用于急性髓細胞白血病的診斷、預后和治療的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于診斷、預測、治療和處理急性髓細胞白血病的方法。一種方法涉及預測患有急性髓細胞白血病的患者的生存率，所述方法包括：分析從所述患者分離的遺傳樣品是否存在細胞遺傳學異常，以及在基因FLT3、NPMI、DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WTI、IDHI、IDH2、KIT、RUNXI、MLL-PTD、ASXLI、PHF6、KRAS、PTEN、P53、HRAS和EZH2中的至少一者中是否存在突變。
【專利說明】用于急性髓細胞白血病的診斷、預后和治療的方法和組合 物
[0001] 相關(guān)專利申請的交叉引用
[0002] 本專利申請要求于2012年3月12日提交的美國臨時專利申請No. 61/609,723的 優(yōu)先權(quán)。這里以引用的方式將各個現(xiàn)有申請的全文并入本文。
[0003] 序列表
[0004] 本申請包括通過EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，這里以引用的方式將其全 文并入本申請。所述ASCII副本于2013年3月7日創(chuàng)建，名為3314. 002AW0_SL.txt，并且 大小為75, 356字節(jié)。
[0005] 關(guān)于聯(lián)邦政府資助研發(fā)的聲明
[0006] 本發(fā)明是在政府的支持下作出的，合同號為U54CA143798-01，由國家癌癥研宄所 腫瘤自然科學中心頒發(fā)。美國政府對本發(fā)明擁有特定的權(quán)利。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0007] 本發(fā)明涉及用于診斷、治療和處理癌癥的方法。本發(fā)明的【技術(shù)領(lǐng)域】為分子生物學、 遺傳學、腫瘤學、臨床診斷學、生物信息學。特別地，本發(fā)明的【技術(shù)領(lǐng)域】涉及血液癌癥的診 斷、預后和治療。

【背景技術(shù)】
[0008] 以下提供對本發(fā)明背景的描述，其僅用于幫助理解本發(fā)明，不被認為是描述或構(gòu) 成本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
[0009] 在發(fā)達國家，癌癥是僅次于心血管疾病的主要致死因素。僅在美國，每年有超過 一百萬人被診斷為患有癌癥，并且每年有超過500, 000人死于癌癥。據(jù)估計，每三個美國人 中有一個會在其一生中患有癌癥，而每五個中有一個將會死于癌癥。此外，預計未來五年內(nèi) 癌癥將超過心血管疾病成為第一大致死因素。因此，人們致力于改善該疾病的治療和診斷。
[0010] 大部分癌癥患者并非被其原發(fā)腫瘤殺死。他們往往因轉(zhuǎn)移癌而死亡：惡性細胞從 原發(fā)腫瘤脫離并通過機體擴散（通常到達遠端），從而形成多個廣泛的腫瘤集落。在血液癌 癥的情況下，根據(jù)受影響細胞的來源以及病程，存在四種類型。后者將所述類型分為急性或 慢性。前者進一步將類型劃分為淋巴母細胞或淋巴細胞性白血病以及髓細胞或骨髓性白血 病。根據(jù)患者以及病癥的特性，這些惡性腫瘤具有不同的預后。
[0011] 血液主要由紅血細胞（RBC)、白細胞（WBC)和血小板組成。紅血細胞的功能是向 機體攜帶氧氣，白血細胞保護我們的身體，血小板在受傷以后幫助血液凝結(jié)。不論疾病的種 類，這些細胞類型的任何異常情況會導致血液癌癥。血液癌癥的主要種類包括急性淋巴細 胞或淋巴母細胞白血?。ˋLL)、慢性淋巴細胞或淋巴母細胞白血病（CLL)、急性骨髓性或髓 細胞白血?。ˋML)以及慢性骨髓性或髓細胞白血?。–ML)。
[0012] 在白血病的情況下，骨髓和血液本身被攻擊，使得癌癥干擾基體造血的能力。在患 者中，這最通常表現(xiàn)為疲乏、貧血、虛弱和骨痛的形式。通過血液測試進行診斷，其中對特定 類型的血細胞進行計數(shù)。白血病的治療通常包括化療和放射以殺死癌細胞，并且有時需要 諸如干細胞移植的措施。如上文所述，存在幾種不同類型的白血病，其中髓細胞白血病所通 常分為兩類：急性髓細胞白血?。ˋML)和慢性髓細胞白血病（CML)。
[0013] AML的特征在于骨髓中骨髓細胞的數(shù)量增加，以及它們的成熟停滯，這通常造成造 血機能不足。在美國，AML的年發(fā)病率為大約每100, 000人中2. 4人發(fā)病，并且隨著年齡逐 漸增大至峰值，即每100, 〇〇〇個65歲或以上的成年人中有12. 6人發(fā)病。盡管治療方法有 所改善，世界各地的AML預后都非常差。即使是在美國，在小于65歲的患者中5年生存率 小于40%。在過去大約十年內(nèi)該值為15。同樣，雖然臨床醫(yī)學有所進步，CML的預后也很 差。
[0014] 急性髓細胞白血?。ˋML)是一種異質(zhì)性疾病，其包括許多種具有不同遺傳異常和 臨床特征的實體。僅對相對較少類型的白血病的發(fā)病機制有完整的描述。細胞遺傳學中度 風險和高風險的患者代表了大多數(shù)AML;基于化療的方法不能治愈大部分該類患者，因此 干細胞移植成為了通常的治療選擇。由于異源干細胞移植不能成為很多高風險白血病患者 的選擇，因此需要我們提高對這些白血病的生物學的認識并研宄更好的治療方法。
[0015] 由于沒有足夠了解急性髓細胞白血病的病因?qū)W、細胞生理學和分子遺傳學，因此 目前轉(zhuǎn)移腫瘤學研宄的主要焦點在于開發(fā)針對髓細胞白血病，特別是急性髓細胞白血病的 有效新試劑以及新的治療方法和/或診斷方法。然而，在癌癥的診斷和治療方面存在固有 的困難，其中包括，存在有多種不同亞類的癌癥，并且合適的治療方案相應地改變，以使患 者的良好預后的可能性最大化。
[0016] -種相對較新的方法是研宄癌癥的遺傳譜，旨在鑒定導致惡性表型的基因干擾。 這些基因譜（包括基因表達和突變）提供了關(guān)于正常細胞和疾病細胞的生物學過程的有價 值的信息。然而，癌癥在它們的遺傳"特征"中存在廣泛的不同，這導致在診斷和治療、以及 開發(fā)有效療法中存在困難。
[0017] 越來越多的基因特征被鑒定并且被開發(fā)為用于疾病檢測以及治療成功性的預后 和前景評估的工具。癌癥（包括白血?。┑倪z傳譜可為癌癥處理和/或治療提供更有效的 方法。在本發(fā)明中，成骨髓細胞（meyoloblast)發(fā)展成惡性表型的過程所涉及的特定基因 和基因產(chǎn)物、以及幾組基因及其基因產(chǎn)物很大程度上仍是未知的。因此，本領(lǐng)域非常需要能 夠更好地了解急性髓細胞白血病的遺傳譜，從而致力于為急性髓細胞白血病以及其他血液 癌癥提供改進的治療方法、以及用于處理、治療和診斷的工具。非常需要用于診斷急性髓細 胞白血病的改進方法、以及用于確定罹患該疾病的患者的預后的改進方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明一方面涉及一種預測患有急性髓細胞白血病的患者的生存率的方法，所述 方法包括：分析從所述患者分離的遺傳樣品是否存在細胞遺傳學異常、以及在基因FLT3、 NPM1、DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WT1、IDH1、IDH2、KIT、RUNX1、MLL-PTD、ASXL1、PHF6、KRAS、 PTEN、P53、HRAS和EZH2的至少一者中是否存在突變；以及⑴如果在基因FLT3、MLL-PID、 ASXL1和PHF6中的至少一者中存在突變，則預測所述患者的生存率差，或者（ii)如果在 IDH2R140中存在突變和/或在CEBPA中存在突變，則預測所述患者的生存率良好。在一 個實施方案中，所述方法還包括：如果存在以下情況，則預測患有由細胞遺傳學限定的中度 風險AML的患者的生存率為中度：⑴在基因FLT3-ITD、TET2、MLL-PTD、DNMT3A、ASXL1或PHF6的任意一者中都不存在突變；（ii)在FLT3-ITD中存在突變時，在CEBPA中存在突變， 或（iii)在FLT3-ITD中存在突變但是不存在8號染色體三體（trisomy8)。在另一個實施 方案中，所述方法還包括：如果存在以下情況，則預測所述患者的生存率不良：（i)在不具 有FLT3-IID突變的患者中，在TET2、ASXL1或PHF6或MLL-PID中存在突變，或（ii)所述患 者具有FLT3-ITD突變、以及在TET2、DNMT3A、MLL-PTD中的突變、或8號染色體三體。
[0019] 除非另有要求，在本發(fā)明的該方面以及任何其他方面，所述突變可以是名為"對 AML患者的18個基因進行測序所鑒定的特定的體細胞突變、以及這些突變的性質(zhì)"的下表 中所述突變中的任意一種。
[0020] 在一個實施方案中，所述樣品為DNA，其提取自患者的骨髓或血液。所述提取可以 為之前提取的，并且在本文的所有實施方案中，本發(fā)明所用的樣品可以是之前提供的樣品， 即提取或分離不屬于本方法本身的一部分。在一個相關(guān)的實施方案中，遺傳樣品是由患者 單核細胞（MNC)分離的DNA。在一個實施方案中，生存率差或生存率不良（不利風險）的患 者能存活小于或等于約10個月。在另一個實施方案中，生存率中等的患者能存活約18個 月至約30個月。在另一個實施方案中，生存率良好的患者能存活約32個月或更長時間。
[0021] 在一個方面，本公開涉及一種預測患有急性髓細胞白血病的患者的生存率的方 法，所述方法包括：檢驗來自所述患者的血液或骨髓的遺傳樣品是否在基因FLT3、NPM1、 DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WT1、IDH1、IDH2、KIT、RUNX1、MLL-PTD、ASXL1、PHF6、KRAS、PTEN、 P53、HRAS和EZH2的至少一者中存在突變；以及，如果在基因FLT3-ITD、MLL-PTD、ASXL1、 PHF6的至少一者中存在突變，則預測所述患者的生存率差，或者如果在CEBPA中存在突變 和/或在IDH2的R140位存在突變，則預測所述患者的生存率良好。在一個實施方案中，所 述患者的特征在于基于細胞遺傳學分析具有中度風險。
[0022] 在一個實施方案中，在患有由細胞遺傳學限定的中度風險急性髓細胞白血病且具 有FLT3-ITD突變的患者之中，以下至少一者與所述患者的不良預后以及總生存率差有關(guān)： 8號染色體三體、或在TET2、DNMT3A或MLL-PTD中具有突變。在另一個實施方案中，在患有 由細胞遺傳學限定的中度風險急性髓細胞白血病且在FLT3-ITD基因中具有突變的患者之 中，CEBPA基因的突變與所述患者的改善的預后和總生存率有關(guān)。在一個實施方案中，在具 有IDH1/IDH2和NPM1突變的由細胞遺傳學限定的中度風險AML患者中，與IDH1和IDH2均 為野生型的NPM1-突變的患者相比，總生存率提高。在一個實施方案中，在患有急性髓細胞 白血病的患者之中，IDH2R140突變與總生存率提高相關(guān)。在一個例子中，生存率差或不良 的所述患者（不良風險）能存活小于或等于約10個月。在一個例子中，生存率良好的患者 能存活大約32個月或更長時間。
