW] - [AILMV]和[EQ] -X-Y-X (2 )-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。
[0369] 在一個(gè)第二方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包括以下基序：
[0370] [ILMV]-P-x(4, 5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]，
[0371] 其中x是任何氨基酸，x (4, 5)是處于4個(gè)或5個(gè)連續(xù)位置的任何氨基酸，并且x (3) 是處于3個(gè)連續(xù)位置的任何氨基酸。在以上基序中，采用可接受的IUPAC單一字母氨基酸 縮寫(xiě)。
[0372] 在本發(fā)明的方法中有用的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的實(shí)例包括但不限于： 來(lái)自土生梭孢殼霉的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽（W0 2005/074647)、來(lái)自橙色嗜熱子 囊菌的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽（W0 2005/074656)、來(lái)自里氏木霉的具有纖維素分 解增強(qiáng)活性的多肽（W0 2007/089290)、以及來(lái)自嗜熱毀絲霉的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的 多肽（TO 2009/085935、TO 2009/085859、TO 2009/085864、TO 2009/085868)。
[0373] 適用于本發(fā)明的商業(yè)木聚糖降解酶制劑的實(shí)例包括：例如SHEARZYME? (諾 維信公司A/S)、CELLICTMHTec (諾維信公司Λ S)、VISCOZYME? (諾維信公司A/ S)、ULTRAFLO? (諾維信公司 A/S)、PULPZYME? HC (諾維信公司 A/S)、 MULTIFECT? 木聚糖酶（杰能科（Genencor))、ECOPULP? ΤΧ-200Α(ΑΒ 酶制劑公 司（AB Enzymes))、HSP 6000木聚糖酶（帝斯曼）、DEP0L?333P(生物催化劑有限公司 (Biocatalysts Limit),英國(guó)威爾士（Wales, UK))、DEP0L?740L.(生物催化劑有限公司，英 國(guó)威爾士）以及DEP0L?762P(生物催化劑有限公司，英國(guó)威爾士）。
[0374] 有用于本發(fā)明的方法的木聚糖酶的實(shí)例包括但不限于：棘孢曲霉木聚糖酶 (GeneSeqP:AAR63790;W0 94/21785)、煙曲霉木聚糖酶（W0 2006/078256)、以及土生梭孢 殼霉 NRRL 8126 木聚糖酶（W0 2009/079210)。
[0375] 有用于本發(fā)明的方法的β_木糖苷酶的實(shí)例包括但不限于：里氏木霉β_木糖苷 酶（UniProtKB/TrEMBL登錄號(hào)Q92458)、埃默森踝節(jié)菌（SwissProt登錄號(hào)Q8X212)、以及粗 糙鏈孢菌（SwissProt登錄號(hào)Q7S0W4)。
[0376] 有用于本發(fā)明的方法的乙酰木聚糖酯酶的實(shí)例包括但不限于：紅褐肉座菌 (Hypocrea jecorina)乙酰木聚糖酯酶（W0 2005/001036)、粗糙鏈孢菌乙酰木聚糖酯酶 (UniProt登錄號(hào)q7s259)、土生梭孢殼霉NRRL 8126乙酰木聚糖酯酶（W0 2009/042846)、 球毛殼菌乙酰木聚糖酯酶（Uniprot登錄號(hào)Q2GWX4)、細(xì)毛殼菌（Chaetomium gracile)乙 酰木聚糖酯酶（GeneSeqP登錄號(hào)AAB82124)、穎枯殼針孢（Phaeosphaeria nodorum)乙 酰木聚糖酯酶（Uniprot登錄號(hào)Q0UHJ1)、以及特異腐質(zhì)霉DSM 1800乙酰木聚糖酯酶（W0 2009/073709)。
[0377] 有用于本發(fā)明的方法的阿魏酸酯酶的實(shí)例包括但不限于：特異腐質(zhì)霉DSM 1800 阿魏酸酯酶（W0 2009/076122)、粗糙鏈孢菌阿魏酸酯酶（UniProt登錄號(hào)Q9HGR3)、以及費(fèi) 希新薩托菌（Neosartorya fischeri)阿魏酸酯酶（UniProt登錄號(hào)A1D9T4)。
[0378] 有用于本發(fā)明的方法中的阿拉伯呋喃糖苷酶的實(shí)例包括但不限于：特異腐質(zhì)霉 DSM 1800阿拉伯呋喃糖苷酶（W0 2009/073383)以及黑曲霉阿拉伯呋喃糖苷酶（GeneSeqP 登錄號(hào) AAR94170)。
[0379] 有用于本發(fā)明的方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的實(shí)例包括但不限于：棒曲霉 (Aspergillus clavatus) α -葡糖醒酸糖苷酶（UniProt登錄號(hào)alccl2)、里氏木霉α -葡 糖醒酸糖苷酶（Uniprot登錄號(hào)Q99024)、埃默森踝節(jié)菌α -葡糖醒酸糖苷酶（UniProt登錄 號(hào)Q8X211)、黑曲霉α-葡糖醒酸糖苷酶（Uniprot登錄號(hào)Q96WX9)、土曲霉（Aspergillus terreus) α -葡糖醒酸糖苷酶（SwissProt登錄號(hào)Q0CJP9)、以及煙曲霉α -葡糖醒酸糖苷 酶（SwissProt 登錄號(hào) Q4WW45)。
