核酸提取的制作方法
【專利摘要】本文描述了用于從生物樣品提取核酸的方法和裝置。所述裝置包括基底，如纖維素濾器，其用殺蟲劑官能化，所述殺蟲劑具有多個官能團，包括：結(jié)合部分，所述結(jié)合部分涉及將所述殺蟲劑結(jié)合到所述基底；疏水部分；和帶電荷部分。各種官能團用于將所述殺蟲劑結(jié)合至所述基底、弱化或溶解樣品的細(xì)胞壁或膜以及將核酸保持在所述基底上。優(yōu)選的殺蟲劑是甲硅烷基化的季銨化合物(SiQAC)，例如3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基二甲基十八烷基氯化銨。
【專利說明】核酸提取 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于從生物樣品（主要是包含細(xì)胞材料的生物樣品）中提取核酸的方 法和產(chǎn)品。本發(fā)明的多個方面還涉及用于從生物樣品制備核酸以用于核酸擴增的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 對于利用核酸擴增技術(shù)的診斷的主要挑戰(zhàn)之一是細(xì)胞材料的預(yù)處理以在擴展過 程之前提取核酸?；诙趸韬突诖胖榈募夹g(shù)效率低10% )并且需要針對特定靶 標(biāo)類型進行優(yōu)化；同樣的過程通常與其他樣品類型不相容。利用酚氯仿的高收率過程由于 組分的毒性而不合適。基于去污劑的方法提供簡單的溶解過程，但需要高溫（95°C)，由于 反轉(zhuǎn)錄酶不是熱穩(wěn)定的，所以這與單步驟RT-PCR不相容。
[0004] 當(dāng)前的方法涉及分離純化形式的核酸，遠(yuǎn)離其他細(xì)胞材料。這通常要求利用酶如 溶菌酶或去污劑破壞細(xì)胞。分枝桿菌（Mycobacterium)需要嚴(yán)格的NALC-NaOH預(yù)處理以破 裂細(xì)胞。蛋白質(zhì)通過使用適當(dāng)?shù)鞍酌福ɡ绲鞍酌窴)進行消化而除去。核酸結(jié)合至載體 樹脂或帶電荷基質(zhì)（例如，磁性顆粒）并被洗滌。核酸通過PH變化從帶電荷載體移到適當(dāng) 緩沖液中。這產(chǎn)生高純度核酸。
[0005] 來自例如 Cepheid、Enigma Diagnostics、Roche、Geneprobe、BD 等的現(xiàn)有技術(shù)系 統(tǒng)將此常規(guī)實驗室核酸提取過程整合到其診斷儀器中。然而，這是復(fù)雜的、昂貴的并且針對 特定的樣品類型。
[0006] 本文中我們描述了去除了此過程的復(fù)雜性的方法，在簡單的、一次性的、基于紙的 系統(tǒng)中遞送能夠通過PCR擴增的核酸，所述系統(tǒng)在室溫運行，能夠破裂細(xì)菌、真菌和病毒細(xì) 胞，并且將核酸釋放到用于直接PCR分析的溶液中。
[0007] Whatman, Inc的國際專利申請W000/62023和W002/16383描述了溶解細(xì)胞并利用 鍍膜的過濾介質(zhì)來分離核酸的方法。所述過濾介質(zhì)是FTA處理的硝基纖維素，其涂覆有陰 離子去污劑例如SDS。被覆層溶解細(xì)胞，并且FTA處理的濾器將核酸吸附至其。被覆層不是 共價結(jié)合至所述濾器，并且可以通過洗滌除去。核酸可以從所述濾器洗脫用于后續(xù)處理。
[0008] 3M Innovative Properties Company 的國際專利申請W02008/134464描述了具有 附著的官能團、溶解材料、基質(zhì)材料和糖的基底，其用于從樣品分離核酸。
[0009] Akhavan-Tafti的美國專利申請2007/0185322描述了用于從樣品中提取RNA的方 法，其涉及使用酸性溶液和可以在不進行細(xì)胞的初步溶解的情況下釋放核酸的固相結(jié)合材 料。提及了使用季銨鹽來結(jié)合核酸。Tarkkanen等的美國申請2005/0042661還描述了使用 季銨化合物來從細(xì)胞選擇性地釋放核酸。
[0010] Appeartex AB 的國際專利申請 TO2004/087226 和 TO2006/071191，以及 Higgs 等 的美國專利5, 064, 613描述了包含季銨鹽的抗微生物組合物。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種從生物樣品制備核酸的方法，所述生物樣品 包含a)具有細(xì)胞膜的細(xì)胞材料，或b)具有細(xì)胞壁的細(xì)胞材料，或c)具有病毒包膜的病毒 材料或d)具有病毒衣殼的病毒材料；所述方法包括使所述樣品與基底接觸，所述基底被用 殺蟲劑官能化，所述殺蟲劑能夠i)弱化細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、病毒包膜或病毒衣殼；或ii)溶解 細(xì)胞或病毒材料。