[0023] 本公開的一個方面涉及一種預測患有急性髓細胞白血病的患者的生存率的方法， 所述方法包括：檢驗來自所述患者的血液或骨髓的遺傳樣品是否在ASXL1和WT1中存在突 變；以及如果檢測到突變的ASXL1和WT1基因，則確定所述患者患有或?qū)⒒加性l(fā)性難治性 急性髓細胞白血病。
[0024] 本公開的另一個方面涉及一種確定患有急性髓細胞白血病的患者對高劑量治療 的響應性的方法，所述方法包括：分析從所述患者分離的遺傳樣品是否在基因DNMT3A和 NPM1中存在突變、以及是否存在MLL易位；以及⑴如果在DNMT3A或NPM1中存在突變，或 存在MLL易位，則確定所述患者能響應高劑量治療；或（ii)如果在DNMT3A或NPM1中不存 在突變，或不存在MLL易位，則確定所述患者不能響應高劑量治療。
[0025] 在一個實施方案中，所述治療包括施用蒽環(huán)類藥物。在一個例子中，蒽環(huán)類藥物選 自由道諾紅霉素、多柔比星、表柔比星、伊達比星、米托蒽醌和阿霉素構(gòu)成的組中。在一個特 定的例子中，蒽環(huán)類藥物為道諾紅霉素。在一個實施方案中，高劑量施用為每天每平方米體 表面積施用60mg(60mg/m2)或更高的道諾紅霉素，持續(xù)3天。在一個特定的實施方案中，高 劑量施用是每天每平方米體表面積施用約90mg(90mg/m2)或更高的道諾紅霉素，持續(xù)3天。 在一個實施方案中，施用約7〇mg/m2至約140mg/m2的高劑量道諾紅霉素。在一個特定的實 施方案中，施用約70mg/m2至約120mg/m2的高劑量道諾紅霉素。在一個相關(guān)的實施方案中， 每天進行該高劑量施用，持續(xù)3天，S卩，例如，在3天內(nèi)共施用約300mg/m2(3X100mg/m2)。在 另一個例子中，每天施用該高劑量，持續(xù)2至6天。在其他臨床狀況下，施用中等劑量的道 諾紅霉素。在一個實施方案中，以約60mg/m2的劑量施用中等劑量的道諾紅霉素。在一個實 施方案中，以約30mg/m2至約70mg/m2的劑量施用中等劑量的道諾紅霉素。另外，在一個實 施方案中，施用約4mg/m2至約25mg/m2的相關(guān)蒽環(huán)類藥物伊達比星。在一個實施方案中，以 約10mg/m2至20mg/m2的劑量施用高劑量的伊達比星。在一個實施方案中，以約6mg/m2至 約10mg/m2的劑量施用中等劑量的伊達比星。在一個特定的實施方案中，每天以約8mg/m2 的劑量施用伊達比星，持續(xù)5天。在另一個例子中，每天施用該中等劑量，持續(xù)2至10天。
[0026] 在一個方面，本公開涉及一種預測患有急性髓細胞白血病的患者是否相對于標準 劑量化療對高劑量化療的響應性更好的方法，所述方法包括：從得自所述患者的血液或骨 髓中獲得DNA樣品；確定基因DNMT3A和NPM1的突變狀態(tài)，并確定是否存在MLL易位；以及， 如果所述樣品對于在DNMT3A或NPM1中的突變或MLL易位呈陽性，則預測相對于標準劑量 化療所述患者對高劑量化療的響應性更好；或者，如果所述樣品為在基因DNMT3a或NPM1中 不存在突變且不存在MLL易位的野生型，則預測相對于標準劑量化療所述患者對高劑量化 療無響應性。
[0027] 本公開的一個方面涉及一種篩查患有急性髓細胞白血病的患者對用高劑量的道 諾紅霉素或其可藥用的鹽、溶劑化物或水合物進行治療的響應性的方法，包括：從所述個體 中獲得含有急性髓細胞白血病細胞的遺傳樣品；以及，檢驗所述樣品，并且檢測DNMT3A或 NPM1中是否存在突變或是否存在MLL易位；以及，與不存在突變的野生型對照相比較，將 DNMT3A或NPM1中具有突變或者具有MLL易位的發(fā)現(xiàn)與所述急性髓細胞白血病患者對用高 劑量的道諾紅霉素或其可藥用的鹽、溶劑化物或水合物進行治療的敏感性更高相關(guān)聯(lián)。在 一個實施方案中，所述方法還包括，如果檢測到DNMT3A或NPM1中的突變或MLL易位，則預 測所述患者在化療后急性髓細胞白血病復發(fā)的風險較低。
[0028] 本公開的另一個方面涉及一種確定個體是否對患上急性髓細胞白血病或該病復 發(fā)具有增加的遺傳風險的方法，所述方法包括：分析從所述個體的血液或骨髓分離的遺 傳樣品是否在基因FLT3、NPM1、DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WT1、IDH1、IDH2、KIT、RUNX1、 MLL-PTD、ASXL1、PHF6、KRAS、PTEN、P53、HRAS和EZH2 的至少一者中存在突變；以及，與在 所述基因中不具有所述基因突變的對照個體相比，當：（i)在不具有FLT3-ITD突變的患者 中檢測到在基因TET2、MLL-PTD、ASXL1和PHF6的至少一者中有突變時，或者（ii)在具有 FLT3-IID突變的患者中檢測到在基因TET2、MLL-PID和DNMT3A的至少一者中有突變、或者 檢測到8號染色體三體時，確定具有由細胞遺傳學限定的中度風險AML的個體患上急性髓 細胞白血病或該病復發(fā)的遺傳風險增加。
[0029] 在一個方面，本公開涉及一種為患有急性髓細胞白血病的患者制備個性化基因組 圖譜的方法，包括：對從來自所述患者的骨髓抽出物或血液樣品中提取的單核細胞進行基 因突變分析；檢驗所述樣品，并在所述細胞中檢測是否存在細胞遺傳學異常、以及在選自由 基因FLT3、NPM1、DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WT1、IDH1、IDH2、KIT、RUNX1、MLL-PTD、ASXL1、 PHF6、KRAS、PTEN、P53、HRAS和EZH2構(gòu)成的組中的基因中是否存在一種或多種突變；以及， 將由所述基因突變分析獲得的數(shù)據(jù)產(chǎn)生報告，其中所述報告包括對所述患者的生存可能性 或治療響應性的預測。
[0030] 在一個方面，本公開涉及一種用于確定對患有AML的患者的治療的試劑盒，所述 試劑盒包括：用于檢測選自由基因ASXL1、DNMT3A、NPM1、PHF6、WT1、TP53、EZH2、CEBPA、 TET2、RUNX1、PTEN、FLT3、HRAS、KRAS、NRAS、KIT、IDH1 和IDH2 構(gòu)成的組中的至少一種基因 的突變的裝置；以及基于一種或多種所述基因中突變的存在進行推薦治療的說明。在一個 例子中，基于DNMT3A或NPM1突變或MLL易位的存在而對所述患者進行推薦治療的說明指 示以高劑量道諾紅霉素為推薦的治療。
[0031] 本公開的一個方面涉及一種在患者中治療、預防或處理急性髓細胞白血病的方 法，包括：分析從所述患者分離的遺傳樣品在基因DNMT3A和NPM1中是否存在突變以及是否 存在MLL易位；如果DNMT3A或NPM1存在突變或存在MLL易位，則確定所述患者對高劑量 化療的響應性好于標準劑量化療；以及，向所述患者施用高劑量治療。在一個例子中，所述 患者的特征在于基于細胞遺傳學分析具有中度風險。在一個例子中，所述治療包括施用蒽 環(huán)類藥物。在一個相關(guān)的實施方案中，施用高劑量治療包括施用高劑量的選自由道諾紅霉 素、多柔比星、表柔比星、伊達比星、米托蒽醌和阿霉素構(gòu)成的組中的一種或多種蒽環(huán)類抗 生素。
[0032] 本公開的一個方面涉及一種預測患有急性髓細胞白血病的患者生存率的方法，包 括：（a)分析從所述患者分離的樣品是否存在以下情況：（i)在基因FLT3、MLL-PTD、ASXL1 和PHF6的至少一者中的突變，以及任選的在基因NPM1、DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WT1、 10111、10112、1(11\冊似1、1(狀5、？1￡隊？53、11狀5和￡2112的一者或多者中的突變 ；或（^)在 基因IDH2和/或CEBPA中的突變，以及任選的在基因FLT3、MLL-PTD、ASXL1、PHF6、NPM1、 DNMT3A、NRAS、TET2、WT1、IDH1、KIT、RUNX1、KRAS、PTEN、P53、HRAS和EZH2 的一者或多者中 的突變；以及（b) (i)如果在基因FLT3、MLL-PTD、ASXL1和PHF6中的至少一者中存在突變， 則預測所述患者的生存率差，或者（ii)如果在IDH2R140中存在突變和/或在CEBPA中存 在突變，則預測所述患者的生存率良好。所述方法還包括分析所述樣品中是否存在細胞遺 傳學異常。所述方法還包括：如果以下突變存在：IDH2R140Q，則預測所述患者的生存率良 好。
[0033] 本公開的其他方面包括化療在本文所述的方法中的應用，或者在用于本文所述的 方法中時在藥物的制備中的應用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1示出了AML的突變的復雜性。Circos圖示出了加入ECOG協(xié)議E1900的原發(fā) 性AML患者中的突變的相對頻率和成對發(fā)生情況（圖A)。弧長對應于第一個基因的突變 頻率，帶寬對應于在第二個基因中也具有突變的患者的百分比。突變的成對發(fā)生僅示出一 次，以順時針方向的第一個基因開始。由于為了清楚性僅編入了成對突變，因此調(diào)節(jié)弧長以 維持弧的相對大小，并且具有單等位基因突變的患者的校正比例由各突變亞群內(nèi)的空隙表 示。圖A還包括測試人群中的突變頻率。圖B和圖C分別示出了DNMT3A和FLT3突變患者 中的突變情況。
[0035] 圖2示出了中度風險AML的多因素風險分類。示出了總生存率（OS)的 Kaplan-Meier估計以進行中度風險AML的風險分級（p值表示所有曲線的比較）。對于 FLT3-ITD陰性的中度風險AML(圖A)，有三種基因型：由突變體TET2或ASXL1或PHF6或 MLL-PTD限定的高風險，由突變體IDH1或IDH2和突變體NPM1限定的低風險，以及由所有其 他基因限定的中度風險。對于FLT3-ITD陽性的中度風險AML(圖B)，存在突變體CEBPA基 因型，由突變體TET2或DNMT3A或MLL-PTD或8號染色體三體、以及所有其它基因型限定的 尚風險。
[0036] 圖3基于整合的遺傳分析示出了經(jīng)過修訂的AML風險分級。圖3A基于整合的細 胞遺傳學和突變分析示出了經(jīng)過修訂的風險分級。最終的總風險組在右側(cè)。圖3B示出了 整合的突變分析對AML患者測試人群中風險分級的影響（p值表示所有曲線的比較）。黑色 曲線示出了細胞遺傳學風險人群中未改變的患者。綠色曲線示出了由中度風險重新劃分為 低風險的患者。紅色曲線示出了由中度風險重新劃分為高風險的患者。圖3C證實了在來 自E1900試驗的104個樣品的獨立人群中，遺傳預后模式的再現(xiàn)性（p值表示所有曲線的比 較）。
