白細(xì)胞介素-3多肽結(jié)合物和其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供靶向白細(xì)胞介素-3受體表達(dá)細(xì)胞的方法，具體地說(shuō)，通過(guò)使用結(jié)合到毒素的白細(xì)胞介素-3(IL-3)變異體來(lái)抑制所述細(xì)胞生長(zhǎng)，所述毒素將影響表達(dá)白細(xì)胞介素-3受體的細(xì)胞。還揭示包含一或多個(gè)非天然編碼氨基酸的白細(xì)胞介素-3(IL-3)變異體，和非天然編碼氨基酸的結(jié)構(gòu)。
【專利說(shuō)明】白細(xì)胞介素-3多肽結(jié)合物和其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供靶向白細(xì)胞介素_3受體表達(dá)細(xì)胞，并且具體地說(shuō)，通過(guò)使用結(jié)合到毒 素的白細(xì)胞介素-3(IL-3)變異體來(lái)抑制所述細(xì)胞生長(zhǎng)方法，所述毒素將影響表達(dá)白細(xì)胞 介素-3受體的細(xì)胞。

【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是最顯著健康病狀中的一種。2003年美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)癌癥事實(shí)和數(shù)據(jù) (American Cancer Society's Cancer Facts and Figures)預(yù)測(cè)今年將有 130萬(wàn)美國(guó)人接 受癌癥診斷。在美國(guó)，癌癥的死亡率僅次于心臟病而排名第二，每4起死亡中便有一例。在 2002年，美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health)估算癌癥的全部花費(fèi)總 共是1716億美元，其中610億美元是直接花費(fèi)。普遍預(yù)測(cè)癌癥的發(fā)病率將隨美國(guó)人口老齡 化而提高，從而進(jìn)一步加強(qiáng)這一病狀的影響。在1970年代和1980年代確立的癌癥現(xiàn)有治 療方案并未顯著變化。在用于最晚期狀態(tài)的常見癌癥時(shí)，這些治療，包括化學(xué)療法、輻射和 其它形態(tài)（包括更新型的靶向療法），顯示有限的整體存活效益，因?yàn)檫@些療法尤其主要靶 向腫瘤塊。
[0003] 更確切地說(shuō)，迄今為止的常規(guī)癌癥診斷和療法均嘗試選擇性地檢測(cè)和根除極快速 生長(zhǎng)的贅生性細(xì)胞（即形成腫瘤塊的細(xì)胞）。標(biāo)準(zhǔn)腫瘤學(xué)方案通常主要經(jīng)設(shè)計(jì)以在無(wú)不當(dāng) 毒性的情況下投與最高劑量的輻射或化學(xué)治療劑，即通常稱為"最大耐受劑量"(MTD)或"無(wú) 明顯副作用水平"（N0AEL)。許多常規(guī)癌癥化學(xué)療法（例如烷基化劑（如環(huán)磷酰胺）、抗代 謝劑（如5-氟尿嘧啶）以及植物堿（如長(zhǎng)春新堿））和常規(guī)輻射療法主要通過(guò)干擾與細(xì)胞 生長(zhǎng)和DNA復(fù)制有關(guān)的細(xì)胞機(jī)制來(lái)對(duì)癌細(xì)胞發(fā)揮其毒性作用?；瘜W(xué)療法方案通常還涉及投 與化學(xué)治療劑的組合以試圖提高治療功效。與多種化學(xué)治療劑的可用性無(wú)關(guān)，這些療法具 有許多缺陷（參見例如斯托克代爾（Stockdale)，1998，"癌癥患者管理準(zhǔn)則（Principles Of Cancer Patient Management)，'，美國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)（Scientific American Medicine),第 3卷，羅本斯特恩（Rubenstein)和費(fèi)德爾曼（Federman)編，第12章，第X節(jié)）。例如， 化學(xué)治療劑由于對(duì)快速生長(zhǎng)細(xì)胞（無(wú)論正常或惡性）的非特異性副作用而具有極大毒性； 例如化學(xué)治療劑引起顯著并且通常危險(xiǎn)的副作用，包括骨髓細(xì)胞減少、免疫抑制以及胃腸 道疼痛等。
[0004] 其它類型的傳統(tǒng)癌癥療法包括手術(shù)、激素療法、免疫療法、抗血管生成療法、靶 向療法（例如針對(duì)癌癥目標(biāo)的療法，如Glcevec?和其它酪氨酸激酶抑制劑、VdcadcR、 SutenLii等）以及輻射治療，用于根除患者的贅生性細(xì)胞（參見例如斯托克代爾，1998，"癌 癥患者管理準(zhǔn)則"，美國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)，第3卷，羅本斯特恩和費(fèi)德爾曼編，第12章，第IV 節(jié)）。所有這些方法在用于患者時(shí)可以造成顯著缺陷，包括功效不足（就長(zhǎng)期結(jié)果而言（例 如由于未能靶向癌癥干細(xì)胞）和毒性（例如由于對(duì)正常組織的非特異性作用））。因此，需 要用于改良癌癥患者的長(zhǎng)期前景的新療法。
[0005] 癌癥干細(xì)胞
[0006] 癌癥干細(xì)胞包含腫瘤的獨(dú)特子群（通常約0. 1% -10% )，其與其余的約90 %腫瘤 (即腫瘤塊）相比致瘤性更高、相對(duì)更緩慢生長(zhǎng)或處于靜態(tài)并且通常與腫瘤塊相比化學(xué)抗 性更高。鑒于常規(guī)療法和方案通常經(jīng)設(shè)計(jì)以快速攻擊增殖細(xì)胞（即包含腫瘤塊的癌細(xì)胞）， 通常緩慢生長(zhǎng)的癌癥干細(xì)胞可能比更快生長(zhǎng)的腫瘤塊對(duì)常規(guī)療法和方案的抗性更高。癌癥 干細(xì)胞可以表現(xiàn)其它特征，所述其它特征使其相對(duì)具有化學(xué)抗性，如更高的抗藥性和抗凋 亡路徑。前述內(nèi)容將構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)腫瘤學(xué)治療方案在大部分晚期癌癥患者中無(wú)法確保長(zhǎng)期效益 的關(guān)鍵原因-即無(wú)法充分靶向和根除癌癥干細(xì)胞。在一些情況下，癌癥干細(xì)胞是腫瘤的奠 基細(xì)胞（即其是包含腫瘤塊的癌細(xì)胞的祖細(xì)胞）。
[0007] 已經(jīng)在多種癌癥類型中發(fā)現(xiàn)癌癥干細(xì)胞。例如，貝奈特（Bonnet)等人能夠使 用流動(dòng)式細(xì)胞測(cè)量術(shù)分離出攜帶特異性表型CD34+CD38-的白血病細(xì)胞，并且接著證明 這些細(xì)胞（對(duì)于既定白血病，包含〈1% )與其余的99+%白血病主體不同，其在傳遞到 免疫缺陷小鼠中時(shí)能夠在其衍生時(shí)復(fù)制白血病。參見例如"人類急性骨髓白血病發(fā)展 成起源于原始造血細(xì)胞的層次（Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell) "，自然醫(yī)學(xué)（Nat. Med. )，3:730-737(1997)。也就是說(shuō)，在10, 000個(gè)白血病細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)〈1個(gè)這些癌癥干細(xì) 胞，但這一低頻率群體能夠在與原始腫瘤中相同的組織學(xué)表型情況下引起人類白血病并且 將其連續(xù)轉(zhuǎn)移到嚴(yán)重的組合免疫缺乏/非肥胖性糖尿病（N0D/SCID)小鼠中。
[0008] 考克斯（Cox)等人發(fā)現(xiàn)人類急性淋巴母細(xì)胞白血?。ˋLL)細(xì)胞的小型子部 分，其具有表型⑶347⑶ΚΓ和⑶347⑶19_并且能夠在免疫功能不全小鼠中移植ALL 腫瘤，即癌癥干細(xì)胞。相反，在一些情況下，使用ALL主體即使注射10倍更多的細(xì)胞 也沒(méi)有觀測(cè)到小鼠的移植。參見考克斯等人，"急性淋巴母細(xì)胞白血病祖細(xì)胞的表征 (Characterization of acute lymphoblastic leukemia progenitor cells)，'，血液 (Blood) 104(19):2919-2925 (2004)。
[0009] 發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤含有細(xì)胞的小型子群，其是CD138-并且與CD138+骨髓瘤細(xì) 胞的大型主體群體相比具有更大的克隆源性和致瘤潛力。參見松井（Matsui)等人，"克 隆源性多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的表征（Characterization of clonogenic multiple myeloma cells)"，血液學(xué)103(6) :2332。作者總結(jié)出多發(fā)性骨髓瘤的⑶138-子群是癌癥干細(xì)胞群 體。
[0010] 近藤（Kondo)等人從C6-神經(jīng)膠瘤細(xì)胞系分離出小型細(xì)胞群體，其借助于其在免 疫功能不全小鼠中自我更新和復(fù)制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的能力而被鑒別成癌癥干細(xì)胞群體。參見 近藤等人，"C6神經(jīng)膠瘤細(xì)胞系中癌癥類干細(xì)胞的小型群體的持續(xù)性（Persistence of a small population of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line)，'，美國(guó) 科學(xué)院院刊（Proc. Natl. Acad, Sci. USA), 101:781-786(2004)。在這一研究中，近藤等人測(cè) 定癌細(xì)胞系含有癌癥干細(xì)胞群體，其提供癌細(xì)胞系移植免疫缺陷小鼠的能力。
[0011] 證實(shí)乳癌含有具有干細(xì)胞特征（攜帶表面標(biāo)記⑶44+⑶24lin)的小型細(xì)胞群體。參 見艾爾-哈吉（Al-Hajj)等人，"致瘤乳癌細(xì)胞的前瞻性識(shí)別（Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells)"，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊 100:3983-3988(2003)。 這些細(xì)胞中只有200個(gè)細(xì)胞（對(duì)應(yīng)于全部腫瘤細(xì)胞群體的1-10% )能夠在N0D/SCID小鼠 中形成腫瘤。相比之下，植入20, 000個(gè)缺乏這一表型（即腫瘤塊）的細(xì)胞不能使腫瘤重新 生長(zhǎng)。
[0012] 發(fā)現(xiàn)來(lái)源于人類前列腺腫瘤的細(xì)胞的子群可以自我更新和復(fù)制出衍生其的前列 腺腫瘤的表型，從而構(gòu)成前列腺癌干細(xì)胞群體。參見柯林斯（Collins)等人，"致瘤前列腺 癌干細(xì)胞的前瞻性識(shí)別（Prospective Identification of Tumorigenic Prostate Cancer Stem Cells)"，癌癥研究（Cancer Res) 65 (23) :10946-10951 (2005)。
[0013] 方（Fang)等人從具有癌癥干細(xì)胞屬性的黑素瘤分離出細(xì)胞子群。具體地說(shuō)，這 一細(xì)胞子群可以分化和自我更新。在培養(yǎng)物中，子群形成球狀物，而來(lái)自病灶的更多的分 化細(xì)胞部分的附著性更高。另外，當(dāng)移植到小鼠中時(shí)，含有球狀細(xì)胞的子群比附著細(xì)胞 的致瘤性更高。參見方等人，"黑色素瘤中具有干細(xì)胞屬性的致瘤子群（A Tumorigenic Subpopulation with Stem Cell Properties in Melanomas)" 癌癥研究65(20); 9328-9337(2005)〇
[0014] 辛格（Singh)等人發(fā)現(xiàn)腦腫瘤干細(xì)胞。當(dāng)分離并且移植到裸小鼠中時(shí)，與⑶133 腫瘤塊細(xì)胞不同，CD133+癌癥干細(xì)胞形成腫瘤，其可接著連續(xù)移植。參見辛格等人，"人 類腦腫瘤引發(fā)細(xì)胞的識(shí)別（Identification of human brain tumor initiating cells)"， 自然（Nature) 432:396-401 (2004);辛格等人，"神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的癌癥干細(xì)胞（Cancer stem cells in nervous system tumors)"，癌基因（0ncogene)23:7267_7273(2004);辛 格等人，"人類腦腫瘤中癌癥干細(xì)胞的識(shí)別（Identification of a cancer stem cell in human brain tumors)"，癌癥研究 63:5821-5828 (2003)。
[0015] 因?yàn)槌Ｒ?guī)癌癥療法靶向快速增殖細(xì)胞（即形成腫瘤塊的細(xì)胞），相信這些治療在 靶向和破壞癌癥干細(xì)胞方面效率相對(duì)較低。實(shí)際上，已證實(shí)癌癥干細(xì)胞，包括白血病干細(xì)胞 對(duì)常規(guī)化學(xué)治療療法（例如Ara-c、道諾霉素（daunorubicin))以及較新的靶向療法（例如 Gieevee?、Veleade? )相對(duì)具有抗性。
[0016] 例如，白血病干細(xì)胞相對(duì)緩慢生長(zhǎng)或處于靜態(tài)、表達(dá)多藥抗性基因并且利用 其它抗凋亡機(jī)制--有助于其化學(xué)抗性的特征。參見喬丹（Jordan)等人，"靶向最致 命細(xì)胞：探討白血病療法作為干細(xì)胞生物學(xué)中的問(wèn)題（Targeting the most critical cells:approaching leukemia therapy as a problem in stem cell biology)，'，自然臨 床實(shí)踐腫瘤學(xué)（Nat. Clin. Pract. Oncol), 2:224-225(2005)。另外，癌癥干細(xì)胞借助于其化 學(xué)抗性而可以促成治療失效，并且還可以在臨床緩解之后在患者中保持，并且這些殘余癌 癥干細(xì)胞因此可以造成在日后的復(fù)發(fā)。參見貝胡德（Behbood)等人，"癌癥干細(xì)胞是否將 提供新的治療目標(biāo)？（Will cancer stem cells provide new therapeutictargets?) "， 癌發(fā)生學(xué)（癌發(fā)生）26(4):703-711(2004)。因此，預(yù)期靶向癌癥干細(xì)胞可以為癌癥患者提 供改良的長(zhǎng)期結(jié)果。因此，需要經(jīng)設(shè)計(jì)以靶向癌癥干細(xì)胞的新型治療劑和/或方案實(shí)現(xiàn)這 一目標(biāo)。
