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      含硫酸化化合物的干細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基的制作方法

      文檔序號:467318閱讀:165來源:國知局
      含硫酸化化合物的干細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明提供含成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)的干細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基,其特征在于,以在FGF存在下起到促進干細(xì)胞增殖的作用的濃度含硫酸化化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽;使用含F(xiàn)GF的干細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基的干細(xì)胞的培養(yǎng)方法,其特征在于,以在FGF存在下起到促進干細(xì)胞增殖的作用的濃度,向培養(yǎng)基中添加硫酸化化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
      【專利說明】含硫酸化化合物的干細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基 【【技術(shù)領(lǐng)域】】
      [0001] 本發(fā)明涉及使用含成纖維細(xì)胞生長因子的干細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基、所述培養(yǎng)基的干 細(xì)胞的培養(yǎng)方法等。 【【背景技術(shù)】】
      [0002] 以往、干細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞、人工多能性干細(xì)胞等)的培養(yǎng)一直使用含有血清的培 養(yǎng)基進行。例如,胎牛血清(FBS)等作為對于細(xì)胞增殖重要的添加物而在細(xì)胞培養(yǎng)中廣泛 使用。但是,將培養(yǎng)后的干細(xì)胞以醫(yī)療目的使用時,異種來源成分有成為血液媒介病原菌的 感染源或異種抗原的可能性。另外,也有由于血清的批間差而在培養(yǎng)結(jié)果上發(fā)生偏差的可 能性。因此,在近年,使用化學(xué)組成明了的培養(yǎng)基(chemically defined medium)培養(yǎng)干細(xì) 胞成為主流,無血清培養(yǎng)基的開發(fā)被推進。
      [0003] 成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)是促進成纖維細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的增殖的分子量 16, 000?20, 000的蛋白質(zhì)。在FGF中包括:堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、酸性成纖 維細(xì)胞生長因子(aFGF)、角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)等,在人及小鼠中各自已知20種以上的 FGF。FGF為了穩(wěn)定進行干細(xì)胞的培養(yǎng)而一般地被添加到培養(yǎng)基中,在無血清培養(yǎng)基中也是 重要性高的成分之一。但是已知,F(xiàn)GF不僅與其他成分相比價格高,在培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性也 低,從而伴隨在細(xì)胞培養(yǎng)中要求高頻度的培養(yǎng)基更換的要因。
      [0004] 至今被報告,硫酸化多糖類有保護FGF免于分解、變性、失活等的作用。
      [0005] 在專利文獻1中公開,角叉菜膠使bFGF穩(wěn)定化。在所述文獻的實施例中記 載,肝素、硫酸葡聚糖、角叉菜膠等的含硫酸化多糖類的保護劑保護5倍量(w/w)的 bFGF(180ii g/200iil)免于由胰蛋白酶的水解(實施例1)及由熱的變性(實施例3)。還 公開,在免于由胰蛋白酶的水解的保護中,相對于所述保護劑的bFGF的重量比有是5?7 以下的必要(實施例2)。
      [0006] 在專利文獻2中公開了使FGF或其突變蛋白和硫酸化葡聚糖在水性介質(zhì)中接觸作 為特征的FGF或其突變蛋白的穩(wěn)定化方法等。在所述文獻的實施例中公開,由硫酸化葡聚 糖的添加,在水性介質(zhì)中FGF的活性被保持穩(wěn)定。