[0037] 圖4示出了對高劑量道諾紅霉素誘導化療響應的分子決定因素。根據(jù)DNMT3A突 變狀態(tài)，示出了全部人群中OS的Kaplan-Meier估計（圖A)，根據(jù)接受高劑量或標準劑量道 諾紅霉素的患者的DNMT3A狀態(tài)，示出了全部人群中OS的Kaplan-Meier估計（圖B)。根據(jù) 治療方式，示出了具有DNMT3A或NPM1突變或MLL易位的患者中的OS(圖C)，以及示出了不 具有DNMT3A或NPM1突變或MLL易位的患者中的OS(圖D)。
[0038] 圖5為示出了綜合突變分析譜改善了患有急性髓細胞白血?。ˋML)的患者的風險 分級和臨床處理。利用突變分析譜描繪了具有顯著不同預后的由細胞遺傳學限定的中度風 險的患者的亞群，并將相當大比例的患者重新分配為低風險或高風險類別（A)。另外，突變 分析譜確定了利用高劑量蒽環(huán)類藥物誘導化療后具有改善的預后的AML患者的遺傳限定 的亞群（B)。
[0039] 圖6為示出了各基因的Circos圖。
[0040]圖7示出了由細胞遺傳學限定的低風險亞組（圖A)、中度風險亞組（圖B)和高風 險亞組（圖C)的患者中的所有基因和一些相關(guān)的細胞遺傳學異常的Circos圖。圖D示出 了在各細胞遺傳學風險類別中，具有大于2個突變的患者的百分比。具有2個或多個體細 胞突變的中度風險的患者比例明顯高于另外兩個細胞遺傳學亞組中的患者。
[0041] 圖8為示出了IDH1、IDH2、TET2和WT1突變的互相排斥的Circos圖。
[0042] 圖9根據(jù)突變狀態(tài)示出了0S的Kaplan-Meier估計：根據(jù)PHF6(圖A)和ASXL1(圖 B)的突變狀態(tài)，示出了全部人群中0S的數(shù)據(jù)。
[0043]圖 10 示出 了全部人群中IDH2 (圖A)、IDH2R140 (圖B)、IDH1 (圖C)和IDH2R172 (圖 D) 等位基因的Kaplan-Meier生存率估計。圖E示出了兩個IDH2等位基因，圖F示出了所 有三個IDH等位基因（p值表示所有曲線的比較）。這些數(shù)據(jù)表明在全部人群中，IDH2R140 等位基因是唯一一個與預后相關(guān)的IDH2等位基因。
[0044] 圖11示出了在核心結(jié)合因子改變的測試人群中，KIT有突變的患者與KIT野生型 的患者的OS的Kaplan-Meier估計。當研宄了具有任意的核心結(jié)合因子改變的患者時（即 具有t(8 ;21)、inv(16)或t(16 ;16)的患者），KIT突變與OS的差異不相關(guān)（A)。形成對比 的是，在特別地具有t(8 ;21)的患者中，KIT突變與OS明顯降低有關(guān)（B)。在具有inv(16) 或t(16;16)的患者中，KIT突變與不利的OS無關(guān)（C)。
[0045] 圖12示出了對人群中的由細胞遺傳學限定的中度風險的患者的TET2的 Kaplan-Meier生存率估計。
[0046] 圖13示出了人群中的具有由細胞遺傳學限定的中度風險的NPM1-突變患者的 Kaplan-Meier生存率估計。只有伴隨IDH突變的患者的生存率提高。
[0047] 圖14示出，圖3所示的FLT3-ITD野生型（A)和突變體⑶中度風險AML的風險 分類情況在這里僅對正常核型的患者顯示。
[0048] 圖15示出，不管是無移植（A)、自體移植（B)還是同種異體移植（C)的緩解后治 療，突變預后模式預測了結(jié)果（P值表示所有曲線的比較）。注意，曲線表示整合了細胞遺傳 學和突變分析的總風險分類（如圖3A最后一列所示）。
[0049] 圖16示出了在接受高劑量或標準劑量的道諾紅霉素的患者中，根據(jù)DNMT3A突變 狀態(tài)（圖A和B)、MLL易位狀態(tài)（圖C和D)或NPM1突變狀態(tài)（圖E和F)的全部人群的0S Kaplan-Meier估計。按照治療方式在DNMT3A突變體（圖A)和野生型（圖B)患者中示出 了患者的0S。圖C示出了在接受高劑量或標準劑量的道諾紅霉素的MLL易位患者的0S，而 圖D按照道諾紅霉素劑量示出了無MLL易位患者的0S。按照治療方式在NPM1突變體（圖 E) 和野生型（圖F)患者中示出了患者的0S。
[0050] 表1示出了ECOGE1900試驗的測試人群、驗證人群和全部人群的樣品的基本特 征。
[0051] 表2示出了用于綜合遺傳分析的基因組DNA引物序列。所有引物序列帶有M13F2/ M13R2標簽。
[0052] 表3示出了在測試人群中所確定的所有突變的比例風險的檢驗p值。
[0053] 表4示出了對ECOGE1900全部人群以及各細胞遺傳學風險組的患者進行測序而 得到的基因突變頻率。
[0054] 表5示出了在來自ECOGE1900試驗的具有原發(fā)性AML的398位AML患者測試人 群中，體細胞突變和細胞遺傳學異常的共發(fā)生情況。
[0055] 表6示出了所有遺傳異常的成對關(guān)系。
[0056] 表7示出了頻繁共發(fā)生的遺傳異常。
[0057] 表8不出了互相排斥的遺傳異常。
[0058] 表9示出了在ECOGE1900人群中單個基因突變對總生存率的影響的單變量分析。
[0059] 表10示出了在ECOGE1900人群中單個基因突變對中度風險人群的影響的單變量 分析。
[0060] 表11示出了基于綜合遺傳分析的經(jīng)修訂的AML風險分類，其中示出了各遺傳風險 類別中患者的頻率和數(shù)量。
[0061] 表12示出了在所分析的ECOGE1900患者的測試人群和全部人群中，遺傳預后模 式不依賴于治療相關(guān)性死亡率和化療耐藥性。
[0062] 表13示出了根據(jù)AML患者的基因型，對高劑量和標準劑量道諾紅霉素誘導化療的 不同的響應。
[0063] 發(fā)明詳述
[0064] 提供以下說明以便于理解本發(fā)明。通常，應當理解，如果沒有對術(shù)語進行其它限 定，應當認為它們具有本領(lǐng)域通常接受的含義和意義。本文所用的術(shù)語僅用于描述具體的 實施方案，而不用于限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅受到隨附的權(quán)利要求的限定。
[0065] 在本發(fā)明的實踐中，使用了分子生物學中的許多常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在以下文獻 中有詳細描述，例如：MolecularCloning:aLaboratoryManual，第 3 版，J.F.Sambrook 和D.W.Russell編著，ColdSpringHarborLaboratory出版社，2001 ;以及DNA Microarrays:AMolecularCloningManual，D.Bowtell和J.Sambrook編著，ColdSpring HarborLaboratory出版社，2002。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員在哺乳動物細胞的突變分析中已 知和使用的標準實驗方案（包括用于制備樣品和使用微陣列平臺的制造商說明手冊）的內(nèi) 容通過引用的方式并入作為本公開的一部分。
[0066] 在下文中，廣泛使用一系列術(shù)語。提供以下定義以便于理解本發(fā)明。除非另有說 明，"一個"、"一種"、"所述"和"至少一者"可互換使用，表示一種或多于一種。
[0067] 術(shù)語"癌癥"、"癌癥的"或"惡性的"指的是或描述哺乳動物的生理狀況，其典型特 征在于腫瘤細胞不受調(diào)控的生長。血液癌癥的例子包括但不限于急性髓細胞白血病。
[0068] 本文所用的術(shù)語"診斷"是指這樣的行為或過程：通過評價疾病或失調(diào)的體征和癥 狀，鑒定或確定哺乳動物的疾病或病癥、或者引起疾病或病癥的因素。通常，基于對象征疾 病的一種或多種因素和/或癥狀進行評價來診斷疾病或病癥。即，可以根據(jù)象征疾病或病 癥存在與否的因素的存在與否或其量來作出診斷。各個被認為象征特定疾病而用于診斷的 因素或癥狀不需要獨特地與所述特定疾病相關(guān)；即，可能存在可從診斷性因素或癥狀推斷 出的不同診斷。同樣地，可能存在這樣的情況：在不具有特定疾病的個體中，存在象征該特 定疾病的因素或癥狀。
[0069] 本文所用的"表達圖譜"可表示基因組表達圖譜。圖譜可通過任何用于確定核酸 序列水平的方便的方式生成，例如microRNA、標記的microRNA、擴增的microRNA、cRNA等的 定量雜交、定量PCR、定量ELISA等，并允許對兩種樣品之間的基因表達差異進行分析。檢驗 受試者或患者的腫瘤樣品，例如，細胞或它們的集合（如組織）。通過本領(lǐng)域已知的方法的 任何方便的方法收集樣品。
[0070] 本文所用的"基因"可為包括轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)控序列、和/或編碼區(qū)域、和/或 非翻譯序列（如內(nèi)含子、5'-和3'-未翻譯序列）的天然（如基因組）基因?；虻木幋a區(qū) 域可為編碼氨基酸序列或功能性RNA(如tRNA、rRNA、催化性RNA、siRNA、miRNA或反義RNA) 的核苷酸序列。術(shù)語"基因"具有本領(lǐng)域所理解的含義。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠理 解，術(shù)語"基因"在本領(lǐng)域中具有許多含義，有些包括基因調(diào)控序列（如促進子、增強子等） 和/或內(nèi)含子序列，其他的則限于編碼序列。還應當理解，"基因"的定義包括是指不編碼蛋 白質(zhì)而是編碼功能性RNA分子（如tRNA)的核酸。為了清楚起見，我們注意到本申請中使 用的術(shù)語"基因"通常是指編碼蛋白質(zhì)的核酸的一部分；所述術(shù)語還任選地包括調(diào)控序列。 該定義不旨在排除術(shù)語"基因"可用于非蛋白質(zhì)編碼表達單元，而是旨在明確，在大部分情 況下，本文中所用的該術(shù)語是指編碼蛋白質(zhì)的核酸。
[0071] 用于處理或治療目的的"哺乳動物"是指被分類為哺乳動物的任何動物，包括人、 家畜和農(nóng)畜、以及動物園動物、競技動物或?qū)櫸铮ㄈ绻贰ⅠR、貓、牛等）。優(yōu)選地，所述哺乳動 物為人。
[0072] "微陣列"是指可雜交的陣列元件（優(yōu)選為多核苷酸探針）在基板上的有序排布。
[0073] 用于執(zhí)行本發(fā)明方法的治療劑包括但不限于對本文鑒定和公開的基因的表達或 活性、或其蛋白質(zhì)翻譯物的抑制劑。"抑制劑"是能夠阻礙或防止化學反應或生理反應或響 應的任何物質(zhì)。通常抑制劑包括但不限于反義分子、抗體和拮抗物。