[0017] 急性骨髓白血病
[0018] 在美國(guó)、加拿大和歐洲，每年約4萬(wàn)名患者患上急性骨髓白血?。ˋML)。參見例 如哈馬爾（Jamal)等人，癌癥統(tǒng)計(jì)學(xué)（Cancer Statisitics) 56 :106-130(2006)。AML 是 成人中最常見的白血病并且是兒童中第二常見的白血病。與治療和并發(fā)癥有關(guān)的住院 期延長(zhǎng)代表這些領(lǐng)域中的顯著衛(wèi)生保健成本共用。另外，即使使用組合誘導(dǎo)和合并化學(xué) 療法，大部分患者最終仍復(fù)發(fā)并且由于其疾病或治療之并發(fā)癥而死亡。參見例如布魯恩 (Brune)等人，"急性骨髓白血病中通過(guò)組胺二鹽酸鹽和白細(xì)胞介素-2改良的合并免 疫療法后的無(wú)白血病存活：隨機(jī)III期試驗(yàn)的結(jié)果（Improved leukemia-free survival after post-consolidation immunotherapy with histamine dihydrochloride and interleukin-2in acute myeloid leukemia:results of a randomized phase III trial)"，血液學(xué)108(1) :88-96 (2006)。急需新穎療法。AML細(xì)胞干細(xì)胞的選擇性靶向可 以提供安全和更有效的療法。
[0019] 骨髓發(fā)育不良綜合癥
[0020] 在美國(guó)，每年有約20, 000例骨髓發(fā)育不良綜合癥（MDS)新病例。骨髓發(fā)育不良 綜合癥患者典型地在紅血球、白血球和血小板中的至少一種或多種方面具有低血液細(xì)胞計(jì) 數(shù)。在檢查時(shí)，通常發(fā)現(xiàn)骨髓發(fā)育異?；蛟錾?，意謂骨髓中存在太多的功能不全的血液干細(xì) 胞。少數(shù)MDS患者具有發(fā)育不全骨髓，意謂骨髓中的血液干細(xì)胞過(guò)少，使得疾病與再生障礙 性貧血看起來(lái)類似。近一半的MDS患者在診斷時(shí)無(wú)癥狀。當(dāng)病征和癥狀出現(xiàn)時(shí)，其可包括 貧血、虛弱、疲勞、頭痛、皮下出血、出血增加、疹子、發(fā)熱、口瘡和拖延性疾病。MDS在年長(zhǎng)人 群中的發(fā)生頻率增加，但其也可在兒童中發(fā)生。在不到三分之一的患者中,MDS隨時(shí)間推移 而發(fā)展變成急性白血病。平均診斷年齡是70歲。取決于MDS的類型、患者病史以及年齡和 耐受某些治療方案的能力，MDS的治療可以顯著不同。治療選項(xiàng)包括支持性護(hù)理、化學(xué)療法 相關(guān)藥劑以及干細(xì)胞移植（其典型地僅在50歲以下的患者中使用）。但是，現(xiàn)有治療的緩 解率相對(duì)較低，并且需要新療法。
[0021] 白細(xì)胞介素-3
[0022] 白細(xì)胞介素-3(IL_3)是一種細(xì)胞激素，其支持多潛力和定型骨髓和淋巴祖 細(xì)胞的增殖和分化。參見例如尼茲切（Nitsche)等人"白細(xì)胞介素-3在N0D/SCID 小鼠中促進(jìn)人類造血干細(xì)胞的增殖和分化，但降低其再增殖潛力"，干細(xì)胞（Stem Cells)21:236-244(2003)。人類白細(xì)胞介素-3通過(guò)結(jié)合于人類IL-3受體而介導(dǎo)其作 用，人類IL-3受體是雜二聚結(jié)構(gòu)并且由IL-3結(jié)合α -子單元和β -子單元組成。α子 單元為配位體結(jié)合所必需并且賦予受體特異性。β子單元也由粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-群落刺 激因子（GM-CSF)和IL-5受體共用，并且為高親和力配位體結(jié)合和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所需。IL-3 的結(jié)合引起α-受體子單元和β-受體子單元的雜二聚化。與某些正常造血細(xì)胞相比， IL-3受體在多種血液癌癥（包括AML、B細(xì)胞急性淋巴球性白血?。˙-ALL)、毛狀細(xì)胞白 血病、霍奇金氏?。℉odgkin's disease)以及某些侵襲性非霍奇金氏淋巴瘤（aggressive non-Hodgkin，s lymphomas)(穆諾茲（Munoz),血液學(xué)（Haematologica)86:1261-1269, 2 001 ;羅西妮（Riccioni),淋巴瘤（Leuk Lymphoma)46:303_311，2005;特斯塔（Testa),白 血?。↙eukemia) 18:219-226, 2004))以及AML的癌癥干細(xì)胞、骨髓發(fā)育不良綜合癥（MDS)、 T細(xì)胞ALL(T-ALL)和慢性骨髓白血?。–ML)(參見喬丹等人"白細(xì)胞介素-3受體α鏈 是人類急性骨髓性白血病干細(xì)胞的獨(dú)特標(biāo)記（The interleukin_3receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells)，'，白血病 14:1777-1784(2000);弗洛里安（Florian)等人"不同骨髓惡性病中CD34+/CD38-干細(xì)胞 表面上分子目標(biāo)的檢測(cè)（Detection of molecular targets on the surface ofCD34+/ CD38_stem cells in various myeloid malignancies)" 淋巴瘤 47:207-222(2006);萊爾 米特（Lhermitte)等人"大部分未成熟T-ALL表達(dá)Ra-IL3(CD123) :DT-IL3#療法的可能目 標(biāo)（Most immatureT-ALLs express Ra_IL3(CD123):possible target for DT-IL3#ther apy)"，20:1908-1910 (2006);和赫格（Hogge)等人"具有增加的受體親和力的變異型白喉 毒素-白細(xì)胞介素-3結(jié)合物具有增強(qiáng)的針對(duì)急性骨髓白血病祖細(xì)胞的細(xì)胞毒性（Variant Diphtheria Toxin-Interleukin-3Conjugates with Increased Receptor Affinity Have Enhanced Cytotoxicity against Acute Myeloid Leukemia Progenitors)，'，臨床癌癥石開 究（Clin. Caner Res. ) 12:1284-1291 (2004))中過(guò)度表達(dá)。
[0023] 最近，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)蛋白質(zhì)科學(xué)中的全新技術(shù)，其能夠克服與蛋白質(zhì)的位點(diǎn)特異性 修飾和重組型細(xì)胞因子的結(jié)合相關(guān)的多種局限性。具體地說(shuō)，已將新的組分加入到原核 生物大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli)(例如參見 L.王（L. Wang)等人，（2001)， 科學(xué)（Science) 292:498-500)和真核生物釀酒酵母菌（Sacchromyces cerevisia， S. cerevisiae)(例如J.秦（J. Chin)等人，科學(xué)301:964-7 (2003))的蛋白質(zhì)生物合成機(jī) 器中，使得所述機(jī)器能夠在活體內(nèi)將非基因編碼氨基酸并入蛋白質(zhì)中。已經(jīng)使用此方法將 多種具有新穎化學(xué)、物理或生物學(xué)特性的新氨基酸，包括光親和力分類和可光異構(gòu)化氨基 酸、光交聯(lián)氨基酸（參見例如J. W.秦等人(2002)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊,99:11020-11024 ； 和J. W.秦等人，(2002)美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志（T. Am. Chem. Soc.) 124:9026-9027)、酮氨基 酸、含有重原子氨基酸和糖基化氨基酸有效地且高保真地并入大腸桿菌中和酵母中響應(yīng) 于琥珀密碼子（TAG)的蛋白質(zhì)中。參見例如J.W.秦等人，(2002),美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)期刊 (Journal of the American Chemical Society) 124:9026-9027 ;J.W.秦和 P.G.舒爾 茨（P. G. Schultz), (2002),化學(xué)牛物化學(xué)（ChemBioChem) 3 (11) :1135-1137 :T.W. Chin 等 人，(2002),美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊（PNAS United States of America) 99:11020-11024 ;以 及L Wang和R G. Schultz, (2002),化學(xué)通訊(Chem. Comm.), 1:1-11，所有參考文獻(xiàn)均以全 文引用的方式并入本文中。這些研究已經(jīng)表明，有可能選擇性地并且常規(guī)地引入例如酮基、 炔基和疊氮基部分等化學(xué)官能團(tuán)，這些化學(xué)官能團(tuán)未發(fā)現(xiàn)于蛋白質(zhì)中，對(duì)20種常見的基因 編碼的氨基酸中所發(fā)現(xiàn)的所有官能團(tuán)呈化學(xué)惰性并且可以用于有效地并且選擇性地反應(yīng) 以形成穩(wěn)定共價(jià)鍵。
[0024] 將非基因編碼的氨基酸并入到蛋白質(zhì)中的能力允許引入可提供天然存在的官能 團(tuán)的有價(jià)值的替代物的化學(xué)官能團(tuán)，例如賴氨酸的ε -NH2、半胱氨酸的硫氫基-SH、組氨酸 的亞氨基等。已知某些化學(xué)官能團(tuán)對(duì)見于20種常見的基因編碼氨基酸中的官能團(tuán)是惰性 的但簡(jiǎn)潔有效地反應(yīng)以形成穩(wěn)定的鍵。例如，此項(xiàng)技術(shù)中已知疊氮化合物和乙炔群在催化 量的銅存在的情況下，在水性條件下進(jìn)行胡伊斯根（Huisgen) [3+2]環(huán)加成反應(yīng)。參見例如 托爾諾（Tornoe)等人，(2002)有機(jī)化學(xué)雜志（T. Org. Chem.) 67: 3057-3064 ;和羅斯托夫采 夫（Rostovtsev)等人，(2002)應(yīng)用化學(xué)國(guó)際版（Angew. Chem. Int. Ed.)41:2596-2599。通 過(guò)將疊氮部分引入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，例如能夠并入官能團(tuán)，所述官能團(tuán)對(duì)見于蛋白質(zhì)中的胺、 硫氫基、羧酸、羥基化學(xué)上惰性，但也與乙炔部分順利并有效地反應(yīng)以形成環(huán)加成產(chǎn)物。重 要的是，在不存在乙炔部分的情況下，疊氮基仍保留化學(xué)惰性，而且在其它蛋白質(zhì)側(cè)鏈存在 時(shí)在生理?xiàng)l件下不發(fā)生反應(yīng)。
[0025] 本發(fā)明尤其解決與IL-3多肽結(jié)合物的活性和產(chǎn)生有關(guān)的問(wèn)題，并且還解決具有 改良的生物或藥理學(xué)特性（如增強(qiáng)的針對(duì)腫瘤的活性和/或改良的結(jié)合和/或改良的治療 半衰期）的IL-3多肽的產(chǎn)生。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0026] 本發(fā)明涉及具有一或多個(gè)非天然編碼氨基酸的白細(xì)胞介素-3(IL_3)多肽。本發(fā) 明更涉及具有一或多個(gè)非天然編碼氨基酸的IL-3多肽結(jié)合物。本發(fā)明更涉及IL-3多肽結(jié) 合物，其中毒素通過(guò)IL-3變異體內(nèi)的一或多個(gè)非天然編碼氨基酸結(jié)合于IL-3變異體。
[0027] 本發(fā)明提供抑制或減少腫瘤或癌癥增長(zhǎng)的方法，其包含用有效量的本發(fā)明IL-3 多肽接觸所述腫瘤。本發(fā)明提供抑制或減少腫瘤或癌癥增長(zhǎng)的方法，其包含用有效量的本 發(fā)明聚乙二醇化IL-3(PEG-IL-3)多肽接觸所述腫瘤。在一個(gè)實(shí)施例中，PEG-IL-3為單聚 乙二醇化PEG-IL-3。在一個(gè)實(shí)施例中，PEG-IL-3為雙聚乙二醇化PEG-IL-3。在一個(gè)實(shí)施 例中，PEG-IL-3上連接有兩個(gè)（2)以上聚（乙）二醇分子。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例提供使 用本發(fā)明的TOG-IL-3多肽調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例提供靶向白細(xì)胞 介素-3受體表達(dá)細(xì)胞并且具體地說(shuō)，通過(guò)使用結(jié)合于毒素的白細(xì)胞介素_3 (IL-3)變異體 來(lái)抑制所述細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述毒素將影響表達(dá)白細(xì)胞介素-3受體的細(xì)胞。
[0028] 本發(fā)明的IL-3多肽和PEG-IL3多肽可用于治療由造血系統(tǒng)中骨髓、紅細(xì)胞、淋巴 或巨核細(xì)胞中的任一種或其組合的含量減少表征的疾病。另外，其可用于活化成熟骨髓和 /或淋巴細(xì)胞。對(duì)本發(fā)明的多肽治療敏感的病狀包括白細(xì)胞減少癥，即外周血液中循環(huán)白 細(xì)胞（白細(xì)胞）的數(shù)目減少。白細(xì)胞減少癥可由暴露于某些病毒或輻射引起。其通常是不 同形式的癌癥療法（例如暴露于化學(xué)治療藥物）和感染或出血的副作用。用本發(fā)明的這些 IL-3和PEG-IL3多肽進(jìn)行白細(xì)胞減少癥的治療性處理可以避免由當(dāng)前可用藥物治療引起 的不良副作用。