[0380] 有用于本發(fā)明的方法的酶和蛋白質(zhì)可以通過(guò)在含有適合碳源和氮源以及無(wú)機(jī)鹽 的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，使用本領(lǐng)域中已知的程序發(fā)酵上述微生物菌株來(lái)產(chǎn)生（參見(jiàn)，例如，班尼 特· J. W. (Bennett，J. W.)和拉熱· L. (LaSure，L.)(編輯），真菌中的更多基因操縱（More Gene Manipulations in Fungi),學(xué)術(shù)出版社，加利福尼亞州，1991)。適合的培養(yǎng)基可從 商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開(kāi)的組成（例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中）制 備。適合用于生長(zhǎng)和酶產(chǎn)生的溫度范圍和其他條件在本領(lǐng)域中是已知的（參見(jiàn)，例如，貝 利· J. E. (Bailey, J. E.)和奧利斯· D. F. (Ollis，D. F.)，生物化學(xué)工程基礎(chǔ)（Biochemical Engineering Fundamentals)，麥格勞-希爾圖書(shū)公司（McGraw-Hill Book Company)，紐約， 1986)。
[0381] 發(fā)酵可以是導(dǎo)致酶表達(dá)或分離的任何細(xì)胞培養(yǎng)方法。所以，可以將發(fā)酵理解為包 括搖瓶培養(yǎng)，或者在一種適合的培養(yǎng)基中并且在允許表達(dá)或分離該酶的條件下在實(shí)驗(yàn)室或 工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵（包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、分批補(bǔ)料發(fā)酵或固態(tài) 發(fā)酵）。通過(guò)上述方法產(chǎn)生的所得酶可以從發(fā)酵培養(yǎng)基回收并且通過(guò)常規(guī)程序純化。
[0382] 發(fā)酵?？梢酝ㄟ^(guò)能夠?qū)⑻侵苯踊蜷g接發(fā)酵成所希望的發(fā)酵產(chǎn)物的一種或多種(若 干種）發(fā)酵微生物發(fā)酵從水解的纖維素材料獲得的可發(fā)酵糖。"發(fā)酵"或"發(fā)酵過(guò)程"是指 任何發(fā)酵過(guò)程或包括發(fā)酵步驟的任何過(guò)程。發(fā)酵方法還包括用于消費(fèi)性醇工業(yè)（例如啤酒 和葡萄酒）、乳品工業(yè)（例如發(fā)酵的乳制品）、皮革工業(yè)和煙草工業(yè)的發(fā)酵方法。發(fā)酵條件 取決于所希望的發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵生物體，并且可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易地確定。
[0383] 在發(fā)酵步驟中，預(yù)處理和酶水解步驟所導(dǎo)致的從纖維素材料釋放的糖由發(fā)酵生物 (如酵母）發(fā)酵成一種產(chǎn)物，例如，乙醇。如上所述，水解（糖化）和發(fā)酵可以是分開(kāi)的或同 時(shí)的。
[0384] 在實(shí)踐本發(fā)明的發(fā)酵步驟中可以使用任何適合的水解的纖維素材料。通常基于所 希望的發(fā)酵產(chǎn)物（即，要從發(fā)酵獲得的物質(zhì)）和所采用的方法來(lái)選擇材料，如本領(lǐng)域中所熟 知的。
[0385] 術(shù)語(yǔ)"發(fā)酵培養(yǎng)基"在此可理解為指在添加一種或多種發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基， 如，由糖化過(guò)程產(chǎn)生的培養(yǎng)基，以及在同時(shí)糖化和發(fā)酵過(guò)程（SSF)中使用的培養(yǎng)基。
[0386] "發(fā)酵微生物"是指適用于所希望的發(fā)酵方法以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的任何微生物，包括 細(xì)菌和真菌生物體。發(fā)酵生物可以是(： 6和/或(：5發(fā)酵生物、或其組合。（：6和(：5發(fā)酵生物 二者均是本領(lǐng)域中所熟知的。適合的發(fā)酵微生物能夠?qū)⑻牵ㄈ缙咸烟?、木糖、木酮糖、阿?伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、或寡糖）直接或間接地發(fā)酵（即，轉(zhuǎn)化）成所希望的發(fā)酵產(chǎn) 物。
[0387] 產(chǎn)生乙醇的細(xì)菌和真菌發(fā)酵生物的實(shí)例由琳（Lin)等人，2006,應(yīng)用微生物學(xué)與 生物技術(shù)69:627-642描述。
[0388] 能夠發(fā)酵C6糖的發(fā)酵微生物的實(shí)例包括細(xì)菌生物和真菌生物，如酵母。優(yōu)選的酵 母包括酵母菌屬菌株，優(yōu)選釀酒酵母。
[0389] 能夠發(fā)酵仏糖的發(fā)酵生物的實(shí)例包括細(xì)菌生物和真菌生物，如酵母。優(yōu)選的 C5發(fā)酵酵母包括畢赤酵母屬的菌株，優(yōu)選樹(shù)干畢赤酵母，例如樹(shù)干畢赤酵母CBS 5773 ; 假絲酵母屬的菌株，優(yōu)選博伊丁假絲酵母（Candida boidinii)、蕓薹假絲酵母（Candida brassicae)、休哈塔假絲酵母（Candida sheatae)、迪丹斯假絲酵母（Candida diddensii)、 假熱帶假絲酵母（Candida pseudotropicalis)、或產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis)。
[0390] 其他發(fā)酵生物包括發(fā)酵單胞菌屬的菌株，例如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌；漢遜酵母屬，例如 異常漢森酵母；克魯維酵母屬，例如脆壁克魯維酵母（K.fragilis);裂殖酵母屬，例如粟酒 裂殖酵母（S.pombe);以及大腸桿菌，尤其已被遺傳修飾以提高乙醇產(chǎn)率的大腸桿菌菌株。