[0074] 本文所用的術(shù)語"差"與"不良"可互換使用。本文所用的術(shù)語"好"可表示"良 好"。本文所用的術(shù)語"差響應者"是指在標準治療（如放射-化療）期間或在標準治療后 很短時間內(nèi)，癌生長的個體，或是指經(jīng)歷由癌癥引起的臨床上顯著的衰退的個體。本文所用 的術(shù)語"對治療響應"是指在標準治療（如放射-化療）期間或在標準治療后很短時間內(nèi)， 腫瘤或癌保持穩(wěn)定或變小/減少的個體。
[0075] "探針"可來源于天然產(chǎn)生的或重組的單鏈或雙鏈核酸，或可為化學合成的。它們 用于檢測相同或類似序列的存在?？衫们锌谄揭品ā1enow補平反應、PCR或其他本領(lǐng)域 已知的方法，使這樣的探針標記有報告分子。核酸探針可用于southern、northern或原位 雜交，從而確定編碼特定蛋白質(zhì)的DNA或RNA是否存在于細胞型、組織或器官中。
[0076] 本文所用的"預后"是指預測癌癥的可能后果，包括癌癥恢復的預期。如本文所 用，術(shù)語預后信息和預測信息可互換地表示在治療進行或未進行的情況下可用于預告疾病 或病癥的過程的任何方面的信息。這樣的信息可包括但不限于，患者的平均預期壽命、患者 存活給定時間的可能性（例如，6個月、1年、5年等）、患者疾病被治愈的可能性、患者的疾 病將對特定的治療有響應的可能性（其中，響應可以用任何不同的方式來定義）。預后和預 測性信息都包含在診斷信息的廣義類別中。
[0077] 本文所用的術(shù)語"預后"是指對臨床病癥或疾病的可能的過程和結(jié)果的預測。患者 的預后通常通過評價象征有利的或不利的疾病過程或結(jié)果的因素或癥狀確定。本文所用的 術(shù)語"確定預后"是指本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過其預測患者病癥的過程或結(jié)果的過程。術(shù) 語"預后"并非是指能夠100%準確地預測病癥的過程或結(jié)果。相反，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠 理解，術(shù)語"預后"是指特定的過程或結(jié)果將會發(fā)生的概率增加；也就是說，與不表現(xiàn)病癥的 個體相比，該過程或結(jié)果更可能在表現(xiàn)出給定病癥的患者體內(nèi)發(fā)生。預后可以表示為預期 患者可以存活的時間量。或者，預后可以是指疾病緩解的可能性或疾病有望保持緩解的時 間量。預后可以以不同的方式表示；例如預后可以表示為病人在一年后、五年后、十年后等 存活的百分比概率。任選地，預后可以表示為患者由于病癥或疾病可預期存活的平均月份 數(shù)。患者的預后可被認為是相對性的表現(xiàn)，有許多因素影響最終的結(jié)果。例如，對于特定病 癥的患者，預后可以適當?shù)乇硎緸椴“Y可治療或可治愈的可能性、或疾病將緩解的可能性， 而患有更嚴重病癥的患者的預后可更適當?shù)乇硎緸榇婊钐囟〞r間的可能性。
[0078] 本文所用的術(shù)語"良好預后"和"積極預后"、或"不良預后"和"消極預后"是預測 病癥或疾病的可能過程和/或可能結(jié)果的相對術(shù)語。良好或積極的預后與不良或消極或不 利的預后相比預測了病癥更好的結(jié)果。在一般意義上的"良好預后"相比于與特定病癥有 關(guān)的其他可能預后是相對較好的結(jié)果，而"不良預后"相比于與特定病癥有關(guān)的其他可能預 后是相對較差的結(jié)果。良好預后或積極預后的典型例子包括比平均更好的治愈率、更低的 轉(zhuǎn)移傾向、更長的預期壽命、不同于癌癥過程的良性過程等。例如，如果預后為在治療后患 者的特定癌癥有50%的可能性被治愈，而患有相同癌癥的患者平均僅有25%的可能性被 治愈，那么該患者示出了積極預后。積極預后可以為如果區(qū)別于惡性腫瘤則診斷為良性腫 瘤。
[0079] 在本申請關(guān)于癌癥的上下文中所用的術(shù)語"復發(fā)"或"再發(fā)"是指在緩解或改善一 段時間后，癌癥體征和癥狀恢復。
[0080] 本文所用的對治療的"響應"可以指由于治療受試者病癥出現(xiàn)任何有益的改變。這 樣的改變可以包括病癥的穩(wěn)定（例如，防止在不進行治療的情況下會發(fā)生的惡化）、病癥的 癥狀的改善、病癥治愈的前景的改善?？梢苑Q為受試者的響應或腫瘤的響應。通常，在本文 中這些概念可互換使用。
[0081] "處理"或"治療"指治療性處理和預防性或防范性措施。術(shù)語"治療有效量"是指 有效治療哺乳動物中疾病或失調(diào)的藥物的量。在癌癥的情況中，藥物的治療有效量可減少 癌細胞的數(shù)目；減小腫瘤大小；抑制（即，減緩到一定程度、優(yōu)選停止）癌細胞浸潤周圍器 官；抑制（即，減緩到一定程度、優(yōu)選停止）腫瘤轉(zhuǎn)移；在一定程度上抑制腫瘤的生長；和/ 或一定程度上緩解與失調(diào)有關(guān)的一種或多種癥狀。
[0082] 對本文描述的數(shù)值范圍，明確地包含插入到兩端值之間的具有相同精確度的每一 個數(shù)。例如，對于2-5的范圍，除了 2和5以外，包含3和4,對于2.0-3. 0的范圍，明確地包 含 2. 0、2. 1、2. 2、2. 3、2. 4、2. 5、2. 6、2. 7、2. 8、2. 9 和 3. 0。如本文所用，術(shù)語"約"X或"近似 于"X是指所述值X的+/-10%。
[0083] 癌癥的診斷和治療的固有困難包括，其中存在有多種不同亞類的癌癥，并且合適 的治療方案相應地改變，以使患者的積極預后的可能性最大化。目前，癌癥治療的方法是相 對非選擇性的。通常情況下，手術(shù)用于去除患病組織；放射治療是用于縮小實體瘤；化學治 療用來殺死快速分裂的細胞。
[0084] 在血液癌癥的情況下，值得首先注意到血液主要由紅血細胞（RBC)、白血細胞 (WBC)和血小板構(gòu)成。血紅細胞向機體攜帶氧氣，白血細胞維持保護我們的身體，并且血小 板幫助血液在受傷以后凝結(jié)。這些細胞類型的異常情況可導致血液癌癥。血液癌癥的主 要種類包括急性淋巴細胞或淋巴母細胞白血?。ˋLL)、慢性淋巴細胞或淋巴母細胞白血病 (CLL)、急性骨髓性或髓細胞白血?。ˋML)以及慢性骨髓性或髓細胞白血病（CML)。
[0085] 白血病和淋巴瘤都是血液和骨髓的血液學惡性腫瘤（癌）。在白血病的情況下，癌 癥的特征是白細胞的異常增殖，并且是癌癥的四種主要類型之一。癌癥干擾機體造血的能 力，并且癌攻擊骨髓和血液自身，引起疲乏、貧血、虛弱和骨痛。通過血液測試診斷白血病， 其中對特定類型的血細胞進行計數(shù)；在美國，每年確診約29, 000名成人和2000名兒童。白 血病的治療通常包括化療和放療以殺死癌細胞，并且在一些情況下包括骨髓移植。
[0086] 根據(jù)最主要涉及的白細胞的類型對白血病進行分類。急性白血病主要是未分化的 細胞群，慢性白血病有比較成熟細胞形式。急性白血病分為淋巴母細胞（ALL)和非淋巴母 細胞（ANLL)類型，其中ALL主要是兒童疾病，而ANLL(也稱為急性髓細胞白血病（AML))是 成年人中較為常見的急性白血病。
[0087] 白血病的特征在于骨髓中骨髓細胞的數(shù)量增加以及它們成熟停滯，通常造成造血 機能不足。在美國，AML的年發(fā)病率是大約每100, 000人中2. 4人發(fā)病，并且隨著年齡逐漸 增大至峰值，即65歲或以上的成年人中每100, 000人中有12. 6人發(fā)病。盡管治療方法有 所改善，世界各地的AML預后都非常差。即使是在美國，在小于65歲的患者中5年生存率 小于40%。
[0088] 急性髓細胞白血?。ˋML)是一種異質(zhì)性疾病，其包括許多種具有不同遺傳異常和 臨床特征的實體。僅對相對較少類型的白血病的發(fā)病機制有完整的描述。細胞遺傳學中度 風險和高風險的患者代表了大多數(shù)AML;基于化療的方法不能治愈大部分該類患者，因此 干細胞移植成為了通常的治療選擇。由于異源干細胞移植不能成為很多高風險白血病患者 的選擇，因此需要我們提高對這些白血病的生物學的認識并研宄更好的治療方法。盡管取 得了很大進展，但沒有足夠了解急性髓細胞白血病的病因?qū)W、細胞生理學和分子遺傳學，因 此目前轉(zhuǎn)移腫瘤學研宄的主要焦點在于開發(fā)針對髓細胞白血病，特別是急性髓細胞白血病 的有效新試劑以及新的治療方法和/或診斷方法。
[0089] 在了解造成AML的風險因素方面（包括遺傳因素）已經(jīng)取得了顯著的進展，但是 這些因素與臨床結(jié)果的關(guān)系仍然不明確。另外，一些蛋白質(zhì)的表達水平和抗體染色模式已 被證明能預測結(jié)果和響應治療的可能性。然而，患者個體的臨床結(jié)果仍然不確定，并且仍然 難以預測哪些患者可能受益于特定類型的治療（例如，某種藥物或一類藥物）。
[0090] 在本公開中，獲得了來自診斷有AML的患者的白血病樣品。收集骨髓或外周血液 樣品，通過Ficoll_Hypaque(Nygaard公司）梯度離心制備。如之前所述現(xiàn)場進行樣品的細 胞遺傳學分析（Bloomfield;Leukemial992 ;6:65_67. 21)。該標準用于根據(jù)國際人類細胞 遺傳學命名系統(tǒng)（InternationalSystemforHumanCytogeneticNomenclature)的建議 描述細胞遺傳學克隆和核型。使用之前所述方法從診斷性骨髓抽出物樣品或外周血樣品中 提取DNA(Zuo等，ModPathol. 2009 ;22, 1023-1031) 〇
[0091] 本公開基于對398位隨機接受誘導治療（包括高劑量或標準劑量道諾紅霉素）的 年齡小于60歲的患有AML的患者中的18個基因的突變分析。預后結(jié)果進一步在一組獨立 的104位患者中驗證。
[0092] 本申請的發(fā)明人已經(jīng)確認，在97. 3%的患者中有大于等于1個的體細胞改變。申 請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)：（1)FLT3-ITD(p= 0? 001)、MLL-PTD(p= 0? 009)、ASXL1(p= 0? 05)和PHF6(p =0. 006)突變與總生存率（OS)降低有關(guān)；以及⑵CEBPA(p= 0. 05)和IDH2R140Q(p= 0.01)突變與OS提高有關(guān)。
[0093] 因此，根據(jù)本公開的一個方面，本公開涉及一種一種預測患有急性髓細胞白血病 的患者的生存率的方法，所述方法包括：分析從所述患者分離的遺傳樣品是否存在細胞遺 傳學異常、以及在基因FLT3、NPM1、DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WT1、IDH1、IDH2、KIT、RUNX1、 MLL-PTD、ASXL1、PHF6、KRAS、PTEN、P53、HRAS和EZH2 的至少一者中是否存在突變；以及， ⑴如果在基因FLT3、MLL-PTD、ASXL1和PHF6中的至少一者中存在突變，則預測所述患者 的生存率差，或者（ii)如果在IDH2R140(例如，IDH2R140Q)中存在突變和/或在CEBPA中 存在突變，則預測所述患者的生存率良好。在一個實施方案中，所述方法還包括：如果存在 以下情況，則預測患有由細胞遺傳學限定的中度風險AML的患者的生存率為中度：⑴在基 因FLT3-ITD、TET2、MLL-PTD、DNMT3A、ASXL1 或PHF6 的任意一者中都不存在突變；（ii)在CEBPA和FLT3-III)中存在突變，或（iii)在FLT3-III)中存在突變但是不存在8號染色體三 體。在另一個實施方案中，所述方法還包括：如果存在以下情況，則預測所述患者的生存率 不良：⑴在不具有FLT3-ITD突變的患者中，在TET2、ASXL1或PHF6中存在突變，或者存在 MLL-PTD，或（ii)所述患者具有FLT3-ITD突變、以及TET2、DNMT3A、MLL-PTD中的突變、或8 號染色體三體。