[0013] 所述方法還可以包括在所述接觸步驟之后使所述樣品經(jīng)受熱的步驟。例如，可以 將所述樣品直接添加至核酸擴增反應(yīng)中。所述熱步驟將用于溶解弱化的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、病 毒包膜或病毒衣殼，以釋放核酸。所述熱步驟對于釋放核酸可以不總是必要的，例如如果所 述殺蟲劑能夠溶解細(xì)胞或病毒材料。
[0014] 這樣，所述方法允許從生物樣品快速且容易地制備核酸以用于進一步處理。
[0015] 所述基底優(yōu)選是纖維素材料；例如，纖維素濾紙或纖維素基質(zhì)。纖維素材料可以 是復(fù)合紙；例如，復(fù)合纖維素紙可以包括側(cè)流層，以從沉積在所述紙的表面上的樣品除去液 體以及低分子量污染物和抑制劑。纖維素的優(yōu)勢在于它具有大量的殺蟲劑可以附著的暴露 羥基。在某些實施方案中，纖維素材料還可以包含用于對樣品進行所需作用的試劑；例如， RNA酶，蛋白酶等，用于樣品清理。優(yōu)選的基底是來源于棉花的纖維素紙，并且尤其是來自 Hahnemiihle FineArt GmbH(Germany)的 FP 2992 紙。
[0016] 可以使用其他基底材料，優(yōu)選具有暴露羥基的那些。例如，基底可以是玻璃、塑料 等等。盡管在優(yōu)選的實施方案中，基底是可以被直接添加至核酸擴增反應(yīng)的濾紙，但是在其 他實施方案中，基底可以為微觀流體通道或反應(yīng)容器或其他容器的形式（生物樣品可以沿 其通過或容納在其內(nèi)）。
[0017] 殺蟲劑優(yōu)先地包含多個官能團。所述官能團優(yōu)選地包括結(jié)合部分，該結(jié)合部分涉 及將所述殺蟲劑結(jié)合至所述基底；疏水部分；和帶電荷部分。疏水部分能夠與細(xì)胞壁或細(xì) 胞膜相互作用并且穿透細(xì)胞壁或細(xì)胞膜。在優(yōu)選的實施方案中，疏水部分可以是烷基鏈，例 如C5-C30烷基，優(yōu)選地Cl0-C20烷基。當(dāng)烷基鏈穿透精致的細(xì)胞壁時，該壁被弱化和刺穿。 帶電荷部分優(yōu)選是帶正電荷的，并且能夠吸引帶電荷的細(xì)胞壁，并在接觸細(xì)胞膜時可以破 壞離子流和內(nèi)穩(wěn)態(tài)，由此有助于破壞細(xì)胞并釋放核酸。帶電荷部分優(yōu)選是季銨基團。結(jié)合 部分可以包含羥基。
[0018] 在優(yōu)選的實施方案中，官能團優(yōu)選是烷基鏈（疏水部分）、甲硅烷基基團（結(jié)合部 分）和氯化銨基團（帶電荷部分）。
[0019] 優(yōu)選的殺蟲劑包括甲硅烷基化的季銨化合物（SiQAC);尤其是3-(三甲氧基甲硅 烷基）丙基二甲基十八烷基氯化銨（3-TPAC)。其他殺蟲劑包括芐基氯化銨。SiQAC的致死 的作用模式公認(rèn)通過如下方式進行：帶正電荷的分子吸附到帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面上，通過 SiQAC分子上的親脂鏈破壞細(xì)胞膜，以及通過該膜的擴散導(dǎo)致細(xì)胞溶解。
[0020] 技術(shù)人員將注意到可以使用的其他合適的殺蟲劑。具體試劑的選擇將根據(jù)上述優(yōu) 選的官能團的存在以及目標(biāo)生物樣品的性質(zhì)-例如，在要處理的樣品是哺乳動物細(xì)胞樣 品的情況下，則沒有細(xì)胞壁去穿透，并且其他官能團可以是適當(dāng)?shù)摹?br> [0021] 可以用于本發(fā)明的其他殺蟲劑的實例包括：
[0022] a)遙爪聚（2-烷基-1，3- _唑啉）；
[0023] b)具有經(jīng)由PEtOx接枝的抗微生物的DDA基團的纖維素，其在接觸時殺死接近 的微生物細(xì)胞（Bieser 等（2011) ,Contact-Active Antimicrobial and Potentially Self-Polishing Coatings Based on Cellulose (基于纖維素的接觸活性抗微生物和潛在 地自拋光被覆層）.Macromol. Biosci.，11，111-121);
