干細胞微粒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及干細胞微粒、其用途和產(chǎn)生，具體來說是神經(jīng)干細胞微粒和其在療法中的用途。所述干細胞微粒典型地是一種外來體或微泡并且可以來源于神經(jīng)干細胞系。所述神經(jīng)干細胞系可以是一種條件永生化干細胞系，例如CTX0E03(以登記No.04091601保藏于ECACC)。
【專利說明】干細胞微粒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細胞微粒、其用途和產(chǎn)生，具體來說是神經(jīng)干細胞微粒和其在療法 中的用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 干細胞具有自我更新和分化成功能上不同的細胞類型的能力。其有潛力成為 不斷發(fā)展的再生醫(yī)學領域、尤其是需要組織替換、再生或修復的再生療法中的有效工具 (Banerjee等人2011)。然而，在療法中使用干細胞存在缺點：需要具有功能和表型穩(wěn)定性 的干細胞的一致和大量供應以及由細胞產(chǎn)生、貯存、運輸和處理所引起的相關高成本和時 間延遲；對避免接受者排斥干細胞的免疫學相容性具有一定要求；和存在與腫瘤或異位組 織形成的潛在安全風險有關的復雜調(diào)節(jié)問題。此外，盡管干細胞移植具有治療功效，但沒有 令人信服的證據(jù)證明所移植干細胞的直接長期作用（例如通過移植和分化成修復和替換 細胞）。
[0004] 神經(jīng)干細胞（NSC)是產(chǎn)生神經(jīng)元、星形細胞和少突膠質(zhì)細胞的具有自我更新能力 的多能干細胞（Kornblum，2007)。已有大量文件證明神經(jīng)干細胞的醫(yī)療潛力。受損中樞 神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)組織具有極有限的再生能力以使得神經(jīng)功能的損失經(jīng)常是慢性和進行性 的。神經(jīng)干細胞（NSC)已顯示了在神經(jīng)損傷或疾病的基于干細胞的療法中有前途的結果 (Einstein等人2008)。已顯不在將神經(jīng)干細胞（NSC)植入中風后動物的腦中后在運動和 認知測試中有顯著恢復（Stroemer等人2009)。還未完全了解NSC如何能夠在受損組織 中恢復功能，但現(xiàn)在逐漸認識到NSC具有多模式修復性質(zhì)，包括位點適當性細胞分化、促血 管生成和神經(jīng)營養(yǎng)活性以及免疫調(diào)節(jié)，從而通過天然免疫系統(tǒng)和其它宿主細胞促進組織修 復（Miljan和Sinden, 2009, Horie等人，2011)。很可能這些作用中有許多取決于從所植 入的神經(jīng)干細胞到宿主環(huán)境的瞬時信號傳導，例如當植入缺血性肌肉組織損傷中時NSC瞬 時表達指導并擴大天然促血管生成和調(diào)節(jié)免疫反應以促進治愈和修復的促炎癥性標記物 (Hicks等人，未公布數(shù)據(jù)）。在慢性中風腦中，NSC也具有相當大的神經(jīng)營養(yǎng)性作用。舉 例來說，其促進具有宿主腦源性雙皮質(zhì)素抗體（doublecortin)陽性神經(jīng)母細胞的中風損 壞的紋狀體腦組織的再增殖（Hassani, 0' Reilly, Pearse, Stroemer 等人，PLoS One. 2012 ; 7(11))。
[0005] 此夕卜，根據(jù)在慢性中風動物模型中的大量NSC恢復作用，ReNeuron Limited(Surrey，UK)正在進行使用神經(jīng)干細胞的臨床試驗，以檢驗使用其"CTX0E03"條 件永生化皮層源性神經(jīng)干細胞對殘疾中風患者的治療（Clinicaltrials. gov標識符： NCT01151124)。
[0006] 間質(zhì)干細胞（MSC)是譜系限制性干細胞，其僅具有分化成間質(zhì)細胞類型（即脂肪 細胞、軟骨細胞和骨細胞譜系）的潛力（Pittenger等人1999 ;Ding等人2011)。MSC(也被 稱為間質(zhì)基質(zhì)細胞和間質(zhì)祖細胞）來源于各種來源，包括骨髓、血液、脂肪和其它體細胞組 織。然而，MSC的治療潛力更加指向應用其作為未分化細胞的促血管生成和免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)。 人類MSC的產(chǎn)生因這些細胞無法大量穩(wěn)定擴增超過約15-20次群體倍增受到限制。
