使用合成的信使rna無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞地衍生人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】本公開總的來(lái)說(shuō)涉及使用工程化的重編程因子通過(guò)動(dòng)力學(xué)受控過(guò)程產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)的新方法和組合物。具體來(lái)說(shuō)，本公開涉及建立被優(yōu)化用于重編程各種不同類型細(xì)胞的重編程因子的組合，包括常規(guī)重編程因子與反式激活結(jié)構(gòu)域之間的融合體。更具體來(lái)說(shuō)，本文中公開的示例性方法可用于從各種不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型、包括人類成纖維細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。還公開了使用合成的信使RNA無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞地衍生人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的示例性方法。
【專利說(shuō)明】使用合成的信使RNA無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞地衍生人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞
[0001]相關(guān)申請(qǐng)
[0002]本申請(qǐng)要求2012年5月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)USSN61/646，292的優(yōu)先權(quán)利益，其內(nèi)容整體并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本公開總的來(lái)說(shuō)涉及使用工程化的重編程因子通過(guò)動(dòng)力學(xué)受控過(guò)程產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)的新方法和組合物。具體來(lái)說(shuō)，本公開涉及建立被優(yōu)化用于重編程各種不同類型細(xì)胞的重編程因子的組合，包括常規(guī)重編程因子與反式激活結(jié)構(gòu)域之間的融合體。更具體來(lái)說(shuō)，本文中公開的示例性方法可用于從各種不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型、包括人類成纖維細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。還公開了使用合成的信使RNA無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞(feeder-free)地衍生人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的示例性方法。

【背景技術(shù)】
[0004]下面包括了可用于理解本公開的各個(gè)方面和實(shí)施方式的信息。這并不是承認(rèn)這里提供的任何信息是本文中描述或要求的發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)或與其相關(guān)，或者任何明確或隱含地參考的出版物或文獻(xiàn)是現(xiàn)有技術(shù)。
[0005]誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)的治療潛力，刺激了避開對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以引起向多能狀態(tài)的重編程的需要的重編程方法的開發(fā)嘗試。就此而言獲得成功的第一種“非整合”方法——蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和腺病毒載體的使用，由于獲得的iPSC轉(zhuǎn)化的效率低而在應(yīng)用上受限。更近些時(shí)候，已顯示利用游離體DNA、仙臺(tái)病毒和合成的信使RNA(mRNA)的技術(shù)，以與使用整合病毒載體所獲得的效率可比或更高的效率產(chǎn)生“無(wú)足跡” iPSC。在原理上，RNA轉(zhuǎn)染是這些方法中最具吸引力的，因?yàn)樗鼘?duì)重編程因子(RF)表達(dá)的時(shí)間過(guò)程提供精確控制，同時(shí)完全避免了對(duì)“清除”重編程的細(xì)胞以除去載體的殘留痕跡的任何需要。然而，基于mRNA的重編程的現(xiàn)有流程，由于在人類細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性所需的?2周時(shí)間內(nèi)需要每日進(jìn)行重復(fù)轉(zhuǎn)染，因此是相對(duì)勞動(dòng)密集的。這些程序也依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞的使用，為方法增添了復(fù)雜性和技術(shù)可變性，同時(shí)引入了具有非人類來(lái)源的(“外來(lái)的”)生物材料的潛在污染源。
[0006]生產(chǎn)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)的主要難點(diǎn)是將分化的細(xì)胞重編程成多能細(xì)胞的低效率。以前已報(bào)道，當(dāng)用由0ct4和MyoD的反式激活結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的融合基因(被稱為M3O)以及Sox2、Klf4和c-Myc(SKM)轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，5%的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)被重編程成iPSC。此外，M3O在大多數(shù)被轉(zhuǎn)導(dǎo)的MEF、包括沒有變成iPSC的細(xì)胞中促進(jìn)了多能性基因的染色質(zhì)重塑。這些觀察表明了在提供更有利的培養(yǎng)條件的情況下，超過(guò)5%的細(xì)胞獲得了變成iPSC的能力的可能性。
[0007]發(fā)明概述
[0008]因此，為了應(yīng)對(duì)這些缺點(diǎn)，本公開提供了用于產(chǎn)生干細(xì)胞的方法和組合物，所述干細(xì)胞能夠產(chǎn)生人體的所有不同組織。在某些情況下，使用信使RNA分子并且不需病毒載體、動(dòng)物產(chǎn)物或飼養(yǎng)細(xì)胞，本文公開的方法可用于將人類成纖維細(xì)胞重編程成誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)。所述示例性方法和組合物的使用導(dǎo)致與以前報(bào)告的細(xì)胞重編程方法相比，效率驚人且出人意料地提聞。
[0009]因此，提供了通過(guò)改進(jìn)重編程因子(RF)混合物，尤其是通過(guò)使用并入了已知的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子例如VP16和MyoD的反式激活結(jié)構(gòu)域的常規(guī)重編程因子例如0ct4(也稱為0ct3/4)、Sox 2等的工程化變體而可用于加速mRNA介導(dǎo)的重編程的方法、試劑和/或組合物。本文中公開的方法和組合物產(chǎn)生了無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞、無(wú)外來(lái)物的方案，其極大減少了基于mRNA的重編程中所涉及的時(shí)間、成本和工作量。
[0010]一方面，本公開提供了一種用于去分化或重編程體細(xì)胞的方法，所述方法包括:a)用組合物轉(zhuǎn)染分離的體細(xì)胞，所述組合物包含有效量的、任一種或多種合成的mRNA重編程因子與反式激活結(jié)構(gòu)域之間的融合產(chǎn)物，由此將所述體細(xì)胞重編程或去分化，所述合成的mRNA 重編程因選自 0ct4、Sox2、Klf4、cMyc、Nanog 和 Lin28。
[0011]在一種實(shí)施方式中，提供了一種權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物包含融合到N-端MyoD反式激活結(jié)構(gòu)域的0ct4。在一種實(shí)施方式中,所述0ct4被融合到采取串聯(lián)三聯(lián)體形式的N-端MyoD反式激活結(jié)構(gòu)域。
[0012]一方面，提供了一種使用權(quán)利要求1中的任一種或多種合成的mRNA重編程因子來(lái)重編程哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，所述方法包括:a)以標(biāo)準(zhǔn)6孔板的每個(gè)孔25k至250k個(gè)細(xì)胞的密度在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞表面中生長(zhǎng)靶細(xì)胞山)在重編程期間，每次用50ng至800ng/ml mRNA的不同劑量轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0013]在一種實(shí)施方式中，以標(biāo)準(zhǔn)6孔板的每個(gè)孔50k、75k、100k或150k個(gè)細(xì)胞的密度在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞表面中生長(zhǎng)所述祀細(xì)胞；b)在重編程期間，每次用50ng至800ng/ml mRNA的不同劑量轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其中在較早時(shí)間點(diǎn)使用比較晚時(shí)間點(diǎn)更低的劑量；c)無(wú)需傳代，獲得iPSC。
[0014]在一種實(shí)施方式中，以標(biāo)準(zhǔn)6孔板的每個(gè)孔50k、75k、10k或150k個(gè)細(xì)胞的密度在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞表面中生長(zhǎng)所述靶細(xì)胞，其中將每個(gè)孔的體積調(diào)整到相當(dāng)于0.5ml至5ml之間的適當(dāng)培養(yǎng)基:b)在重編程期間，每次用50ng至800ng/ml mRNA的不同劑量轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其中在較早時(shí)間點(diǎn)使用比較晚時(shí)間點(diǎn)更低的劑量；c)無(wú)需傳代，獲得iPSC。