[0024] c)皂角苷是留族化合物或三萜化合物苷，常見于大量植物中，并且長期已知對紅 細(xì)胞膜具有溶解作用且已知許多阜角苷是抗微生物的（Francis等，British Journal of Nutrition (2002)，88, 587 - 605)。在皂角苷的膜-可滲透性方面已經(jīng)進行了大量研究。 也已觀察到這些結(jié)構(gòu)上多樣的化合物殺死原生動物并且充當(dāng)抗真菌劑和抗病毒劑。相對 于在人工膜中產(chǎn)生的80A°孔隙，當(dāng)用皂角苷處理時，分離的來自人紅細(xì)胞的細(xì)胞膜形成 40-50A。直徑的孔隙（Seeman 等 1973 Structure of membrane holes in osmotic and saponin hemolysis(滲透壓和阜角苷溶血中的膜孔洞的結(jié)構(gòu)）? Journal of Cell Biology 56, 519 - 527)。
[0025] 對于可以使用的其他組合物的綜述，參見"Antimicrobial Polymers in Solution and on Surfaces(溶液中和表面上的抗微生物聚合物）"，Siedenbiedel和Tiller (2012) Polymers, 4, 46-71。
[0026] 優(yōu)選地，生物樣品可以包含具有細(xì)胞壁的細(xì)胞材料。例如，細(xì)胞材料可以是原核細(xì) 胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或者可以是植物或真菌細(xì)胞。備選地，生物樣品包含具有細(xì)胞膜且沒有細(xì) 胞壁的細(xì)胞材料。例如，細(xì)胞材料可以是真核動物細(xì)胞，包括哺乳動物或昆蟲細(xì)胞。備選地， 生物樣品可以包含病毒材料。
[0027] 本發(fā)明的另一方面提供一種擴增生物樣品中的核酸的方法，所述方法包括：根據(jù) 本發(fā)明上述第一方面的方法制備核酸；和對所制備的酸進行核酸擴增步驟，優(yōu)選地是聚合 酶鏈反應(yīng)（PCR)擴增。
[0028] 所述擴增可以被進行以用于診斷目的。
[0029] 本發(fā)明的另一方面提供一種用于從生物樣品制備核酸的裝置，所述生物樣品包含 a)具有細(xì)胞膜的細(xì)胞材料，或b)具有細(xì)胞壁的細(xì)胞材料，或c)具有病毒包膜的病毒材料或 d)具有病毒衣殼的病毒材料；所述裝置包括用殺蟲劑官能化的基底，所述殺蟲劑能夠i)弱 化細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、病毒包膜或病毒衣殼；或ii)溶解細(xì)胞或病毒材料。
[0030] 基底優(yōu)選是纖維素材料。
[0031] 在某些實施方案中，基底可以被整合到樣品制備盒（cartridge)等之中。因此，所 述裝置還可以包括用于容納所述基底或所述基底的一部分的反應(yīng)容器。所述裝置還可以進 一步包括用于將所述基底的一部分與剩余基底分離的部件；這可以允許在樣品已經(jīng)被添加 后分離基底的一塊，并且然后允許所分離的塊進入反應(yīng)容器并被用于PCR。
[0032] 附圖簡述
[0033] 圖1顯示SiQAC分子3-TPAC的結(jié)構(gòu)。
[0034] 圖2描繪纖維素通過SiQAC的官能化。
[0035] 圖3是SiQAC對細(xì)胞的作用模式的示意圖。
[0036] 圖4顯示來自用SiQAC處理的血液的瘧原蟲（Plasmodium)物種的檢測。
[0037] 圖5比較了用于提取分枝桿菌（Mycobacterium)DNA的不同紙?zhí)幚矸椒ā?br> [0038] 圖6顯示臨床樣品的精度數(shù)據(jù)。
[0039] 圖7顯示使用所述方法從口水提取的不同濃度的MTB的多次重復(fù)測試，y軸顯示 峰值解鏈溫度（melt temperature)并且X軸顯示峰高度。
[0040] 圖8顯示用于生產(chǎn)SiQAC官能化的紙和樣品分析的優(yōu)化的方法工作流程。
[0041] 圖9顯示從全乳（whole dairy milk)分離微生物DNA。
[0042] 圖10顯示獲自HIV陽性血漿樣品的核酸的擴增。
[0043] 圖11顯示獲自擴增的HIV核酸的序列。
[0044] 附圖詳述
[0045] 本發(fā)明總體操作如下。基底（如纖維素濾紙）用殺蟲劑（優(yōu)選SiQAC、更優(yōu)選 3-TPAC)官能化。該官能化的基底可以用于樣品制備以從細(xì)胞樣品提取核酸用于PCR反應(yīng)。
[0046] 細(xì)胞材料沉積在所述紙的頂層上。液體流動通過所述紙并且細(xì)胞材料被俘獲在表 面上。液相和任何低分子量抑制性離子分散在位于表面官能化的纖維素層下方的第二側(cè)流 層中。