      [0007] 另外,在非專利文獻1中記載,肝素或己糖醛酰己糖氨基聚糖硫酸(HHS-4)保護 bFGF免于失活,增強其生理活性,還記載,所述效果僅在使高濃度的肝素(20 yg/ml)或 HHS-4 (200 ii g/ml)與細(xì)胞接觸時見到,對于肝素而言,以高濃度(也依賴于bFGF的濃度,但 例如IOu g/ml以上)則見到被看作是毒性的細(xì)胞增殖抑制。
      [0008] 在另外專利文獻3中公開,葡聚糖多硫酸、肝素等的多硫酸化多糖類或其有生物 學(xué)活性的分子片段顯示發(fā)揮含多分化能細(xì)胞的前體細(xì)胞的保護、生存率改善及分化調(diào)節(jié)的 功能,與多硫酸化多糖類或其有生物學(xué)活性的分子片段一同含前體細(xì)胞的組合物。據(jù)記載, 所述組合物中的多硫酸化多糖類的濃度是500ng/ml?lOmg/ml的范圍。據(jù)記載,在所述組 合物中可再含F(xiàn)GF,但對多硫酸化多糖類的上述功能和FGF的關(guān)系則完全無公開。
      [0009] 在另外專利文獻4中記載,葡萄糖的聚合物等的由糖質(zhì)構(gòu)成的高分子促進人間質(zhì) 干細(xì)胞的增殖,但公開由糖質(zhì)構(gòu)成的高分子的有效濃度是2. 5mg/ml?lOOmg/ml的范圍。
      [0010] 另一方面,多糖以外的高分子有機化合物的硫酸化物是否均有保護FGF免于分 解、變性、失活等的作用,或者是否在細(xì)胞培養(yǎng)中給細(xì)胞的增殖造成影響則完全不知。
      [0011] 【現(xiàn)有技術(shù)文獻】
      [0012] 【專利文獻】
      [0013] 專利文獻1:國際公開第92/13526號單行本
      [0014] 專利文獻2:特開平02-138223號公報
      [0015] 專利文獻3:國際公開第2009/070842號單行本
      [0016] 專利文獻4:國際公開第2011/108993號單行本
      [0017] 【非專利文獻】
      [0018] 非專利文獻 1:J. Cell. Physiol.、1986、128、475-484 【
      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0019]【發(fā)明要解決的技術(shù)課題】
      [0020] 本發(fā)明旨在提供在含F(xiàn)GF的干細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基中促進干細(xì)胞的增殖的手段。再 者,本發(fā)明旨在提供使用含F(xiàn)GF的干細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基的干細(xì)胞的培養(yǎng)方法等。
      [0021] 【解決課題的技術(shù)方案】
      [0022] 本發(fā)明人為達成上述目的進行銳意探討的結(jié)果發(fā)現(xiàn),硫酸化化合物可抑制干細(xì)胞 增殖用培養(yǎng)基中的FGF的蛋白質(zhì)量降低,及在FGF的存在下促進干細(xì)胞的增殖。為了發(fā)揮 在FGF存在下的干細(xì)胞的增殖促進效果而詳細(xì)地探討必要的硫酸化化合物的濃度時,意外 發(fā)現(xiàn),在FGF的蛋白質(zhì)量降低的抑制效果低的濃度范圍將硫酸化化合物添加到培養(yǎng)基中時 也存在確認(rèn)在FGF存在下的顯著的干細(xì)胞的增殖促進效果的化合物。本發(fā)明人基于這些見 解重復(fù)再研究的結(jié)果,完成本發(fā)明。
      [0023] SP,本發(fā)明如下。
      [0024] [1]含成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)的干細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基,其特征在于,以在FGF 存在下起到促進干細(xì)胞增殖的作用的濃度含硫酸化化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽,其中, 在硫酸化化合物是硫酸化多糖時的硫酸化化合物的含量是250ng/ml以下。
      [0025] [2] [1]所述的培養(yǎng)基,其中硫酸化化合物是硫酸化糖類,其中,在硫酸化糖類是硫 酸化多糖時的硫酸化糖類的含量是250ng/ml以下。
      [0026] [3] [2]所述的培養(yǎng)基,其中所述硫酸化糖類是選自下列的至少一種:
      [0027] (I)含1個或2個以上的從下述通式(a)所示的化合物衍生的構(gòu)成單元、且含1個 或2個以上的硫酸基的化合物:
      [0028]【化學(xué)式1】
      [0029]
      【權(quán)利要求】
      1. 含成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)的干細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基,其特征在于,以在FGF存在下 起到促進干細(xì)胞增殖的作用的濃度含硫酸化化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽,其中,在硫酸 化化合物是硫酸化多糖時的硫酸化化合物的含量是250ng/ml以下。
      2. 權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基,其中硫酸化化合物是硫酸化糖類,其中,在硫酸化糖類是 硫酸化多糖時的硫酸化糖類的含量是250ng/ml以下。
      3. 權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基,其中所述硫酸化糖類是選自下列的至少一種: (I) 含1個或2個以上的從下述通式(a)所示的化合物衍生的構(gòu)成單元、且含1個或2 個以上的硫酸基的化合物: 【化學(xué)式1】 式中,
      na 是 1、2 或 3, Rla及R3a相同或不同,且各是任選具有取代基的官能團, na個R2a各自獨立地是任選具有取代基的官能團、 (II) 下述通式(b)所示的化合物: 【化學(xué)式2】 式中,
      nb是3?100的整數(shù), nb個Rlb各自獨立地是任選具有取代基的官能團, 含1個或2個以上的硫酸基、及 (III) 下述通式(c)所示的化合物: 【化學(xué)式3】
      式中, nc 是 1、2 或 3, 儼?儼相同或不同,且各是任選具有取代基的官能團, nc個R5c;各自獨立地是任選具有取代基的官能團, 含1個或2個以上的硫酸基。
      4. 權(quán)利要求2或3所述的培養(yǎng)基,其中硫酸化糖類是選自下列的至少一種:硫酸化單 糖、硫酸化二糖、硫酸化多糖、硫酸化糖醇及硫酸化環(huán)多醇。
      5. 權(quán)利要求2?4中任一項所述的培養(yǎng)基,其中在硫酸化糖類中的硫的含量是5重 量%以上。
      6. 權(quán)利要求2?5中任一項所述的培養(yǎng)基,其中所述硫酸化糖類或其藥學(xué)上可接受 的鹽是選自下列的至少一種:硫酸葡聚糖Na、纖維素 S03Na、黃原膠S03Na、果膠S03Na、墨角 藻聚糖、藻酸S03Na、菊粉S03Na、麥芽七糖S03Na、水蘇糖S0 3Na、麥芽三糖S03Na、麥芽糖醇 S03Na、蔗糖8S03K、葡萄糖S03Na、肌-6肌醇S0 3K、a -環(huán)糊精S03Na、甘露糖醇S03Na、木糖醇 SO3Na及赤蘚糖醇S03Na。
      7. 權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)基,其中所述硫酸化糖類或其藥學(xué)上可接受的鹽是選自下列 的至少一種:硫酸葡聚糖Na、墨角藻聚糖、黃原膠S03Na、果膠S03Na、麥芽七糖S0 3Na、麥芽三 糖S03Na、麥芽糖醇SO3Na及蔗糖8S03K。
      8. 權(quán)利要求2?7中任一項所述的培養(yǎng)基,其中所述硫酸化糖類或其藥學(xué)上可接受的 鹽是平均分子量2, 500?7, 500的硫酸葡聚糖Na。
      9. 權(quán)利要求2?7中任一項所述的培養(yǎng)基,其中所述硫酸化糖類或其藥學(xué)上可接受的 鹽是鹿糖8S03K。
      10. 權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)基,其中所述蔗糖8S03K的含量是25pg/ml?10 i! g/ml。
      11. 權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基,其中硫酸化化合物是硫酸化聚合物,但是,硫酸化糖類 除外。
      12. 權(quán)利要求11所述的培養(yǎng)基,其中所述硫酸化聚合物是下述通式(I)所示的、且含1 個或2個以上的磺基的化合物: 【化學(xué)式4】 式中,
      A是聚合物構(gòu)成單元, n是1?1500的整數(shù), R1是任選具有取代基的官能團。
      13. 權(quán)利要求11或12所述的培養(yǎng)基,其中在硫酸化聚合物中的硫的含量是5重量%以 上。