[0007] 間質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基（MSC-CM)具有類似于MSC自身的治療功效，表明了基于 MSC的療法的旁分泌機制（Timmers等人2007)。TO-A-2009/105044公開由MSC分泌的稱 為外來體的粒子包含MSC的至少一種生物學性質(zhì)并且提出在療法中使用這些MSC粒子，而 Th6ry等人2011提供了對外來體和其它類似分泌囊泡的綜述。盡管通過使用間質(zhì)干細胞 源性外來體克服了直接使用干細胞作為治療劑的一些缺點（例如貯存、運輸和處理），但提 供功能上和表型上穩(wěn)定的干細胞的一致且大量供應以產(chǎn)生外來體仍是個問題。對于治療用 途，外來體優(yōu)選地需要大規(guī)模地產(chǎn)生。在缺乏干細胞系的情況下，需要通過從干細胞來源重 復得到而補充細胞，其帶來了用于測試和檢驗每一個新的批次的續(xù)生成本。此外，可以通過 MSC治療的疾病和病癥可能是有限的。
[0008] 仍需要改良的基于干細胞的療法。 發(fā)明概要
[0009] 本發(fā)明是基于神經(jīng)干細胞含有治療上有用的微粒的驚人發(fā)現(xiàn)。
[0010] 還發(fā)現(xiàn)可以通過向培養(yǎng)基中添加組分、通過在低氧條件下培養(yǎng)干細胞或通過與其 它細胞類型共培養(yǎng)，從而提供改良的產(chǎn)生干細胞微粒的方法來改變干細胞的微粒產(chǎn)生。
[0011] 本發(fā)明的第一方面提供了一種神經(jīng)干細胞微粒。該微粒可以是外來體、微泡、膜粒 子、膜泡、外來體樣囊泡、核外粒體樣囊泡、核外粒體或外來泡（exovesicle)。典型地，微粒 是外來體。微粒可以來源于已培養(yǎng)在允許干細胞分化的環(huán)境中的神經(jīng)干細胞。微?？梢詮?部分分化的神經(jīng)干細胞分離。在一個實施方案中，允許干細胞分化的環(huán)境是多隔室生物反 應器，典型地其中細胞被培養(yǎng)超過七天。微?？梢詠碓从谏窠?jīng)干細胞系。在一些實施方案 中，神經(jīng)干細胞系可以是"CTX0E03"細胞系、"STR0C05"細胞系、"HPC0A07"細胞系或Miljan 等人Stem Cells Dev. 2009中公開的神經(jīng)干細胞系。在一些實施方案中，微粒來源于在培 養(yǎng)時不需要維持血清的干細胞系。微粒可具有如通過電子顯微鏡術所測定的介于30nm和 IOOOnm之間或介于30nm和200nm之間或介于30nm和IOOnm之間的尺寸；和/或I. 1-1. 2g/ ml的蔗糖密度。微?？砂琑NA。RNA可以是mRNA、miRNA和/或任何其它小RNA。微?？?包含 hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488 和 hsa-miR-4532 中的一種、兩種、三種或 四種。微粒可包含一種或多種脂質(zhì)，典型地選自神經(jīng)酰胺、膽固醇、鞘磷脂、磷脂酰絲氨酸、 磷脂酰肌醇、磷脂酰膽堿。微?？砂环N或多種四跨膜蛋白，典型地為⑶63、⑶81、⑶9、 CD53、CD82 和 / 或 CD37。微?？砂?TSG101、Alix、CD109、thy-Ι 和 CD133 中的一種或多 種。微?？砂?9或表21中所出現(xiàn)的蛋白質(zhì)中的至少10種。微?？砂窠?jīng)干細胞 或神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)基的至少一種生物活性。至少一種生物活性可以是組織再生活性。 本發(fā)明的微粒典型地經(jīng)過分離或純化。
[0012] 本發(fā)明的第二方面提供了一種用于療法中的神經(jīng)干細胞微粒。該療法可以是需要 組織替換、再生或修復的再生療法，例如其中該療法需要血管生成、神經(jīng)發(fā)生和/或神經(jīng)保 護。療法可以用于神經(jīng)疾病、病癥或缺損。療法可以改善功能和/或認知恢復。療法可以 是對中風、外周動脈疾病、神經(jīng)病或需要組織再生、血管再生或局部消炎作用的任何其它疾 病或病癥的療法，這些疾病或病癥包括：