[0391] 在一個(gè)優(yōu)選方面，酵母是酵母菌屬種。在一個(gè)更優(yōu)選方面，酵母是釀酒酵母。在另 一個(gè)更優(yōu)選方面，酵母是糖化酵母（Saccharomyces distaticus)。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，酵 母是葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum)。在另一個(gè)優(yōu)選方面，酵母是克魯維酵母屬。在 另一個(gè)更優(yōu)選方面，酵母是馬克斯克魯維酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，酵母是脆壁克魯維酵 母。在另一個(gè)優(yōu)選方面，酵母是假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，酵母是博伊丁假絲酵母。 在另一個(gè)更優(yōu)選方面，酵母是蕓薹假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，酵母是迪丹斯假絲酵 母。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，酵母是假熱帶假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，酵母是產(chǎn)朊假絲 酵母。在另一個(gè)優(yōu)選方面，酵母是棒孢酵母屬（Clavispora)。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，酵母是 葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae)。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，酵母是仙人掌棒孢酵母 (Clavispora opuntiae)。在另一個(gè)優(yōu)選方面，酵母是管囊酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選方面， 酵母是嗜鞣管囊酵母。在另一個(gè)優(yōu)選方面，酵母是畢赤酵母屬。在另一個(gè)優(yōu)選方面，酵母是 樹(shù)干畢赤酵母。在另一個(gè)優(yōu)選方面，酵母是酒香酵母屬（Bretannomyces)。在另一個(gè)更優(yōu)選 方面，酵母是克勞森酒香酵母（菲利皮迪斯· G. P. (Philippidis，G. P.)，1996,纖維素生物 轉(zhuǎn)化技術(shù)（Cellulose bioconversion technology)，生物乙醇手冊(cè)：生產(chǎn)和利用（Handbook on Bioethanol :Production and Utilization)，懷曼.C.E (Wyman, C.E.)編輯，泰勒-弗朗 西斯出版集團(tuán)（Taylor&Francis)，華盛頓特區(qū)（Washington, DC)，179-212))。
[0392] 能夠有效地將己糖和戊糖發(fā)酵成乙醇的細(xì)菌包括，例如，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌和熱纖 維梭菌（Clostridium thermocellum)(菲利皮迪斯，1996,見(jiàn)上文）。
[0393] 在一個(gè)優(yōu)選方面,細(xì)菌是發(fā)酵單胞菌屬。在一個(gè)更優(yōu)選方面,細(xì)菌是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞 菌。在另一個(gè)優(yōu)選方面，細(xì)菌是梭菌屬。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，細(xì)菌是熱纖維梭菌。
[0394] 適于乙醇生產(chǎn)的可商購(gòu)的酵母包括，例如乙醇紅酵母（ETHANOL REDTMyeast)(可 從富酶泰斯/樂(lè)斯富（Fermentis/Lesaffre)，USA獲得）、FALI?(可從弗萊施曼酵母 (Fleischmann，s Yeast)，USA 獲得）、SUPERSTART? 和 THERM0SACC? 新鮮酵母（可從乙醇 技術(shù)（Ethanol Technology)，WI，USA)、BI0FERM?AFT 和 XR(可從 NABC-北美生物產(chǎn)品公司 (North American Bioproducts Corporation), GA，USA 獲得）、GERT STRAND?(可從 Gert Strand AB，瑞典獲得）、以及FERMIOL?(可從帝斯曼食品配料部（DSM Specialties)獲得）。
[0395] 在一個(gè)優(yōu)選方面，發(fā)酵微生物已經(jīng)經(jīng)過(guò)遺傳修飾，以提供發(fā)酵戊糖的能力，如利用 木糖的微生物、利用阿拉伯糖的微生物、以及共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
[0396] 將異源基因克隆到多種發(fā)酵微生物中已經(jīng)構(gòu)建出能夠?qū)⒓禾呛臀焯寝D(zhuǎn)化成乙 醇（共發(fā)酵）的生物（陳（Chen)和霍（Ho)，1993,釀酒酵母中畢赤酵母木糖還原酶基 因的克隆和改善表達(dá)（Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae)，應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù) (Appl. Biochem. Biotechnol.) 39-40:135-147 ;霍等人，1998,能夠有效共發(fā)酵葡萄糖和 木糖的遺傳工程化的酵母菌屬酵母（Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose)，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué) 64:1852-1859;科特（Kotter)和西拉塞（Ciriacy)，1993,釀酒酵母發(fā)酵木糖（Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae),應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)（八卩卩1· Microbiol. Biotechnol.) 