[0029] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的IL-3多肽結(jié)合于毒素。與某些正常造血細(xì)胞相比， IL-3受體在多種血液癌癥（包括AML、B細(xì)胞急性淋巴球性白血?。˙-ALL)、毛狀細(xì)胞白血 病、霍奇金氏病以及某些侵襲性非霍奇金氏淋巴瘤（穆諾茲，血液學(xué)86:1261-1269, 2001 ; 羅西妮，淋巴瘤46:303-311，2005;特斯塔，白血病18:219-226, 2004))以及AML的癌 癥干細(xì)胞、骨髓發(fā)育不良綜合癥（MDS)、T細(xì)胞ALL(T-ALL)和慢性骨髓白血?。–ML)(參 見喬丹等人"白細(xì)胞介素-3受體α鏈?zhǔn)侨祟惣毙怨撬栊园籽「杉?xì)胞的獨(dú)特標(biāo)記"，白 血病14:1777-1784(2000);弗洛里安等人"不同骨髓惡性病中⑶34+/⑶38-干細(xì)胞表面 上分子目標(biāo)的檢測(cè)"淋巴瘤47:207-222 (2006);萊爾米特等人"大部分未成熟T-ALL表達(dá) Ra-IL3 (CD123) :DT-IL3#療法的可能目標(biāo)"，20:1908-1910 (2006);和赫格等人"具有增加 的受體親和力的變異型白喉毒素-白細(xì)胞介素-3結(jié)合物具有增強(qiáng)的針對(duì)急性骨髓白血病 祖細(xì)胞的細(xì)胞毒性"，臨床癌癥研究12:1284-1291(2004))中過(guò)度表達(dá)。本發(fā)明的IL-3和 結(jié)合于毒素（包含但不限于腫瘤學(xué)技術(shù)中已知的毒素和白喉毒素（DPT))的IL-3多肽是用 于治療癌細(xì)胞和/或用于治療IL-3表達(dá)腫瘤細(xì)胞。
[0030] 本發(fā)明的一些實(shí)施例是針對(duì)抑制白細(xì)胞介素-3受體表達(dá)細(xì)胞的方法，其包含投 與需要此類抑制的人類醫(yī)藥組合物，所述醫(yī)藥組合物包含可有效抑制所述細(xì)胞的量的人類 白細(xì)胞介素-3-毒素結(jié)合物和藥學(xué)上可接受的載劑，其條件是白細(xì)胞介素_3受體表達(dá)細(xì)胞 不是急性骨髓白血病細(xì)胞，并且其中細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞介素-3受體的α子單元和β子單 元。本發(fā)明的一些實(shí)施例是針對(duì)結(jié)合物，其是IL-3/白喉毒素結(jié)合物。在本發(fā)明的一個(gè)方 面中，抑制白細(xì)胞介素-3受體表達(dá)細(xì)胞的生長(zhǎng)。在本發(fā)明的這一實(shí)施例或任一實(shí)施例中， 白細(xì)胞介素-3-毒素結(jié)合物可包含通過(guò)與毒素的共價(jià)鍵連接的全長(zhǎng)成熟（缺乏信號(hào)肽）人 類白細(xì)胞介素-3。優(yōu)選的是毒素由于細(xì)胞表面結(jié)合域缺失而經(jīng)修飾。例如，結(jié)合物是化學(xué) 結(jié)合物，其中例如白喉毒素部分（白喉毒素的催化和易位結(jié)構(gòu)域）與白細(xì)胞介素-3部分是 直接或通過(guò)化學(xué)連接基團(tuán)化學(xué)連接在一起。任選地，結(jié)合物是基因重組型，其中結(jié)合物表達(dá) 為單一多膚。
[0031] 在這一實(shí)施例的特定方面中，結(jié)合物可按每天4微克/千克或更大的劑量投與。在 其它方面中，結(jié)合物可按每天約4微克/千克到每天約20微克/千克范圍內(nèi)的劑量投與。 在其它方面中，結(jié)合物可按每天約4微克/千克到每天約9微克/千克范圍內(nèi)的劑量投與。 在其它方面中，結(jié)合物可按每天約4微克/千克到每天約12. 5微克/千克范圍內(nèi)的劑量投 與。在這一實(shí)施例的特定方面中，結(jié)合物可按每天約5. 3微克/千克的劑量或每天約7. 1微 克/千克的劑量或每天約9. 4微克/千克的劑量或每天約12. 5微克/千克的劑量投與。在 特定方面中，結(jié)合物可按無(wú)不當(dāng)毒性情況下的最大耐受劑量或低于所述劑量的劑量投與。 另外，結(jié)合物可每周投與至少兩次或結(jié)合物可每周投與至少三次、每周至少四次、每周至少 五次、每周至少六次或每周至少七次。在特定方面中，當(dāng)結(jié)合物投與超過(guò)一次時(shí)，結(jié)合物每 次可按每天4微克/千克或更大的劑量投與。具體地說(shuō)，結(jié)合物可在一周或兩周或更長(zhǎng)的 時(shí)段內(nèi)投與。在抑制白細(xì)胞介素-3受體表達(dá)細(xì)胞的生長(zhǎng)的方面中，與參考樣品，即未與本 發(fā)明的結(jié)合物接觸的細(xì)胞樣品相比，可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)至少50 %、至少65 %、至少75 %、至 少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%。
[0032] 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明是針對(duì)抑制白細(xì)胞介素-3受體表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)的方法， 其包含投與需要此類抑制的人類醫(yī)藥組合物，所述醫(yī)藥組合物包含可有效抑制所述細(xì)胞的 量的白細(xì)胞介素-3-毒素結(jié)合物和藥學(xué)上可接受的載劑，其中結(jié)合物是按每天超過(guò)4微克/ 千克的劑量投與，并且其中細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞介素-3受體的α子單元。在這一實(shí)施例的一 方面中，細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞介素-3受體的α子單元和β子單元。
[0033] 本發(fā)明的IL-3和PEG-IL3多肽可適用于治療嗜中性白血球減少癥和例如治療如 再生障礙性貧血、環(huán)狀嗜中性白血球減少癥、特發(fā)性嗜中性白血球減少癥、先天性白細(xì)胞顆 粒異常綜合征（Chdiak-Higashi syndrome)、全身性紅斑性狼瘡癥（SLE)、白血病、骨髓發(fā)育 不良綜合癥和骨髓纖維化等病狀。
[0034] 多種藥物可引起骨髓抑制或造血不足。此類藥物的實(shí)例是AZT、DDI、烷基化劑以及 用于化學(xué)療法的抗代謝劑、抗生素（如氯氨苯醇、青霉素和磺胺藥）、吩噻嗪酮、鎮(zhèn)靜劑（如 安寧（meprobamate))以及利尿劑。本發(fā)明的IL-3和PEG-IL3多肽可適用于預(yù)防或治療通 常在經(jīng)這些藥物治療的患者中發(fā)生的骨髓抑制或造血不足。
[0035] 造血不足也可以因病毒、微生物或寄生蟲感染和因腎臟疾病或腎衰竭的治療（例 如透析）而發(fā)生。本發(fā)明的IL-3和PEG-IL3多肽可適用于治療此類造血不足。
[0036] 造血不足的治療可包括向患者投與含有IL-3和/或PEG-IL3多肽的醫(yī)藥組合物 中的IL-3和/或PEG-IL3多肽。本發(fā)明的IL-3和/或PEG-IL3多肽也可以適用于通過(guò)用 本發(fā)明的突變蛋白質(zhì)試管內(nèi)處理造血前驅(qū)體細(xì)胞，隨后將這些細(xì)胞注射到患者中來(lái)實(shí)現(xiàn)造 血前驅(qū)體細(xì)胞的活化和擴(kuò)增。
[0037] 本發(fā)明的IL-3和PEG-IL3多肽治療也可以有利地影響多種免疫缺乏癥（例如在 T和/或B淋巴細(xì)胞中）或免疫病癥（例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）。免疫缺乏癥可以由病毒性 感染（例如HTLVI、HTLVII、HTLVIII)、過(guò)度暴露于輻射、癌癥療法或由其它醫(yī)學(xué)治療引起。 本發(fā)明的IL-3和/或PEG-IL3多肽也可以單獨(dú)或與其它促紅細(xì)胞生成素組合用于治療其 它血液細(xì)胞不足，包括血小板減少（血小板不足）或貧血。這些新型多肽的其它用途在于 活體內(nèi)和活體外治療從骨髓移植恢復(fù)的患者以及開發(fā)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)診斷或治療用途方法產(chǎn)生 的單株和多株抗體。
[0038] 本發(fā)明的其它方面是用于治療上述病狀的方法和治療性組合物。此類組合物包含 治療有效量的一或多種本發(fā)明的IL-3和/或PEG-IL3多肽與藥學(xué)上可接受的載劑的混合 物。這一組份可以非經(jīng)腸、靜脈內(nèi)或皮下投與。在投與時(shí)，本發(fā)明中使用的治療組合物優(yōu)選 呈無(wú)熱原質(zhì)、非經(jīng)腸可接受水性溶液形式。此類非經(jīng)腸可接受蛋白質(zhì)溶液的制備（考慮pH 值、等滲性、穩(wěn)定性等方面）屬于此項(xiàng)技術(shù)的技能范圍。
[0039] 涉及用于治療上述病狀的方法的給藥方案將由主治醫(yī)師視不同因素而確定，所述 不同因素改變藥物的作用，例如患者的病狀、體重、性別和膳食、任何感染嚴(yán)重性、投藥時(shí)間 和其它臨床因素。通常，日療程可在每千克體重0.2-150微克/千克非糖基化IL-3蛋白質(zhì) 范圍內(nèi)。這一給藥方案是參考標(biāo)準(zhǔn)生物活性水準(zhǔn)，其識(shí)別原生IL-3在本文中所描述的AML 增殖分析法中通常具有10皮摩爾到100皮摩爾或約10皮摩爾到100皮摩爾的EC5(I。因此， 將關(guān)于既定突變蛋白質(zhì)活性對(duì)比原生（參考）IL-3活性來(lái)調(diào)節(jié)劑量并且應(yīng)注意劑量方案可 包括低到每天每千克體重〇. 1微克和高到每天每千克體重1毫克的劑量。此外，可能存在 IL-3和/或PEG-IL3多肽的劑量調(diào)節(jié)到高于或低于每千克體重10-200微克范圍的特定情 形。這些情形包括與其它CSF或生長(zhǎng)因子共同投與；與化學(xué)治療藥物和/或輻射共同投與； 以及本章節(jié)中早先提到的不同患者相關(guān)問(wèn)題。如上文所指出，治療方法和組合物還可包含 與其它人類因子共同投與。用于與本發(fā)明的多肽同時(shí)或依序共同投與的其它合適促紅細(xì) 胞生成素、CSF和白細(xì)胞間介素包括GM-CSF、CSF-1、G-CSF、Meg-CSF、Μ-CSF、紅血球生成素 (ΕΡ0)、IL-1、IL-4、IL-2、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、LIF、B 細(xì)胞、成長(zhǎng)因 子、B細(xì)胞分化因子和嗜酸性細(xì)胞分化因子、干細(xì)胞因子（SCF)(也稱為青灰因子或c套組 配體）或其組合。將調(diào)節(jié)上述劑量以補(bǔ)償治療組合物中的此類額外組分。可以通過(guò)血液概 況（例如分化細(xì)胞計(jì)數(shù)等）的周期性評(píng)估來(lái)監(jiān)測(cè)所治療患者的進(jìn)展。
[0040] 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的IL-3和/或PEG-IL-3多肽調(diào)節(jié)至少一種發(fā)炎性細(xì) 胞因子的表達(dá)，所述細(xì)胞因子可以選自由以下各者組成的群組：IFN. γ、IL-4、IL-6、IL-3 和RANK-配體（RANK-L)。在某些實(shí)施例中，PEG-IL-3結(jié)合于至少一種化學(xué)治療劑?；瘜W(xué)治療 劑可以選自由以下各者組成的群組：替莫唑胺（temozolomide)、吉西他濱（gemictabine)、 多柔比星（doxorubicin)、IFN-a。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，PEG-IL-3與以下各者之一共 同投與：替莫唑胺（劑量5mg-250mg);吉西他濱（200mg-lg);多柔比星（lmg/m 2-50mg/m2); 干擾素 -a (lyg/kg-300yg/kg)。在某些實(shí)施例中，腫瘤或癌癥選自由以下各者組成的群 組：結(jié)腸癌、卵巢癌、乳癌、黑色素瘤、肺癌、神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤和白血病。
[0041] 本發(fā)明還涉及一種用于治療哺乳動(dòng)物中急性白血病的方法，其包含向所述哺乳動(dòng) 物投與治療有效量的本發(fā)明的IL-3和/或PEG-IL3多肽。本發(fā)明還提供抑制急性白血病 母細(xì)胞增殖的方法，其包含投與罹患急性白血病的哺乳動(dòng)物治療有效劑量的本發(fā)明的IL-3 和/或PEG-IL3多肽。
[0042] 本發(fā)明還提供治療哺乳動(dòng)物中的急性白血病的方法，其包含投與所述哺乳動(dòng)物治 療有效量的本發(fā)明的IL-3和/或PEG-IL3多肽，其中IL-3和/或PEG-IL3多肽對(duì)急性白 血病母細(xì)胞具有在白細(xì)胞介素-3投與停止之后持續(xù)的抗增殖作用。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明的方法，待治療的急性白血病可能是骨髓細(xì)胞白血?。ㄈ缂毙怨撬栊?白血?。ˋML))或B細(xì)胞白血?。ㄈ缂毙粤馨颓蛐园籽。ˋLL))。所投與的IL-3可以選 自由以下組成的群組：白細(xì)胞介素-3與一或多個(gè)非天然編碼氨基酸和白細(xì)胞介素_3多肽 結(jié)合物。本發(fā)明的另一實(shí)施例是針對(duì)抑制白細(xì)胞介素-3受體表達(dá)細(xì)胞的方法，其包含向需 要所述抑制的人投與醫(yī)藥組合物，所述醫(yī)藥組合物包含可有效抑制所述細(xì)胞的量的人類白 細(xì)胞介素-3-白喉毒素結(jié)合物和藥學(xué)上可接受的載劑，其條件是白細(xì)胞介素_3受體表達(dá)細(xì) 胞不是急性骨髓白血病細(xì)胞，并且其中細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞介素-3受體的α子單元和β子單 元。在這一實(shí)施例之優(yōu)選方面中，抑制白細(xì)胞介素-3受體表達(dá)細(xì)胞的生長(zhǎng)。
[0044] 在本發(fā)明的這一或任一實(shí)施例中，白細(xì)胞介素-3-毒素（IL3_t)結(jié)合物可包含連 接到毒素的全長(zhǎng)、成熟（缺乏信號(hào)肽）、人類白細(xì)胞介素-3。在本發(fā)明的這一或任一實(shí)施例 中，白細(xì)胞介素-3-毒素（IL3-t)結(jié)合物可包含通過(guò)共價(jià)鍵連接到毒素的全長(zhǎng)、成熟（取法 信號(hào)肽）、人類白細(xì)胞介素-3。在一些實(shí)施例中，毒素經(jīng)修飾，作為非限制性實(shí)例，毒素可包 括一或多個(gè)非天然編碼氨基酸。