[0013] (i)神經(jīng)病癥、疾病或缺損，例如帕金森氏?。≒arkinson's disease)、阿爾茨海默 氏?。ˋlzheimer's disease)、中風或 ALS ;
[0014] (ii)溶酶體貯積癥；
[0015] (iii)心血管病癥，例如心肌梗塞、充血性心力衰竭、外周動脈疾病、糖尿病性潰 瘍、傷口愈合；
[0016] (iv)肺部疾病，包括特發(fā)性肺纖維化、呼吸窘迫綜合癥、慢性阻塞性肺病、特發(fā)性 肺動脈高血壓、囊性纖維化和哮喘；
[0017] (V)新陳代謝或炎癥性病癥，例如糖尿?。↖或II)、類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、狼 瘡、克羅恩氏病（Crohn's disease)、炎癥性腸病或移植物抗宿主?。℅raft versus Host Disease)；
[0018] (vi)精神病癥，例如抑郁癥、躁郁癥、精神分裂癥或自閉癥候群病癥（例如自閉 癥、亞斯伯格綜合癥（Asperger's syndrome)或瑞特綜合癥（Rett Syndrome));
[0019] (Vii)視網(wǎng)膜致盲疾病，例如年齡相關黃斑變性、斯塔加特?。⊿targardt disease)、糖尿病性視網(wǎng)膜病、色素性視網(wǎng)膜炎；和
[0020] (Viii)脫髓鞘疾病，例如多發(fā)性硬化癥、大腦性麻痹、腦橋中部髓鞘溶解、脊髓癆、 橫貫性脊髓炎、德維克?。―evic's disease)、進行性多灶性白質(zhì)腦病、視神經(jīng)炎、白質(zhì)腦 病、格巴二氏綜合癥（Guillain-Barre syndrome)、抗MAG周圍神經(jīng)病和恰克-馬利-杜斯 氏癥（Charcot-Marie-Tooth disease) 〇
[0021] 在一個實施方案中，微粒是外來體且療法是對需要組織替換、再生或修復的疾病 或病癥的療法。在另一個實施方案中，微粒是微泡且療法是對需要血管生成的疾病或神經(jīng) 疾病、病癥或缺損的療法。
[0022] 療法也可以是在隨后、同時或同步接受微粒所來源的干細胞的宿主中誘導耐受 性、典型地為免疫耐受性的預防療法。在施用干細胞療法之前或同時向患者施用一次或多 次劑量的本發(fā)明的微?？捎糜诮档透杉毎煼ǖ牟焕庖叻磻?排斥"）的風險。
[0023] 本發(fā)明的第三方面提供了神經(jīng)干細胞微粒在制造用于治療疾病的藥劑中的用途。
[0024] 本發(fā)明的第四方面提供了一種產(chǎn)生干細胞微粒、典型地為神經(jīng)干細胞微粒的方 法。該方法可包括在允許干細胞分化的環(huán)境中培養(yǎng)干細胞并收集由這些細胞產(chǎn)生的微粒。 可以從部分分化的神經(jīng)干細胞分離微粒?？梢栽谠试S有效除去新陳代謝廢物的條件下培養(yǎng) 干細胞。在一個實施方案中，允許干細胞分化的環(huán)境是在多隔室生物反應器中培養(yǎng)，典型地 持續(xù)長時間（例如超過七天）。該方法可以包含從干細胞條件培養(yǎng)基分離微粒。干細胞條 件培養(yǎng)基可以包含一種或多種刺激干細胞將微粒釋放到培養(yǎng)基中的添加劑組分或藥劑。該 一種或多種組分可以選自轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、干擾素 -Y (IFN-Y)和/或腫瘤壞 死因子-α (TNF-α)?？梢詮母杉毎麠l件培養(yǎng)基分離微粒，其中在低氧條件下培養(yǎng)干細胞。 可以從干細胞條件培養(yǎng)基分離由與不同細胞類型、典型地為內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)的干細胞所產(chǎn) 生的微粒，以便形成NSC小生境環(huán)境。
[0025] 本發(fā)明的第五方面提供了一種通過根據(jù)本發(fā)明的第四方面的方法可獲得的微粒。
[0026] 本發(fā)明的第六方面提供了一種組合物，其包含神經(jīng)干細胞微粒和藥學上可接受的 賦形劑、載劑或稀釋劑。