38:776-783 ;維爾福森（Walfridsson)等人，1995，過(guò)表達(dá)編 碼戊糖磷酸途徑酶轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶的TKL1和TALI基因的木糖代謝釀酒酵母菌 株(Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKLland TALlgenes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase)，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué) 61:4184-4190;凱拍（Kuyper)等人，2004,用 于有效厭氧木糖發(fā)酵的釀酒酵母的最小代謝工程化：原理的證實(shí)（Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation:a proof of principle)，歐洲微生物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)酵母研究（FEMS Yeast Research)4:655_664;比爾（Beall)等人，1991，通過(guò)重組大腸桿菌從木糖和其他糖產(chǎn) 生乙酉享的參數(shù)石開(kāi)究（Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli)，生物技術(shù)與生物工程（Biotech. Bioeng. )38:296-303;英格拉姆（Ingram)等人，1998,用于乙醇產(chǎn)生的細(xì)菌的代謝工 程化（Metabolic engineering of bacteria for ethanol production)，生物技術(shù)與 生物工程58:204-214 ;張（Zhang)等人，1995,產(chǎn)生乙醇的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中戊糖代謝 途徑的代謝工程化（Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis)，科學(xué)（Science)267:240_243;狄安妲（Deanda)等 人，1996,通過(guò)代謝途徑工程化開(kāi)發(fā)發(fā)酵阿拉伯糖的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株（Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering)，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)62:4465-4470 ;W0 2003/062430,木糖異構(gòu)酶）。
[0397] 在一個(gè)優(yōu)選方面，遺傳修飾的發(fā)酵微生物是釀酒酵母。在另一個(gè)優(yōu)選方面，遺傳修 飾的發(fā)酵微生物是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。在另一個(gè)優(yōu)選方面，遺傳修飾的發(fā)酵微生物是大腸桿 菌。在另一個(gè)優(yōu)選方面，遺傳修飾的發(fā)酵微生物是產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca)。 在另一個(gè)優(yōu)選方面，遺傳修飾的發(fā)酵微生物是克魯維酵母屬。
[0398] 本領(lǐng)域中熟知的是，以上所描述的生物體還可以用于產(chǎn)生其他物質(zhì)，如在此所描 述。
[0399] 典型地向降解的木質(zhì)纖維素或水解物中添加發(fā)酵微生物，并且進(jìn)行發(fā)酵持續(xù)約8 至約96小時(shí)，例如約24至約60小時(shí)。溫度典型地在約26°C至約60°C之間，具體地約32°C 或50°C，并且在約pH 3至約pH 8,例如pH 4至5、6、或7左右。
[0400] 在一個(gè)優(yōu)選方面，對(duì)降解的纖維素材料施用酵母和/或另一種微生物，并且進(jìn)行 發(fā)酵持續(xù)約12至約96小時(shí)，如典型地24至60小時(shí)。在一個(gè)優(yōu)選方面，溫度優(yōu)選在約20°C 至約60°C之間，更優(yōu)選約25°C至約50°C，并且最優(yōu)選約32°C至約50°C，具體地約32°C或 50°C，并且pH通常是從約pH 3至約pH 7,優(yōu)選地在pH 4-7左右。然而，一些發(fā)酵生物 (例如細(xì)菌）具有更高的最適發(fā)酵溫度。酵母或另一種微生物優(yōu)選以每ml發(fā)酵液大約105 至1〇12,優(yōu)選從大約1〇7至1〇1(1，特別是大約2X10 8個(gè)活細(xì)胞計(jì)數(shù)的量施用。關(guān)于使用酵 母進(jìn)行發(fā)酵的進(jìn)一步指南可以見(jiàn)于例如"醇教材"（"The Alcohol Textbook"）（K ·雅克 (K.Jacques)、T.P.里昂（T.P.Lyons)以及 D.R.凱爾索爾（D.R.Kelsall)編輯，諾丁漢大 學(xué)出版社（Nottingham University Press)，聯(lián)合王國(guó)（United Kingdom) 1999)，其通過(guò)引 用結(jié)合在此。
[0401] 對(duì)于乙醇生產(chǎn)，在發(fā)酵之后，蒸餾發(fā)酵的漿料以萃取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得 的乙醇可用作例如燃料乙醇、飲用乙醇，即可飲用的酒精，或工業(yè)乙醇。
[0402] 發(fā)酵刺激劑可以與在此所描述的任何方法組合使用，以進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵方法，特 別是改進(jìn)發(fā)酵微生物的性能，如，提高速度和乙醇產(chǎn)率。"發(fā)酵刺激劑"是指用于發(fā)酵微生 物（特別是酵母）生長(zhǎng)的刺激劑。用于生長(zhǎng)的優(yōu)選發(fā)酵刺激劑包括維生素和礦物質(zhì)。維 生素的實(shí)例包括多種維生素、生物素、泛酸鹽（酯）、煙酸、內(nèi)消旋肌醇、硫胺、吡哆醇、對(duì) 氨基苯酸、葉酸、核黃素、以及維生素 A、B、C、D和E，例如參見(jiàn)阿爾弗雷多（Alfenore)等 人，通過(guò)在分批補(bǔ)料方法過(guò)程中的一種維生素補(bǔ)料策略改進(jìn)乙醇產(chǎn)生和釀酒酵母的存活 力(Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisia by a vitamin feeding strategy during fed-batch process)，施普林格（2002)，其通過(guò)引用結(jié) 合在此。礦物質(zhì)的實(shí)例包括可以供應(yīng)包含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Ζη、Μη和Cu營(yíng)養(yǎng)素的礦物質(zhì) 和礦物鹽。