[0015]在一種實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人類細(xì)胞。在一種實(shí)施方式中，所述方法是無(wú)外來(lái)物的。
[0016]在一種實(shí)施方式中，所述一種或多種因子選自mRNA、調(diào)控RNA、siRNA miRNA及其組合。
[0017]在一種實(shí)施方式中，將所述體細(xì)胞用至少兩種不同RNA轉(zhuǎn)染。在一種實(shí)施方式中，所述體細(xì)胞選自單能、專能(multipotent)、多能和分化的細(xì)胞。在一種實(shí)施方式中，所述一種或多種RNA誘導(dǎo)所述體細(xì)胞去分化成單能、專能或多能細(xì)胞。
[0018]在一種實(shí)施方式中，所述至少一種因子選自0CT4、S0X2、NAN0G、LIN28、KLF4和MYCmRNA。在一種實(shí)施方式中，所述0CT4、S0X2、NANOG和LIN28mRNA被組合給藥。在一種實(shí)施方式中，所述0CT4、S0X2、KLF4和MYC mRNA被組合給藥。
[0019]在一種實(shí)施方式中，將所述被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為誘導(dǎo)性多能干(iPS)細(xì)胞維持在培養(yǎng)物中。在一種實(shí)施方式中，所述被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞形成誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，并且還包括誘導(dǎo)所述iPS細(xì)胞以形成分化的細(xì)胞。
[0020]一方面，提供了一種在患者中治療或抑制疾病或障礙的一種或多種癥狀的方法，所述方法包括將細(xì)胞在體外去分化，并將所述細(xì)胞給藥于所述患者。在一種實(shí)施方式中，所述組合物還包含Rarg和LrH-1反式作用激活結(jié)構(gòu)域。在一種實(shí)施方式中，所述組合物包含融合到VP16反式激活結(jié)構(gòu)域的0ct4。
[0021]本文描述和要求權(quán)利的本發(fā)明具有許多特性和實(shí)施方式，包括但不限于在本概述中提出或描述或指稱的。它不打算是全包含性的，并且本文描述和要求權(quán)利的本發(fā)明不限于在本概述中認(rèn)定的特點(diǎn)或?qū)嵤┓绞交虿皇芷湎拗?，包含所述特點(diǎn)或?qū)嵤┓绞絻H僅是出于說(shuō)明而不是限制的目的。其他實(shí)施方式可能公開在下面的詳細(xì)描述中。
[0022]附圖簡(jiǎn)述
[0023]圖1.使用基于M3O的mRNA重編程混合物衍生的iPSC集落。(A)源自于第一次基于M3O的BJ重編程試驗(yàn)的兩個(gè)擴(kuò)增的iPSC克隆的1x亮視野圖像。(B)擴(kuò)增的克隆的多能性標(biāo)志物的免疫染色。
[0024]圖2.使用基于M3O的混合物的無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞重編程。㈧免疫熒光成像示出了來(lái)自于50K個(gè)XFF成纖維細(xì)胞上的無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞衍生的TRA-1-60+集落產(chǎn)量，比較了基于c_Myc和L-Myc的混合物以及4小時(shí)和24小時(shí)的轉(zhuǎn)染方式。所有孔被轉(zhuǎn)染9天。4小時(shí)轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物在實(shí)驗(yàn)的第15天被固定用于染色，24小時(shí)轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物則在第11天。(B)來(lái)自于同一實(shí)驗(yàn)的400ng/ml Stemfect孔的1x亮視野成像,示出了在衍生的第9天培養(yǎng)物上的接近鋪滿狀態(tài)(near-confluent)的hESC樣集落。(C)跟蹤試驗(yàn)中標(biāo)記的視野的1x亮視野時(shí)間過(guò)程，其中使用400ng/ml Stemfect方式對(duì)100K個(gè)XFF再次進(jìn)行9天的轉(zhuǎn)染，示出了上皮形成和隨后hESC樣集落的出現(xiàn)。
[0025]圖3.使用4種不同mRNA混合物的重編程效率的比較。流程圖概述了 4種混合物的比較實(shí)驗(yàn)。
[0026]圖4.HDF-a無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞重編程培養(yǎng)物中的hESC樣集落。在來(lái)自于75K個(gè)HDF_a成人成纖維細(xì)胞的無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞衍生的第9天時(shí)，出現(xiàn)的hESC樣集落的1x亮視野圖像，所述成纖維細(xì)胞用作為培養(yǎng)基增補(bǔ)物使用Stemfect轉(zhuǎn)染試劑遞送的400ng/ml mRNA混合物(M3CHc-Myc+Nanog+)處理 9 天。
[0027]圖5合成的mRNA混合物的產(chǎn)生。(A)示意性概述了用于制造mRNA重編程混合物的程序。(B)SYBR E-凝膠上的編碼多個(gè)RF和熒光報(bào)告物的合成的mRNA。每條泳道上樣500ng RNA。
[0028]詳細(xì)描述
[0029]當(dāng)描述本發(fā)明時(shí)，在本文中沒有定義的所有術(shù)語(yǔ)具有它們?cè)诒绢I(lǐng)域中公認(rèn)的通常意義。在下面的描述是本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】或特定應(yīng)用的意義上，它的意圖僅僅是說(shuō)明而不是限制所要求的發(fā)明。下面的描述打算涵蓋包括在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)的所有可替選方案、改良方案和等同方案。
[0030]通過(guò)表達(dá)一組選定的轉(zhuǎn)錄因子可以將分化的細(xì)胞恢復(fù)到多能狀態(tài)，這為可以使用患者特異性細(xì)胞產(chǎn)生用于遺傳病的體外研究并最終用于細(xì)胞替換療法的任何所需類型的細(xì)胞開辟了前景。重編程因子的表達(dá)可以通過(guò)使用整合到基因組中的病毒載體來(lái)實(shí)現(xiàn)，并且iPSC衍生仍通常使用整合型反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒來(lái)進(jìn)行。隨著而來(lái)的基因組修飾代表了 iPSC的治療性應(yīng)用的重要障礙，同時(shí)從整合的病毒表達(dá)盒重新激活表達(dá)的可能性即使對(duì)于體外研究來(lái)說(shuō)也是一種顧慮。最近，在應(yīng)用新的表達(dá)載體減輕或消除基因組修飾問題中已取得相當(dāng)大的進(jìn)展?，F(xiàn)在可以獲得在兩側(cè)帶有1x重組位點(diǎn)的單一多順反子盒中編碼iPSC誘導(dǎo)所需的多個(gè)因子的慢病毒載體，所述單一多順反子盒允許在重編程后通過(guò)Cre重組酶的瞬時(shí)表達(dá)幾乎無(wú)縫地切除轉(zhuǎn)入基因。轉(zhuǎn)入基因的插入和隨后的切除，也可以使用轉(zhuǎn)座子載體并隨后簡(jiǎn)短表達(dá)轉(zhuǎn)座酶來(lái)實(shí)現(xiàn)。已使用了幾種不同類型的可以瞬時(shí)表達(dá)重編程因子足夠長(zhǎng)的時(shí)間以誘導(dǎo)多能性的非整合型DNA載體，包括腺病毒、質(zhì)粒和游離體DNA。通過(guò)用合并有細(xì)胞穿透肽的重組RF蛋白重復(fù)地轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，也已被證明可能產(chǎn)生iPSC，盡管效率低。相對(duì)高效的iPSC轉(zhuǎn)化，現(xiàn)在可以使用具有完全基于RNA的繁殖周期的仙臺(tái)病毒，并通過(guò)編碼Yamanaka因子的合成的mRNA轉(zhuǎn)錄本的持續(xù)轉(zhuǎn)染來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0031]將mRNA轉(zhuǎn)染應(yīng)用于重編程(并潛在地應(yīng)用于定向分化和轉(zhuǎn)分化)是有吸引力的，因?yàn)檫@種系統(tǒng)允許簡(jiǎn)單地通過(guò)改變向細(xì)胞培養(yǎng)基添加的轉(zhuǎn)錄本種類，在每日基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)重編程混合物以及甚至各個(gè)組分因子的表達(dá)。在特定因子的轉(zhuǎn)染結(jié)束后，由于mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的快速衰減，靶細(xì)胞內(nèi)的異位表達(dá)在短時(shí)間內(nèi)停止。與非整合型DNA載體或RNA病毒相反，使用mRNA轉(zhuǎn)染時(shí)不需清除，也不存在隨機(jī)基因組整合或持續(xù)病毒感染的任何風(fēng)險(xiǎn)。如果我們?cè)O(shè)想最終可以利用多輪異位RF表達(dá)從患者活體組織出發(fā)經(jīng)iPSC中間體得到所需類型的特化細(xì)胞，這些優(yōu)點(diǎn)將呈現(xiàn)出更大的重要性。然而，當(dāng)前實(shí)施的基于mRNA的重編程存在缺點(diǎn)。盡管在mRNA被轉(zhuǎn)染后RF的表達(dá)通常在24小時(shí)的量級(jí)上是魯棒的，但是因子的表達(dá)要花費(fèi)約2周才能在人類細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性，因此使用這種技術(shù)重編程細(xì)胞所需的實(shí)際動(dòng)手時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)。不是所有細(xì)胞類型和培養(yǎng)基都同等地有利于有效的mRNA遞送，并且這在目前是某些感興趣的細(xì)胞類型、包括血細(xì)胞的基于mRNA的重編程的障礙。到目前為止還證明，為了使用mRNA方法將細(xì)胞成功地重編程成iPSC，必需利用有絲分裂停止的成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層。隨著靶細(xì)胞在iPSC誘導(dǎo)所需的長(zhǎng)時(shí)間過(guò)程中從低的起始密度開始長(zhǎng)出，這些飼養(yǎng)細(xì)胞緩沖培養(yǎng)物的群體密度，平衡掉遞送的RNA和轉(zhuǎn)染試劑的劑量(兩者都具有相伴的毒性)，并在重編程過(guò)程所造成的促凋亡和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的力量面前支持靶細(xì)胞的生存力。這種需要為所述程序增添了復(fù)雜性和實(shí)際動(dòng)手時(shí)間，并引入了重要的技術(shù)可變性來(lái)源，特別是如果飼養(yǎng)細(xì)胞本身經(jīng)歷轉(zhuǎn)染的話。飼養(yǎng)細(xì)胞層的存在也妨礙重編程過(guò)程的監(jiān)測(cè)和分析。最后，盡管人類飼養(yǎng)細(xì)胞目前是mRNA重編程的標(biāo)準(zhǔn)，但是當(dāng)將非人類動(dòng)物產(chǎn)品用于它們的衍生和擴(kuò)增時(shí)，即使是這些細(xì)胞也是外來(lái)生物污染的潛在來(lái)源。