[0027] 本發(fā)明的第七方面提供了一種篩選改變干細胞的微粒產(chǎn)生的藥劑的方法，其包括 使干細胞與候選藥劑接觸并觀察所接觸的干細胞的微粒產(chǎn)率與對照相比是增加還是降低。
[0028] 本發(fā)明的第八方面提供了一種用于用以產(chǎn)生干細胞微粒的方法中的試劑盒，其包 含：(a)適于培養(yǎng)干細胞的培養(yǎng)基；(b)干細胞；（c)任選地本發(fā)明的第四方面的一種或多 種組分；（d)任選地適合用作對照的干細胞微粒；（e)任選地適于特異性檢測所產(chǎn)生微粒的 檢測劑；和（f)關于使用該試劑盒產(chǎn)生干細胞微粒的說明書。
[0029] 本發(fā)明的第九方面提供了 一種組合物，其包含hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、 hsa-miR-4488和hsa-miR-4532中的兩種、三種或全部四種。這種組合物任選地是藥物組合 物，其包含藥學上可接受的載劑、稀釋劑、媒劑和/或賦形劑。該藥物組合物適合用于療法 中，典型地用于與如上文所述的本發(fā)明的微粒相同的療法中。
[0030] 附圖簡述
[0031] 圖1描繪了產(chǎn)生微粒的CTX0E03條件永生化神經(jīng)干細胞的電子顯微圖。圖A-E 示出了含有直徑介于30nm和50nm之間的外來體的細胞內(nèi)多泡體（multivesicular body; MVB)且圖F示出了通過在細胞膜處出芽的方法由神經(jīng)干細胞釋放的直徑>100nm的微泡。
[0032] 圖2是用于鑒別、表征微粒和由干細胞產(chǎn)生微粒的方案概述。
[0033] 圖3示出了對CTX0E03條件和非條件培養(yǎng)基進行的人類血管生成ELISA條光學密 度讀數(shù)。
[0034] 圖4A示出了與正常培養(yǎng)條件（3天T175)相比從15ml含有由Integra系統(tǒng)純化 的微粒的培養(yǎng)基提取的蛋白質(zhì)的量（通過BCA分析測量）。圖4B示出了（i)Integra培養(yǎng) 的CTX0E03外來體（上左圖）和微泡（上右圖）中的⑶63和（ii) Integra培養(yǎng)的CTX0E03 外來體（下左圖）和微泡（下右圖）中的⑶81的FACS檢測（以2ug/ml，1:250)。
[0035] 圖5示出了與正常培養(yǎng)條件（3天T175)相比從15ml含有通過從Integra系統(tǒng)過 濾而純化的微粒的培養(yǎng)基提取的在260/280nm下測量的分離的總RNA的量。
[0036] 圖6A示出了傷口閉合/劃痕分析的結果，其表示在CTX0E03條件培養(yǎng)基中培養(yǎng) 或在添加經(jīng)純化的CTX0E03外來體后的正常人類皮膚纖維母細胞（NHDF)的遷移活性。圖 6B示出了 72小時后的劃痕分析的結果，比較10 μ g CTX0E03外來體與基礎條件（無外來 體）的作用。圖6Ctj^出了基礎條件、2yg/ml外來體、6yg/ml外來體、20yg/ml外來體 和LSGS (低血清生長補充劑）陽性對照的愈合區(qū)域％。圖6C的上圖示出了從在Integra Celline系統(tǒng)中培養(yǎng)2周的CTX0E03細胞分離的外來體且圖6C的下圖示出了從在Integra Celline系統(tǒng)中培養(yǎng)6周的CTX0E03細胞分離的外來體。圖6D在體內(nèi)注射傷口愈合分析中 將CTX0E03細胞與陰性對照（生理鹽水）進行了比較。
[0037] 圖7示出了在3周時間點從標準CTX0E03 (T175)培養(yǎng)物相對于Integra CELLine 系統(tǒng)獲得的每個培養(yǎng)基的經(jīng)純化外來體的數(shù)量。
[0038] 圖8A示出了從CTX0E03Integra CELLine培養(yǎng)系統(tǒng)的兩個不同燒瓶在1周、2周 和3周后所收獲的外來體的濃度。圖8B示出了在CTX0E03細胞的6周連續(xù)培養(yǎng)期間從單 個Integra CELLine燒瓶收獲的外來體的濃度。
[0039] 圖9示出了與標準（"對照"）CTX0E03(T175)培養(yǎng)物相比在Integra CELLine系 統(tǒng)中培養(yǎng)3周的CTX0E03細胞中所測量的多種mRNA標記物的表達水平的變化倍數(shù)。