[0403] 發(fā)酵產(chǎn)物：發(fā)酵產(chǎn)物可以是由發(fā)酵得到的任何物質(zhì)。該發(fā)酵產(chǎn)物可以是（不限 制）一種醇（例如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、丙三醇（glycerol)、甲醇、1，3_丙二醇、山梨 糖醇、以及木糖醇）；一種有機(jī)酸（例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2, 5-二 酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康 酸、乳酸、蘋(píng)果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸、以及木糖酸）；一種酮（例如，丙 酮）；一種氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸、以及蘇氨酸）；以及一 種氣體（例如，甲烷、氫氣（?)、二氧化碳（C0 2)、以及一氧化碳（C0))。發(fā)酵產(chǎn)物還可以是 作為高價(jià)值產(chǎn)物的蛋白。
[0404] 在一個(gè)優(yōu)選的方面，發(fā)酵產(chǎn)物是一種醇。將理解，術(shù)語(yǔ)"醇"涵蓋含有一個(gè)或多個(gè)羥 基部分的物質(zhì)。在一個(gè)更優(yōu)選方面，該醇是阿拉伯糖醇。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該醇是丁醇。 在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該醇是乙醇。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該醇是甘油。在另一個(gè)更優(yōu)選方 面，該醇是甲醇。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該醇是1，3-丙二醇。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該醇是山 梨糖醇。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該醇是木糖醇。參見(jiàn)，例如，貢*C.S. (Gong, C.S.)、卡奧·Ν. J. (Cao, N. J.，）、杜· J. (Du，J.)、以及曹· G. T. (Tsao, G. Τ·)，1999,由可再生資源生產(chǎn)乙醇， 生物化學(xué)工程 / 生物技術(shù)的進(jìn)展（Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology),舍佩爾· T. (Scheper, T.) 編輯，施普林格（Springer-Verlag)，德國(guó)海德堡柏林（Berlin Heidelberg, Germany), 65:207-241 ;西爾韋拉·ΕΜ· (Silveira, EE)和喬納斯· R. (Jonas，R.)，2002,山梨糖 醇的生物技術(shù)生產(chǎn)（The biotechnological production of sorbitol)，應(yīng)用微生物學(xué) 與生物技術(shù)59:400-408;尼加姆（Nigam)和辛格（Singh)，1995,用于木糖醇-一種糖替 代品的發(fā)酵產(chǎn)生工藝（Processes for fermentative production of xylitol - a sugar substitute)，加工生物化學(xué)（Process Biochemistry)30(2) :117-124 ;伊澤吉（Ezeji)、 庫(kù)雷希（Qureshi)和布拉舍克（Blaschek)，2003,通過(guò)拜季林斯基羧菌BA101生產(chǎn)丙酮、 丁醇和乙醇并且通過(guò)氣提原位回收（Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BAlOland in situ recovery by gas stripping),微生物與生 物技術(shù)世界雜志（World Journal of Microbiology and Biotechnology) 19(6):595-603。
[0405] 在另一個(gè)優(yōu)選方面，發(fā)酵產(chǎn)物是有機(jī)酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是乙酸。 在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是醋酮酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是己二酸。在另 一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是抗壞血酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是檸檬酸。在另 一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是2, 5-二酮-D-葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是甲 酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是反丁烯二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是葡糖 二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是葡糖醛 酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是戊二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是3-二羥基 丙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是衣康酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是乳酸。 