[0045] 適合的毒素或細(xì)胞毒性劑可以是例如奧瑞他?。╝uristatin)、DNA小溝結(jié)合 齊[J、DNA小溝燒化劑、烯二炔、萊希菌素（lexitropsin)、倍癌霉素（duocarmycin)、紫杉燒 (taxane)、噪呤霉素（puromycin)、海兔毒素（dolastatin)、類美登素（maytansinoid)和 長(zhǎng)春花（vinca)生物堿。在特定實(shí)施例中，細(xì)胞毒性劑是AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB、奧 瑞他汀E、太平洋紫杉醇、多西他賽、CC-1065、SN-38、拓樸替康（topotecan)、嗎啉基-多 柔比星、根霉素、氰基嗎啉基-多柔比星、海兔毒素-10、棘霉素（echinomycin)、考布他 汀（combretatstatin)、卡里奇霉素（chalicheamicin)、美登素（maytansine)、DM-1 或 紡錘菌素（netropsin)。其它適合的細(xì)胞毒性劑包括抗微管蛋白劑，如奧瑞他汀、長(zhǎng)春 花生物堿、鬼曰毒素（podophyllotoxin)、紫杉燒、巴卡亭（baccatin)衍生物、念珠藻素 (cryptophysin)、類美登素、考布他汀或海兔毒素。在特定實(shí)施例中，抗微管蛋白劑是AFP、 MMAF、MMAE、AEB、AEVB、奧瑞他汀 E、長(zhǎng)春新喊（vincristine)、長(zhǎng)春喊（vinblastine)、長(zhǎng) 春地辛（￥；[11(168；[116)、長(zhǎng)春瑞賓（￥；[110代113；[116)、/?-16、喜樹堿（03115)1：01：1160；[11)、紫杉醇、 多烯紫杉醇、埃坡霉素 A(epothilone A)、埃坡霉素 B、諾考達(dá)唑（nocodazole)、秋水仙堿 (colchicines)、秋水醜胺（colcimid)、雌莫司?。╡stramustine)、西馬多?。╟emadotin)、 迪斯德莫來(lái)（discodermolide)、美登素、DM-1或艾槽塞洛素（eleutherobin)。
[0046] 在IL-3和PEG-IL3藥物結(jié)合物中，IL-3和PEG-IL3藥物結(jié)合物可以直接或通過(guò) 連接基團(tuán)結(jié)合到毒素。合適的連接基團(tuán)包括例如可裂解和非可裂解連接基團(tuán)?？闪呀膺B接 基團(tuán)通常對(duì)胞內(nèi)條件下的裂解敏感。適合的可裂解連接基團(tuán)包括例如可由胞內(nèi)蛋白酶（如 溶酶體蛋白酶或內(nèi)體蛋白酶）裂解的肽連接基團(tuán)。在例示性實(shí)施例中，連接基團(tuán)可以是二 肽連接基團(tuán)，如纟顏氨酸-瓜氨酸（val-cit)或苯丙氨酸-賴氨酸（phe-lys)連接基團(tuán)。其 它適合的連接基團(tuán)包括可在小于5. 5的pH值下水解的連接基團(tuán)，如腙連接基團(tuán)。額外適合 的可裂解連接基團(tuán)包括二硫連接基團(tuán)。IL-3或PEG-IL3藥物結(jié)合物可靶向IL-3受體表達(dá) 細(xì)胞并且可以調(diào)節(jié)劑量和/或毒性。作為非限制性實(shí)例，IL-3或PEG-IL3結(jié)合物可以是化 學(xué)結(jié)合物，其中白喉毒素部分（白喉毒素的催化和易位結(jié)構(gòu)域）與白細(xì)胞介素-3部分直接 或通過(guò)化學(xué)連接基團(tuán)以化學(xué)方式連接在一起。
[0047] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的IL-3多肽、PEG-IL3多肽、IL-3-毒素結(jié)合物和 PEG-IL3-毒素結(jié)合物用于癌癥的過(guò)繼性免疫療法。本發(fā)明還包括用于過(guò)繼性免疫療法的 醫(yī)藥組合物，其包含IL-3多肽、PEG-IL3多肽、IL-3-毒素結(jié)合物和PEG-IL3-毒素結(jié)合物。 本發(fā)明部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：IL-3可以預(yù)防或減少細(xì)胞因子產(chǎn)生，所述細(xì)胞因子被認(rèn)為是 造成目前過(guò)繼性免疫療法中遇到的許多有害副作用的原因。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"過(guò)繼性免 疫療法"意味著涉及將對(duì)抗功能性癌癥的免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)移到患者中的療法。優(yōu)選地，對(duì)抗癌 癥的免疫細(xì)胞包含源自患者本身的腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（TIL)。廣義上，本發(fā)明的方法包 含以下步驟：（i)在存在IL-2和IL-3的情況下培養(yǎng)TIL，（ii)向患者投與經(jīng)培養(yǎng)的TIL， 和（iii)在投與TIL之后向患者投與IL-2和IL-3。這些化學(xué)物質(zhì)和方法描述于貝爾托齊 (Bertozzi)申請(qǐng)案美國(guó)公開案第20090068738號(hào)，其以全文引用的方式并入本文中。
[0048] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，IL-3多肽、PEG-IL3多肽、IL-3-毒素結(jié)合物和 PEG-IL3-毒素結(jié)合物是用于抑制移植組織的排斥作用。本發(fā)明還包括包含白細(xì)胞介素-3 的醫(yī)藥組合物。
[0049] 在一些實(shí)施例中，投與本發(fā)明的IL-3多肽、PEG-IL3多肽、IL-3-毒素結(jié)合物和 PEG-IL3-毒素結(jié)合物可以抑制腫瘤誘導(dǎo)的血管生成和/或促進(jìn)腫瘤毒性分子[例如氧化氮 (N0)]的產(chǎn)生，其在一或多種臨床前模型中引起腫瘤消退。
[0050] 在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的方法涉及投與白喉毒素（DT)結(jié)合物（DT-IL3)以便抑 制人類中癌細(xì)胞和/或癌癥干細(xì)胞的生長(zhǎng)，這些細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞介素-3受體的一或多個(gè)子 單元。例示性細(xì)胞包括骨髓白血病癌癥干細(xì)胞。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的方法涉及骨髓 或外周血液的離體凈化，以便移除表達(dá)白細(xì)胞介素-3受體的一或多個(gè)子單元的細(xì)胞，使得 經(jīng)過(guò)凈化的骨髓或外周血液適于例如自體干細(xì)胞移植以便恢復(fù)造血功能。
[0051] 本發(fā)明提供治療哺乳動(dòng)物中的癌癥的方法，例如哺乳動(dòng)物包括（但不限于）患 有以下病狀中的一或多種的哺乳動(dòng)物：結(jié)腸癌、卵巢癌、乳癌、黑素瘤、肺癌、神經(jīng)膠母細(xì) 胞瘤和白血病，其通過(guò)投與有效量的IL-3多肽、PEG-IL3多肽、IL-3-毒素結(jié)合物和/或 PEG-IL3-毒素結(jié)合物。
[0052] 如本文所使用，白細(xì)胞介素3或IL-3定義為一種蛋白質(zhì)，其（a)具有與IL-3的 已知序列實(shí)質(zhì)上一致的氨基酸序列，包括名稱為"使用突變?nèi)祟惏准?xì)胞介素-3(IL-3)多肽 的治療方法（Therapeutic methods employing mutant human interleukin-3 (IL-3)多 肽）"的美國(guó)專利第6,017, 523號(hào)，保爾（Bauer)等人中描述的IL-3突變蛋白質(zhì)，其以全 文引用的方式併入本文中；成熟IL-3序列（即缺乏分泌性前導(dǎo)序列）和如本申請(qǐng)的SEQ ID N0:l-3中揭示的IL-3,和（b)具有至少一種與原生IL-3共有的生物活性。出于本發(fā)明的 目的，糖基化（例如在如酵母或CH0細(xì)胞的真核細(xì)胞中產(chǎn)生）和未糖基化（例如以化學(xué)方 式合成或在大腸桿菌中產(chǎn)生）的IL-3是等效物并且可以互換使用。還包括其它突變體和 其它類似物，包括病毒IL-3,其保留IL-3的生物活性。
[0053] 優(yōu)選的是，本發(fā)明的白細(xì)胞介素-3是選自由以下組成的群組：由以下氨基酸序列 定義的開放式閱讀框的成熟多肽：Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gin Leu Leu Val Arg Pro Gly Leu Gin Ala Pro Met Thr Gin Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp Val Asn Cys Ser Asn Met lie Asp Glu lie lie Thr His Leu Lys Gin Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn lie Asn Gly Glu Asp Gin Asp lie Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Ala Phe Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gin Asn Asn Ala Ser Ala lie Glu Ser lie Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr Arg His Pro lie His lie Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gin Ala Gin Gin Thr Thr Leu Ser Leu Ala lie Phe (SEQ ID NO:1)，和 Ala Pro Met Thr Gin Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp Val Asn Cys Ser Asn Met lie Asp Glu lie lie Thr His Leu Lys Gin Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn He Asn Gly Glu Asp Gin Asp lie Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Ala Phe Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gin Asn Asn Ala Ser Ala lie Glu Ser lie Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr Arg His Pro lie His He Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gin Ala Gin Gin Thr Thr Leu Ser Leu Ala lie Phe (SEQ ID N0:2)，和Met Ala Pro Met Thr Gin Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp Val Asn Cys Ser Asn Met lie Asp Glu lie lie Thr His Leu Lys Gin Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn lie Asn Gly Glu Asp Gin Asp He Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Ala Phe Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gin Asn Asn Ala Ser Ala lie Glu Ser lie Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr Arg His Pro lie His He Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gin Ala Gin Gin Thr Thr Leu Ser Leu Ala lie Phe (SEQ ID NO:3), 其中標(biāo)準(zhǔn)三字母縮寫是用于表示L-氨基酸，從N端開始。
[0054] 本發(fā)明提供包含一或多個(gè)非天然編碼氨基酸的白細(xì)胞介素3 (IL-3)多肽。本發(fā)明 提供白細(xì)胞介素3(IL_3)多肽，其包含結(jié)合到毒素的一或多個(gè)非天然編碼氨基酸。本發(fā)明 提供包含一或多個(gè)非天然編碼氨基酸的聚乙二醇化白細(xì)胞介素3(IL-3)多肽。本發(fā)明提 供結(jié)合到毒素的白細(xì)胞介素3 (IL-3)多肽，其包含一或多種水溶性聚合物，其中IL-3多肽 包含一或多個(gè)非天然編碼氨基酸。本發(fā)明提供結(jié)合到一或多種水溶性聚合物的白細(xì)胞介素 3 (IL-3)多肽，其中聚乙二醇化IL-3多肽也連接到毒素并且其中IL-3多肽包含一或多個(gè)非 天然編碼氨基酸。本發(fā)明還提供IL-3多肽的單體和二聚物。本發(fā)明還提供IL-3多肽的三 聚物。本發(fā)明提供IL-3多肽的多聚物。本發(fā)明還提供包含一或多個(gè)非天然編碼氨基酸的 IL-3二聚物。本發(fā)明提供包含一或多個(gè)非天然編碼氨基酸的IL-3多聚物。本發(fā)明提供同 源IL-3多聚物，其包含一或多個(gè)非天然編碼氨基酸，其中每個(gè)IL-3多肽具有相同的氨基酸 序列。本發(fā)明提供異源IL-3多聚物，其中至少一個(gè)IL-3多肽包含至少一個(gè)非天然編碼氨 基酸，其中多聚物中的任一個(gè)或每一個(gè)IL-3多肽可以具有不同的氨基酸序列。
[0055] 在一些實(shí)施例中，IL-3多肽包含一或多種翻譯后修飾。在一些實(shí)施例中，IL-3多 肽與連接基團(tuán)、聚合物或生物活性分子連接。在一些實(shí)施例中，IL-3單體是同源的。在一些 實(shí)施例中，IL-3二聚物是同源的。在一些實(shí)施例中，IL-3多聚物結(jié)合到一種水溶性聚合物 上。在一些實(shí)施例中，IL-3多聚物結(jié)合到兩種水溶性聚合物。在一些實(shí)施例中，IL-3多聚 物結(jié)合到三種水溶性聚合物。在一些實(shí)施例中，IL-3多聚物結(jié)合到三種以上水溶性聚合物 上。在一些實(shí)施例中，其中IL-3多肽與長(zhǎng)度足夠允許形成二聚物的連接基團(tuán)連接。在一些 實(shí)施例中，其中IL-3多肽與長(zhǎng)度足夠允許形成三聚物的連接基團(tuán)連接。在一些實(shí)施例中， 其中IL-3多肽與長(zhǎng)度足夠允許形成多聚物的連接基團(tuán)連接。在一些實(shí)施例中，IL-3多肽 與雙官能聚合物、雙官能連接基團(tuán)或至少一種其它IL-3多肽連接。在一些實(shí)施例中，IL-3 多肽包含一或多個(gè)翻譯后修飾。在一些實(shí)施例中，IL-3多肽與連接基團(tuán)、聚合物或生物活 性分子連接。