      14. 權(quán)利要求11?13中任一項所述的培養(yǎng)基,其中硫酸化聚合物是選自下列的至少一 種:含有磺基的聚乙烯基醇、含有磺基的聚乙烯基胺、含有磺基的聚烯丙基胺、含有磺基的 聚乙烯亞胺、含有磺基的a-聚賴氨酸、含有磺基的a-聚谷氨酸甲酯/ a-5-羥基正纈氨 酸(2/8)共聚物、a-聚谷氨酸-Y-?;撬帷⒑谢腔娜z氨酸、含有磺基的絲氨酸、含 有磺基的分支型聚甘油及其衍生物、以及聚乙烯磺酸。
      15. 權(quán)利要求14所述的培養(yǎng)基,其中含有磺基的分支型聚甘油的衍生物或其藥學(xué)上可 接受的鹽是分支型聚甘油-單甲基四乙二醇_S03Na、分支型聚甘油-2-糠基-SO3Na或分支 型聚甘油-異丙基氧基-S03Na。
      16. 權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基,其中硫酸化化合物是利用二異氰酸酯化合物形成的糖 類的交聯(lián)聚合物的硫酸化物。
      17. 權(quán)利要求16所述的培養(yǎng)基,其中利用二異氰酸酯化合物形成的糖類的交聯(lián)聚合物 的硫酸化物或其藥學(xué)上可接受的鹽是麥芽三糖-六亞甲基二異氰酸酯SO3Na或葡聚糖-六 亞甲基二異氰酸酯S03Na。
      18. 權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基,其中硫酸化化合物是糖內(nèi)酯的硫酸化物。
      19. 權(quán)利要求18所述的培養(yǎng)基,其中糖內(nèi)酯的硫酸化物或其藥學(xué)上可接受的鹽是葡萄 糖酸內(nèi)酯-SO3Na。
      20. 權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基,其中硫酸化化合物是有機酸的硫酸化物。
      21. 權(quán)利要求20所述的培養(yǎng)基,其中有機酸的硫酸化物或其藥學(xué)上可接受的鹽是酒石 酸-SO3Na。
      22. 權(quán)利要求1?21中任一項所述的培養(yǎng)基,其中成纖維細(xì)胞生長因子是堿性成纖維 細(xì)胞生長因子。
      23. 權(quán)利要求1?22中任一項所述的培養(yǎng)基,其中所述干細(xì)胞是間質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì) 胞或人工多能性干細(xì)胞。
      24. 使用含F(xiàn)GF的干細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基的干細(xì)胞的培養(yǎng)方法,其特征在于,以在FGF存 在下起到促進干細(xì)胞增殖的作用的濃度,向培養(yǎng)基中添加硫酸化化合物或其藥學(xué)上可接受 的鹽,其中,在硫酸化化合物是硫酸化多糖時的硫酸化化合物的含量是250ng/ml以下。
      25. 權(quán)利要求24所述的方法,其中硫酸化化合物是硫酸化糖類,其中,在硫酸化糖類是 硫酸化多糖時的硫酸化糖類的含量是250ng/ml以下。
      26. 權(quán)利要求25所述的方法,其中所述硫酸化糖類是選自下列的至少一種: (I) 含1個或2個以上的從下述通式(a)所示的化合物衍生的構(gòu)成單元、且含1個或2 個以上的硫酸基的化合物:
      【化學(xué)式5】 式中, na 是 1、2 或 3, Rla及R3a相同或不同,且各是任選具有取代基的官能團, na個R2a各自獨立地是任選具有取代基的官能團、 (II) 下述通式(b)所示的化合物: 【化學(xué)式6】 式中,
      nb是3?100的整數(shù), nb個Rlb各自獨立地是任選具有取代基的官能團, 含1個或2個以上的硫酸基、及 (III)下述通式(c)所示的化合物: 【化學(xué)式7】 式中,
      nc 是 1、2 或 3, 儼?儼相同或不同,且各是任選具有取代基的官能團, nc個R5c;各自獨立地是任選具有取代基的官能團, 含1個或2個以上的硫酸基。
      27. 權(quán)利要求25或26所述的方法,其中硫酸化糖類是選自下列的至少一種:硫酸化單 糖、硫酸化二糖、硫酸化多糖、硫酸化糖醇及硫酸化環(huán)多醇。
      28. 權(quán)利要求25?27中任一項所述的方法,其中在硫酸化糖類中的硫的含量是5重 量%以上。
      29. 權(quán)利要求25?28中任一項所述的方法,其中所述硫酸化糖類或其藥學(xué)上可接受 的鹽是選自下列的至少一種:硫酸葡聚糖Na、纖維素 S03Na、黃原膠S03Na、果膠S03Na、墨角 藻聚糖、藻酸S03Na、菊粉S03Na、麥芽七糖S03Na、水蘇糖S0 3Na、麥芽三糖S03Na、麥芽糖醇 S03Na、蔗糖8S03K、葡萄糖S03Na、肌-6肌醇S0 3K、a -環(huán)糊精S03Na、甘露糖醇S03Na、木糖醇 SO3Na及赤蘚糖醇S03Na。