[0047] 樣品中的微生物細(xì)胞（或植物、動物或真菌細(xì)胞）與SiQAC官能化的纖維素相互 作用并且被弱化和/或溶解，通常在接觸的5分鐘內(nèi)釋放它們的細(xì)胞內(nèi)容物。
[0048] 復(fù)合紙的栓（plug)可以從基底切除，并且在10分鐘時間后直接添加至PCR反應(yīng)。 PCR的初始熱可以用來額外地溶解任何剩余的細(xì)胞從而進一步釋放核酸。
[0049] SiQAC分子[3_(三甲氧基甲硅烷基）丙基二甲基十八烷基氯化銨（3-TPAC)] 的結(jié)構(gòu)示于圖1。3-TPAC首次描述于1972年（參見Isquith等（1972)，?？1. Microbiol, 24:6859-863, http://www. ncbi. nlm. nih. gov/pmc/articles/PMC380687/pdf/ applmicro00052-0033. pdf)。
[0050] 存在許多版本的基礎(chǔ)化學(xué)（例如，芐基氯化銨BAC)，但是全都共用類似的關(guān)鍵成 分：氯化銨變體（活性抗微生物劑），作為結(jié)合劑的硅（甲硅烷基部分）和鏈烷烴鏈。所述 氯化銨是季銨基團，其連接至兩個甲基基團并且有效地兩個更長鏈烷基基團。此陽離子官 能賦予抗微生物性質(zhì)，其導(dǎo)致細(xì)菌、真菌和病毒膜的破壞，釋放核酸內(nèi)容物。疏水鏈烷烴鏈 穿透細(xì)胞壁。三甲氧基甲硅烷基基團經(jīng)由活性羥基將該分子結(jié)合至基底（例如，纖維素）。
[0051] 季銨化合物對于包括細(xì)菌、真菌和包膜病毒在內(nèi)的多種生物是致死的，并且在較 小程度上對內(nèi)生孢子、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis)和無包被病毒是致死 的。已知許多殺蟲聚合物具有季銨基團。季銨（QA)化合物是用于醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生應(yīng)用的 最廣泛使用的抗細(xì)菌劑，并且已經(jīng)證實其針對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌二者都是有效 的（Tashiro (2001)Macromol. Mater. Eng. ;286, 63-87)。
[0052] 具有QA基團的陽離子聚合物通常比其對應(yīng)的低分子量單體表現(xiàn)出更高的抗微生 物活性[Ikeda 和 Tazuke, 1983, Makromol. Chem.，Rapid Commun. 4 (1983) 459-461]。更高的 活性歸因于由于聚合物的更大的電荷密度所致的細(xì)胞和聚合物之間更大的靜電吸引。
[0053] SiQAC通過兩步過程起作用。SiQAC分子上的正電荷作用吸引微生物的帶負(fù)電荷 的細(xì)胞壁。初始，疏水烷基鏈穿透與其接觸的有機體的類似疏水的細(xì)胞壁。當(dāng)烷基鏈穿透 精致的細(xì)胞壁時，該壁被弱化和刺穿。接著，當(dāng)陽離子季銨基團接觸細(xì)胞壁時，它破壞離子 流并且引起到細(xì)胞壁之中或之外的滲漏，通常導(dǎo)致細(xì)胞失去其內(nèi)容物或爆裂，這取決于離 子環(huán)境。帶電荷的季銨烷基基團保持不變并且可用于無限地重復(fù)該過程。
[0054] 由于這種"物理的"和"電的"的殺死機制，微生物不會得到發(fā)展對SiQAC的抗性 或免疫性的機會。
[0055] 季銨化合物廣泛用作消毒劑、防腐劑、藥物產(chǎn)品和化妝品并且可以是水果 和蔬菜消毒的備選。所有季銨化合物（QAC)是具有基本結(jié)構(gòu)（NH4+)的陽離子化合 物。這些化合物穿透到細(xì)菌細(xì)胞壁中，與細(xì)胞質(zhì)膜反應(yīng)，誘導(dǎo)由自溶酶引起的壁溶解 (McDonnell, G. &Russell, A.D.1999Antiseptics and disinfectants:activity,action and resistance (防腐劑和消毒劑：活性、作用和抗性）? Clinical Microbiology Reviews 12, 147 - 179)。