[0032]因此，有鑒于與以前已知的程序相關(guān)的問題，在本文中提供了以提高的重編程效率和得到的細(xì)胞的改進(jìn)的品質(zhì)生產(chǎn)iPSC的新方法、材料和流程。通過(guò)遞送到細(xì)胞的RF混合物的增強(qiáng)作用，本發(fā)明的實(shí)施方式被成功地用于獲得明顯驚人和出人意料的改進(jìn)。本發(fā)明的實(shí)施方式還提供了新的流程，其壓縮并簡(jiǎn)化mRNA重編程過(guò)程，并支持不使用飼養(yǎng)細(xì)胞或任何其他可能被外來(lái)物質(zhì)污染的試劑而從人類成纖維細(xì)胞生產(chǎn)無(wú)足跡的iPSC。本文提供的新方法和組合物將擴(kuò)展以前已知的mRNA方法的優(yōu)點(diǎn)，并幫助掃清通向iPSC技術(shù)的治療性應(yīng)用的其余障礙。
[0033]總的來(lái)說(shuō)，本公開涉及使用工程化的重編程因子通過(guò)動(dòng)力學(xué)受控過(guò)程產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)的方法。更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及建立被優(yōu)化用于重編程各種不同類型細(xì)胞的重編程因子的組合，包括常規(guī)重編程因子與反式激活結(jié)構(gòu)域之間的融合體；通過(guò)引起轉(zhuǎn)入基因的適當(dāng)水平表達(dá)的方法，將這些因子作為合成的信使RNA(mRNA)導(dǎo)入到處于優(yōu)選密度下的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中；將細(xì)胞維持在確定的條件下以產(chǎn)生以前不能獲得的重編程效率。與本領(lǐng)域中已知的其他方法相比，本發(fā)明由于使用了完全無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞和無(wú)外來(lái)物的選擇并且不需傳代，極大減少了重編程中所涉及的時(shí)間、成本和工作量。本文中公開的材料和程序可用于從不同類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括人類成纖維細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。
[0034]本公開的方面還提供了使用信使RNA分子，不需病毒載體、動(dòng)物產(chǎn)品或飼養(yǎng)細(xì)胞，生產(chǎn)能夠產(chǎn)生人體各種不同組織的干細(xì)胞的方法。本文公開的新方法可用于在優(yōu)化條件下，以驚人且出人意料的效率將人類成纖維細(xì)胞重編程成誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)。
[0035]定義
[0036]當(dāng)在本文中使用時(shí)，適合于與所述方法一起使用的細(xì)胞包括但不限于原代細(xì)胞和建立的細(xì)胞系、胚胎細(xì)胞、免疫細(xì)胞、干細(xì)胞和分化的細(xì)胞，包括但不限于源自于外胚層、內(nèi)胚層和中胚層的細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞、實(shí)質(zhì)細(xì)胞、造血細(xì)胞和上皮細(xì)胞。當(dāng)在本文中使用時(shí)，干細(xì)胞包括單能細(xì)胞、專能細(xì)胞和多能細(xì)胞；胚胎干細(xì)胞和成年干細(xì)胞例如造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞和肌衛(wèi)星細(xì)胞。在一種實(shí)施方式中，體細(xì)胞被去分化或重編程。可以使用任何適合的體細(xì)胞。代表性的體細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、器官和組織細(xì)胞以及各種血細(xì)胞，包括但不限于造血細(xì)胞包括造血干細(xì)胞和提供短期或長(zhǎng)期造血移植的細(xì)胞。最優(yōu)選的細(xì)胞類型包括但不限于人類成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞和造血干細(xì)胞。所述方法對(duì)于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行去分化并任選地重分化而不永久改變細(xì)胞基因組來(lái)說(shuō)特別有用。
[0037]在本公開的方法中有用的RNA包括mRNA、調(diào)控RNA或小RNA例如siRNA或miRNA，其中一種或多種mRNA編碼起到去分化或重編程細(xì)胞作用的多肽。轉(zhuǎn)染的效率高。通常，超過(guò)90%的被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群體將表達(dá)導(dǎo)入的RNA。因此，可以使用一種或多種不同RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。例如，可以將細(xì)胞群體用一種或多種不同mRNA、一種或多種不同siRNA、一種或多種不同miRNA或其組合轉(zhuǎn)染?？梢詫⒓?xì)胞群體在單次給藥中用多種RNA同時(shí)轉(zhuǎn)染，或者多次給藥可以錯(cuò)開數(shù)分鐘、數(shù)小時(shí)、數(shù)日或數(shù)周時(shí)間。多種不同RNA的轉(zhuǎn)染可以錯(cuò)開。例如，如果需要第一種RNA在一種或多種其他RNA表達(dá)之前表達(dá)的話。
[0038]通過(guò)改變輸入RNA的量，可以在廣范圍內(nèi)操縱被轉(zhuǎn)染的RNA的表達(dá)水平，使得可以單個(gè)地調(diào)控每個(gè)被轉(zhuǎn)染的RNA的表達(dá)水平。輸入的RNA的有效量根據(jù)所需結(jié)果來(lái)確定。此夕卜，基于PCR的mRNA生產(chǎn)技術(shù)便于設(shè)計(jì)具有不同結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域組合的mRNA?？捎糜诒竟_方法的RNA在本領(lǐng)域中是已知的，并且將根據(jù)靶宿主細(xì)胞類型以及待操縱的途徑或細(xì)胞活性或治療應(yīng)用來(lái)選擇?？捎糜谌シ只?xì)胞，例如將成年的分化體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成干細(xì)胞的構(gòu)建物，可以基于已知的基因、mRNA或其他核苷酸或蛋白質(zhì)序列來(lái)構(gòu)建。
[0039]術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互換使用，是指任何長(zhǎng)度的核苷酸、可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸的聚合形式。因此，這個(gè)術(shù)語(yǔ)包括但不限于單鏈、雙鏈或多鏈DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜合體或包含嘌呤和嘧啶堿基或其他天然、化學(xué)或生物化學(xué)修飾、非天然或衍生的核苷酸堿基的聚合物。“寡核苷酸” 一般是指單鏈或雙鏈DNA的約5至約100個(gè)核苷酸之間的多核苷酸。然而，出于本公開的目的，對(duì)于寡核苷酸的長(zhǎng)度沒有上限。寡核苷酸也被稱為寡聚體，并且可以從基因分離或者通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法化學(xué)合成。
[0040]當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“微RNA”是指任何類型的干擾RNA，包括但不限于內(nèi)源微RNA和人造微RNA(例如合成的miRNA)。內(nèi)源微RNA是在基因組中天然編碼的能夠調(diào)節(jié)mRNA的生產(chǎn)性利用的小RNA。人造微RNA可以是內(nèi)源微RNA之外的能夠調(diào)節(jié)mRNA的活性的任何類型的RNA序列。微RNA序列可以是由這些序列中的任一種或多種構(gòu)成的RNA序列?！拔NA前體”(或“前miRNA”)是指具有其中合并有微RNA序列的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的核酸?！俺墒煳NA”(或“成熟miRNA”)包括已從微RNA前體(“前miRNA”)切下或已被合成(例如在實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)無(wú)細(xì)胞合成來(lái)合成)的微RNA，并具有約19個(gè)核苷酸至約27個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，例如，成熟微 RNA 可以具有 19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt 或 27nt 的長(zhǎng)度。成熟微RNA可以結(jié)合于靶mRNA并抑制靶mRNA的翻譯。