[0040] 圖10示出了從在Integra生物反應器培養(yǎng)物中培養(yǎng)3周的CTX0E03細胞獲得的 外來體和從標準CTX0E03(T175)培養(yǎng)物獲得的微粒中多種miRNA的上調(diào)和下調(diào)倍數(shù)，其是 針對標準（T175)培養(yǎng)物中的CTX0E03細胞中的基線表達水平而進行評估。
[0041] 圖11描繪了由來自在標準（T175)條件下培養(yǎng)的CTX0E03細胞（"CTX"）、微泡 ("1^"）和外來體（1乂0"）的11^1?嫩的深度測序的獲得的1^1?嫩譜。圖11&和1113示出 了兩種培養(yǎng)物的結果。
[0042] 圖12示出了 hNSC微泡對HUVEC的血管生成的作用。圖12A是照片，示出了與基 本HUVEC相比添加微泡時（右圖）所觀察到的管形成的顯著增加。圖12B和12C示出了在 多種濃度（〇. 05 μ g、0. 1 μ g、0. 3 μ g-圖12B ;和0. 6 μ g/ml-圖12C)下由hNSC微泡提供的 總管長的增加。
[0043] 圖13示出了 hNSC微泡對PC-12細胞中的軸突長出的作用。
[0044] 圖14是電泳圖，示出了如通過Agilent RNA生物分析器所測定的CTX0E03細胞、 外來體和微泡中的總RNA含量譜。
[0045] 圖15是完全覆蓋外顯子的編碼基因和位于內(nèi)含子或基因間序列中的非編碼轉(zhuǎn)錄 物的百分比的示意圖（通過針對GENC0DE序列數(shù)據(jù)集運行NGS BAM文件而產(chǎn)生）。
[0046] 圖16描繪了與CTX0E03產(chǎn)生者細胞相比外來體和MV中的熱門優(yōu)先穿梭的新穎 miRNA。
[0047] 圖17示出了試圖測定在Integra CELLine系統(tǒng)中培養(yǎng)1、2、3、4、5和6周的 CTX0E03外來體（圖17A)和微泡（圖17B)的粒徑和濃度的NanoSight分析結果。
[0048] 圖18示出了比較來自CTX0E03外來體和微泡的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)（18A和18B)和將 神經(jīng)干細胞外來體與間質(zhì)干細胞外來體進行比較（18C和18D)的文氏圖（Venn diagram)。 圖18A說明了從第2周Integra培養(yǎng)系統(tǒng)分離的CTX0E03外來體和微泡內(nèi)的獨特蛋白質(zhì) 數(shù)目。圖18B比較了與CTX0E03外來體和微泡內(nèi)所鑒別的蛋白質(zhì)相關的生物過程。圖18C 將CTX0E03神經(jīng)干細胞外來體蛋白質(zhì)組與間質(zhì)干細胞外來體蛋白質(zhì)組進行了比較，并且圖 18D比較了與MSC源性外來體與神經(jīng)干細胞源性外來體中所鑒別的蛋白質(zhì)相關的生物過 程。
[0049] 圖19示出了發(fā)現(xiàn)與NSC源性外來體和非間質(zhì)干細胞外來體相關的30種生物過 程。
[0050] 發(fā)明詳述
[0051] 本
【發(fā)明者】已驚人地鑒別出神經(jīng)干細胞中的微粒。這些微粒保留其所來源的神經(jīng)干 細胞的一些功能并且典型地在治療上適用于與神經(jīng)干細胞相同的治療。微粒優(yōu)于相應干細 胞，因為其較小并且較不復雜，從而更易產(chǎn)生、維持、貯存和運輸，并且具有避免與干細胞相 關的一些調(diào)節(jié)問題的潛力。微粒可以通過從條件培養(yǎng)基分離而連續(xù)產(chǎn)生，例如在例如多隔 室生物反應器的生物反應器中，其允許大規(guī)模生產(chǎn)和提供"現(xiàn)成"療法。該多隔室生物反應 器典型地是兩隔室生物反應器。
[0052] 另外發(fā)現(xiàn)，令人驚訝的是，在允許干細胞開始分化的環(huán)境中培養(yǎng)干細胞（任何類 型，不限于神經(jīng)干細胞）顯著增加所產(chǎn)生微粒的產(chǎn)量。
[0053]