[0056] 三甲氧基甲硅烷基基團與表面如玻璃和棉花上的羥基反應(yīng)從而形成將QA化合物 保持在表面并防止其在水中溶解的共價鍵。三甲氧基甲硅烷基基團也可以彼此發(fā)生反應(yīng)而 形成結(jié)合至處理的表面的高度穩(wěn)定的交聯(lián)的硅烷被覆層。這些被覆層已被證實在許多應(yīng) 用中給予表面以殺生物活性，同時沒有將化學(xué)試劑釋放到周圍環(huán)境中[Isquith等，1972 ; Isquith等，1973美國專利3, 730, 701 ;Speier和Malek, 1982J of Colloid and Interface Science 89, 68 ;Walters 等，1973, J.，Appl. Microbiol. 25, 253]。
[0057] 盡管這些被覆層作為殺真菌劑和抗細(xì)菌劑非常有效，但是它們對于孢子是低效 的。
[0058] 圖2舉例說明了利用SiQAC分子3-TPAC的纖維素的官能化。在未改變的天然纖 維素中，X表示氫，其形成大量的懸吊的羥基（OH)基團。在更快的初始階段，鍵形成于所述 分子和羥基之間，形成甲硅烷基醚。在第二個較慢的步驟中，在相鄰的二甲氧基甲硅烷基基 團之間形成交聯(lián)從而形成與基底表面平行排列的隨機有機硅醚聚合物。
[0059] 陽離子部分在表面結(jié)合中不起作用，但在結(jié)合至基底表面后可用。其表面類似于 被識別為局部防腐劑的季銨化合物，其中二癸基二甲基氯化銨（DDAC)是一個典型實例。
[0060] SiQAC分子結(jié)合至基底表面的機制化學(xué)上類似于聚乙烯交聯(lián)形成PEX的機制。
[0061] 圖3是顯示SiQAC官能化的纖維素的作用方法的示意圖。SiQAC鏈結(jié)合至纖維素 纖維并且被定向和交聯(lián)（標(biāo)記的A)從而形成活性層。疏水烷基鏈（標(biāo)記的B)穿透微生物 的類似疏水的細(xì)胞壁。當(dāng)烷基鏈穿透精致的細(xì)胞壁時，該壁被弱化和刺穿。然后陽離子季 銨基團（C)與細(xì)胞壁接觸，并破壞離子流且引起到細(xì)胞壁之中或之外的滲漏，通常導(dǎo)致細(xì) 胞失去其內(nèi)容物或者取決于離子環(huán)境，完全爆裂該細(xì)胞。在其弱化的狀態(tài)，細(xì)胞的快速干燥 過程進一步弱化細(xì)胞壁使得在PCR的早期循環(huán)期間，核酸材料被釋放到溶液中并且在PCR 期間被擴增。
[0062] 因此，SiQAC分子的作用模式涉及多種不同的要件。存在經(jīng)由烷基鏈的細(xì)胞質(zhì)和 外膜脂質(zhì)雙層以及細(xì)胞壁的擾動，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)材料的一般性和進行性滲漏，導(dǎo)致部分的或 完全的細(xì)胞溶解，這取決于周圍溶液的離子強度。此被帶正電荷的銨基團增強，帶正電荷的 銨基團與帶負(fù)電荷的膜磷脂締合。即使在低濃度的活性組分下，也發(fā)生低摩爾質(zhì)量胞質(zhì)組 分（例如，K+、核酸和氨基酸）的滲漏。SiQAC化合物比非甲硅烷基化的季銨化合物顯著更 有效，因為甲硅烷基基團結(jié)合至表面，引起抗微生物部分變得在局部集中和定向。
[0063] 通過SiQAC化合物的細(xì)胞溶解的方法在室溫下進行，這不同于現(xiàn)有技術(shù)中的其他 方法。SiQAC官能化的纖維素適合于弱化和/或破壞細(xì)菌、真菌的細(xì)胞壁以及病毒顆粒的蛋 白質(zhì)外殼。在優(yōu)選的實施方案中，其在5分鐘內(nèi)提供可用于進行PCR(PCR-ready)的溶解的 細(xì)胞材料。本發(fā)明的官能化的基底和方法使得能夠在單個步驟中將樣品內(nèi)的DNA和RNA的 核酸提取與其他潛在的有害劑的凈化結(jié)合。還可能從病毒顆粒提取RNA，提供在RT-PCR之 前不需要復(fù)雜樣品處理以獲得RNA的單步驟方法。
[0064] 所述方法可以用作選擇用于溶解的細(xì)胞類型的手段，例如這里的數(shù)據(jù)顯示在血中 溫育24小時后全血細(xì)胞保持完整，而白紅細(xì)胞被溶解。
[0065] 我們認(rèn)為SiQAC方法至少與以下微生物是相容的：