[0041]0CT4的示例性的基因組mRNA(cDNA)和蛋白質(zhì)序列在本領(lǐng)域中是已知的，參見例如(0CT4)P0U5F1P0U 5 類同源框[智人(Homo sapiens)]基因 ID: 5460，其提供 mRNA (cDNA)序列Genbank登記號(hào)NM — 001173531.1，題為智人POU 5類同源框I (P0U5F1)，轉(zhuǎn)錄本變體3，mRNA ;Genbank登記號(hào)NM—002701.4，題為智人POU 5類同源框I (P0U5F1)轉(zhuǎn)錄本變體I，mRNA ;和Genbank登記號(hào)NM — 203289.4，題為智人POU 5類同源框I (P0U5F1)，轉(zhuǎn)錄本變體2, mRNA ο S0X2的示例性的基因組mRNA (cDNA)和蛋白質(zhì)序列在本領(lǐng)域中是已知的，參見例如S0X2SRY (性別決定區(qū)Y)-盒2 [智人]，基因ID:6657，其提供mRNA (cDNA)序列Genbank登記號(hào)NM — 003106.2，題為mRNA序列智人SRY(性別決定區(qū)Y)-盒2(S0X2)，mRNA。NANOG的示例性的基因組mRNA(cDNA)和蛋白質(zhì)序列在本領(lǐng)域中也是已知的，參見例如NANOG Nanog同源框[智人]，基因ID:79923，其提供mRNA (cDNA)序列Genbank登記號(hào)NM —024865.2，題為智人Nanog同源框(NANOG), mRNA。LIN28的示例性的基因組mRNA (cDNA)和蛋白質(zhì)序列在本領(lǐng)域中也是已知的，參見例如LIN28A同源物A (秀麗隱桿線蟲(C.elegans))[智人]，基因 ID:79727，其提供 mRNA (cDNA)序列 Genbank 登記號(hào) NM — 024674.4，題為智人 lin_28同源物A(C.elegans) (LIN28A)，mRNA。KLF4的示例性的基因組mRNA (cDNA)和蛋白質(zhì)序列在本領(lǐng)域中是已知的，參見例如KLF4Kruppel樣因子4(腸)[智人]，基因ID:9314，其提供mRNA(cDNA)序列 Genbank 登記號(hào) NM—004235.4,題為智人 Kruppel 樣因子 4 (腸)(KLF4),mRNA。MYC的mRNA序列在本領(lǐng)域中也是已知的，參見例如MYC v-myc髓細(xì)胞組織增生病毒癌基因同源物(禽)[智人]，基因ID:4609，其提供mRNA (cDNA)序列Genbank登記號(hào)NM—002467.4，題為智人v-myc髓細(xì)胞組織增生病毒癌基因同源物(禽類)(MYC)，mRNA。
[0042]“莖環(huán)結(jié)構(gòu)”指的是具有一定二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸，其包括已知或預(yù)測(cè)形成雙鏈的核苷酸區(qū)域(莖部分)，該區(qū)域在一側(cè)連接有主要為單鏈核苷酸的區(qū)域(環(huán)部分)。術(shù)語(yǔ)“發(fā)夾”和“回折”結(jié)構(gòu)在本文中也被用于指稱莖環(huán)結(jié)構(gòu)。這樣的結(jié)構(gòu)在本領(lǐng)域中是公知的，并且這些術(shù)語(yǔ)與它們?cè)诒绢I(lǐng)域中已知的意義相一致使用。莖環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)核苷酸的真正一級(jí)序列對(duì)于本發(fā)明的實(shí)踐來(lái)說(shuō)不是關(guān)鍵的，只要存在所述二級(jí)結(jié)構(gòu)即可。正如在本領(lǐng)域中已知的，二級(jí)結(jié)構(gòu)不需要精確的堿基配對(duì)。因此，莖可以包括一個(gè)或多個(gè)堿基錯(cuò)配?；蛘撸瑝A基配對(duì)可以是精確的，即不包括任何錯(cuò)配。
[0043]當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”是指可以被誘導(dǎo)而增殖的未分化的細(xì)胞。干細(xì)胞能夠自我維持，意味著通過(guò)每次細(xì)胞分裂，一個(gè)子細(xì)胞也將是干細(xì)胞。干細(xì)胞可以從胚胎、胎兒、新生兒、青少年或成人組織獲得。術(shù)語(yǔ)“祖細(xì)胞”當(dāng)在本文中使用時(shí)是指源自于干細(xì)胞的未分化的細(xì)胞，并且其本身不是干細(xì)胞。某些祖細(xì)胞可以產(chǎn)生能夠分化成超過(guò)一種細(xì)胞類型的后代。
[0044]當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞”(或“iPS細(xì)胞”)是指從體細(xì)胞例如分化的體細(xì)胞誘導(dǎo)，并且與所述體細(xì)胞相比具有更高潛力的干細(xì)胞。iPS細(xì)胞能夠自我更新并分化成成熟細(xì)胞例如平滑肌細(xì)胞。iPS可能也能分化成平滑肌祖細(xì)胞。
[0045]當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“分離的”在指稱細(xì)胞時(shí)，是指處于與細(xì)胞天然存在的環(huán)境不同的環(huán)境中的細(xì)胞，例如在細(xì)胞天然存在于多細(xì)胞生物體中，并且將所述細(xì)胞從多細(xì)胞生物體取出的情況下，所述細(xì)胞是“分離的”。分離的遺傳修飾的宿主細(xì)胞可以存在于遺傳修飾的宿主細(xì)胞的混合群體中，或存在于包含遺傳修飾的宿主細(xì)胞和沒有遺傳修飾的宿主細(xì)胞的混合群體中。例如，分離的遺傳修飾的宿主細(xì)胞可以存在于體外遺傳修飾的宿主細(xì)胞的混合群體中，或存在于包含遺傳修飾的宿主細(xì)胞和沒有遺傳修飾的宿主細(xì)胞的混合的體外群體中。
[0046]當(dāng)在本文中使用時(shí)，“宿主細(xì)胞”是指體內(nèi)或體外細(xì)胞(例如作為單細(xì)胞實(shí)體培養(yǎng)的真核細(xì)胞)，所述真核細(xì)胞可以被用作或已被用作核酸(例如外源核酸)的受體，并且包括已通過(guò)核酸進(jìn)行遺傳修飾的原始細(xì)胞的后代。應(yīng)該理解，由于天然、偶然或蓄意的突變，單個(gè)細(xì)胞的后代可能不一定在形態(tài)、基因組或總DNA互補(bǔ)物上與原始親代完全一致。
[0047]術(shù)語(yǔ)“遺傳修飾”是指在引入新的核酸(即對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)外源的核酸)后在細(xì)胞中引起的永久或暫時(shí)的遺傳變化。遺傳變化(“修飾”)可以通過(guò)將新的核酸并入宿主細(xì)胞的基因組中，或通過(guò)將新的核酸作為染色體外元件暫時(shí)或穩(wěn)定地維持來(lái)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)細(xì)胞是真核細(xì)胞時(shí)，永久的遺傳變化可以通過(guò)將核酸導(dǎo)入到細(xì)胞的基因組中來(lái)實(shí)現(xiàn)。遺傳修飾的適合方法包括病毒感染、轉(zhuǎn)染、接合、原生質(zhì)體融合、電穿孔、粒子槍技術(shù)、磷酸鈣沉淀、直接顯微注射等。
[0048]當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“外源核酸”是指通?；蛱烊磺闆r下不存在于天然細(xì)胞中和/或不由其生產(chǎn)，和/或被導(dǎo)入到細(xì)胞中(例如通過(guò)電穿孔、轉(zhuǎn)染、感染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或?qū)⒑怂釋?dǎo)入到細(xì)胞中的其他手段)的核酸。
[0049]當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“治療”是指獲得所需的藥理和/或生理效果。所述效果就完全或部分阻止疾病或其癥狀而言可以是預(yù)防性的，和/或就疾病和/或歸因于疾病的不利影響的部分或完全治愈而言可以是治療性的。當(dāng)在本文中使用時(shí)，“治療”覆蓋了哺乳動(dòng)物中，尤其是人類中疾病的任何治療，并包括:(a)在對(duì)疾病具有易感性但是尚未被診斷為患有它的受試者中阻止疾病的發(fā)生；(b)抑制疾病，即停止疾病的發(fā)展；和(c)緩解疾病，即引起疾病減退。
[0050]在本文中可互換使用的術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”、“受試者”、“宿主”和“患者”是指哺乳動(dòng)物，包括但不限于人類、非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物(例如小鼠、大鼠等)、有蹄類動(dòng)物、犬科動(dòng)物、兔形目動(dòng)物、貓科動(dòng)物等。在某些實(shí)施方式中，目標(biāo)受試者是人類。在某些實(shí)施方式中，受試者是非人類動(dòng)物例如嚙齒動(dòng)物或兔形目動(dòng)物。
[0051]“治療有效量”或“有效量”意味著當(dāng)給藥于受試者以治療疾病時(shí)，足以執(zhí)行這種對(duì)疾病的治療的化合物、核酸的量或細(xì)胞的數(shù)量?！爸委熡行Я俊睂㈦S著化合物或細(xì)胞、疾病及其嚴(yán)重性和待治療受試者的年齡、體重等而變。
[0052]在進(jìn)一步描述本發(fā)明之前，應(yīng)該理解，本發(fā)明不限于所描述的【具體實(shí)施方式】，因?yàn)樗鼈儺?dāng)然可以改變。還應(yīng)該理解，本文中使用的術(shù)語(yǔ)僅僅是出于描述【具體實(shí)施方式】的目的，并且不打算是限制性的，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將僅由隨附的權(quán)利要求書限定。
[0053]當(dāng)提供值的范圍時(shí)，應(yīng)該理解，除非上下文明確陳述，否則在所述范圍的上限與下限或所陳述范圍中的任何其他陳述的或居間的值之間的精確到下限的單位的十分之一的每個(gè)居間值，被涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)。這些較小的范圍的上限和下限，除了在所陳述的范圍內(nèi)任何具體排除的限值之外，可以被獨(dú)立地包含在所述較小的范圍內(nèi)，并且也涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)。當(dāng)所陳述的范圍包括一個(gè)或兩個(gè)所述限值時(shí)，排除了任一個(gè)或兩個(gè)所述被包含的限值的范圍，也包括在本發(fā)明中。
[0054]除非另有定義，否則在本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的意義。盡管與本文中描述的相似或等同的任何方法和材料也可用于本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)，但現(xiàn)在將描述優(yōu)選的方法和材料。本文中提到的所有出版物，通過(guò)參考并入本文，以公開和描述與被引用的出版物相關(guān)的方法和/或材料。