在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是蘋(píng)果酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是丙二酸。在另 一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是草酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是丙酸。在另一個(gè)更優(yōu) 選方面，該有機(jī)酸是琥珀酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸是木糖酸。參見(jiàn)例如陳（Chen) 和李（Lee)，1997,用于從纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)乳酸的膜介導(dǎo)的萃取發(fā)酵（Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass)應(yīng) 用生物化學(xué)與生物技術(shù)（Appl. Biochem. Biotechnol.)，63_65:435_448。
[0406] 在另一個(gè)優(yōu)選方面，發(fā)酵產(chǎn)物是一種酮。應(yīng)理解的是，術(shù)語(yǔ)"酮"涵蓋包含一個(gè)或 多個(gè)酮部分的物質(zhì)。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該酮是丙酮。參見(jiàn)，例如，庫(kù)雷希和布拉舍克， 2003,見(jiàn)上文。
[0407] 在另一個(gè)優(yōu)選方面，發(fā)酵產(chǎn)物是一種氨基酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該有機(jī)酸 是天冬氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該氨基酸是谷氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該氨基 酸是甘氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該氨基酸是賴氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該氨基 酸是絲氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該氨基酸是蘇氨酸。參見(jiàn)例如理查德（Richard)和 馬加里蒂（Margaritis)，2004,用于聚（谷氨酸）生產(chǎn)和其他微生物生物聚合物的分批 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的實(shí)驗(yàn)建模（Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly (glutamic acid) production and other microbial biopolymers),生物技術(shù)和生物 工程（Biotechnology and Bioengineering) 87 (4) : 501-515。
[0408] 在另一個(gè)優(yōu)選方面，發(fā)酵產(chǎn)物是一種氣體。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該氣體是甲烷。 在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該氣體是H 2。在另一個(gè)更優(yōu)選方面，該氣體是co2。在另一個(gè)更優(yōu) 選方面，該氣體是C0。參見(jiàn)，例如，片岡· N. (Kataoka, N. )、A ·米亞（A. Miya)、以及K ·桐 山（K.Kiriyama)，1997,關(guān)于通過(guò)產(chǎn)氫厭氧細(xì)菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)生氫氣的研究（Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria)，水科學(xué)與技術(shù)（Water Science and Technology) 36 (6-7) :41-47 ; 以及古那森蘭· V. N. (Gunaseelan V. N.)，生物質(zhì)與生物能源（Biomass and Bioenergy)， 第13 (1-2)卷，第83-114頁(yè)，1997,用于甲燒生產(chǎn)的生物質(zhì)的厭氧消化：綜述（Anaerobic digestion of biomass for methane production:A review)〇
[0409] 通並：?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何方法可任選地從發(fā)酵培養(yǎng)基回收一種或多種 發(fā)酵產(chǎn)物，這些方法包括但不限于，色譜法、電泳程序、差別溶解度、蒸餾、或萃取。例如，通 過(guò)常規(guī)蒸餾方法從發(fā)酵的纖維素材料中分離和純化醇?？梢垣@得具有高達(dá)約96vol. %的純 度的乙醇，這可以用作例如燃料乙醇、引用乙醇，即飲用中性乙醇、或工業(yè)乙醇。
[0410] 信號(hào)肽