[0066] 細(xì)菌：MRSA，CA-MRSA ;微球菌屬（Micrococcus sp.);表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermis);聚團腸桿菌（Enterobacter agglomerans);乙酸 I丐不 動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus);金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) (有色素的）；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)(無色素的）；肺炎克雷伯氏菌 (Klibsiella pneumonial moniae);銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa);幾鏈球 菌（Streptococcus faecalis);大腸桿菌（Escherichia coli);奇異變形桿菌（Proteus mirabilis);差異梓樣酸桿菌（Citrobacter diversus);傷寒沙門氏菌（Salmonella typhosa);豬霍亂沙門氏菌（Salmonella choleraesuis);牛棒桿菌（Cornyebacterium bovis);包皮垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis);結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis);狗布魯氏菌（Brucella canis);流產(chǎn)布魯氏菌（Brucella abortus); 豬布魯氏桿菌（Brucella suis);突變鏈球菌（Streptococcus mutans);枯草芽抱桿 菌（Bacillus subtilis);產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌（Clostridium perfringens);流感嗜 血桿菌（Haemophilus influenzae);豬嗜血桿菌（Haemophilus suis);干釀乳酸桿菌 (Lactobacillus easel);乳明串珠菌（Leuconostoc Iactis);單核細(xì)胞增多性李司戎氏菌 (Listeria monocytogenes);痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes);普通變形桿菌 (Proteus vulgaris)〇
[0067] 真菌：鏈格抱屬（Alternaria);黃曲霉（Aspergillus flavus);煙曲霉 (Aspergillus fumigatus);黑曲霉(Aspergillus niger) ; 土曲霉(Aspergillus terreus);花 斑曲霉(Aspergillus versicolor) ；Aureobadisium pullulans ； Cephaldascus fragrans ;球毛殼（Chaetomium globosum);草本支抱霉（Cladosporium herbarum);表皮癬菌屬（Epidermophyton);鐮刀菌龍葵（Fusarium nigrum);腐皮鐮 刀菌（Fusarium solani) ；Glicocladium roseum ;毛霉（Mucor);乳卵抱子菌（Oospora Iactis);擴展念珠菌（Pencillium albicans) ；Tricophyton mentagraphophytes ;擴展 線蟲（Pencillium elegans) ；Pencillium funiculosum ;Pencillium humicola ;特異青霉 (Pencillium notatum);產(chǎn)糖芽霉菌（Pullularia pullulans);青霉素皮蠢（Penicillium variabile);黑色根霉菌（Rhizopus nigricans) ;Ricoderm;葡萄穗霉（Stachybotrys atra) ；Trichophyton interdigitalie ；Trichderma flavus ;橘青霉(Penicillium citrinum)〇
[0068] 酵母和藻類：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae);白色念珠菌（Candida albicans);顫藻 LB143(Oscillatoria borneti LB143);柱抱魚渥藻（Anabaena cylindrica);羊角竹葉B_325(Selenastrum gracile B-325) ;Pleurococcus LBll; Schenedesmus quadricuada;盤藻 LB 9c(Gonium LB 9c);團藻 LB 9(Volvox LB 9);普 通小球藻（Chlorella vulgaris);藍(lán)藻（Cyanophyta)(藍(lán)-綠色）；金藻（Chrysophyta) (褐色）；綠藻（Chlorophyta)(綠色）Seienastum ;綠藻（Chlorophyta)(綠色）原球藻 (Protococcus)〇