[0055]在本公開的一個(gè)方面，通過(guò)使用分別合并有N-端MyoD反式激活結(jié)構(gòu)域(Hirai等，Stem Cells, 2011)或C-端VP16反式激活結(jié)構(gòu)域的三聯(lián)體重復(fù)序列的0ct4或Sox 2的工程化變體(Wang等，EMBO Reports, 2011 ;其中通過(guò)將VP16反式激活結(jié)構(gòu)域分別融合到0CT4(也被稱為Pou5fl) ,NANOG和S0X2來(lái)制備合成的重編程因子，這些合成的因子可以以提高的效率和加速的動(dòng)力學(xué)重編程小鼠和人類兩者的成纖維細(xì)胞)，或通過(guò)用兩種其他因子Rarg和Lrh-1擴(kuò)大“標(biāo)準(zhǔn)” RF混合物(Wang等，PNAS, 2011)，可以增強(qiáng)基于mRNA的重編程。每個(gè)所述文獻(xiàn)的內(nèi)容通過(guò)參考并入本文。強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活子當(dāng)結(jié)合于DNA的特定位點(diǎn)處時(shí)，可以有效地召集多種染色質(zhì)重塑復(fù)合物。一個(gè)良好的實(shí)例是MyoD，骨骼肌形成的主要轉(zhuǎn)錄因子，其可以改變分化的細(xì)胞的命運(yùn)。Hirai等推測(cè)，由于MyoD是非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄因子，因此如果被融合在一起，它可以增加iPS因子對(duì)染色質(zhì)的可接近性。當(dāng)用帶有Oct-MyoD TAD融合基因以及Sox2和Klf4的反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠或人類細(xì)胞時(shí)，與標(biāo)準(zhǔn)的iPS因子相比，它們將iPSC集落的數(shù)量提高?50倍。同樣地，廣為人知的魯棒的轉(zhuǎn)錄激活子VP16，當(dāng)融合到不同iPS因子時(shí)，可以對(duì)重編程表現(xiàn)出強(qiáng)刺激效果。
[0056]人類iPSC的示例性制備
[0057]所述方法還廣泛用于細(xì)胞的重分化或重編程，以例如產(chǎn)生iPS細(xì)胞，其能夠被進(jìn)一步調(diào)制以形成造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞和肌衛(wèi)星細(xì)胞或人類組織的分化的細(xì)胞，包括但不限于紅細(xì)胞，白細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞，血小板，基質(zhì)細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，骨細(xì)胞包括破骨細(xì)胞，上皮組織包括皮膚細(xì)胞，肌肉組織包括平滑肌、骨骼肌和心肌，血管組織包括內(nèi)皮細(xì)胞，肝組織包括肝細(xì)胞，和神經(jīng)組織包括神經(jīng)元。誘導(dǎo)iPS細(xì)胞分化成各種分化的細(xì)胞類型，包括但不限于心肌細(xì)胞、造血干細(xì)胞、骨細(xì)胞例如破骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞和神經(jīng)元的方法，可以通過(guò)用誘導(dǎo)分化的RNA進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染來(lái)誘導(dǎo)干細(xì)胞、包括但不限于分離的胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的分化。此外或可替選地，可以通過(guò)將細(xì)胞在細(xì)胞類型特異性的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞重分化。例如，可以將iPS細(xì)胞維持在CF-1飼養(yǎng)細(xì)胞上，隨后適應(yīng)于無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的條件?？梢酝ㄟ^(guò)將細(xì)胞在頭蛋白(noggin)、Dkk-1和IGF-1存在下進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)誘導(dǎo)iPS細(xì)胞形成分化的視網(wǎng)膜細(xì)胞。
[0058]以前報(bào)道的方法依賴于整合載體即病毒或質(zhì)粒來(lái)攜帶修飾的因子。在一種實(shí)施方式中，進(jìn)行了重編程試驗(yàn)以比較6種不同mRNA組合混合物的性能，所述混合物組合包括用于mRNA重編程的5種因子(0ct4、Sox2、Klf4、cMyc_T58A和Lin28)的轉(zhuǎn)錄本，或包括Rarg和Lrh-1的7種重編程因子RF混合物，每種組合以基于野生型0ct4以及MyoD-和VP16-0ct4融合構(gòu)建物(分別命名為M3O和VPx3)的三種變化形式進(jìn)行試驗(yàn)。將BJ成纖維細(xì)胞在基于飼養(yǎng)細(xì)胞的重編程培養(yǎng)中轉(zhuǎn)染11天，到此時(shí)為止在幾個(gè)孔中高級(jí)的形態(tài)是顯而易見的。在接下來(lái)的幾天中，在用基于野生型0(^4和M3O的混合物轉(zhuǎn)染的孔中出現(xiàn)了具有特征性hESC形態(tài)的集落。VPx3-轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物中的靶細(xì)胞盡管顯示出加速生長(zhǎng)和聚集成灶點(diǎn)的某些趨勢(shì)，但保持成纖維細(xì)胞的形態(tài)，并且沒有出現(xiàn)集落。基于野生型0ct4和M3O的混合物的5因子和7因子實(shí)施方式顯示出相近的集落產(chǎn)率，因此在混合物中包含Rarg和Lrh-1沒有帶來(lái)優(yōu)勢(shì)。然而，M3O混合物給出了數(shù)倍于由野生型0ct4生成的集落數(shù)。根據(jù)這一結(jié)果，從M3O 5因子孔挑取集落，用于擴(kuò)增和進(jìn)一步分析(圖1)。M3O來(lái)源的集落的多能性通過(guò)對(duì)核和細(xì)胞表面標(biāo)志物的免疫染色，并通過(guò)體外分化成三種原始胚層得到證實(shí)。對(duì)6個(gè)擴(kuò)增的iPSC克隆進(jìn)行核型分析和DNA指紋分析，在所有情況下證實(shí)了細(xì)胞的核型正常性和BJ譜系。
[0059]所述方法還可以廣泛用于細(xì)胞的重分化或重編程，以例如產(chǎn)生iPS細(xì)胞，其能夠被進(jìn)一步調(diào)制以形成造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞和肌衛(wèi)星細(xì)胞或人類組織的分化的細(xì)胞，包括但不限于紅細(xì)胞，白細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞，血小板，基質(zhì)細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，骨細(xì)胞包括破骨細(xì)胞，上皮組織包括皮膚細(xì)胞，肌肉組織包括平滑肌、骨骼肌和心肌，血管組織包括內(nèi)皮細(xì)胞，肝組織包括肝細(xì)胞，和神經(jīng)組織包括神經(jīng)元。誘導(dǎo)iPS細(xì)胞分化成各種分化的細(xì)胞類型，包括但不限于心肌細(xì)胞、造血干細(xì)胞、骨細(xì)胞例如破骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞和神經(jīng)元的方法，在本領(lǐng)域中是已知的(Song等，CellRes.，19(11):1233-42(2009), Lamba 等，PLoS One, 5(1): e8763 (2010)，Gai 等，Cell B1lInt.200933(11): 1184-93 (2009) ,Grigoriadis 等，Blood, 115(14): 2769-76 (2010))?？梢酝ㄟ^(guò)用誘導(dǎo)分化的RNA進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染來(lái)誘導(dǎo)干細(xì)胞、包括但不限于分離的胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的分化。此外或可替選地，可以通過(guò)將細(xì)胞在細(xì)胞類型特異性的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞重分化。例如，可以將iPS細(xì)胞維持在CF-1飼養(yǎng)細(xì)胞上，隨后適應(yīng)于無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的條件。可以通過(guò)將細(xì)胞在頭蛋白、Dkk-1和IGF-1存在下進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)誘導(dǎo)iPS細(xì)胞形成分化的視網(wǎng)膜細(xì)胞。另一方面，可以通過(guò)包含Nanog轉(zhuǎn)錄本進(jìn)一步增強(qiáng)mRNA混合物的效能。在這種實(shí)施方式中，將在飼養(yǎng)細(xì)胞上含有50K個(gè)BJ成纖維細(xì)胞的4個(gè)孔用基于野生型0ct4或M3O的5因子或6因子混合物轉(zhuǎn)染6天，然后將每種培養(yǎng)物在新鮮的飼養(yǎng)細(xì)胞上以1:6傳代，以在6孔板中擴(kuò)增(4)。在每塊板中將轉(zhuǎn)染繼續(xù)進(jìn)行另外0-5天。在第18天將培養(yǎng)物固定并用TRA-1-60抗體染色(其中第O天對(duì)應(yīng)于第一次轉(zhuǎn)染)，以便評(píng)估不同混合物和轉(zhuǎn)染時(shí)間過(guò)程對(duì)iPSC生產(chǎn)率的影響。結(jié)果顯示，不論使用何種0ct4變體，向混合物添加Nanog都是非常有益的，而當(dāng)M3O和Nanog被一起使用時(shí)，獲得了最高的轉(zhuǎn)化效率。