[0056] 在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸連接到水溶性聚合物。在一些實(shí)施例中，水溶 性聚合物包含聚（乙二醇）（PEG)部分。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸通過(guò)連接基團(tuán) 與水溶性聚合物連接或與水溶性聚合物鍵接。在一些實(shí)施例中，聚（乙二醇）分子是一種 雙官能聚合物。在一些實(shí)施例中，雙官能聚合物與第二多肽連接。在一些實(shí)施例中，第二多 肽是IL-3。在一些實(shí)施例中，IL-3或其變異體包含至少兩個(gè)與包含聚（乙二醇）部分的水 溶性聚合物連接的氨基酸。在一些實(shí)施例中，至少一個(gè)氨基酸是非天然編碼氨基酸。
[0057] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的IL-3或PEG-IL3連接到治療劑，如細(xì)胞毒性劑。細(xì)胞 毒性劑可以是任何對(duì)癌細(xì)胞發(fā)揮治療作用的藥劑或可以用作治療劑以用于結(jié)合到IL-3、 PEG-IL3或IL-3變異體的活性免疫細(xì)胞（參見例如W02004/010957, "藥物結(jié)合物和其用 于治療癌癥、自體免疫疾病或感染性疾病的用途（Drug Conjugates and Their Use for Treating Cancer, An Autoimmune Disease or an Infectious Disease)，'。
[0058] 適用類別之細(xì)胞毒性劑或免疫抑制劑包括例如抗微管蛋白劑、奧瑞他汀、DNA小溝 結(jié)合劑、DNA復(fù)制抑制劑、烷化劑（例如鉬復(fù)合物，如順式-鉬、單（鉬）、雙（鉬）及三-核 鉬復(fù)合物及卡鉬）、蒽環(huán)霉素、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝物、化學(xué)治療增感劑、倍癌霉素、依 --泊苷（etoposide)、氟化啼陡、離子載體、萊克希托普森（lexitropsin)、亞硝基脲、順氯 氨鉬（platinol)、預(yù)形成化合物、噪呤抗代謝物、噪呤霉素（puromycin)、福射增感劑、類固 醇、紫杉烷、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、長(zhǎng)春花生物堿或其類似物。
[0059] 個(gè)別細(xì)胞毒素或免疫抑制藥劑包括例如男性荷爾蒙、安曲霉素（anthramycin) (AMC)、天冬酰胺酶、5-氮雜胞苷、硫唑噪呤、博萊霉素（bleomycin)、白消安（busulfan)、 丁硫氨酸磺酰亞胺（buthionine sulfoximine)、喜樹堿（camptothecin)、卡鉬 (carboplatin)、卡莫司汀（carmustine) (BSNU)、CC-1065、苯丁酸氮芥、順鉬、秋水仙喊 (colchicine)、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷（cytarabine)、胞啼陡核苷（cytidine)、阿拉伯糖 昔（arabinoside)、細(xì)胞松她素 B(cytochalasin B)、達(dá)卡巴嚷（dacarbazine)、更生霉素 (dactinomycin)(以前是放射菌素（actinomycin))、道諾霉素（daunorubicin)、達(dá)卡巴 嗪（decarbazine)、多西他賽、多柔比星、雌激素、5-氟脫氧尿苷、5-氟尿啼陡、短桿菌肽 D(gramicidin D)、輕基脲、艾達(dá)霉素（idarubicin)、異環(huán)磷酰胺、伊立替康（irinotecan)、 洛莫司?。╨omustine) (CCNU)、雙氯乙基甲胺、美法侖、6-巰基嘌呤、甲胺喋呤、光神霉素 (mithramycin)、絲裂霉素 C(mitomycin C)、米托蒽醌（mitoxantrone)、硝基咪唑、太平洋紫 杉醇、普卡霉素（plicamycin)、丙卡巴肼（procarbizine)、鏈佐霉素（streptozotocin)、特 諾波賽（tenoposide)、6_硫鳥噪呤、噻替派（thioTEPA)、拓樸替康、長(zhǎng)春堿（vinblastine)、 長(zhǎng)春新喊（vincristine)、長(zhǎng)春瑞賓（vinorelbine)、VP_16 和 VM-26。
[0060] 在一些典型實(shí)施例中，治療劑是細(xì)胞毒性劑。合適的細(xì)胞毒性劑包括例如海兔 毒素（例如奧瑞他汀E、AFP、MMAF、MMAE)、DNA小溝結(jié)合劑（例如烯二炔和萊克希托普森 (lexitropsins))、倍癌霉素（duocarmycins)、紫杉燒（例如太平洋紫杉醇和多西他賽）、噪 呤霉素、長(zhǎng)春花生物堿、CC-1065、SN-38、拓樸替康、嗎啉基-多柔比星、根霉素（rhizoxin)、 氰基-嗎啉基-多柔比星、棘霉素（echinomycin)、考布他?。╟ombretastatin)、紡錘 菌素（netropsin)、埃坡霉素 A(epothilone A)和埃坡霉素 B(epothilone B)、雌氣 芥（estramustine)、克瑞普托非森（cryptophysins)、西馬多?。╟emadotin)、美登醇 (maytansinoids)、迪斯德莫來(lái)（discodermolide)、艾槽塞洛素（eleutherobin)和米托蒽 醌。
[0061] 在某些實(shí)施例中，細(xì)胞毒性劑是常規(guī)化學(xué)治療，如多柔比星、太平洋紫杉醇、美法 侖、長(zhǎng)春花生物堿、甲胺喋呤、絲裂霉素 C或依托泊苷。另外，如CC-1065類似物、卡奇霉素、 美登素、海兔毒素10類似物、根霉素和巖沙?？舅兀╬alytoxin)等強(qiáng)效劑可以連接到本 發(fā)明的IL-3和PEG-IL3多肽。
[0062] 在特定實(shí)施例中，細(xì)胞毒素或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑是奧瑞他汀E(所屬領(lǐng)域中也稱為 海兔毒素-10)或其衍生物。典型地，奧瑞他汀E衍生物是例如奧瑞他汀E與酮酸之間形成 的酯。例如，奧瑞他汀E可以分別與對(duì)乙酰基苯甲酸或苯甲?；焖岱磻?yīng)產(chǎn)生AEB和AEVB。 其它典型奧瑞他汀衍生物包括AFP、MMAF和MMAE。奧瑞他汀E和其衍生物的合成和結(jié)構(gòu) 描述于美國(guó)專利申請(qǐng)案第09/845, 786號(hào)（美國(guó)專利申請(qǐng)公開案第20030083263號(hào)）和第 10/001，191號(hào)；國(guó)際專利申請(qǐng)案第PCT/US03/24209號(hào)、國(guó)際專利申請(qǐng)案第PCT/US02/13435 號(hào)和美國(guó)專利案第6, 323, 315號(hào)；第6, 239, 104號(hào)；第6, 034, 065號(hào)；第5, 780, 588號(hào)；第 5, 665, 860 號(hào)；第 5, 663, 149 號(hào)；第 5, 635, 483 號(hào)；第 5, 599, 902 號(hào)；第 5, 554, 725 號(hào)；第 5, 530, 097 號(hào)；第 5, 521，284 號(hào)；第 5, 504, 191 號(hào)；第 5, 410, 024 號(hào)；第 5, 138, 036 號(hào)；第 5, 076, 973 號(hào)；第 4, 986, 988 號(hào)；第 4, 978, 744 號(hào)；第 4, 879, 278 號(hào)；第 4, 816, 444 號(hào)；以及 第 4, 486, 414 號(hào)。
[0063] 在一些實(shí)施例中，將一個(gè)非天然編碼氨基酸并入在IL-3或其變異體中一或多個(gè) 的以下位置中：位置 1 之前（即在 N 端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、 133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、 152或添加到蛋白質(zhì)羧基端上，和其任何組合（SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2或3中的相應(yīng) 氨基酸）。在一些實(shí)施例中，一或多種毒素直接結(jié)合到IL-3變異體。在一些實(shí)施例中，一 或多種毒素結(jié)合到IL-3多肽中的一或多個(gè)非天然編碼氨基酸。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的 IL-3變異體連接到連接基團(tuán)。在一些實(shí)施例中，連接到連接基團(tuán)的IL-3變異體更包含毒 素。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，IL-3連接基團(tuán)連接到非天然編碼氨基酸。
[0064] 在一些實(shí)施例中，將一或多個(gè)非天然編碼氨基酸并入在IL-3或其變異體中一或 多個(gè)的以下位置中：位置1之前（即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、 113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、 132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、 151、152或添加到蛋白質(zhì)羧基端上，和其任何組合（SEQ ID ΝΟ:1或SEQ ID NO:2或3中的 相應(yīng)氨基酸）。
[0065] 在一些實(shí)施例中，一或多個(gè)非天然編碼氨基酸并入在如下的對(duì)應(yīng)于IL-10或其變 異體二級(jí)結(jié)構(gòu)的以下區(qū)域中一或多個(gè)中的任何位置處：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 3的螺旋L側(cè)；疏水性相互作用位點(diǎn)處；N端最初43個(gè)氨基酸內(nèi)；氨基酸位置44-160內(nèi)。 在一些實(shí)施例中，將一或多個(gè)非天然編碼氨基酸并入在IL-3或其變異體的以下一或多個(gè) 位置中：SEQ ID N0:1 的位置 1 之前（亦即在 N 端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43和其任何組合，或SEQ ID N0:2或3的相應(yīng)氨基酸。在一些實(shí)施例中，，將一 或多個(gè)非天然編碼氨基酸并入IL-3或其變異體的以下一或多個(gè)安置中：44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、61、68、69、70、71、72、73、 74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、 99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、 118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、 137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152,或添加到 SEQ ID N0:1的蛋白質(zhì)的羧基端和其任何組合，或SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3中的相應(yīng)氨基 酸。
[0066] 在一些實(shí)施例中，IL-3或其變異體中這些位置中的一或多個(gè)處的非天然存在的氨 基酸連接到毒素，包括（但不限于）以下位置：位置1之前（即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、61、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、 146、147、148、149、150、151、152,或添加到蛋白質(zhì)的羧基端，和其任何組合（SEQ ID NO: 1或 SEQ ID N0:2或3中的相應(yīng)氨基酸或任何IL-3序列中的相應(yīng)氨基酸）。
[0067] 在一些實(shí)施例中，IL-3或其變異體中這些位置中的一或多個(gè)處的非天然存在的氨 基酸連接到連接基團(tuán)，包括（但不限于）以下位置：位置1之前（即在N端）、1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、 106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、 125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、 144、145、146、147、148、149、150、151、152,或添加到蛋白質(zhì)的羧基端，和其任何組合（SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2或3中的相應(yīng)氨基酸或任何IL-3序列中的相應(yīng)氨基酸）。
[0068] 在一些實(shí)施例中，IL-3或其變異體中這些位置中的一或多個(gè)處的非天然存在的 氨基酸連接到連接基團(tuán)，即更連接到毒素，包括（但不限于）以下位置：位置1之前（即 在 N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、 77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、 102、 103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、 122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、 140、 141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152,或添加到蛋白質(zhì)的羧基端，和 其任何組合（SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2或3中的相應(yīng)氨基酸或任何IL-3序列中的相應(yīng) 氨基酸）。
[0069] 在一些實(shí)施例中，IL-3或其變異體中這些位置中的一或多個(gè)處的非天然存在的 氨基酸連接到水溶性聚合物，包括（但不限于）以下位置：位置1之前（即在N端）、1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、 124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、 143、144、145、146、147、148、149、150、151、152,或添加到蛋白質(zhì)的羧基端，和其任何組合 (SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2或3中的相應(yīng)氨基酸或任何IL-3序列中的相應(yīng)氨基酸）。