[0411] 本發(fā)明還涉及編碼一種信號(hào)肽的一種分離的多核苷酸，該信號(hào)肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至17、SEQ ID NO:4的氨基酸1至17或SEQ ID NO:6的氨基酸1至26或 由其組成。所述多核苷酸可以進(jìn)一步包括編碼蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)與信號(hào)肽和/或 前肽可操作地連接。該蛋白質(zhì)優(yōu)選地對(duì)于該信號(hào)肽來(lái)說(shuō)是外源的。在一個(gè)方面，編碼該信 號(hào)肽的多核苷酸是SEQ ID NO: 1的核苷酸33至83、SEQ ID N0: 3的氨基酸81至131、SEQ ID N0:5的氨基酸235至312。
[0412] 本發(fā)明還涉及包括這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體及重組宿主細(xì)胞。
[0413] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生蛋白的方法，該方法包括：（a)對(duì)包括這種多核苷酸的重組宿 主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；并且（b)回收該蛋白質(zhì)。
[0414] 該蛋白質(zhì)對(duì)于宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)可以是原生的或異源的。術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"在此不意圖 是指一種特定長(zhǎng)度的編碼產(chǎn)物，并且因此涵蓋肽、寡肽及多肽。術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"還涵蓋組合 形成編碼的產(chǎn)物的兩個(gè)或更多個(gè)多肽。這些蛋白質(zhì)還包括雜合多肽和融合多肽。
[0415] 優(yōu)選的是，蛋白質(zhì)是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分、或報(bào)道子。 舉例來(lái)說(shuō)，該蛋白質(zhì)可以是一種水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶或轉(zhuǎn)移酶，例 如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多 糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、α -半乳糖苷酶、 β_半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷 酶、變聚糖酶（mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解 酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β_木糖苷酶。
[0416] 該基因可以從任何原核、真核或其他來(lái)源獲得。
[0417] 通過(guò)以下實(shí)例進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)例不應(yīng)當(dāng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。
[0418] 實(shí)例
[0419] 菌株
[0420] 此處包括的酶是從包括以下各項(xiàng)的不同范圍的微生物分離的：一色齒毛菌（SEQ ID Ν0:1+2)、里氏木霉（SEQ ID Ν0:3+4)和球毛殼菌（針對(duì) SEQ ID Ν0:5+6)。
[0421] 培養(yǎng)基和溶液
[0422] 此處提供的反應(yīng)條件、介質(zhì)和溶液納入用于啟發(fā)，并且在技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)適用時(shí)，可 被替代方法、反應(yīng)條件以及介質(zhì)替換。
[0423] 水解條件
[0424]
【權(quán)利要求】
1. 一種具有葡萄糖醛酸酯酶活性的分離的多肽，該多肽選自下組，該組由以下各項(xiàng)組 成： (a) -種多肽，該多肽與SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少80%、至少85%、至少90%、 至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至 少99%、或100%序列一致性；或 與SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、 或100 %序列一致性或 與SEQ ID N0:6的成熟多肽具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、 或100 %序列一致性； (b) 由一種多核苷酸編碼的一種多肽，該多核苷酸在高嚴(yán)謹(jǐn)度條件或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條 件下與⑴SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列、（ii)其cDNA序列、或（iii)⑴或（ii)的 全長(zhǎng)互補(bǔ)體雜交；或 或在非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與（iv)SEQ ID勵(lì):3的成熟多肽編碼序列、（0其(^嫩序列、 或（vi) (iv)或（v)的全長(zhǎng)互補(bǔ)體雜交； 或在非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與（vii)SEQ ID N0:5的成熟多肽編碼序列、（viii)其cDNA 序列、或（ix) (vii)或（viii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)體雜交； (c) 由一種多核苷酸所編碼的一種多肽，該多核苷酸與SEQ ID NO: 1的成熟多肽編碼序 列或其cDNA序列具有至少80 %、至少85 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至 