[0069] 病毒：HIV ;登革（Dengue);甲 / 乙型流感（Influenza A/B) ;SARS ;H1N1(豬流感 (swine flu)) ;H3N2; 1 型單純皰疫（Herpes Simplex Type 1)。
[0070] 其他：三日癥原蟲（Plasmodium malariae)。
[0071] SiQAC的抗微生物作用的細(xì)節(jié)可以在Isquith等（1972)中找到。 實施例
[0072] 除非另有說明，所有實施例中使用的紙是來自Hahnemiihle FineArt GmbH(Germany)的源于棉花的纖維素紙FP 2992。
[0073] 實施例1 :利用SiQAC溶液的細(xì)菌培養(yǎng)物的紙某鈍化和PCR產(chǎn)物表征
[0074] :
[0075] 1.制備給定細(xì)菌（肺炎克雷伯氏菌（K. pneumonia)、金黃色葡萄球菌（S. aureus) 和結(jié)核分枝桿菌（M. Tuberculosis)*)的過夜（0/N)培養(yǎng)物并取50 ill。[*MTB培養(yǎng)物已被 溫育兩周（0? D. I. 1)]
[0076] 2.制備三組要干燥過夜（0/N)的卡片
[0077] i ?未處理的紙
[0078] ii.用在15 ill水中稀釋的5 ill SiQAC(3_TPAC)溶液官能化的
[0079] iii?用在 15iil TRIS-Cl[pH 7. 5]中稀釋的 5iil SiQAC(3-TPAC)溶液官能化的
[0080] 3.向每組處理的和未處理的紙?zhí)砑?0 iU的培養(yǎng)物并在室溫干燥10分鐘[對每 種培養(yǎng)物，在不同紙上x4重復(fù)]
[0081] 4.使用無菌活檢穿孔器（I. 5mm)移出紙沖孔片（paper-punched disk)。
[0082] 5.將該沖孔片添加至PCR混合物（20 ii 1終體積）
[0083] 6.進行對每個測試通用的16S的35個循環(huán)；肺炎克雷伯氏菌和金黃色葡萄球菌， ⑶'s MTB/RIF
[0084] 7.對于肺炎克雷伯氏菌和金黃色葡萄球菌使用PCR產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)焦磷酸測序
[0085] 結(jié)果:
[0086] 1.肺炎克雷伯氏菌的自標(biāo)準(zhǔn)墊（std pad)(第1組）的PCR在焦磷酸測序（pyro) 中產(chǎn)生平均18個高質(zhì)量bp讀數(shù)
[0087] 2.肺炎克雷伯氏菌的自用添加至15 ill水的5 ill SiQAC(3_TPAC)溶液富集的墊 (第2組）的PCR在pyro中產(chǎn)生平均24個中等質(zhì)量bp讀數(shù)
[0088] 3.肺炎克雷伯氏菌的自用添加至15 ill TRIS-Cl[pH 7. 5]的5 ill SiQAC (3-TPAC)溶液富集的墊（第3組）的PCR在pyro中產(chǎn)生平均28個高質(zhì)量bp讀數(shù)
[0089] 4?金黃色葡萄球菌的自未處理的墊（第1組）的PCR在pyro中產(chǎn)生平均16個高 質(zhì)量bp讀數(shù)
[0090] 5.金黃色葡萄球菌的自用添加至15 ill水的5 ill SiQAC(3-TPAC)溶液富集的墊 (第2組）的PCR在pyro中產(chǎn)生平均20個中等質(zhì)量bp讀數(shù)
[0091] 6.金黃色葡萄球菌的自用添加至15 ii I TRIS-Cl [pH 7. 5]的5 ii 1 SiQAC (3-TPAC)溶液富集的墊（第3組）的PCR在pyro中產(chǎn)生平均25個高質(zhì)量bp讀數(shù)
[0092] 7.⑶'s MTB/RIF :MTB鑒別對于三組樣品是正確的，包括在通過富集有用15 ill TRIS-Cl[pH 7. 5]稀釋的5 ill SiQAC (3-TPAC)溶液的墊處理的樣品中的RIF鑒別
[0093] 結(jié)論:
[0094] 富集有SiQAC(3_TPAC)溶液的紙成功地溶解細(xì)菌細(xì)胞，允許自提取的核酸進行 PCR。這由以下確認(rèn)：通過焦磷酸測序獲得的序列的原始長度，以及來自作為很難打開的 細(xì)胞的結(jié)核分枝桿菌的MTB-RIF的端點檢測，其通常需要使用NALC-NaOH的嚴(yán)格處理以實 現(xiàn)相同水平的細(xì)胞破壞。未處理的紙不產(chǎn)生相同的結(jié)果。需要TRIS-Cl[pH 7. 5]來緩沖 SiQAC0