[0070] 在一些實(shí)施例中，IL-3或其變異體中這些位置中的一或多個(gè)處的非天然存在的氨 基酸連接到水溶性聚合物，包括（但不限于）以下位置：SEQ ID NO: 1的位置1之前（即 在 N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43 或其任何組合，或 SEQ ID N0:2 或SEQ ID NO:3中的相應(yīng)氨基酸殘基。
[0071] 在一些實(shí)施例中，IL-3或其變異體中這些位置中的一或多個(gè)處的非天然存在的氨 基酸連接到水溶性聚合物，包括（但不限于）以下位置：44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、 79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、 103、 104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、 122、 123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、 141、 142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152,或添加到蛋白質(zhì)的羧基端，和其任 何組合（SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2或3中的相應(yīng)氨基酸）。
[0072] 在一些實(shí)施例中，IL-3或其變異體包含調(diào)節(jié)IL-3對(duì)另一個(gè)IL-3或其變異體的親 和力的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，IL-3或其變異體包含調(diào)節(jié)IL-3或其變異體對(duì) IL-3受體或結(jié)合搭配物的親和力的取代、添加缺失缺失，所述受體或結(jié)合搭配物包括（但 不限于）蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)、脂肪酸、小分子或核酸。在一些實(shí)施例中，IL-3或其變異體包 含調(diào)節(jié)在與不含取代、添加或缺失的相應(yīng)IL-3穩(wěn)定性相比較時(shí)的IL-3穩(wěn)定性的取代、添加 或缺失。穩(wěn)定性和/或溶解性可以使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的多種不同分析來(lái)測(cè) 量。所述分析包括（但不限于）SE-HPLC和RP-HPLC。在一些實(shí)施例中，IL-3或其變異體包 含調(diào)節(jié)在與不含取代、添加或缺失的相應(yīng)IL-3免疫原性相比較時(shí)的IL-3免疫原性的取代、 添加或缺失。在一些實(shí)施例中，IL-3包含調(diào)節(jié)在與不含取代、添加或缺失的相應(yīng)IL-3血清 半衰期或循環(huán)時(shí)間相比較時(shí)的IL-3血清半衰期或循環(huán)時(shí)間的取代、添加或缺失。
[0073] 在一些實(shí)施例中，IL-3或其變異體包含在與不含取代、添加或缺失的相應(yīng)IL-3或 其變異體水溶性相比較時(shí)增加 IL-3水溶性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，IL-3或 其變異體包含在與不含取代、添加或缺失的相應(yīng)IL-3或其變異體溶解性相比較時(shí)增加宿 主細(xì)胞中所產(chǎn)生IL-3或其變異體溶解性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，IL-3或其 變異體包含在與不含所述取代、添加或缺失的相應(yīng)IL-3或其變異體的表達(dá)或合成相比較 時(shí)增加宿主細(xì)胞中IL-3表達(dá)或增加活體外合成的取代、添加或缺失。包含此取代的IL-3 或其變異體保持促效劑活性并且保持或改良在宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平。在一些實(shí)施例中， IL-3或其變異體包含在與不含所述取代、添加或缺失的相應(yīng)IL-3或其變異體的蛋白酶抗 性相比較時(shí)增加所述IL-3或其變異體蛋白酶抗性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中， IL-3或其變異體包含在與受體對(duì)不含取代、添加或缺失的相應(yīng)IL-3或其變異體相互作用 的活性相比較時(shí)調(diào)節(jié)所述IL-3受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例 中，IL-3或其變異體包含在與不含所述取代、添加或缺失的相應(yīng)IL-3的結(jié)合相比較時(shí)調(diào)節(jié) 所述IL-3與另一個(gè)分子的結(jié)合的取代、添加或缺失。
[0074] IL-3毒素結(jié)合物或PEG-IL3-毒素結(jié)合物可以調(diào)配成包含治療有效量的IL-3毒素 結(jié)合物或PEG-IL3-毒素結(jié)合物和醫(yī)藥學(xué)載劑的醫(yī)藥組合物。"治療有效量"是足以提供所 需治療結(jié)果的量。優(yōu)選地，所述量負(fù)性副作用最少。投與用于治療可用IL-3-毒素結(jié)合物 治療的病狀的IL-3-毒素結(jié)合物或PEG-IL3-毒素結(jié)合物的量是部分基于目標(biāo)細(xì)胞上IL-3 受體的表達(dá)，其可由所屬領(lǐng)域中已知的IL-3活性分析法測(cè)定。對(duì)需要所述治療的特定患者 的治療有效量可以通過(guò)考慮各種因素來(lái)確定，如所治療的病狀、患者的總體健康狀況、投藥 方法、副作用嚴(yán)重性等等。在腫瘤情形中，合適的IL-3活性將是例如CD8T細(xì)胞浸潤(rùn)到腫瘤 位點(diǎn)中、來(lái)自這些浸潤(rùn)細(xì)胞的發(fā)炎性細(xì)胞因子（如IFN. γ、IL-4、IL-6、IL-3和RANK-L)的 表達(dá)、生物樣品中TNF-α或IFN-γ的含量提高。
[0075] IL-3-毒素結(jié)合物或PEG-IL3-毒素結(jié)合物的治療有效量可在每天每公斤體重約 0. 01微克到約100微克蛋白質(zhì)范圍內(nèi)。優(yōu)選地，聚乙二醇化IL-3的量在每天每公斤體重約 0. 1微克到20微克蛋白質(zhì)，更優(yōu)選地每天每公斤體重約0. 5微克到10微克蛋白質(zhì)，并且最 優(yōu)選地每天每公斤體重約1微克到4微克蛋白質(zhì)的范圍內(nèi)。使用本發(fā)明的PEG-IL3-毒素 結(jié)合物，可以使用頻繁較低的投藥時(shí)程，因?yàn)檫@一結(jié)合形式的作用時(shí)間比IL-3毒素結(jié)合物 更長(zhǎng)。聚乙二醇化IL-3毒素結(jié)合物是按純形式調(diào)配并且實(shí)質(zhì)上不含集聚物和其它蛋白質(zhì)。 優(yōu)選的是，通過(guò)持續(xù)灌注投與PEG-IL3-t使得每天遞送約50微克到800微克范圍內(nèi)的量的 蛋白質(zhì)（即每天每公斤體重約1微克到16微克蛋白質(zhì)IL-3-毒素結(jié)合物或PEG-IL3-毒素 結(jié)合物）。每日輸注速率可以基于副作用監(jiān)測(cè)和血液細(xì)胞計(jì)數(shù)而變化。
[0076] 為了制備含有IL-3毒素結(jié)合物或PEG-IL3-毒素結(jié)合物的醫(yī)藥組合物，將治 療有效量的IL-3-毒素結(jié)合物或PEG-IL3-毒素結(jié)合物與藥學(xué)上可接受的載劑或賦形 劑混合。載劑或賦形劑優(yōu)選是惰性的。醫(yī)藥載劑可以是任何適合于向患者遞送本發(fā) 明IL-3組合物的相容的無(wú)毒物質(zhì)。合適載劑的實(shí)例包括標(biāo)準(zhǔn)生理食鹽水、林格氏溶 液（Ringer's solution)、右旋糖溶液和漢克氏溶液（Hank's solution)、也可以使用 如非揮發(fā)性油和油酸乙酯等非水性載劑。優(yōu)選的載劑是5%右旋糖/鹽水。載劑可以 含有少量添加劑，如增進(jìn)等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)，例如緩沖劑和防腐劑，參見例如 雷明頓藥物科學(xué)（Remington's Pharmaceutical Sciences)和美國(guó)藥典：國(guó)內(nèi)處方集 (U. S. Pharmacopeia:National Formulary),馬克出版公司(Mack Publishing Company), 賓夕法尼亞州伊斯頓（Easton，Pa.) (1984)。治療劑和診斷劑的調(diào)配物可以通過(guò)與生理 學(xué)上可接受的呈例如凍干粉末、漿料、水溶液或懸浮液形式的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑混合 來(lái)制備（參見例如哈德曼（Hardman)等人（2001)古德曼和吉爾曼治療劑藥理學(xué)基礎(chǔ) (Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics),麥格勞 _ 希爾 集團(tuán)（McGraw-Hill),紐約州紐約（New York, N.Y.);吉納羅（Gennaro) (2000)雷明頓：醫(yī) 藥科學(xué)和實(shí)踐（Remington:The Science and Practice of Pharmacy),利平科特、威廉姆 斯和威爾金斯公司（Lippincott, Williams, and Wilkrns),紐約州紐約；阿維斯（Avis)等 人（編）（I"3)醫(yī)藥劑型：非經(jīng)腸藥物治療（Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications),馬塞爾德克公司（Marcel Dekker),紐約州；利伯曼（Lieberman)等人 (編）（1990)醫(yī)藥劑型：淀劑（Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets),馬塞爾德克 公司，紐約州；利伯曼等人（編）（1990)醫(yī)藥劑型：分散系統(tǒng)（Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems),馬塞爾德克公司，紐約州；Weiner 和 Kotkoskie(2000) 賦形劑毒性和安全性（Excipient Toxicity and Safety),馬塞爾德克公司（Marcel Dekker, Inc.)，紐約州紐約。
[0077] PEG-IL-3可以調(diào)配成醫(yī)藥組合物，所述醫(yī)藥組合物包含治療有效量的IL-3和醫(yī) 藥載劑。"治療有效量"是足以提供所需治療結(jié)果的量。優(yōu)選地，所述量負(fù)性副作用最少。 經(jīng)投與以治療可用IL-3治療的病狀的PEG-IL-3量是基于所結(jié)合蛋白質(zhì)的IL-3活性，該活 性可以通過(guò)此項(xiàng)技術(shù)中已知的IL-3活性分析來(lái)加以測(cè)定。對(duì)需要所述治療的特定患者的 治療有效量可以通過(guò)考慮各種因素來(lái)確定，如所治療的病狀、患者的總體健康狀況、投藥方 法、副作用嚴(yán)重性等等。在腫瘤情形中，合適的IL-3活性將是例如⑶8T細(xì)胞浸潤(rùn)到腫瘤位 點(diǎn)中、來(lái)自這些浸潤(rùn)細(xì)胞的發(fā)炎性細(xì)胞因子（如IFN. γ、IL-4、IL-6、IL-3和RANK-L)的表 達(dá)、生物樣品中TNF-a或IFN-y的含量提高。
[0078] 聚乙二醇化IL-3的治療有效量可以在每天每公斤體重約0. 01微克到約100微克 蛋白質(zhì)的范圍內(nèi)變化。優(yōu)選地，聚乙二醇化IL-3的量在每天每公斤體重約0. 1微克到20 微克蛋白質(zhì)，更優(yōu)選地每天每公斤體重約〇. 5微克到10微克蛋白質(zhì)，并且最優(yōu)選地每天每 公斤體重約1微克到4微克蛋白質(zhì)的范圍內(nèi)。使用本發(fā)明的PEG-IL-3可以采用較不頻繁 的投藥安排，因?yàn)榇私Y(jié)合形式的作用比IL-3長(zhǎng)。聚乙二醇化IL-3調(diào)配成經(jīng)純化的形式，并 且實(shí)質(zhì)上不含聚集體和其它蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，通過(guò)連續(xù)輸注投與PEG-IL-3,以使得每天遞送 介于約50微克到800微克蛋白質(zhì)范圍內(nèi)的量（亦即每天每公斤體重約1微克到16微克蛋 白質(zhì)PEG-IL-3)。每日輸注速率可以基于副作用監(jiān)測(cè)和血液細(xì)胞計(jì)數(shù)而變化。
[0079] 為制備含有單-PEG-IL-3的醫(yī)藥組合物，將治療有效量的PEG-IL-3與醫(yī)藥學(xué)上可 接受的載劑或賦形劑混合。載劑或賦形劑優(yōu)選是惰性的。醫(yī)藥載劑可以是任何適合于向患 者遞送本發(fā)明IL-3組合物的相容的無(wú)毒物質(zhì)。合適載劑的實(shí)例包括標(biāo)準(zhǔn)生理食鹽水、林格 氏溶液、右旋糖溶液和漢克氏溶液。也可以使用非水性載劑，如非揮發(fā)性油和油酸乙酯。優(yōu) 選的載劑是5%右旋糖/鹽水。載劑可以含有少量添加劑，如增進(jìn)等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的 物質(zhì)，例如緩沖劑和防腐劑，參見例如雷明頓藥物科學(xué)和美國(guó)藥典：國(guó)內(nèi)處方集，馬克出版 公司，賓夕法尼亞州伊斯頓（1984)。治療劑和診斷劑的調(diào)配物可以通過(guò)與生理學(xué)上可接 受的呈例如凍干粉末、漿料、水溶液或懸浮液形式的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑混合來(lái)制備（參 見例如哈德曼等人（2001)古德曼和吉爾曼治療劑藥理學(xué)基礎(chǔ)，麥格勞-希爾集團(tuán)，紐約 州紐約；Gennaro (2000)雷明頓：醫(yī)藥科學(xué)和實(shí)踐，利平科特、威廉姆斯和威爾金斯公司， 紐約州紐約；阿維斯等人（編）（1993)醫(yī)藥劑型：非經(jīng)腸藥物治療，馬塞爾德克公司，紐 約州；利伯曼等人（編）（1990)醫(yī)藥劑型：錠劑，馬塞爾德克公司，紐約州；利伯曼等人 (編）（1990)醫(yī)藥劑型：分散系統(tǒng)，馬塞爾德克公司，紐約州；韋納（Weiner)和科特斯基 (Kotkoskie) (2000)賦形劑毒性和安全性，馬塞爾德克公司，紐約州紐約。