[0094] 所述遺傳樣品可得自骨髓抽出物、或病人的血液。一旦獲得樣品，在一個例子中， 根據(jù)已知的技術(shù)（包括Ficoll分離）分離單核細胞并提取DNA。在一個特定的實施方案 中，患者的差的生存率或不良風險為生存率小于或等于約10個月。然而，在一個實施方案 中，生存率中等的患者能存活約18個月至約30個月。在另一個實施方案中，生存率良好的 患者能存活約32個月或更長時間。
[0095] 在另一個方面，本公開涉及一種預測患有急性髓細胞白血病的患者生存率的方 法，所述方法包括：對來自所述患者的血液或骨髓的遺傳樣品進行檢驗，檢驗所述樣品中是 否存在基因FLT3、NPM1、DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WT1、IDH1、IDH2、KIT、RUNX1、MLL-PTD、 ASXL1、PHF6、KRAS、PTEN、P53、HRAS和EZH2的至少一者中的突變；以及，如果在基因 FLT3-ITD、MLL-PTD、ASXL1、PHF6的至少一者中存在突變，則預測所述患者的生存率差，或者 如果在CEBPA中存在突變和/或在IDH2的R140位存在突變，則預測所述患者的生存率良 好。在一個實施方案中，所述患者的特征在于基于細胞遺傳學分析具有中度風險。
[0096] 在一個實施方案中，在患有由細胞遺傳學限定的中度風險急性髓細胞白血病且具 有FLT3-ITD突變的患者之中，以下至少一者與所述患者的不良預后以及總生存率差有關(guān)： 8號染色體三體、或在TET2、DNMT3A或MLL-PTD中具有突變。在另一個實施方案中，在患有 由細胞遺傳學限定的中度風險急性髓細胞白血病且在FLT3-ITD基因中具有突變的患者之 中，CEBPA基因的突變與所述患者的改善的預后和總生存率有關(guān)。在一個實施方案中，在具 有IDH1/IDH2和NPM1突變的由細胞遺傳學限定的中度風險AML患者中，與IDH1和IDH2均 為野生型的NPM1-突變的患者相比，總生存率提高。在一個實施方案中，在患有急性髓細胞 白血病的患者之中，IDH2R140突變與總生存率提高相關(guān)。在一個例子中，生存率差或不良 的所述患者（不良風險）能存活小于或等于約10個月。在一個例子中，生存率良好的患者 能存活大約32個月或更長時間。
[0097] 在一個實施方案中，NPM1突變的有利影響限于同時具有IDH1/IDH2和NPM1突變 的患者。此外， 申請人:鑒定了預后的遺傳預告因子，其獨立于年齡、WBC計數(shù)、誘導劑量和緩 解后治療而改善了AML的風險分級，并且證實了它們在獨立群體中的重要性。 申請人:發(fā)現(xiàn)， 相對于標準劑量道諾紅霉素的治療，高劑量的道諾紅霉素能改善具有DNMT3A或NPM1突變 或MLL易位的患者的生存率（p= 0. 001)，但這些改變未見于為野生型的患者（p= 0. 67)。
[0098] 這些數(shù)據(jù)通過描述能預測AML結(jié)果并改善AML風險分級的突變，提供了AML遺傳 改變的臨床意義。 申請人:在此發(fā)現(xiàn)并證明了突變譜在改善AML預后和治療決策中的效用， 并且特別地，示出了DNMT3A或NPM1突變或MLL易位能預測改善的高劑量誘導化療的結(jié)果。
[0099] 以前的研宄已經(jīng)強調(diào)了急性髓細胞白血?。ˋML)的臨床和生物異質(zhì)性。然而，相 對較少的細胞遺傳學和分子損傷與影響臨床實踐有足夠的相關(guān)性。細胞遺傳學異常的預后 相關(guān)性導致廣泛在三個由細胞遺傳學限定的、0S有顯著差異的風險組中采用風險分級。盡 管已經(jīng)在確定AML預后標志物中取得了進展，但很大比例的患者缺乏預后顯著性的特定異 常。此外，在各風險組中患者個體的預后存在顯著的差異。
[0100] 近來的研宄已經(jīng)在患有AML的患者中確定了許多頻發(fā)的體細胞突變，然而，迄今 為止，在臨床試驗人群中仍然沒有研宄出是否更多的基因的突變譜能夠改善AML的預后。 在這里， 申請人:認為，對在>5%的AML患者中發(fā)生的所有已知的分子改變的綜合突變分析 能夠確認AML的預后的新分子標志物，并且能夠確認能受益于劑量增加的誘導化療的在分 子水平上限定的患者亞群。
[0101] AML中的高通量突奪譜：綜合遺傳分析
[0102] 臨床研宄表明，急性髓細胞白血?。ˋML)在表現(xiàn)和臨床結(jié)果方面是異質(zhì)的，并且 已經(jīng)有研宄表明，細胞遺傳學可以用來改善預后并指導治療決策。最近，遺傳研宄提高了我 們對AML的遺傳基礎的了解。 申請人:認識到遺傳損傷代表預后標志物，其可用于對AML患 者進行風險分級并且指導治療決策。然而，盡管在AML中許多基因以很高的頻率發(fā)生突變， 其預后價值在大型III期臨床試驗的人群中仍然是未知的。
[0103] 申請人:首次報導了在均等治療的臨床人群中的已知在AML中突變顯著（>5% )的 所有基因的突變狀態(tài)、以及這些基因的突變對結(jié)果和對治療響應性的影響。 申請人:使用了 高通量重測序平臺對來自ECOGE1900研宄中所登記的398位原發(fā)性AML患者的預處理基 因組DNA的FLT3、NPM1、DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WT1、IDH1、IDH2、KIT、RUNX1、MLL-PTD、 ASXL1、PHF6、KRAS、PTEN、P53、HRAS和EZH2的編碼區(qū)進行了全長重測序。
[0104] 通過包括突變和細胞遺傳學異常， 申請人:在E1900人群的所有患者的91. 2%中確 定了克隆改變；42%有1種體細胞改變，36. 4%有2種體細胞改變，11. 3%有3種體細胞改 變以及1. 5%有4種體細胞改變。每個病人的突變數(shù)據(jù)與總生存率、無病生存率、以及與治 療方案（標準劑量或高劑量道諾紅霉素）相關(guān)。 申請人:在FLT3(總計37% ;30%ITD、7% TKD)、DNMT3A(23% )、NPM1(14% )、CEBPA(10% )、TET2(10% )、NRAS(10% )、WT1(10% )、 KIT(9% )、IDH2(8% )、IDH1(6% )、RUNX1(6% )、ASXL1(4% )、PHF6(3% )、KRAS(2. 5% )、 TP53(2% )、PTEN(1. 5% )中發(fā)現(xiàn)了體細胞突變；在 申請人:的篩選中沒有發(fā)生突變的基因僅 為HRAS和EZH2。
[0105] 接下來， 申請人:使用相關(guān)分析來評估突變是否呈正相關(guān)或負相關(guān)（圖1)。除了確 定突變的相關(guān)性（FLT3和NPM1、KIT和核心結(jié)合因子白血病）， 申請人:發(fā)現(xiàn)在該大的人群 中，F(xiàn)LT3和ASXL1突變是相互排斥的（p= 0. 0008)。此外， 申請人:發(fā)現(xiàn)，IDH1/IDH2突變與 TET2(p= 0. 02和WT1(p= 0. 01)突變是相互排斥的，這表明這些突變在白血病發(fā)病機理中 有重疊作用。
[0106] 接下來， 申請人:開始研宄是否有任何突變都與缺乏對化療的響應相關(guān)；特別地，原 發(fā)性難治性AML患者中富含ASXL1(P= 0. 0002)和WT1(P= 0. 03)突變。將ECOGE1900 試驗的突變數(shù)據(jù)與結(jié)果整合，表明了顯著的影響：即，在FLT3(p= 0. 0005)、ASXL1(p= 0. 005)和PHF6(p= 0. 02)中的突變與總生存率下降有關(guān)。此外， 申請人:發(fā)現(xiàn)，CEBPA(p= 0. 04)和IDH2(p= 0. 003)的突變與整體生存率提高相關(guān)；IDH1突變對結(jié)果所產(chǎn)生的有利 影響特異地見于具有IDH2R140突變的患者。
[0107] 該數(shù)據(jù)代表了對均等治療的原發(fā)性AML患者人群中18個基因的綜合突變分析，這 使得 申請人:能夠描述該基因群體在原發(fā)性AML中的突變頻率、AML中的突變協(xié)同效應的模 式、以及基因突變對AML的生存率和治療響應性的臨床影響。在一個實施方案中， 申請人:發(fā) 現(xiàn)在AML中，ASXL1和WT1的突變在不能響應標準劑量誘導化療的患者中有顯著的富集。該 數(shù)據(jù)為AML的遺傳改變提供了重要的臨床意義，并且為成人AML的多步發(fā)病機理提供了見 解。在一個實施方案中，急性髓細胞白血病選自新診斷的、復發(fā)的或難治性急性髓細胞白血 病。
[0108] 因此，本發(fā)明的一個方面涉及一種預測患有急性髓細胞白血病的患者的生存率的 方法，所述方法包括：檢驗來自所述患者的血液或骨髓的遺傳樣品在基因ASXL1和WT1中是 否存在突變；以及如果檢測到突變的ASXL1和WT1基因，則確定所述患者患有或?qū)⒒加性l(fā) 性難治性急性髓細胞白血病。樣品可以是骨髓抽出物或病人的血液。此外，在一個實施方 案中，分離單核細胞以用于所述檢驗。
[0109] 申請人:開發(fā)了一種突變分類體系，其可通過將細胞遺傳學的標準分析與對FLT3、 NPM1、DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WT1、IDH1、IDH2、KIT、RUNX1、MLL-PTD、ASXL1、PHF6、KRAS、 PTEN、P53、HRAS和EZH2的全長測序組合，從而用于預測患有急性髓細胞白血病的成人的復 發(fā)風險。本申請的教導使得能夠開發(fā)一種綜合的突變分類體系，相比于目前已知的技術(shù)，其 能夠更準確地預測結(jié)果和復發(fā)風險。在一個實施方案中，生存率差的患者能存活小于或等 于約10個月。在另一個實施方案中，生存率中等的患者能存活約18個月至約30個月。在 相關(guān)的實施方案中，生存率好的患者能存活約32個月或更長時間。