[0060]在一種實(shí)施方式中，在其他基于飼養(yǎng)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，使用其他三種人類成纖維細(xì)胞系(HDF-f、HDF-n和XFF)，證實(shí)了基于M3O的5因子或6因子混合物的效能。使用所有這三種與BJ相比在正常擴(kuò)增培養(yǎng)中表現(xiàn)出更快的本源群體倍增時(shí)間的低傳代細(xì)胞系時(shí)，重編程動(dòng)力學(xué)和效率明顯改進(jìn)。在某些情況下，我們從少至6天的轉(zhuǎn)染獲得了 hESC樣集落，盡管在轉(zhuǎn)染繼續(xù)進(jìn)行另外幾天的實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)率高得多。包括了通過(guò)添加新鮮細(xì)胞來(lái)定期加強(qiáng)飼養(yǎng)層的實(shí)驗(yàn)表明，盡管這種策略可能提供一些益處，但它們被得到的流程的復(fù)雜性所抵消。因此我們決定聚焦于使用更強(qiáng)效的混合物來(lái)開發(fā)簡(jiǎn)化的無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的流程。
[0061]本公開涉及無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的iPSC的產(chǎn)生。不論使用何種重編程技術(shù)，不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞的iPSC衍生一般被證明略具挑戰(zhàn)性，但是在持續(xù)轉(zhuǎn)染方式的背景中產(chǎn)生特殊困難。對(duì)于成纖維細(xì)胞可以被鋪板而不損害細(xì)胞生存力和增殖活性的密度，存在下限。當(dāng)細(xì)胞面對(duì)轉(zhuǎn)染和重編程因子的異位表達(dá)的壓力時(shí)，細(xì)胞在稀疏培養(yǎng)中經(jīng)歷有絲分裂停止或凋亡的傾向加劇。此外，在基于飼養(yǎng)細(xì)胞的重編程特征性的高細(xì)胞密度下被良好耐受的RNA劑量，當(dāng)在更少的細(xì)胞之間分配時(shí)，產(chǎn)生更嚴(yán)重的細(xì)胞毒性效應(yīng)。同時(shí)，在成纖維細(xì)胞達(dá)到鋪滿狀態(tài)后，可以使用mRNA轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)的表達(dá)的外顯率急劇降低，這可能是由于與接觸抑制和Gl停止相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)吞作用的下調(diào)。在細(xì)胞經(jīng)歷間充質(zhì)向上皮的轉(zhuǎn)變(MET)后，在重編程期間這種在擁擠培養(yǎng)中對(duì)轉(zhuǎn)染的接納性的降低似乎被減輕。然而，對(duì)于人類成纖維細(xì)胞來(lái)說(shuō)，當(dāng)使用目前的mRNA混合物時(shí)達(dá)到MET通常需要的?7天，使得即使將細(xì)胞以最低可存活初始密度鋪板，也難以繞過(guò)成纖維細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)的問題。可以通過(guò)傳代使細(xì)胞稀化以延遲這種命運(yùn)，但是高度受激的重編程中間體的鋪板效率難以預(yù)測(cè)，并且在任何情況下，基于傳代的衍生流程將犧牲方便性，并且很難放大到高通量應(yīng)用。
[0062]本公開涉及MET的表型指征(成纖維細(xì)胞過(guò)程的退化，以及焦點(diǎn)和鵝卵石形態(tài)的出現(xiàn))。在一種實(shí)施方式中，通過(guò)我們的發(fā)明，使用增強(qiáng)的混合物來(lái)加速M(fèi)ET，能夠使用6因子M3O混合物，不需傳代，以各種低濃度(每孔50K比100K比150K)接種靶細(xì)胞，進(jìn)行無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的重編程。
[0063]本發(fā)明的一個(gè)方面涉及這些重編程培養(yǎng)物的命運(yùn)，所述培養(yǎng)物被證明對(duì)接種密度高度敏感，推測(cè)是由于在轉(zhuǎn)染方式的過(guò)程中過(guò)量細(xì)胞毒性和成纖維細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)的影響兩者被自我加強(qiáng)。在使用“標(biāo)準(zhǔn)”RNA劑量(每孔1200ng)的實(shí)驗(yàn)中，從以每孔100K的密度鋪板的HDF-n和XFF成纖維細(xì)胞獲得幾十個(gè)hESC樣集落，而相應(yīng)的50K和150K培養(yǎng)分別在屈服于種群崩潰和成纖維細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)后，僅給出幾個(gè)集落。在嘗試使用兩種其他成纖維細(xì)胞系BJ和HDF-a的衍生中，在達(dá)到鋪滿狀態(tài)后不久，即使是最有希望(150K)的培養(yǎng)物也變得基本上是靜止不動(dòng)的，隨后僅產(chǎn)生具有延遲的動(dòng)力學(xué)的零星集落。
[0064]在本發(fā)明的一種特定實(shí)施方式中，我們從環(huán)境切換到5%氧氣培養(yǎng),并在轉(zhuǎn)染的前4天從四分之一劑量逐漸升高到全RNA劑量，以試圖最小化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。
[0065]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，使用這些新的條件,本發(fā)明人試驗(yàn)了用L-Myc替代c_Myc是否能夠進(jìn)一步改進(jìn)重編程混合物。
[0066]在另一種實(shí)施方式中，我們?cè)u(píng)估了一個(gè)簡(jiǎn)化的轉(zhuǎn)染方案，其中將RNA隨著每日培養(yǎng)基更換添加到細(xì)胞，而不是在早4小時(shí)的獨(dú)立步驟中遞送。在“24小時(shí)轉(zhuǎn)染”孔中將RNA劑量降低以補(bǔ)償預(yù)期的細(xì)胞毒性增加，并且試驗(yàn)了兩種不同轉(zhuǎn)染試劑(RNAiMAX和Stemfect) 0將XFF細(xì)胞以每孔50K鋪板并轉(zhuǎn)染9天。常規(guī)的“4小時(shí)轉(zhuǎn)染”方式使用基于C-Myc的混合物時(shí)給出每孔一百個(gè)TRA-1-60+集落的量級(jí)，而L-Myc混合物的表現(xiàn)相比不良(圖2)。來(lái)自于“24小時(shí)轉(zhuǎn)染”培養(yǎng)的結(jié)果甚至更令人印象深刻。在生產(chǎn)率最高的這些孔中(對(duì)應(yīng)于c-Myc400ng/ml Stemfect條件)，在第9天，即最后一次轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，培養(yǎng)物變得幾乎長(zhǎng)滿hESC樣細(xì)胞?！?4小時(shí)轉(zhuǎn)染”的優(yōu)越表現(xiàn)的機(jī)制基礎(chǔ)，可能有通過(guò)濃縮由細(xì)胞釋放的擴(kuò)散因子而提高薄培養(yǎng)物的有效密度的效應(yīng)。當(dāng)將這些優(yōu)選的流程條件應(yīng)用于另一個(gè)示例性實(shí)驗(yàn)，即使用HDF-a成纖維細(xì)胞的衍生中時(shí)，在以每孔75K個(gè)細(xì)胞接種的培養(yǎng)物中，生產(chǎn)率不如使用高增殖性XFF細(xì)胞獲得的那樣壯觀，但是早在流程的第9天，再一次出現(xiàn)大量hESC樣集落(圖4)。
[0067]在一種特定實(shí)施方式中，當(dāng)將細(xì)胞以比常規(guī)使用的體積更小的培養(yǎng)基體積例如ImU0.75ml,0.5ml或仍能維持細(xì)胞培養(yǎng)的最小量的培養(yǎng)基接種時(shí)，使用上面公開的條件的重編程效率明顯得到提高。重編程過(guò)程中的這種小體積條件由此并入本發(fā)明。
[0068]本文中已描述的實(shí)施方式絕不僅僅應(yīng)用于本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，在略微可變的條件下，或使用用于重編程、定向分化或轉(zhuǎn)分化的常規(guī)或工程化因子的類似組合，本公開也可用于重編程其他細(xì)胞。
[0069]在其他實(shí)施方式中，對(duì)因子的化學(xué)計(jì)量進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，也將加快重編程的步伐——事實(shí)上，mRNA方法提供了確定獨(dú)立地針對(duì)ipPSC誘導(dǎo)的早期和晚期階段的混合物的機(jī)會(huì)。使用M30獲得的提高，為最近將新的工程化的重編程因子應(yīng)用于ipse產(chǎn)生提供了最新的驗(yàn)證。其他這樣的工程化的重編程因子包括將S0X2、KLF4、CMYC, LMYC, LIN28、NANOG等融合到來(lái)自于VP16或MYOD之外的因子例如GAL4、GATA1、P53等的反式激活結(jié)構(gòu)域。應(yīng)該指出，用于遞送mRNA的試劑和方法也可用于共轉(zhuǎn)染在iPSC產(chǎn)生中的價(jià)值已得到證明的siRNA和miRNA。然而，本文中公開的無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的流程代表了與當(dāng)前流程相比顯著的進(jìn)步，使重編程所需的時(shí)間減少了多達(dá)一半，并同等或更大地減少了勞動(dòng)力和材料成本，剔除了程序中的繁瑣步驟，并允許以與生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子幾乎相同的容易性將mRNA遞送到細(xì)胞——即作為培養(yǎng)基增補(bǔ)劑。