[0080] 本發(fā)明的組合物可以經(jīng)口投與或注射到身體中。用于經(jīng)口使用的調(diào)配物還可以包 括進(jìn)一步保護(hù)IL-3不受胃腸道中蛋白酶影響的化合物。注射通常是肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或 靜脈內(nèi)的。或者，在適當(dāng)情況下可以使用關(guān)節(jié)內(nèi)注射或其它途徑。
[0081] 當(dāng)非經(jīng)腸投與時(shí)，聚乙二醇化IL-3、IL-3-毒素結(jié)合物和/或PEG-IL3-毒素結(jié)合 物優(yōu)選的是按與醫(yī)藥學(xué)載劑結(jié)合的單位劑量可注射形式（溶液、懸浮液、乳液）調(diào)配。參見 例如阿維斯等人編，醫(yī)藥劑型：非經(jīng)腸藥物治療，德克公司（Dekker)，紐約州（1993);利伯 曼等人編，醫(yī)藥劑型：錠劑，德克公司，紐約州（1990);和利伯曼等人編，醫(yī)藥劑型：分散 系統(tǒng)，德克公司，紐約州（1990)。或者，本發(fā)明的組合物可以通過(guò)可植入或可注射藥物遞 送系統(tǒng)引入到患者身體中，例如俄科哈特（Urquhart)等人藥理學(xué)和毒理學(xué)年度綜述（Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. )24:199-236, (1984);路易斯（Lewis)編，農(nóng)藥和醫(yī)藥的受控釋 放（Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals)普雷納姆出版社（Plenum Press)，紐約（1981)美國(guó)專利第3, 773, 919號(hào)；第3, 270, 960號(hào)；等等。聚乙二醇化IL-3 可以在存在或不存在各種添加劑和/或稀釋劑下在如水、鹽水或緩沖媒劑的水性媒劑中投 與。
[0082] 特定患者的有效量可以取決于例如以下各者的因素而變化：所治療的病狀、患者 的總體健康狀況、投藥的方法途徑和劑量、和副作用的嚴(yán)重性（參見例如梅納德（Maynard) 等人（1996)良好臨床實(shí)踐SOP手冊(cè)（A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice), 國(guó)際藥物出版社（Interpharm Press),佛羅里達(dá)州波卡拉頓（Boca Raton，F(xiàn)la.);登 特（Dent) (2001)良好實(shí)驗(yàn)室和良好臨床實(shí)踐（Good Laboratory and Good Clinical Practice),厄奇出版社（Urch Publ.)，英國(guó)倫敦）。
[0083] 典型獸醫(yī)學(xué)、實(shí)驗(yàn)或研究個(gè)體包括猴、犬、貓、大鼠、小鼠、兔、天竺鼠、馬和人類。
[0084] 由臨床醫(yī)生例如使用此項(xiàng)技術(shù)中已知或懷疑影響治療或預(yù)測(cè)影響治療的參數(shù)或 因素來(lái)確定適當(dāng)劑量。一般來(lái)說(shuō)，劑量以在某種程度上小于最佳劑量的量開始，并且其隨后 以較小增量增加，直到相對(duì)于任何負(fù)性副作用達(dá)成所需或最佳效果。重要診斷測(cè)量包括例 如炎癥癥狀或所產(chǎn)生發(fā)炎性細(xì)胞因子含量的那些測(cè)量。優(yōu)選地，將使用的生物來(lái)源于與治 療所針對(duì)的動(dòng)物相同物種，由此將對(duì)試劑的體液響應(yīng)減到最少。
[0085] 用第二治療劑（例如細(xì)胞因子、類固醇、化學(xué)治療劑、抗生素或輻射）共投與或治 療的方法是此項(xiàng)技術(shù)中熟知的（參見例如哈德曼等人（編）（2001)古德曼和吉爾曼治療 劑藥理學(xué)基礎(chǔ)，第10補(bǔ)充版，麥格勞-希爾集團(tuán)，紐約州紐約；普爾（Poole)和彼得森 (Peterson)(編）（2001)高階實(shí)踐的藥物治療學(xué)：實(shí)用方法（Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach),利平科特、威廉姆斯和威爾金斯公司，賓夕 法尼亞州費(fèi)城（Phila.，PA);錢伯納（Chabner)和隆戈（Longo)(編）（2001)癌癥化學(xué)療法 和生物療法（Cancer Chemotherapy and Biotherapy)，利平科特、威廉姆斯和威爾金斯公 司，賓夕法尼亞州費(fèi)城）。有效量的治療劑將減少癥狀（例如腫瘤大?。┗蛞种颇[瘤增長(zhǎng)， 通常至少10% ;通常至少20% ;優(yōu)選地至少約30% ;更優(yōu)選地至少40%，并且最優(yōu)選地至 少 50%。
[0086] 本發(fā)明提供治療增生性病狀或病癥的方法，例如以下各者的癌癥：子宮、子宮 頸、乳房、前列腺、睪丸、陰莖、胃腸道（例如食道、口咽、胃、小腸或大腸、結(jié)腸、或直腸）、 腎臟、腎細(xì)胞、膀胱、骨、骨髓、皮膚、頭部或頸部、皮膚、肝臟、膽囊、心、肺、胰腺、唾液腺、 腎上腺、甲狀腺、大腦（例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤）、神經(jīng)節(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)和外周神經(jīng)系 統(tǒng)（PNS)和免疫系統(tǒng)（例如脾臟或胸腺）。本發(fā)明提供治療例如以下各者的方法：免疫 原性腫瘤、非免疫原性腫瘤、休眠腫瘤、病毒誘導(dǎo)癌癥，例如上皮細(xì)胞癌、內(nèi)皮細(xì)胞癌、鱗狀 細(xì)胞癌、乳突狀瘤病毒、腺癌、淋巴瘤、癌瘤、黑色素瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、畸胎癌、化學(xué) 誘導(dǎo)癌癥、癌轉(zhuǎn)移和血管生成。本發(fā)明還涵蓋例如通過(guò)調(diào)節(jié)調(diào)控性T細(xì)胞（Treg)和或 CD8T細(xì)胞的活性來(lái)降低對(duì)腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞抗原的耐受性（參見例如拉米雷茲-蒙太 古（Ramirez-Montagut)等人（2003)癌基因（Oncogene) 22:3180-3187 ;薩瓦亞（Sawaya) 等人（2003)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志349:1501-1509 ;法勒（Farrar)等人（1999)免疫學(xué)雜志 162:2842-2849 ;勒（Le)等人（2001)免疫學(xué)雜志 167:6765-6772 ;卡尼斯塔（Cannistra) 和尼洛夫（Niloff) (1996)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志334:1030-1038 ;奧斯本（Osborne) (1998) 新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志339:1609-1618 ;林奇（Lynch)和沙佩勒（Chapelle) (2003)新英 格蘭醫(yī)學(xué)雜志348:919-932 ;恩辛格（Enzinger)和梅爾（Mayer) (2003)新英格蘭醫(yī) 學(xué)雜志349:2241-2252;福雷斯蒂耶雷（Forastiere)等人（2001)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志 345:1890-1900 ;伊茲比克（Izbicki)等人（1997)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志337:1188-1194 ;霍蘭 德（Holland)等人（編）（1996)癌癥的癌癥藥物百科全書（Cancer Medicine Encyclopedia of Cancer)，第4補(bǔ)充版，學(xué)術(shù)出版社，加利福尼亞州圣地亞哥）。
[0087] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于用PEG-IL-3和至少一種其它治療劑或診斷劑 來(lái)治療增生性病狀、癌癥、腫瘤或癌變前病狀（如非典型增生）的方法。其它治療劑可以是 例如細(xì)胞因子或細(xì)胞因子拮抗劑（如IL-12、干擾素-α或抗表皮生長(zhǎng)因子受體）、多柔比 星、表柔比星（epirubicin)、抗葉酸（例如甲胺碟呤或氟尿啼陡）、伊立替康、環(huán)磷酰胺、放 射線療法、激素或抗激素療法（例如雄激素、雌激素、抗雌激素、氟他胺（flutamide)或二 乙基己烯雌酚（diethylstilbestrol))、手術(shù)、他莫昔芬（tamoxifen)、異環(huán)磷酰胺、二溴衛(wèi) 矛醇、烷基化劑（例如美法侖或順鉬）、依托泊苷、長(zhǎng)春瑞賓、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春地辛、糖皮質(zhì)激素 (glucocorticoid)、組胺受體拮抗劑、血管生成抑制劑、福射、福射敏化劑、蒽環(huán)霉素、長(zhǎng)春 花生物堿、紫杉烷（例如紫杉醇和多烯紫杉醇）、細(xì)胞周期抑制劑（例如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白 依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependent kinase inhibitor))、針對(duì)另一種腫瘤抗原的單克 隆抗體、單克隆抗體與毒素的復(fù)合物、T細(xì)胞佐劑、骨髓移植、或抗原呈遞細(xì)胞（例如樹突狀 細(xì)胞療法）。疫苗可以可溶性蛋白質(zhì)形式或以編碼所述蛋白質(zhì)的核酸形式提供（參見例如 勒等人，同前文獻(xiàn)；格列柯（Greco)和澤爾夫斯基（Zellefsky)(編）（2000)前列腺癌的放 射線療法（Radiotherapy of Prostate Cancer),哈伍德學(xué)術(shù)出版社（Harwood Academic), 阿姆斯特丹（Amsterdam);夏皮羅（Shapiro)和雷希特（Recht) (2001)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志 344:1997-2008 ;霍托巴基（Hortobagyi) (1998)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志339:974-984 ;卡特羅 納（Catalona) (1994)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志 331:996-1004;內(nèi)勒（Naylor)和哈登（Hadden) (2003)國(guó)際免疫藥理學(xué)（Int. Immunopharmacol. )3:1205-1215 ;國(guó)際輔助肺癌研究合作組 (The Int. Adjuvant Lung Cancer Trial Collaborative Group) (2004)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜 志350:351-360 ;斯拉蒙（Slamon)等人（2001)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志344:783-792 ;庫(kù)德卡 (Kudelka)等人（1998)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志338:991-992 ;范內(nèi)登（van Netten)等人（1996) 新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志334:920-921)。
[0088] 還提供治療癌癥髓外造血（EMH)的方法。描述EMH(參見例如拉奧（Rao)等人 (2003)白血病和淋巴瘤（Leuk.Lymphoma)44:715-718 ;雷恩（Lane)等人（2002)皮膚病理 學(xué)雜志（J. Cutan. Pathol.) 29:608-612)。
[0089] 在一些實(shí)施例中，IL-3或其變異體包含與不含所述取代、添加或缺失的相應(yīng)IL-3 的脂質(zhì)結(jié)合活性相比較調(diào)節(jié)所述IL-3脂質(zhì)結(jié)合的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中， IL-3或其變異體包含與不含取代、添加或缺失的相應(yīng)IL-3或其變異體的脂質(zhì)代謝活性相 比較增強(qiáng)所述IL-3與代謝脂質(zhì)相關(guān)活性的取代、添加或缺失。
[0090] 在一些實(shí)施例中，IL-3或其變異體包含在與不含所述取代、添加或缺失的相應(yīng)野 生型IL-3的相容性相比較時(shí)增加所述IL-3或其變異體與醫(yī)藥防腐劑（例如間甲酚、苯酚、 苯甲醇）相容性的取代、添加或缺失。這一增加的相容性將使保存的醫(yī)藥調(diào)配物制劑能夠 在存儲(chǔ)期間保持蛋白質(zhì)的物理化學(xué)特性（physiochemical property)和生物活性。
[0091] 在一些實(shí)施例中，通過(guò)一或多個(gè)非天然氨基酸產(chǎn)生一或多個(gè)經(jīng)工程改造的鍵。分 子內(nèi)鍵可以許多方式產(chǎn)生，包括（但不限于）在合適的條件下于蛋白質(zhì)中的兩個(gè)氨基酸之 間反應(yīng)（一個(gè)或兩個(gè)氨基酸可為非天然氨基酸）；在合適的條件下與兩個(gè)氨基酸（其中每 一個(gè)氨基酸可為天然編碼或非天然編碼氨基酸）、與連接基團(tuán)、聚合物或其它分子反應(yīng)等。
[0092] 在一些實(shí)施例中，IL-3或其變異體中的一或多個(gè)氨基酸取代可以用一或多個(gè)天然 存在或非天然存在的氨基酸。在一些實(shí)施例中，IL-3或其變異體中的氨基酸取代可以用 天然存在或非天然存在的氨基酸進(jìn)行，其限制條件為至少一個(gè)取代用非天然編碼氨基酸進(jìn) 行。在一些實(shí)施例中，IL-3或其變異體中的一或多個(gè)氨基酸取代可以用一或多個(gè)天然存在 的氨基酸進(jìn)行，并且另外至少一個(gè)取代用非天然編碼氨基酸進(jìn)行。
[0093] 在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基、乙?；?、氨氧基、肼基、酰肼基、氨 基脈基、置氣基或塊基。
[0094] 在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基 酸具有以下結(jié)構(gòu)：
[0095]