【發(fā)明者】已意外地觀察到，在多隔室生物反應器中培養(yǎng)干細胞（任何類型，不限于 神經(jīng)干細胞）導致干細胞部分分化成更加分化形式的干細胞。培養(yǎng)中的這種分化不需要添 加誘導分化的藥劑。這種分化典型地需要至少一周、至少兩周或至少三周的培養(yǎng)期。通過所 培養(yǎng)的干細胞產(chǎn)生的微粒反映在多隔室生物反應器中孵育時所出現(xiàn)的干細胞變化。因此， 通過在多隔室生物反應器中培養(yǎng)干細胞，可以誘導細胞分化。因此，來自部分分化的干細胞 的微粒可以通過從在多隔室生物反應器中培養(yǎng)典型地至少一周、至少兩周、至少三周、至少 四周、至少五周或至少六周的干細胞收獲微粒而產(chǎn)生。任選地，NSC已經(jīng)培養(yǎng)了至多十周。 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種通過從部分分化的神經(jīng)干細胞分離微粒來產(chǎn)生微粒 的方法。
[0054]
【發(fā)明者】還發(fā)現(xiàn)可以誘導微粒從干細胞分泌。也不限于神經(jīng)干細胞并且可以用于從 任何干細胞產(chǎn)生微粒的這一發(fā)現(xiàn)允許從干細胞培養(yǎng)獲得改良的微粒產(chǎn)量。已經(jīng)鑒別出在不 同程度上增強微粒分泌的若干種藥劑，其具有能夠控制分泌的微粒的量的其它優(yōu)點。在低 氧條件下培養(yǎng)干細胞也會改良微粒產(chǎn)生。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將干細胞與不同細胞類型、尤其是 內(nèi)皮細胞類型共培養(yǎng)可以有利地改變由干細胞產(chǎn)生的微粒。
[0055] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了由無血清干細胞產(chǎn)生的微粒、典型地為外來 體。血清是成功培養(yǎng)許多細胞系所需的，但其含有許多污染物，包括其自身外來體。如下文 所述，
【發(fā)明者】已經(jīng)從成功培養(yǎng)不需要血清的干細胞產(chǎn)生微粒。
[0056] 神經(jīng)干細朐微粒
[0057] 在一個方面，本發(fā)明提供了從神經(jīng)干細胞可獲得的微粒。神經(jīng)干細胞微粒是一種 由神經(jīng)干細胞產(chǎn)生的微粒。典型地，微粒由神經(jīng)干細胞分泌。更加典型地，微粒是外來體或 微泡。來自其它細胞（例如間質(zhì)干細胞）的微粒在本領域中是已知的。
[0058] "微粒"是由細胞釋放的直徑為30nm到IOOOnm的細胞外囊泡。其受到包圍生物分 子的脂質(zhì)雙分子層限制。術語"微粒"在本領域中是已知的并且涵蓋許多不同種類的微粒， 包括膜粒子、膜泡、微泡、外來體樣囊泡、外來體、核外粒體樣囊泡、核外粒體或外來泡。不同 類型的微粒是基于直徑、亞細胞起源、其蔗糖密度、形狀、沉降速率、脂質(zhì)組合物、蛋白質(zhì)標 記物和分泌方式（即根據(jù)信號（誘導性）或自發(fā)（組成性））來進行區(qū)分。四種常見微粒 和其區(qū)分特點描述于下表1中。
[0059] 表1 :多種微粒
[0060]

【權利要求】
1. 一種神經(jīng)干細胞微粒。
2. 根據(jù)權利要求1所述的神經(jīng)干細胞微粒，其中所述微粒是外來體、微泡、膜粒子、膜 泡、夕卜來體樣囊泡、核外粒體樣囊泡、核外粒體或外來泡（exovesicle)。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的神經(jīng)干細胞微粒，其中所述微粒來源于神經(jīng)干細胞系。
4. 根據(jù)權利要求3所述的神經(jīng)干細胞微粒，其中所述神經(jīng)干細胞系是條件永生化的和 /或在無血清培養(yǎng)基生長中。
5. 根據(jù)權利要求4所述的神經(jīng)干細胞微粒，其中所述神經(jīng)干細胞系是具有ECACC登 記 No. 04091601 的 CTX0E03、具有 ECACC 登記 No. 04110301 的 STR0C05 和具有 ECACC 登記 No.04092302 的 HPC0A07。
6. 根據(jù)任一前述任何權利要求所述的神經(jīng)干細胞微粒，其中所述微粒具有： (a) 如通過電子顯微鏡術所測定的介于30nM和IOOOnM之間或介于30nM和200nM之間 或介于30nM和IOOnM之間的尺寸；或 (b) l. l-1.2g/ml的蔗糖密度。