[0110] 在一個實施方案中，在FLT3-ITD為野生型的中度風險急性髓細胞白血病的患者 中，TET2、ASXL1、PHF6和MLL-PTD基因突變獨立地顯示出與患者的不良預后和差的總體生 存率相關(guān)。在另一個實施方案中，在具有FLT3-ITD突變的中度風險急性髓細胞白血病的 患者中，CEBPA基因突變與患者的改善的預后和總體生存率相關(guān)。在另一個實施方案中，在 具有FLT3-ITD突變的由細胞遺傳學限定的中度風險AML患者中，8號染色體三體和TET2、 DNMT3A和MLL-PTD突變與患者的不良預后和差的總體生存率相關(guān)。在一個實施方案中，與 IDH1和IDH2均為野生型的NPM1-突變的患者相比，同時具有IDH1/IDH2和NPM1突變的由 細胞遺傳學限定的中度風險的AML患者具有改善的總體生存率。在一個相關(guān)的實施方案 中，IDH2R140Q突變與AML患者總?cè)巳旱目傮w生存率的改善相關(guān)。
[0111] 本公開的一個方面涉及一種預測患有急性髓細胞白血病的患者生存率的方法，包 括：（a)分析從所述患者分離的樣品是否存在以下情況：（i)在基因FLT3、MLL-PTD、ASXL1 和PHF6的至少一者中的突變，以及任選的在基因NPM1、DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WT1、 10111、10112、1(11\冊似1、1(狀5、？1￡隊？53、11狀5和￡2112的一者或多者中的突變 ；或（^)在 基因IDH2和/或CEBPA中的突變，以及任選的在基因FLT3、MLL-PTD、ASXL1、PHF6、NPM1、 DNMT3A、NRAS、TET2、WT1、IDH1、KIT、RUNX1、KRAS、PTEN、P53、HRAS和EZH2 的一者或多者中 的突變；以及（b) (i)如果在基因FLT3、MLL-PTD、ASXL1和PHF6中的至少一者中存在突變， 則預測所述患者的生存率差，或者（ii)如果在IDH2R140中存在突變和/或在CEBPA中存 在突變，則預測所述患者的生存率良好。所述方法還包括分析所述樣品中細胞遺傳學異常 的存在。所述方法還可以包括：如果以下突變存在：IDH2R140Q，則預測所述患者的生存率 良好。
[0112] 此外， 申請人:已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，DNMT3A突變、NPM1突變或MLL融合預測了高劑量化療（包 括劑量增加的誘導治療）具有改善的結(jié)果。本申請的教導提供了對AML患者的準確的風險 分級，并且在高風險的情況下能夠確定哪些患者需要更強勢的治療，并且能夠確定不怎么 需要強化的緩解后治療的低風險患者。此外，能夠鑒別可受益于用劑量加大的蒽環(huán)類藥物 (如道諾紅霉素）進行誘導的基因型限定的患者亞群。本發(fā)明提供了對風險分級更準確的 評估。目前，還沒有有效的方法來確定哪些患有AML的患者能受益于高劑量道諾紅霉素。在 一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種新的分類體系以及對響應性的預測體系。
[0113] 因此，本公開的一個方面提供了 一種確定患有急性髓細胞白血病的患者對高劑量 治療的響應性的方法，所述方法包括：分析從所述患者分離的遺傳樣品在基因DNMT3A和 NPM1中是否存在突變、以及是否存在MLL易位；以及⑴如果在DNMT3A或NPM1中存在突 變，或存在MLL易位，則確定所述患者能響應高劑量治療；或（ii)如果在DNMT3A或NPM1中 不存在突變，或不存在MLL易位，則確定所述患者不能響應高劑量治療。在一個實施方案 中，所述樣品為提取自患者骨髓或血液的DNA。所述遺傳樣品可以為從來自患者血液或骨髓 的單核細胞（MNC)分離的DNA。在一個實施方案中，所述治療包括施用蒽環(huán)類藥物。蒽環(huán)類 藥物的例子包括道諾紅霉素、多柔比星、表柔比星、伊達比星、米托蒽醌和阿霉素。在一個特 定的例子中，蒽環(huán)類藥物為道諾紅霉素。
[0114]本方法可以用于在治療開始前、治療中或治療完成后預測患者對治療的響應性。 例如，通過在治療開始前預測患者對治療的響應，該信息可以用于確定病人的最佳治療選 擇。
[0115]本發(fā)明的一個實施方案涉及一種篩查患者以用于確定急性髓細胞白血病的預后 的方法。本發(fā)明可以提供關(guān)于病人的生存率、病人的預測壽命、和/或所預測的患者生存率 可能性等方面的信息。在一個實施方案中，認為生存率差的患者通常能存活小于或等于約 10個月，認為良好的預后或長期生存率為約36個月或更長的時間。在一個實施方案中，認 為差的生存率為約1至16個月，而認為好的、良好的或長期的生存率為約30至42個月、超 過約46個月、或超過約60個月。在一個實施方案中，認為好的生存率為約30個月或更長 時間。
[0116] 除非本文中另有要求，在本發(fā)明的任何方面，可以分析或檢驗以下基因和/或細 胞遺傳缺陷的組合：FLT3和CEBPA;FLT3和8號染色體三體；FLT3和TET2 ;FLT3和DNMT3A; FLT3 和MLL;FLT3、MLL、ASXL1 和PHF6,任選的TET2 或DNMT3A;IDH2 和CEBPA;IDH1、IDH2 和NPM1 ;IDH2、ASXL1和WT1 ;DNMT3A、NPM1和MLL。任意的這些組合可與名為'用于在AML 患者的基因組DNA中分析體細胞突變的基因及其臨床相關(guān)性'的表中所述的任何一個或多 個基因組合。任選地，對所述表中所列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18或19個基因進行分析或測定。
[0117]本發(fā)明還涉及一種用于確定個體是否對一種或多種對急性髓細胞白血病的治療 有響應性的方法。所述治療可以是任何類型，但在具體的實施方案中其包括化療，諸如一種 或多種蒽環(huán)類抗生素試劑。在一個實施方案中，化療包括抗代謝物阿糖胞苷與蒽環(huán)類藥物 的組合。
[0118]在本發(fā)明的一些實施方案中，治療為化療、免疫治療、基于抗體的治療、放射治療 或支持療法（基本上可為任何用于白血病的措施）。在一個特定的實施方案中，治療包括施 用化療試劑，包括蒽環(huán)類抗生素。蒽環(huán)類抗生素的例子包括但不限于，道諾紅霉素、多柔比 星、表柔比星、伊達比星、米托蒽醌和阿霉素。在某些實施方案中，化療為Gleevac或伊達比 星和ara-C。在一個特定的實施方案中，使用道諾紅霉素。
[0119] 通常，診斷檢驗由治療患者的執(zhí)業(yè)醫(yī)生指導，所述診斷檢驗是由向執(zhí)業(yè)醫(yī)生報告 檢驗結(jié)果的技術(shù)人員實施的，執(zhí)業(yè)醫(yī)生使用檢驗所得值作為診斷患者的標準。因此，本發(fā)明 方法的組成步驟可以由一個以上的人來執(zhí)行。
[0120] 預后可以是對患者存活一段特定時期的可能性的預測，或者所述預后是對患者能 存活多長時間的預測，或者所述預后是患者可從疾病或失調(diào)恢復的可能性。預后可通過許 多方式表示。例如，預后可以用完全緩解率（CR)、總體生存率（OS，生病到死亡的時間量）、 無病生存率（DFS，CR到復發(fā)或死亡的時間量）來表示。在一個實施方案中，患者生存率或 總體生存率良好的可能性包括患者存活大約18個月或更長時間。
[0121] 預后通常是通過檢查一個或多個預后因素或指標來確定的。這些為標志物，它們 在患者（或得自患者的樣品）中的存在或量提示了指定過程或結(jié)果將發(fā)生的可能性。本領(lǐng) 域技術(shù)人員將能夠理解，將預后指標與導致不利結(jié)果的誘因相關(guān)聯(lián)可以涉及統(tǒng)計分析。此 夕卜，因素濃度從基線水平的變化可以反映病人的預后，并且標志物水平的改變程度可以與 不良情況的嚴重程度相關(guān)聯(lián)。統(tǒng)計學顯著性通常是通過比較兩個或多個群體、并確定置信 區(qū)間和/或p值來確定的。參見，例如，Dowdy和Wearden編著的StatisticsforResearch， JohnWiley&Sons出版社，紐約，1983年。在一個實施方案中，本發(fā)明的置信區(qū)間是90%、 95%、97.5%、98%、99%、99.5%、99.9%和 99.99%，而優(yōu)選的？值為0.1、0.05、0.025、 0. 02、0. 01、0. 005、0. 001和0. 0001。對用于將預后指標與導致不利結(jié)果的誘因相關(guān)聯(lián)的示 例性統(tǒng)計檢驗進行了描述。
[0122] -種研宄癌癥的方法是遺傳分析譜，其致力于確定基因表達的干擾和/或?qū)е聬?性表型的突變。這些基因表達譜和突變狀態(tài)提供了關(guān)于正常細胞和疾病細胞的生物學過程 的有價值的信息。然而，癌癥的遺傳特征有很大的不同，這導致難以診斷和治療，以及難以 開發(fā)有效的治療。越來越多的基因突變被發(fā)現(xiàn)并且被開發(fā)為用于疾病檢測以及對預后和治 療成功的前景評估的工具。
[0123] 本申請的發(fā)明人提出，急性髓細胞白血病的遺傳譜將為癌癥處理和/或治療提供 更有效的方法。本發(fā)明人在此確定了導致惡性表型的一組基因組的突變。
[0124] 本發(fā)明人使用了分子手段解決該問題，并已確定了急性髓細胞白血病中一組基因 突變與總體生存率顯著相關(guān)。相應地，本發(fā)明涉及在評估預后和/或預測急性髓細胞白血 病復發(fā)中有用的基因突變譜。在一個方面中，本發(fā)明涉及一組基因，它們在患者骨髓或血細 胞（特別是單核細胞）中的突變與生存率差的可能性相關(guān)。本發(fā)明涉及患有急性髓細胞白 血病患者的預后和/或治療響應結(jié)果。本發(fā)明提供了一些基因，它們的突變單獨或組合地 具有預后價值，特別是針對生存率。
[0125] 在一個例子中，本公開提供了一種確定個體是否對患上急性髓細胞白血病或該病 復發(fā)具有增加的遺傳風險的方法，所述方法包括：分析從所述個體的血液或骨髓分離的遺 傳樣品是否在基因FLT3、NPM1、DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WT1、IDH1、IDH2、KIT、RUNX1、 MLL-PTD、ASXL1、PHF6、KRAS、PTEN、P53、HRAS和EZH2 的至少一者中存在突變；以及，與在 所述基因中不具有所述基因突變的對照個體相比，當：（i)在不具有FLT3-ITD突變的患者 中檢測到在基因TET2、MLL-PTD、ASXL1和PHF6的至少一者中有突變時，或者（ii)在具有 FLT3-IID突變的患者中檢測到在基因TET2、MLL-PID和DNMT3A的至少一者中有突變、或者 檢測到8號染色體三體時，確定具有由細胞遺傳學限定的中度風險AML的個體患上急性髓 細胞白血病或該病復發(fā)的遺傳風險增加。