少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一 致性或 與SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少90%、至少91%、至少 92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% 序列一致性或 與SEQ ID N0:5的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少85%、至少90%、至少 91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99 %或100 %序列一致性或 (d) SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6的成熟多肽的一種變體，該變體在一個(gè) 或多個(gè)位置處包括取代、缺失、和/或插入；以及 (e) (a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一個(gè)片段，該片段具有葡萄糖醛酸酯酶活性。
2. 如權(quán)利要求1所述的多肽，該多肽包括序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中的一個(gè)或由其組成。
3. 如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的多肽，該多肽包括序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4 或SEQ ID N0:6中的一個(gè)的成熟多肽或由其組成。
4. 如權(quán)利要求3所述的多肽，其中該成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸101至474、 SEQ ID NO:4的氨基酸94至460或SEQ ID NO:6的氨基酸21至392。
5. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的多肽，該多肽是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID N0:6的一個(gè)片段，其中該片段具有葡萄糖醛酸酯酶活性。
6. -種組合物，該組合物包括如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的多肽。
7. -種分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的多肽。
8. -種核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體，該核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體包括如權(quán)利要求7所述的多 核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至指導(dǎo)該多肽在一個(gè)表達(dá)宿主內(nèi)的產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)控 制序列。
9. 一種重組宿主細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞包括如權(quán)利要求7所述的多核苷酸，該多核苷 酸可操作地連接至指導(dǎo)該多肽的產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)控制序列。
10. -種產(chǎn)生如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的多肽的方法，該方法包括： (a) 在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下，培養(yǎng)一種細(xì)胞，該細(xì)胞在處于其野生型形式下產(chǎn)生 該多肽；并且 (b) 回收該多肽。
11. 一種產(chǎn)生具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的方法，該方法包括： (a) 在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞；并且 (b) 回收該多肽。
12. -種用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括：在如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的 具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的存在下，用一種酶組合物處理該纖維素材料。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中該纖維素材料是經(jīng)預(yù)處理的。
14. 如權(quán)利要求12或13所述的方法，其中該酶組合物包括選自下組的一種或多種酶， 該組由以下各項(xiàng)組成：纖維素酶、具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽、半纖維素酶、酯酶、蛋白 酶、漆酶、或過(guò)氧化物酶。
15. -種用于產(chǎn)生一種發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括： (a) 在如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的存在下，用 一種酶組合物糖化纖維素材料； (b) 用一種或多種發(fā)酵微生物對(duì)糖化的纖維素材料進(jìn)行發(fā)酵，以產(chǎn)生該發(fā)酵產(chǎn)物；并 且 (c) 從發(fā)酵中回收該發(fā)酵產(chǎn)物。
【文檔編號(hào)】C12N9/24GK104245930SQ201380021079
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月23日
【發(fā)明者】J.波杰森, A.維克索-尼爾森, N.斯波德斯伯格, K.B.R.M.克羅格 申請(qǐng)人:諾維信公司