7. 根據(jù)任一前述權利要求所述的神經(jīng)干細胞微粒，其包含RNA。
8. 根據(jù)權利要求7所述的神經(jīng)干細胞微粒，其中所述RNA是mRNA和/或miRNA。
9. 根據(jù)權利要求8所述的神經(jīng)干細胞微粒，其中所述微粒包含hsa-miR-1246、 hsa-miR-4492、hsa-miR-4488 和 hsa-miR-4532 中的一種、兩種、三種或四種。
10. 根據(jù)任一前述權利要求所述的神經(jīng)干細胞微粒，其包含以下一種或多種： (a) 脂質(zhì)，選自神經(jīng)酰胺、膽固醇、鞘磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇和/或磷脂酰膽 堿； (b) miRNA,任選地選自 hsa_let_7g、hsa-miR-101、hsa-miR-10a、hsa-miR-10b、 hsa-miR-126、hsa-miR-128、hsa-miR-129_5p、hsa_miR-130a、hsa-miR-134、hsa-miR-137、 hsa-miR-155、hsa_miR-15a、hsa_miR-15b、hsa-miR-16、hsa-miR-17、hsa-miR-182、 hsa-miR-183、hsa-miR-185、hsa_miR-18b、hsa-miR-192、hsa-miR-194、hsa-miR-195、 hsa_miR-20a、hsa_miR-20b、hsa-miR-210、hsa-miR-218、hsa_miR-301a、hsa_miR-302a、 hsa_miR-302c、hsa-miR-345、hsa-miR-375、hsa-miR-378、hsa-miR-7、hsa-miR-9、 hsa-miR-93、hsa_miR-96 和 hsa_miR-99a ; (c) 四跨膜蛋白，任選地選自⑶63、⑶81、⑶9、⑶53、⑶82和/或⑶37 ; (d) TSG101、Alix、CD109 和 / 或 thy-Ι ;和 / 或 (e) CD133。
11. 根據(jù)任一前述權利要求所述的神經(jīng)干細胞微粒，其包含表19或表21中所出現(xiàn)的蛋 白質(zhì)中的至少10種。
12. 根據(jù)任一前述權利要求所述的神經(jīng)干細胞微粒，其包含神經(jīng)干細胞或神經(jīng)干細胞 條件培養(yǎng)基的至少一種生物活性。
13. 根據(jù)權利要求12所述的神經(jīng)干細胞微粒，其中所述至少一種生物活性是再生活 性。
14. 根據(jù)任一前述權利要求所述的神經(jīng)干細胞微粒，其用于療法中。
15. 根據(jù)權利要求14所述的神經(jīng)干細胞微粒，其中所述療法是再生療法。
16. 根據(jù)權利要求14或15所述的神經(jīng)干細胞微粒，其中所述療法是用于 (i) 神經(jīng)病癥、疾病或缺損，例如帕金森氏?。≒arkinson's)、阿爾茨海默氏病 (Alzheimer，s)、中風或 ALS ; (ii) 溶酶體貯積癥； (iii) 心血管病癥，例如心肌梗塞、充血性心力衰竭、外周動脈疾病、糖尿病性潰瘍、傷 口愈合； (iv) 肺病，包括特發(fā)性肺纖維化、呼吸窘迫綜合癥、慢性阻塞性肺病、特發(fā)性肺動脈高 血壓、囊性纖維化和哮喘； (V)新陳代謝或炎癥性病癥，例如糖尿?。↖或Π )、類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、狼瘡、 克羅恩氏?。–rohn's disease)、腸易激綜合癥或移植物抗宿主?。? (vi) 精神病癥，例如：抑郁癥、躁郁癥、精神分裂癥或自閉綜合癥病癥（Autistic syndrome disorder)(例如自閉癥、亞斯伯格綜合癥（Asperger's syndrome)或瑞特綜合癥 (Rett Syndrome))； (vii) 視網(wǎng)膜致盲疾病，例如年齡相關黃斑變性、斯塔加特?。⊿targardt disease)、糖 尿病性視網(wǎng)膜病或色素性視網(wǎng)膜炎；和 (viii) 脫髓鞘病，例如多發(fā)性硬化癥、腦橋中部髓鞘溶解、脊髓癆、橫貫性脊髓炎、 德維克?。―evic's disease)、進行性多灶性白質(zhì)腦病、視神經(jīng)炎、白質(zhì)腦病、格巴二 氏綜合癥（Gui I Iain-Barre syndrome)、抗MAG周圍神經(jīng)病和恰克-馬利-杜斯氏癥 (Charcot-Marie-Tooth disease)〇