[0126]目前，沒有能夠預測急性髓細胞白血病預后的這樣的測試，其中該測試使人們能 夠?qū)ML患者分類為好的和不好的響應者，特別是鑒定對高劑量化療響應更好的患者。結(jié) 果，一些個體可能被過度治療，在這樣的情況中，其不必要地接受了具有很小作用的治療。 另外，一些個體可能會治療不足，在這樣的情況中，向標準治療中加入額外的試劑可能改善 那些對僅標準治療難以治療的患者的預后。因此，理想的是在治療開始之前，預期地將標準 治療響應者和非響應者區(qū)分，由此優(yōu)化單個患者的治療。
[0127] 因此，本公開的一個方面涉及一種預測患有急性髓細胞白血病的患者是否相對于 標準劑量化療對高劑量化療的響應性更好的方法，所述方法包括：從得自所述患者的血液 或骨髓中獲得DNA樣品；確定基因DNMT3A和NPM1的突變狀態(tài)，并確定MLL易位的存在；以 及，如果所述樣品對于在DNMT3A或NPM1中的突變或MLL易位呈陽性，則預測相對于標準劑 量化療所述患者對高劑量化療的響應性更好；或者，如果所述樣品為在基因DNMT3a或NPM1 中不存在突變且不存在MLL易位的野生型，則預測相對于標準劑量化療所述患者對高劑量 化療無響應性。
[0128] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種能用于預測急性髓細胞白血病預后的臨床 檢驗。測量了所述樣品中的一種或多種特定基因的突變狀態(tài)和/或表達。將個體分為有可 能對治療響應良好的人群或響應不好的人群。來自測試結(jié)果的信息用于幫助確定需要治療 的患者的最佳治療方案。將患者分為接受標準治療后可能具有不良預后的人群和可能具有 良好預后的人群。醫(yī)療服務人員使用該檢驗的結(jié)果來幫助確定對需要治療的患者的作用過 程，例如最佳治療方案。
[0129] 由于來自患者的某些標志物以連續(xù)的方式與患者的預后相關(guān)，因此可以通過利 用統(tǒng)計分析將所確定的標志物狀態(tài)與患者的預后相關(guān)聯(lián)，從而確定預后。本領(lǐng)域技術(shù)人 員能夠設計合適的統(tǒng)計方法。例如，本發(fā)明的方法可以采用卡方檢驗、Kaplan-Meier法、 log-rank檢驗、多因素logistic回歸分析、Cox比例風險模型等來確定預后。計算機和計 算機軟件程序可以用于組織數(shù)據(jù)和進行統(tǒng)計分析。
[0130] 在一個實施方案中，提供了檢驗，由此分析了樣品（例如骨髓或血液樣品）的基因 群體，并且由突變分析結(jié)果確定了對標準急性髓細胞白血病治療的響應性的可能性評估。 在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及預測患有急性髓細胞白血病的個體在治療后對標準和/ 或高劑量化療的預后和/或響應可能性，包括在得自患者的遺傳樣品中確定一個或多個基 因的突變狀態(tài)，特別是確定DNMT3A或NPM1基因的突變狀態(tài)或MLL易位（相對于對照基因 或基因群體標準化）。由該基因群體中單個基因的突變狀態(tài)計算每個個體的總值。
[0131] 本發(fā)明涉及血液癌癥的診斷、預后和治療，包括預測對治療的響應以及對患者的 治療進行分類。本公開教導了 398位來自EC0GE1900III期臨床試驗的患者的綜合突變譜 的突變頻率、預后顯著性和治療相關(guān)性，并且在來自相同試驗的104位患者的獨立人群中 證實了這些數(shù)據(jù)。之前的研宄已經(jīng)表明，CEBPA、NPM1和FLT3-ITD的突變分析可用于對中 度風險的AML患者進行風險分類。通過對進行單一臨床試驗治療的一大群患者的綜合突變 分析， 申請人:證明了更廣泛的突變分析能更好的將AML患者分為相關(guān)的預后人群（圖3)。 例如，F(xiàn)LT3-ITD-陰性的NPM1/IDH突變的患者代表由特定的突變基因型限定的低風險AML 亞群，而FLT3-ITD-陰性、NPM1突變且不具有并發(fā)的IDH突變的患者具有遠遠較差的預后， 特別是同時有高風險突變的患者。
[0132] 此外， 申請人:發(fā)現(xiàn)，TET2、ASXL1、MLL-PID、PHF6和DNMT3A突變可以用來確定不具 有FLT3-ITD的由細胞遺傳學限定的中度風險AML患者中的不良預后的患者?？傊?，這些數(shù) 據(jù)表明，對數(shù)量較大的遺傳改變的突變分析可以用于將AML患者區(qū)分為具有有利的、中度 的、或不利的風險且預后有顯著差異的更精確的亞群。該方法可以用于確定另外的一組單 獨接受誘導治療和鞏固治療而具有由突變限定的良好預后的患者；以及一組具有由突變限 定的不良風險的患者，這些患者由于對標準AML治療的預后差，因此作為同種異體干細胞 移植或臨床試驗的候選者（圖5A)。
[0133] 最近對AML所進行的兩個檢測加大蒽環(huán)類藥物劑量的好處的隨機檢驗證明，更 強的誘導化療改善了AML的預后。（Fernandez等，NEnglJMed, 2009, 361，1249-59 ; Lowenberg等，NEnglJMed, 2009, 361，1235-48)。值得注意的是，用我們的502位患者人 群對原始E1900試驗進行重新評價發(fā)現(xiàn)，在原始檢驗的兩個治療組中，在每個遺傳風險類 別中患者均勾分布（P= 〇. 41，Pearson's卡方檢驗）。然而，這些研宄的初步報告并沒有 確定劑量加大的誘導治療是否能改善不同AML亞組的預后。
[0134] 申請人:已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，加大蒽環(huán)類藥物的劑量顯著地改善了在DNMT3A或NPM1中有突 變或有MLL易位的患者的預后，這說明突變譜可以用于確定哪些患者受益于劑量加大的誘 導治療（圖5B)。
[0135] 申請人:還發(fā)現(xiàn)了普遍發(fā)生在AML患者中的突變組合，以及那些即使有也很少與其 它的突變互補群同時發(fā)生的突變組合。例如，在該AML人群中TET2和IDH突變相互排斥這 一發(fā)現(xiàn)引起了對IDH突變和功能缺失性TET2突變在造血轉(zhuǎn)化的共享機制中的關(guān)聯(lián)性的功 能性研宄。
[0136] 在許多治療方案的情況中，確實有一些患者對化療（例如蒽環(huán)類抗生素（道諾紅 霉素））治療有響應，而其它患者沒有。對不太可能對治療響應的患者實施該治療是不可取 的。因此，在施用藥物之前知道患者在多大程度上對該治療響應是有益的，從而非響應者將 不用接受非必要的治療，因此那些最可能受益于該藥物的患者將被恰當?shù)闹委煵⒈O(jiān)測。此 夕卜，對于對治療有響應的患者，存在多種程度的響應。用蒽環(huán)類藥物以外的治療劑治療或 除了蒽環(huán)類藥物道諾紅霉素以外還使用治療劑的治療，可以有利于對特定化療不響應的患 者、或者對單獨的特定化療（如道諾紅霉素或類似的蒽環(huán)類抗生素）的響應不理想的患者。
[0137] 本公開表明臨床試驗人群的綜合突變譜能促進我們對AML生物學的了解、改善目 前的預后模型、并報告治療決定。特別是，這些數(shù)據(jù)表明，更詳細的遺傳分析可以導致改善 的風險分級、以及確定能受益于更強的誘導化療的患者。
[0138] 在一個具體的方面，本公開涉及一種篩查患有急性髓細胞白血病的患者對用高劑 量的道諾紅霉素或其可藥用的鹽、溶劑化物或水合物進行治療的響應性的方法，包括：從 所述個體中獲得含有急性髓細胞白血病細胞的遺傳樣品；以及，檢驗所述樣品，并且檢測 DNMT3A或NPM1中是否存在突變或是否存在MLL易位；以及，與不存在突變的野生型對照相 比較，將DNMT3A或NPM1中具有突變或者具有MLL易位的發(fā)現(xiàn)與所述急性髓細胞白血病患 者對用高劑量的道諾紅霉素或其可藥用的鹽、溶劑化物或水合物進行治療的敏感性更高相 關(guān)聯(lián)。在一個實施方案中，所述方法還包括，如果檢測到DNMT3A或NPM1中的突變或MLL易 位，則預測所述患者在化療后急性髓細胞白血病復發(fā)的風險較低。在一個實施方案中，所述 方法還進一步包括如果檢測到DNMT3A或NPM1中的突變或MLL易位，則預測所述患者在化 療后急性髓細胞白血病復發(fā)的風險較低。
[0139] 在癌癥患者的臨床管理中，對患者群體分級以預測治療響應越來越有價值。例 如，在用靶向治療的患者中，分級需要伴隨診斷，所述靶向治療例如在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中使用 的曲妥珠單抗（Herceptin，Genentech)以及在結(jié)直腸癌中使用的西妥昔單抗（Erbitux， Merck)。預測性生物標志物還用于在胃腸道間質(zhì)瘤中使用的伊馬替尼（Gleevec，Novarti)， 以及在肺癌中使用的吉非替尼（Iressa，Astra_Zeneca)。目前還沒有方法能預測對急性髓 細胞白血病的蒽環(huán)類抗生素的響應。如上所述，為了鑒定與對蒽環(huán)類抗生素（特別是道諾 紅霉素）有更高敏感性相關(guān)的基因， 申請人:檢驗了特定基因中突變的存在。
[0140]如本發(fā)明所沭，用于在AML患者的基閔組DNA中分析體細朐突奪的基閔及其臨床 相關(guān)件
[0141]

【權(quán)利要求】
1. 一種預測患有急性髓細胞白血病的患者的生存率的方法，所述方法包括： (a) 分析從所述患者分離的遺傳樣品是否存在細胞遺傳學異常，以及在基因 FLT3、 NPM1、DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WT1、IDH1、IDH2、KIT、RUNX1、MLL-PTD、ASXL1、PHF6、KRAS、 PTEN、P53、HRAS和EZH2的至少一者中是否存在突變；以及 (b) ⑴如果在基因 FLT3、MLL-PTD、ASXL1和PHF6中的至少一者中存在突變，則預測所 述患者的生存率差，或者（ii)如果在IDH2R140中存在突變和/或在CEBPA中存在突變，則 預測所述患者的生存率良好。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，還包括： 如果存在以下情況，則預測患有由細胞遺傳學限定的中度風險AML的患者的生存率為 中度： (i) 在基因 FLT3-ITD、TET2、MLL-PTD、DNMT3A、ASXL1或PHF6的任意一者中都不存在突 變； (ii) 在CEBPA和FLT3-ITD中存在突變，或 (iii) 在FLT3-ITD中存在突變但是不存在8號染色體三體。
3. 權(quán)利要求1所述的方法，還包括： 如果存在以下情況，則預測所述患有由細胞遺傳學限定的中度風險AML的患者的生存 率不良： (i) 在不具有FLT3-ITD突變的患者中，在TET2、ASXL1或PHF6或MLL-PTD中存在突變， 或 (ii) 所述患者具有FLT3-ITD突變、以及TET2、DNMT3A、MLL-PTD中的突變、或8號染色 體三體。
4. 權(quán)利要求2所述的方法，其中生存率中度的所述患者能夠生存大約18個月到大約 30個月。