【權(quán)利要求】
1. 一種白細(xì)胞介素3 (IL-3)多肽，其包含一或多個(gè)非天然編碼氨基酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3多肽與SEQ ID NO: 290%同源。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3多肽與SEQ ID NO: 3至少90%同源。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3多肽與SEQ ID NO: 2至少95%同源。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3多肽與SEQ ID NO: 2至少98%同源。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3多肽與SEQ ID NO: 2至少99%同源。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3結(jié)合到一或多種水溶性聚合物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的IL-3,其中所述水溶性聚合物中的至少一者連接到所述非天 然編碼氨基酸中的至少一者。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3的形式是單體。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3的形式是二聚物。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組 成的群組的位置處經(jīng)取代：位置1之前（即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、 111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、 130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、 149、150、151、152，或添加到所述蛋白質(zhì)的羧基端，和其任何組合。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3包含一或多個(gè)調(diào)節(jié)所述IL-3多肽對(duì) IL-3受體的親和力的氨基酸取代、添加或缺失。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3包含一或多個(gè)提高所述IL-3的穩(wěn)定 性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3包含一或多個(gè)提高所述IL-3多肽在 重組宿主細(xì)胞中的表達(dá)或體外合成的氨基酸取代、添加或缺失。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3多肽包含一或多個(gè)提高所述IL-3的 耐蛋白酶性的氨基酸取代、添加或缺失。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述非天然編碼氨基酸對(duì)連接基團(tuán)、聚合物或生 物活性分子具反應(yīng)性，而所述連接基團(tuán)、聚合物或生物活性分子另外對(duì)所述多肽中的20種 常見氨基酸中的任一者均不具反應(yīng)性。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、 醜餅基、氣基脈基、置氣基或塊基。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的IL-3,其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3連接到毒素、細(xì)胞毒性劑或免疫抑制 劑。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的IL-3,其中所述經(jīng)結(jié)合的IL-3連接到一或多種水溶性聚 合物。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的IL-3,其中所述毒素、細(xì)胞毒性劑或免疫抑制劑是通過(guò)連 接基團(tuán)連接到所述IL-3。
22. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的IL-3,其中所述毒素、細(xì)胞毒性劑或免疫抑制劑直接結(jié)合 到所述IL-3中的一或多個(gè)所述非天然編碼氨基酸。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述非天然編碼氨基酸具有以下結(jié)構(gòu)：
其中η為O到10成為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基；R2為H、烷基、芳基、經(jīng)取 代烷基和經(jīng)取代芳基；且R3為H、氨基酸、多肽或氨基端修飾基團(tuán)；且R4為H、氨基酸、多肽 或羧基端修飾基團(tuán)。
24. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的IL-3,其中所述非天然編碼氨基酸包含氨氧基。
25. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的IL-3,其中所述非天然編碼氨基酸包含酰肼基。
26. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的IL-3,其中所述非天然編碼氨基酸包含肼基。
27. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的IL-3,其中所述非天然編碼氨基酸包含氨基脲基。
28. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的IL-3多肽，其中所述非天然編碼氨基酸殘基包含疊氮基。
29. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述非天然編碼氨基酸具有以下結(jié)構(gòu)：
其中η為0-10成為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基、經(jīng)取代芳基或不存在；X為0、N、S或不存 在；m為0-10 ;R2為H、氨基酸、多肽或氨基端修飾基團(tuán)；且R3為H、氨基酸、多肽或羧基端修 飾基團(tuán)。
30. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的IL-3,其中所述非天然編碼氨基酸包含炔基。
31. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述非天然編碼氨基酸具有以下結(jié)構(gòu)：
其中η為0-10成為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基；X為0、N、S或不存在；m為 0-10 ;R2為H、氨基酸、多肽或氨基端修飾基團(tuán)；且R3為H、氨基酸、多肽或羧基端修飾基團(tuán)。
32. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的IL-3,其中所述水溶性聚合物的分子量介于約0. IkDa與約 IOOkDa 之間。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的IL-3多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量介于約 0. IkDa與約50kDa之間。
34. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的IL-3,其中所述氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基是通過(guò)酰 胺鍵連接到所述水溶性聚合物。
35. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的IL-3,其通過(guò)使包含羰基的水溶性聚合物與包含非天然 編碼氨基酸的多肽反應(yīng)來(lái)制得，所述非天然編碼氨基酸包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲 基。
36. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述非天然編碼氨基酸包含糖部分。
37. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3多肽更包含通過(guò)所述非天然編碼氨基 酸連接到所述多肽的連接基團(tuán)、聚合物或生物活性分子。
38. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的IL-3,其中所述IL-3多肽其中所述連接基團(tuán)、聚合物或生 物活性分子通過(guò)糖部分連接到所述多肽。
39. -種制造根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞介素3的方法，所述方法包含使所分離的 包含非天然編碼氨基酸的IL-3多肽與包含與所述非天然編碼氨基酸反應(yīng)的部分的連接基 團(tuán)、聚合物或生物活性分子接觸。
40. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述聚合物包含選自由水溶性聚合物和聚（乙二 醇）組成的群組的部分。
41. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼 基、餅基、氣基脈基、置氣基或塊基。
42. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基部分，且所述 連接基團(tuán)、聚合物或生物活性分子包含氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分。
43. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分通過(guò)酰胺鍵 連接到所述連接基團(tuán)、聚合物或生物活性分子。
44. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含炔部分，且所述連 接基團(tuán)、聚合物或生物活性分子包含疊氮部分。
45. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含疊氮部分，且所述 連接基團(tuán)、聚合物或生物活性分子包含炔部分。
46. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的IL-3多肽，其中所述水溶性聚合物是聚（乙二醇）部分。
47. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的IL-3多肽，其中所述聚（乙二醇）部分是分支或多臂接枝 聚合物。
48. -種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。
49. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的組合物，其中所述非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連 接。
50. -種治療患有由白細(xì)胞介素3調(diào)節(jié)的病癥的患者的方法，其包含向所述患者投與 治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物。
51. -種組合物，其包含與毒素結(jié)合的根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3和藥學(xué)上可接受的 載劑。
52. -種包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-3的組合物，其更包含連接基團(tuán)和結(jié)合物以及 藥學(xué)上可接受的載劑。
53. -種制造包含非天然編碼氨基酸的白細(xì)胞介素3的方法，所述方法包含在允許包 含非天然編碼氨基酸的IL-3多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含編碼所述IL-3多肽的包含選擇密 碼子的一或多個(gè)多核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的細(xì)胞；以及純化所述多肽。
54. -種調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素3多肽的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間的方法，所述方法包含用一 或多個(gè)非天然編碼氨基酸取代所述多肽中的任何一或多個(gè)天然存在氨基酸。
55. -種白細(xì)胞介素3多肽，其包含一或多個(gè)提高重組宿主細(xì)胞中所述IL-3多肽的表 達(dá)的氨基酸取代、添加或缺失。
56. -種白細(xì)胞介素3多肽，其包含至少一個(gè)連接基團(tuán)、聚合物或生物活性分子，其中 所述連接基團(tuán)、聚合物或生物活性分子通過(guò)以核糖體方式并入所述多肽中的非天然編碼氨 基酸的官能團(tuán)連接到所述多肽上。
57. -種白細(xì)胞介素3多肽，其包含連接到一或多個(gè)非天然編碼氨基酸的連接基團(tuán)、聚 合物或生物活性分子，其中所述非天然編碼氨基酸在預(yù)先選擇的位點(diǎn)處以核糖體方式并入 所述多肽中。
58. -種減少經(jīng)診斷患有骨髓發(fā)育不良綜合癥（MDS)的人類中的胚細(xì)胞的方法，其包 含向需要所述減少的人類投與包含人類白細(xì)胞介素3(IL-3)_白喉毒素結(jié)合物的醫(yī)藥組合 物，其中所述結(jié)合物是按約〇. 1 μ /kg到約50 μ /kg的劑量投與。
59. -種減少經(jīng)診斷患有癌癥的人類中腫瘤細(xì)胞數(shù)目的方法，其包含向需要所述減少 的人類投與包含人類白細(xì)胞介素3 (IL-3)-毒素結(jié)合物的醫(yī)藥組合物，其中所述結(jié)合物。
60. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述結(jié)合物是按約0. 1 μ /kg到約50 μ /kg的劑 量投與。
【文檔編號(hào)】C12P21/04GK104245720SQ201380021531
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月29日
【發(fā)明者】梅蘭妮·尼爾森, 克里斯汀·S.·艾頓 申請(qǐng)人:Ambrx公司