      30. 權(quán)利要求29所述的方法,其中所述硫酸化糖類或其藥學(xué)上可接受的鹽是選自下列 的至少一種:硫酸葡聚糖Na、墨角藻聚糖、黃原膠S03Na、果膠S03Na、麥芽七糖S0 3Na、麥芽三 糖S03Na、麥芽糖醇SO3Na及蔗糖8S03K。
      31. 權(quán)利要求25?30中任一項所述的方法,其中所述硫酸化糖類或其藥學(xué)上可接受的 鹽是平均分子量2, 500?7, 500的硫酸葡聚糖Na。
      32. 權(quán)利要求25?30中任一項所述的方法,其中所述硫酸化糖類或其藥學(xué)上可接受的 鹽是鹿糖8S03K。
      33. 權(quán)利要求32所述的方法,其中所述蔗糖8S03K的含量是25pg/ml?10 ii g/ml。
      34. 權(quán)利要求24所述的方法,其中硫酸化化合物是硫酸化聚合物,但是,硫酸化糖類除 外。
      35. 權(quán)利要求34所述的方法,其中所述硫酸化聚合物是下述通式(I)所示的、且含1個 或2個以上的磺基的化合物:
      【化學(xué)式8】 式中, A是聚合物構(gòu)成單元, n是1?1500的整數(shù), R1是任選具有取代基的官能團。
      36. 權(quán)利要求34或35所述的方法,其中在硫酸化聚合物中的硫的含量是5重量%以 上。
      37. 權(quán)利要求34?36中任一項所述的方法,其中硫酸化聚合物是選自下列的至少一 種:含有磺基的聚乙烯基醇、含有磺基的聚乙烯基胺、含有磺基的聚烯丙基胺、含有磺基的 聚乙烯亞胺、含有磺基的a-聚賴氨酸、含有磺基的a-聚谷氨酸甲酯/ a-5-羥基正纈氨 酸(2/8)共聚物、a-聚谷氨酸-Y-牛磺酸、含有磺基的三絲氨酸、含有磺基的絲氨酸、含 有磺基的分支型聚甘油及其衍生物、以及聚乙烯磺酸。
      38. 權(quán)利要求37所述的方法,其中含有磺基的分支型聚甘油的衍生物或其藥學(xué)上可接 受的鹽是分支型聚甘油-單甲基四乙二醇_S03Na、分支型聚甘油-2-糠基-SO3Na或分支型 聚甘油-異丙基氧基_S03Na。
      39. 權(quán)利要求24所述的方法,其中硫酸化化合物是利用二異氰酸酯化合物形成的糖類 的交聯(lián)聚合物的硫酸化物。
      40. 權(quán)利要求39所述的方法,其中利用二異氰酸酯化合物形成的糖類的交聯(lián)聚合物的 硫酸化物或其藥學(xué)上可接受的鹽是麥芽三糖-六亞甲基二異氰酸酯SO3Na或葡聚糖-六亞 甲基二異氰酸酯S03Na。
      41. 權(quán)利要求24所述的方法,其中硫酸化化合物是糖內(nèi)酯的硫酸化物。
      42. 權(quán)利要求41所述的方法,其中糖內(nèi)酯的硫酸化物或其藥學(xué)上可接受的鹽是葡萄糖 酸內(nèi)酯-SO3Na。
      43. 權(quán)利要求24所述的方法,其中硫酸化化合物是有機酸的硫酸化物。
      44. 權(quán)利要求43所述的方法,其中有機酸的硫酸化物或其藥學(xué)上可接受的鹽是酒石 酸-SO3Na。
      45. 權(quán)利要求24?44中任一項所述的方法,其中成纖維細(xì)胞生長因子是堿性成纖維細(xì) 胞生長因子。
      46. 權(quán)利要求24?45中任一項所述的方法,其中所述干細(xì)胞是間質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì) 胞或人工多能性干細(xì)胞。
      47. 硫酸化化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽,其選自:木糖醇S03Na、麥芽三糖-六亞甲基 二異氰酸酯SO3Na及葡萄糖酸內(nèi)酯-S03Na。
      48. 硫酸化化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽,其選自:a-聚谷氨酸甲酯/a-5-羥基正纈 氨酸(5-S03Na) (2/8)共聚物、三絲氨酸-SO3Na及分支型聚甘油-異丙基氧基-S03Na。
      【文檔編號】C12N5/10GK104334714SQ201380025206
      【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月30日
      【發(fā)明者】栗山陽子, 杉本尚, 北澤學(xué), 岡元訓(xùn), 千山將, 原田育惠, 大橋賢 申請人:味之素株式會社
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