5. -種預測患有急性髓細胞白血病的患者生存率的方法，所述方法包括： (a) 檢驗來自所述患者的血液或骨髓的遺傳樣品在所述樣品中的基因 FLT3、NPM1、 DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WT1、IDH1、IDH2、KIT、RUNX1、MLL-PTD、ASXL1、PHF6、KRAS、PTEN、 P53、HRAS和EZH2的至少一者中是否存在突變；以及 (b) 如果在基因 FLT3-ITD、MLL-PTD、ASXL1、PHF6的至少一者中存在突變，則預測所述 患者的生存率差，或者如果在CEBPA中存在突變和/或在IDH2的R140位存在突變，則預測 所述患者的生存率良好。
6. 權(quán)利要求5所述的方法，其中在患有由細胞遺傳學限定的中度風險急性髓細胞白血 病且具有FLT3-ITD突變的患者之中，以下至少一者與所述患者的不良預后以及總生存率 差有關(guān)：8號染色體三體、或在TET2、DNMT3A或MLL-PTD中具有突變。
7. 權(quán)利要求5所述的方法，其中在患有由細胞遺傳學限定的中度風險急性髓細胞白血 病且在FLT3-ITD基因中具有突變的患者之中，CEBPA基因的突變與所述患者的改善的預后 和總生存率有關(guān)。
8. 權(quán)利要求5所述的方法，其中在同時具有IDH1/IDH2和NPM1突變的由細胞遺傳學限 定的中度風險AML患者中，與IDH1和IDH2均為野生型的NPM1-突變的患者相比，總生存率 提尚。
9. 權(quán)利要求5所述的方法，其中在患有急性髓細胞白血病的患者之中，IDH2R140突變 與總生存率提尚相關(guān)。
10. 權(quán)利要求1至9中任意一項所述的方法，其中生存率差或不良的所述患者（不良風 險）能存活小于或等于約10個月。
11. 權(quán)利要求1至9中任意一項所述的方法，其中生存率良好的所述患者能存活大約 32個月或更長時間。
12. -種預測患有急性髓細胞白血病的患者的生存率的方法，所述方法包括： (a) 檢驗來自所述患者的血液或骨髓的遺傳樣品在基因 ASXL1和WT1中是否存在突變； 以及 (b) 如果檢測到突變的ASXL1和WT1基因，則確定所述患者患有或?qū)⒒加性l(fā)性難治性 急性髓細胞白血病。
13. -種確定患有急性髓細胞白血病的患者對高劑量治療的響應性的方法，所述方法 包括： (a) 分析由所述患者分離的遺傳樣品在基因 DNMT3A和NPM1中是否存在突變、以及是否 存在MLL易位；以及 (b) (i)如果在DNMT3A或NPM1中存在突變，或存在MLL易位，則確定所述患者能響應高 劑量治療；或 (ii)如果在DNMT3A或NPM1中不存在突變，或不存在MLL易位，則確定所述患者不能響 應高劑量治療。
14. 一種預測患有急性髓細胞白血病的患者是否相對于標準劑量化療對高劑量化療的 響應性更好的方法，所述方法包括： (a) 從得自所述患者的血液或骨髓中獲得DNA樣品； (b) 確定基因 DNMT3A和NPM1的突變狀態(tài)，并確定是否存在MLL易位；以及 (c) 如果所述樣品對于在DNMT3A或NPM1中的突變或MLL易位呈陽性，則預測相對于標 準劑量化療所述患者對高劑量化療的響應性更好；或者，如果所述樣品為在基因 DNMT3a或 NPM1中不存在突變且不存在MLL易位的野生型，則預測相對于標準劑量化療所述患者對高 劑量化療無響應性。
15. -種篩查患有急性髓細胞白血病的患者對用高劑量的道諾紅霉素或其可藥用的 鹽、溶劑化物或水合物進行治療的響應性的方法，包括：從所述個體中獲得含有急性髓細胞 白血病細胞的遺傳樣品；以及檢驗所述樣品，并且檢測DNMT3A或NPM1中的突變或MLL易位 是否存在；以及與不存在突變的野生型對照相比較，將DNMT3A或NPM1中具有突變或者具有 MLL易位的發(fā)現(xiàn)與所述急性髓細胞白血病患者對用高劑量的道諾紅霉素或其可藥用的鹽、 溶劑化物或水合物進行治療的敏感性更高相關(guān)聯(lián)。
16. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述方法還包括，如果檢測到DNMT3A或NPM1中的突 變或MLL易位，則預測所述患者在化療后急性髓細胞白血病復發(fā)的風險較低。
17. -種確定個體是否對患上急性髓細胞白血病或該病復發(fā)具有增加的遺傳風險的方 法，所述方法包括： (a)分析從所述個體的血液或骨髓分離的遺傳樣品在基因 FLT3、NPM1、DNMT3A、NRAS、 CEBPA、TET2、WT1、IDH1、IDH2、KIT、RUNX1、MLL-PTD、ASXL1、PHF6、KRAS、PTEN、P53、HRAS 和 EZH2的至少一者中是否存在突變；以及 (b)與在所述基因中不具有所述基因突變的對照個體相比，當：（i)在不具有FLT3-ITD 突變的患者中檢測到在基因 TET2、MLL-PTD、ASXL1和PHF6的至少一者中有突變時，或者 (ii)在具有FLT3-IID突變的患者中檢測到在基因 TET2、MLL-PID和DNMT3A的至少一者中 有突變、或者檢測到8號染色體三體時，確定具有由細胞遺傳學限定的中度風險AML的個體 患上急性髓細胞白血病或該病復發(fā)的遺傳風險增加。
18. -種為患有急性髓細胞白血病的患者制備個性化基因組圖譜的方法，包括： (a) 對從來自所述患者的骨髓抽出物或血液樣品中提取的單核細胞進行基因突變分 析； (b) 檢驗所述樣品，并在所述細胞中檢測是否存在細胞遺傳學異常、以及在選自由基因 FLT3、NPM1、DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WT1、IDH1、IDH2、KIT、RUNX1、MLL-PTD、ASXL1、PHF6、 KRAS、PTEN、P53、HRAS和EZH2構(gòu)成的組中的基因中是否存在一種或多種突變；以及 (c) 將由所述基因突變分析獲得的數(shù)據(jù)產(chǎn)生報告，其中所述報告包括對所述患者的生 存可能性或治療響應性的預測。
19. 一種用于確定對患有AML的患者的治療的試劑盒，所述試劑盒包括：用于檢測選 自由 ASXL1、DNMT3A、NPM1、PHF6、WT1、TP53、EZH2、CEBPA、TET2、RUNX1、PTEN、FLT3、HRAS、 KRAS、NRAS、KIT、IDH1和IDH2構(gòu)成的組中的至少一種基因的突變的裝置；以及基于一種或 多種所述基因中突變的存在進行推薦治療的說明。
20. 權(quán)利要求31所述的試劑盒，其中基于DNMT3A或NPM1突變或MLL易位的存在而對 所述患者進行推薦治療的說明指示以高劑量道諾紅霉素為推薦的治療。
21. -種在患者中治療、預防或處理急性髓細胞白血病的方法，包括： (a) 分析從所述患者分離的遺傳樣品在基因 DNMT3A和NPM1中是否存在突變以及是否 存在MLL易位； (b) 如果DNMT3A或NPM1存在突變或存在MLL易位，則確定所述患者對高劑量化療的響 應性好于標準劑量化療；以及 (c) 向所述患者施用高劑量化療。
22. 權(quán)利要求5或13或14或21所述的方法，其中所述患者的特征在于基于細胞遺傳 學分析具有中度風險。
23. 權(quán)利要求14或21所述的方法，其中所述治療包括施用蒽環(huán)類藥物。
24. 權(quán)利要求14或21所述的方法，其中施用高劑量治療包括施用高劑量的選自由道諾 紅霉素、多柔比星、表柔比星、伊達比星、米托蒽醌和阿霉素構(gòu)成的組中的一種或多種蒽環(huán) 類抗生素。
25. 權(quán)利要求13或21所述的方法，其中所述樣品為從所述患者的骨髓或血液中提取的 DNA〇
26. 權(quán)利要求13或21所述的方法，其中所述遺傳樣品為分離自所述患者的單核細胞 (MNC)中的 DNA。
27. 權(quán)利要求21所述的方法，其中所述高劑量化療為施用約70mg/m2至約140mg/m2的 道諾紅霉素，或施用約l〇mg/m2至約20mg/m2的伊達比星。
28. -種高劑量化療試劑在治療、預防或處理患者的急性髓細胞白血病的方法中的應 用，所述方法包括： (a) 分析從所述患者中分離的遺傳樣品是否在基因 DNMT3A和NPM1中存在突變以及是 否存在MLL易位； (b) 如果DNMT3A或NPM1存在突變或存在MLL易位，則確定所述患者對高劑量化療的響 應性好于標準劑量化療；以及 (c) 向所述患者施用高劑量化療。
29. 權(quán)利要求28所述的試劑的應用，其中所述患者的特征在于基于細胞遺傳學分析具 有中度風險。
30. 權(quán)利要求28或29所述的試劑的應用，其中所述試劑為蒽環(huán)類抗生素，其任選地選 自由道諾紅霉素、多柔比星、表柔比星、伊達比星、米托蒽醌和阿霉素構(gòu)成的組中。
31. 權(quán)利要求28至30中任意一項所述的試劑的應用，其中所述樣品為從所述患者的骨 髓或血液中預先提取的DNA。
32. 權(quán)利要求28至30中任意一項所述的試劑的應用，其中所述遺傳樣品為從所述患者 的單核細胞（MNC)中預先分離的DNA。
33. 權(quán)利要求28至32中任意一項所述的試劑的應用，其中高劑量施用為施用約70mg/ m2至約140mg/m2的道諾紅霉素，或施用約10mg/m2至約20mg/m 2的伊達比星。
34. -種預測患有急性髓細胞白血病的患者生存率的方法，包括： (a) 分析從所述患者分離的樣品是否存在以下情況： (i) 在基因 FLT3、MLL-PTD、ASXL1和PHF6的至少一者中的突變，以及任選的在基因 NPM1、DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WT1、IDH1、IDH2、KIT、RUNX1、KRAS、PTEN、P53、HRAS 和 EZH2的一者或多者中的突變；或 (ii) 在基因 IDH2和/或CEBPA中的突變，以及任選的在基因 FLT3、MLL-PTD、ASXL1、 PHF6、NPM1、DNMT3A、NRAS、TET2、WT1、IDH1、KIT、RUNX1、KRAS、PTEN、P53、HRAS 和 EZH2 的一 者或多者中的突變；以及 (b) ⑴如果在基因 FLT3、MLL-PTD、ASXL1和PHF6中的至少一者中存在突變，則預測所 述患者的生存率差，或者（ii)如果在IDH2R140中存在突變和/或在CEBPA中存在突變，則 預測所述患者的生存率良好。
35. 權(quán)利要求34所述的方法，還包括分析所述樣品中是否存在細胞遺傳學異常。
36. 權(quán)利要求34所述的方法，還包括：（ii)如果以下突變存在：IDH2R140Q，則預測所 述患者的生存率良好。
【文檔編號】C12Q1/68GK104508143SQ201380024896
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月12日
【發(fā)明者】羅斯·L·萊文, 奧馬爾·阿卜杜勒-瓦希卜, 杰伊·P·帕特爾, 米特哈特·戈嫩 申請人:紀念斯隆-凱特琳癌癥中心