[0070]在某些實(shí)施方式中，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重編程以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。例如，可以將淋巴細(xì)胞重編程成調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，其可以被給藥于需要的患者以提高或轉(zhuǎn)移免疫耐受，特別是自身耐受。Foxp3陽(yáng)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)或給藥可能可用于減輕免疫應(yīng)答例如移植物排斥，和/或減少、抑制或減輕自體免疫疾病或障礙的一種或多種癥狀，所述疾病或障礙例如糖尿病、多發(fā)性硬化癥、哮喘、炎性腸病、甲狀腺炎、腎臟疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、斑禿、強(qiáng)制性脊柱炎、抗磷脂綜合征、自體免疫性Addison病、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性肝炎、自體免疫性內(nèi)耳疾病、自體免疫性淋巴增生綜合征(ALPS)、自體免疫性血小板減少性紫癜(ATP)、白塞病、大皰性類天皰瘡、心肌病、乳糜性皮炎、慢性疲勞綜合征的免疫缺乏綜合征(CFIDS)、慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、瘢痕性類天皰瘡、冷凝集素病、CREST綜合征、克羅恩病、Dego’ s病、皮肌炎、青少年皮肌炎、盤狀狼瘡、特發(fā)性混合型冷球蛋白血癥、纖維肌痛-肌纖維組織炎、Grave's病、Guillain-Barre病、橋本甲狀腺炎、特發(fā)性肺纖維化、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA腎病、胰島素依賴型糖尿病(I型)、幼年型關(guān)節(jié)炎、美尼爾氏病、混合型結(jié)締組織病、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無(wú)力、尋常型天皰瘡、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、多軟骨炎、多腺體(polyglancular)綜合征、風(fēng)濕性多肌痛、多發(fā)性肌炎和皮肌炎、原發(fā)性無(wú)丙種球蛋白血癥、原發(fā)性膽汁性肝硬化、牛皮癬、雷諾氏現(xiàn)象、萊特爾綜合征、風(fēng)濕熱、結(jié)節(jié)病、硬皮病、干燥綜合征、僵人綜合征、多發(fā)性大動(dòng)脈炎、顳動(dòng)脈炎/巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、潰瘍性結(jié)腸炎、葡萄膜炎、脈管炎、白癜風(fēng)和韋格納肉芽腫。
[0071]所述方法可用于產(chǎn)生可能在各種疾病和障礙的治療中有用的細(xì)胞，所述疾病和障礙包括但不限于諸如帕金森氏病、阿茲海默氏病、傷口愈合和多發(fā)性硬化癥的疾病。所述方法還可用于器官再生，并用于免疫系統(tǒng)的恢復(fù)或補(bǔ)充。例如，處于分化的不同階段的細(xì)胞例如iPS細(xì)胞、造血干細(xì)胞、專能細(xì)胞或單能細(xì)胞例如前體細(xì)胞如上皮前體細(xì)胞等，可以靜脈內(nèi)或通過(guò)局部手術(shù)來(lái)給藥。所述方法可以與其他常規(guī)方法例如處方藥物方式、手術(shù)、激素療法、化療和/或放療組合使用。
[0072]在一種實(shí)施方式中，試劑盒包含RNA、細(xì)胞和將RNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中的器件。RNA可以被冷凍干燥或在溶液中。試劑盒可以任選包括其他材料例如細(xì)胞培養(yǎng)試劑。在可替選實(shí)施方式中，試劑盒提供按照本公開的方法制備的重分化、去分化或重編程的細(xì)胞，并冷藏或冷凍儲(chǔ)存和/或運(yùn)輸用于以后使用。細(xì)胞通常被儲(chǔ)存在維持生存力的溶液中。含有細(xì)胞的試劑盒應(yīng)該使用與生存力相一致的方法，例如在含有干冰的冷卻器中儲(chǔ)存或運(yùn)輸，以使細(xì)胞維持低于4°C，優(yōu)選地低于_20°C。
[0073]試劑盒任選地包括下列一種或多種物質(zhì):生物活性藥劑，培養(yǎng)基，賦形劑和下列一種或多種:注射器，針頭，線，紗布，繃帶，消毒劑，抗生素，局部麻醉劑，鎮(zhèn)痛劑，手術(shù)線，剪刀，手術(shù)刀，無(wú)菌流體和無(wú)菌容器。試劑盒的組分可以單獨(dú)包裝并且可以是無(wú)菌的。試劑盒通常提供在容器中，例如適合于商業(yè)化銷售的塑料、紙板或金屬容器。任何試劑盒均可以包括使用說(shuō)明書。所述方法可用于產(chǎn)生可能在各種疾病和障礙的治療中有用的細(xì)胞，所述疾病和障礙包括但不限于神經(jīng)變性疾病例如帕金森氏病、阿茲海默氏病和多發(fā)性硬化癥。所述方法還可用于器官再生，并用于免疫系統(tǒng)的恢復(fù)或補(bǔ)充。例如，處于分化的不同階段的細(xì)胞例如iPS細(xì)胞、造血干細(xì)胞、專能細(xì)胞或單能細(xì)胞例如前體細(xì)胞如上皮前體細(xì)胞等，可以靜脈內(nèi)或通過(guò)局部手術(shù)來(lái)給藥。所述方法可以與其他常規(guī)方法例如處方藥物方式、手術(shù)、激素療法、化療和/或放療組合使用。
[0074]本公開的方面提供了干細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)和用于生產(chǎn)傷口治療用的皮膚組織細(xì)胞的分化方法，以及用于關(guān)節(jié)炎、狼瘡和其他自體免疫相關(guān)疾病的治療的干細(xì)胞療法。
實(shí)施例
[0075]現(xiàn)在參考下面的實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明。提供這些實(shí)施例僅僅是出于說(shuō)明的目的，并且本發(fā)明不限于這些實(shí)施例，而是涵蓋了明顯是本文提供的教示的結(jié)果的所有變化方式。
[0076]實(shí)施例1-1VT樽板的產(chǎn)牛
[0077]用于產(chǎn)生線性PCR產(chǎn)物體外轉(zhuǎn)錄(IVT)模板的質(zhì)粒構(gòu)建物，使用不依賴于連接的克隆(LIC)來(lái)構(gòu)建。我們首先構(gòu)建了并入有5’和3’非翻譯區(qū)(UTR)的親本質(zhì)粒(pIVT)，所述非翻譯區(qū)側(cè)翼帶有被設(shè)計(jì)用于接受編碼目的蛋白的開放閱讀框(ORF)插入片段的插入位點(diǎn)。ORF側(cè)翼的序列如Warren等，Cell Stem Cell, 2010中所述,包含低二級(jí)結(jié)構(gòu)前導(dǎo)序列和強(qiáng)Kozak位點(diǎn)(5’ UTR)和鼠類α-球蛋白3’ UTR0通過(guò)使用帶尾引物從質(zhì)粒擴(kuò)增的兩個(gè)PCR產(chǎn)物的重新退火，產(chǎn)生帶有5’突出部分的pIVT載體的線性化形式。通過(guò)類似程序產(chǎn)生具有互補(bǔ)突出部分的ORF PCR產(chǎn)物，與載體PCR產(chǎn)物合并，并通過(guò)熱休克轉(zhuǎn)化到DH5 α細(xì)菌中，以克隆基因特異性構(gòu)建物(pIVT-KLF4等)。將得到的質(zhì)粒用作PCR反應(yīng)的模板，制造并入有Τ7啟動(dòng)子、側(cè)翼帶有UTR的ORF和T12Jl的線性IVT模板，以驅(qū)動(dòng)polyA尾的添加，如Warren等，Cell Stem Cell, 2010中所述。通過(guò)使用帶尾反向引物(T120CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA)引入T12Jl區(qū)域。對(duì)于M 30和VPx3融合構(gòu)建物來(lái)說(shuō)，使用帶尾引物，通過(guò)PCR將編碼反式激活結(jié)構(gòu)域的序列附連到0RF。以?10ng/ μ L的濃度維持PCR產(chǎn)物模板儲(chǔ)用物。
[0078]實(shí)施例2 - mRNA混合物的產(chǎn)牛
[0079]mRNA合成過(guò)程概述在圖5中。在IVT反應(yīng)中，使用4:1的ARCA帽類似物與GTP的比率產(chǎn)生合成的mRN，以產(chǎn)生高百分率的加帽轉(zhuǎn)錄本。在核苷酸三磷酸(NTP)混合物中用5m-CTP完全代替CTP和用假UTP完全代替UTP，被用于降低RNA產(chǎn)物的免疫原性。帽類似物和修飾的NTP購(gòu)自Trilink B1technologies。制備2.5x NTP混合物(ARCA:ATP:5m-CTP:GTP:假 UTP 為 15:15:3.75:3.75:3.75mM)以替換隨著用于進(jìn)行 IVT 反應(yīng)的MEGAscript T7試劑盒(Amb1n)提供的標(biāo)準(zhǔn)NTP。每個(gè)40 μ L IVT反應(yīng)包含16 μ LNTP混合物、4 μ L 1x Τ7緩沖液、16 μ L DNA模板和4 μ L Τ7酶。將反應(yīng)在37°C溫育4_6小時(shí)，然后用2μ L TURBO DNase在37°C繼續(xù)處理15分鐘，然后在MEGAclear (Amb1n)離心柱上純化，將RNA產(chǎn)物洗脫在10yL體積中。為了從未加帽的轉(zhuǎn)錄本除去免疫原性的5’三磷酸組成部分，向每個(gè)制備物加入10 μ L Antarctic磷酸化酶反應(yīng)緩沖液和3 μ LAntarctic磷酸化酶(NEB)。磷酸化酶反應(yīng)在37°C溫育30分鐘，并重新純化IVT產(chǎn)物。通過(guò) Nanodrop (Thermo Scientific)定量 RNA 產(chǎn)量,并依此通過(guò)加入 TE pH 7.0 (Amb1n)將制備物調(diào)整到lOOng/μ L的標(biāo)準(zhǔn)化工作濃度。通過(guò)將代表各種RF的制備物以所需化學(xué)計(jì)量比合并，組裝RNA混合物。使用的每種RF的比例考慮到了相應(yīng)轉(zhuǎn)錄本的預(yù)測(cè)分子量，所有RF為等摩爾，例外的是0ct4及其衍生物，其以3x摩爾濃度被包含。向混合物加入編碼短壽命核化單體LanYFP熒光蛋白的mRNA的10%摻入物，以便于在重編程試驗(yàn)期間監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效能。
_0] 實(shí)施例3 -細(xì)胞和培養(yǎng)基
[0081]重編程的靶細(xì)胞包括BJ新生兒成纖維細(xì)胞(ATCC)、HDF-f胎兒成纖維細(xì)胞、HDF-n新生兒成纖維細(xì)胞和HDF-a成人成纖維細(xì)胞(ScienCell)以及XFF無(wú)外來(lái)物的新生兒成纖維細(xì)胞(Millipore)。對(duì)于BJ、HDF和XFF細(xì)胞來(lái)說(shuō)，擴(kuò)增培養(yǎng)分別在BJ培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS)、ScienCell成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基和FibroGRO無(wú)外來(lái)物的人類成纖維細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基(Millipore)中進(jìn)行。使用的飼養(yǎng)細(xì)胞是3001G輻照過(guò)的新生兒人類包皮成纖維細(xì)胞(GlobalStem)和FibroGRO絲裂霉素C失活的無(wú)外來(lái)物的人類新生兒成纖維細(xì)胞(Millipore)。與無(wú)外來(lái)物的基于飼養(yǎng)細(xì)胞和無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的重編程試驗(yàn)相關(guān)的細(xì)胞傳代步驟，使用TrypLE Select (Gibco)這種無(wú)動(dòng)物產(chǎn)品的細(xì)胞解離試劑來(lái)進(jìn)行。