17. 根據(jù)權利要求14到16所述的神經(jīng)干細胞微粒，其中所述療法改善功能和/或認知 恢復。
18. 根據(jù)權利要求14到17所述的神經(jīng)干細胞微粒，其中所述療法是對中風、外周動脈 疾病或視網(wǎng)膜致盲疾病的療法。
19. 根據(jù)權利要求14到17所述的神經(jīng)干細胞微粒，其中： (i) 所述微粒是外來體且療法是對需要組織替換、再生或修復的疾病或病狀的療法； 或 (ii) 所述微粒是微泡且所述療法是對需要血管生成的疾病或神經(jīng)疾病、病癥或缺損的 療法。
20. -種根據(jù)任一前述權利要求所述的神經(jīng)干細胞微粒在制造用于治療疾病的藥劑中 的用途。
21. -種產(chǎn)生根據(jù)權利要求1到13所述的神經(jīng)干細胞微粒的方法，其包括從神經(jīng)干細 胞條件培養(yǎng)基分離微粒。
22. -種產(chǎn)生干細胞微粒的方法，其包括從干細胞條件培養(yǎng)基分離微粒，其中： (i) 所述干細胞條件培養(yǎng)基包含一種或多種組分，其誘導通過所述干細胞將微粒釋放 到所述培養(yǎng)基中； (ii) 在低氧條件下培養(yǎng)所述干細胞； (iii) 將所述干細胞與不同細胞類型共培養(yǎng)； (iv) 在多隔室生物反應器中培養(yǎng)所述干細胞；和/或 (V)使所述干細胞部分分化。
23. 根據(jù)權利要求22所述的方法，其中所述干細胞是任選地根據(jù)權利要求3到5中任 一項所述的神經(jīng)干細胞。
24. 根據(jù)權利要求22 (i)或從屬于權利要求22 (i)時的權利要求23所述的方法，其中 所述一種或多種組分選自：轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β)、干擾素 -Y (INF-γ)和腫瘤壞死因 子-a (TNF- α )。
25. 根據(jù)權利要求22 (iii)、從屬于權利要求22 (iii)時的權利要求23或24所述的方 法，其中所述不同細胞類型是內(nèi)皮細胞。
26. -種通過根據(jù)權利要求22到25中任一項所述的方法可獲得的微粒。
27. -種組合物，其包含根據(jù)任何權利要求1到13或26中任一項所述的微粒和藥學上 可接受的賦形劑、載劑或稀釋劑。
28. -種用于用以產(chǎn)生根據(jù)權利要求1到13或26中任一項所述的微粒的方法中的試 劑盒，其包含：(a)培養(yǎng)基；(b)神經(jīng)干細胞；（c)任選地根據(jù)權利要求22到24所述的一種 或多種組分；（d)任選地適合用作對照的根據(jù)權利要求1到13或26中任一項所述的微粒； (e)任選地適于特異性檢測所產(chǎn)生微粒的檢測劑；和⑴使用所述試劑盒產(chǎn)生根據(jù)權利要 求1到13或26中任一項所述的微粒的說明書。
29. -種篩選改變干細胞的微粒產(chǎn)率的藥劑的方法，其包括使干細胞與候選藥劑接觸 并觀察所接觸的干細胞的微粒產(chǎn)率與對照相比是增加還是減少。
30. -種組合物，其包含 hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488 和 hsa-miR-4532 中的兩種、三種或全部四種。
31. 根據(jù)權利要求30所述的組合物，其為包含藥學上可接受的載劑、稀釋劑、媒劑和/ 或賦形劑的藥物組合物。
32. 根據(jù)權利要求30或31所述的組合物，其用于療法中。
33. 根據(jù)權利要求32所述的用于療法中的組合物，其中所述療法如權利要求16所述。
【文檔編號】C12N5/0797GK104321062SQ201380025532
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2013年4月3日 優(yōu)先權日:2012年4月3日
【發(fā)明者】約翰·辛登, 拉臘·斯泰瓦納托, 倫道夫·考特林 申請人:蘭諾龍有限公司