[0082]實(shí)施例4-人類成纖維細(xì)胞的重編程
[0083]所描述的所有重編程實(shí)驗(yàn)在包被有CELLart (Gibco)無(wú)外來(lái)物基材的6孔組織培養(yǎng)板中，按照制造商的指導(dǎo)來(lái)進(jìn)行。在初始的BJ重編程實(shí)驗(yàn)中，使用含F(xiàn)BS的BJ培養(yǎng)基將GlobalStem飼養(yǎng)細(xì)胞以每孔250K的密度鋪板。在一些后續(xù)的基于飼養(yǎng)細(xì)胞的試驗(yàn)中，提高接種密度并在培養(yǎng)基更換期間臨時(shí)補(bǔ)充飼養(yǎng)細(xì)胞，以力圖對(duì)使用新的RF混合物時(shí)遇到的高消耗率做出響應(yīng)維持接近鋪滿狀態(tài)的飼養(yǎng)細(xì)胞層。無(wú)外來(lái)物的飼養(yǎng)細(xì)胞在使用時(shí)，在不含血清的基于Pluriton的重編程培養(yǎng)基中鋪板。靶細(xì)胞在添加有抗生素、Pluriton增補(bǔ)劑和200ng/ml B18R干擾素抑制劑(eB1science)的Pluriton無(wú)血清培養(yǎng)基(Stemgent)中鋪板。在重編程期間和之后每日更換培養(yǎng)基，其中在最后一次轉(zhuǎn)染后的當(dāng)天終止B18R的補(bǔ)充。在重編程期間將細(xì)胞在新鮮飼養(yǎng)細(xì)胞上分拆的實(shí)驗(yàn)中，在用于重新鋪板的培養(yǎng)基中包含1uM Y27632 (Stemgent)。轉(zhuǎn)染在祀細(xì)胞接種后的當(dāng)天開始，并且在本文中指明的持續(xù)時(shí)間中以24小時(shí)的時(shí)間間隔重復(fù)。除非另有注明，否則在每日培養(yǎng)基更換之前4小時(shí)，使用RNAiMAX(Invitrogen)將劑量為1200ng的RNA遞送到每個(gè)孔。通過(guò)將10ng/μ LRNA在無(wú)鈣/鎂的DPBS中稀釋5倍，將5μ L RNAiMAX/ μ g RNA在相同的稀釋劑中稀釋10倍，合并以產(chǎn)生1ng/ μ L RNA/載體的懸液，并在15分鐘室溫溫育后分發(fā)到培養(yǎng)基，來(lái)制造基于RNAiMAX的轉(zhuǎn)染混合物。對(duì)于使用Stemfect試劑(Stemgent)的轉(zhuǎn)染來(lái)說(shuō)，將RNA和Stemfect (4 μ L/ μ g RNA)在Stemfect緩沖液中混合，以給出1ng/ μ L的RNA濃度。將所述混合物溫育15分鐘，然后遞送到培養(yǎng)基或冷藏以備后續(xù)使用。
[0084]實(shí)施例5.1PSC集落的表征
[0085]為了評(píng)估iPSC集落生產(chǎn)率，使用DPBS(含有鈣/鎂)中的4%聚甲醛將重編程培養(yǎng)物固定，并用在DPBS(含有鈣/鎂)中稀釋100倍的StainAlive TRA-l-60Alexa 488抗體(Stemgent)進(jìn)行免疫染色。進(jìn)行集落挑取、擴(kuò)增和隨后的免疫染色和用于多能性的分子和功能驗(yàn)證的三譜系分化測(cè)定法。進(jìn)行DNA指紋分析和核型分析。在超過(guò)一套的小鼠模型中進(jìn)行和驗(yàn)證畸胎瘤形成。由此證實(shí)干細(xì)胞的多能性。
[0086]公開了用于將非干細(xì)胞高效重編程成多能干細(xì)胞的新方法，所述方法通過(guò)將靶細(xì)胞與工程化的重編程因子和非工程化的重編程因子的組合相接觸，使得可以在約9天、有時(shí)短至6或甚至5天內(nèi)產(chǎn)生iPSC。這些iPS細(xì)胞可以被生產(chǎn)成無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的、無(wú)外來(lái)物的和無(wú)足跡的iPSC。除了本發(fā)明方法的顯著提高的重編程效率之外，這種新技術(shù)與所有以前已知的技術(shù)的區(qū)別還在于如此產(chǎn)生的iPSC是“干凈的”，因?yàn)樗鼈儧]有與任何病毒或載體接觸。本發(fā)明可以在事實(shí)上涉及干細(xì)胞建立、分化、細(xì)胞和發(fā)育研究應(yīng)用以及臨床應(yīng)用的所有領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)用途。類似的程序也可用于定向分化或轉(zhuǎn)分化。
【權(quán)利要求】
1.一種用于去分化或重編程體細(xì)胞的方法，所述方法包括: 用組合物轉(zhuǎn)染分離的體細(xì)胞，所述組合物包含有效量的、任一種或多種合成的HiRNA重編程因子與反式激活結(jié)構(gòu)域之間的融合產(chǎn)物，由此將所述體細(xì)胞重編程或去分化，所述合成的 mRNA 重編程因子選自 0ct4、Sox2、Klf4、cMyc、Nanog 和 Lin28。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物包含融合到N-端MyoD反式激活結(jié)構(gòu)域的0ct4。
3.權(quán)利要求2的方法，其中0ct4被融合到采取串聯(lián)三聯(lián)體形式的N-端MyoD反式激活結(jié)構(gòu)域。
4.一種使用權(quán)利要求1中的任一種或多種合成的mRNA重編程因子來(lái)重編程哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，所述方法包括: a)以標(biāo)準(zhǔn)6孔板的每個(gè)孔25k至250k個(gè)細(xì)胞的密度在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞表面中生長(zhǎng)靶細(xì)胞，或者在具有其他表面區(qū)域的孔中以成比例減少的每孔細(xì)胞數(shù)生長(zhǎng)靶細(xì)胞；并且 b)在重編程期間，每次用50ng至800ng/mlmRNA的不同劑量轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
5.權(quán)利要求4的方法，其中以標(biāo)準(zhǔn)6孔板的每個(gè)孔50k、75k、100k或150k個(gè)細(xì)胞的密度在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞表面中生長(zhǎng)靶細(xì)胞； a)在重編程期間，每次用50ng至800ng/mlmRNA的不同劑量轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其中在較早時(shí)間點(diǎn)使用比較晚時(shí)間點(diǎn)更低的劑量；并且 b)無(wú)需傳代，獲得iPSC。
6.權(quán)利要求4的方法，其中以標(biāo)準(zhǔn)6孔板的每個(gè)孔50k、75k、100k或150k個(gè)細(xì)胞的密度在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞表面中生長(zhǎng)靶細(xì)胞，其中將每個(gè)孔的體積調(diào)整到相當(dāng)于0.5ml至5ml之間的適當(dāng)培養(yǎng)基； a)在重編程期間，每次用50ng至800ng/mlmRNA的不同劑量轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其中在較早時(shí)間點(diǎn)使用比較晚時(shí)間點(diǎn)更低的劑量；并且 b)無(wú)需傳代，獲得iPSC。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人類細(xì)胞。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述方法是無(wú)外來(lái)物的。
9.權(quán)利要求1的方法，其中一種或多種因子選自mRNA、調(diào)控RNA、siRNAmiRNA及其組八口 ο
10.權(quán)利要求1的方法，其中將所述體細(xì)胞用至少兩種不同RNA轉(zhuǎn)染。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述體細(xì)胞選自單能、專能、多能和分化的細(xì)胞。
12.權(quán)利要求1的方法，其中一種或多種RNA誘導(dǎo)所述體細(xì)胞去分化成單能、專能或多能細(xì)胞。
13.權(quán)利要求4的方法，其中至少一種所述因子選自0CT4、S0X2、NAN0G、LIN28、KLF4和MYC mRNAο
14.權(quán)利要求4的方法，其中0CT4、S0X2、NANOG和LIN28mRNA被組合給藥。
15.權(quán)利要求4的方法，其中0CT4、S0X2、KLF4和MYCmRNA被組合給藥。
16.權(quán)利要求1的方法，其中將被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為誘導(dǎo)性多能干(iPS)細(xì)胞維持在培養(yǎng)物中。
17.權(quán)利要求1的方法，其中被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞形成誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，并且所述方法還包括誘導(dǎo)所述iPS細(xì)胞以形成分化的細(xì)胞。
18.—種在患者中治療或抑制疾病或障礙的一種或多種癥狀的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1的方法將細(xì)胞在體外去分化，并將所述細(xì)胞給藥于所述患者。
19.權(quán)利要求2的方法，其中所述組合物還包含Rarg和LrH-1反式作用激活結(jié)構(gòu)域。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物包含融合到VP16反式激活結(jié)構(gòu)域的0ct4。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK104520424SQ201380025010
【公開日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月13日
【發(fā)明者】王繼武, 魯吉·瓦蘭, 倪毓輝 申請(qǐng)人:美國(guó)綠陽(yáng)生物技術(shù)及醫(yī)藥公司