[0095] 實施例2 :檢測來自用SiQAC溶液處理的血液的瘧原蟲物種
[0096] 圖4顯示對來自獲得自感染患者的血液樣品中的不同瘧原蟲物種的核酸的檢測 結(jié)果。
[0097] 實施例3 :紙官能化和#用方法
[0098] 給出三種備選的紙官能化方法：
[0099] 方法 A
[0100] 紙用20 ill SiQAC (3-TPAC)溶液官能化，干燥24小時，然后在20 ill 5mM TRIS-Cl [pH 9. 0]，0? 2mM MgC12 中洗滌，接著干燥，并且；
[0101] i.施加樣品，干燥20'，移出片（disc)并添加20iil的miliQ水用于PCR，或
[0102] ii.施加樣品，干燥20移出片并利用溫和的移液（pipetting)在20 ii 1的 miliQ水中漂洗，在PCR中使用20 ill
[0103] 方法 B
[0104] 紙用 20iil SiQAC(3-TPAC)溶液官能化，干燥 30' 并在 5mM TRIS-Cl[pH 9. 0]，0. 2mM MgC12中洗滌，然后干燥，并且；
[0105] i.施加樣品，干燥20'，移出片并添加20 ill的miliQ水用于PCR，或
[0106] ii.施加樣品，干燥20'，移出片并使用溫和的移液在20iil的miliQ水中漂洗， 在PCR中使用20 ill
[0107] 方法 C
[0108] 紙用20iil SiQAC(3-TPAC)官能化并干燥30'，并且；
[0109] i.施加樣品，干燥20'，移出片并使用溫和的移液在20iil的miliQ水中漂洗，在 PCR中使用20 iil，或
[0110] 江施加樣品，干燥20/，移出片并添加20111的51111丁1^-(：1[?119.0]，0.21111 MgC12用于PCR;或
[0111] iii.施加樣品，干燥20'，移出片并使用溫和的移液在20 ill的5mM TRIS-Cl[pH 9. 0]，0? 2mM MgC12 中漂洗，在 PCR 中使用 20 ill
[0112] 就以下方面對各種不同的紙?zhí)幚矸椒ㄟM行比較：從生痰的臨床樣品提取結(jié)核分枝 桿菌DNA以及使用NALC-NaOH利用標(biāo)準(zhǔn)C印heid GeneXpert? MTB處理獲得的結(jié)果。結(jié) 果顯示在圖5中。（MTB =檢測到的分枝桿菌rpoB基因；RIFs或RIFr =檢測到的利福平 (rifampicin)突變；FAILED =沒有檢測到）。三種處理方法以不同程度將核酸釋放到用于 PCR的溶液中，從而允許檢測多拷貝和單拷貝rpoB基因，以及檢測利福平突變。所有方法給 出與GeneXpert?:金標(biāo)系統(tǒng)的比較數(shù)據(jù)。方法c產(chǎn)生比金標(biāo)"更好"的結(jié)果，產(chǎn)生高度的細(xì) 胞破壞和用于PCR分析的高質(zhì)量DNA的穩(wěn)定性，通過焦磷酸測序進一步確認(rèn)。焦磷酸測序 顯示在從來自V2核糖體DNA的擴增子來的30bp的序列中觀察到序列變化，長的黃色和藍(lán) 色讀數(shù)說明該序列中不存在突變，確認(rèn)存在良好的擴增產(chǎn)物。
[0113] 圖6顯示使用所述的7種不同改變處理的、來自5個臨床痰樣品（4x RIFs和Ix RIFr)(即35個測試）的累積精度數(shù)據(jù)。表明RIF狀態(tài)（RIFs、RIFr)的MTB (淺藍(lán)色）和 rpoB突變的解鏈溫度的測量以及表示所測得的數(shù)據(jù)點上的標(biāo)準(zhǔn)差的相關(guān)誤差棒顯示，所述 方法不影響解鏈峰測定的精度，其在±〇.5°C內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)方法可以影響測量的精度。
[0114] 圖7顯示利用所描述的方法從痰提取的不同濃度的MTB的多次重復(fù)測試，y軸顯 示峰值解鏈溫度并且X軸顯示峰高。
[0115] 依據(jù)這些實施例，圖8顯示利用SiQAC化合物的紙官能化和樣品分析的優(yōu)化方法。
[0116] 實施例4 :#用SiQAC從痰樣品提取的結(jié)核分枝桿菌的焦磷酸測序
[0117] 三個痰樣品使用SiQAC(3-TPAC)官能化的復(fù)合卡片處理。在沒有熱啟動（即，僅 循環(huán)）的情況下，將I. 5mm片添加至標(biāo)準(zhǔn)16S核糖體DNA擴增，并且所得的擴增子使用焦磷 酸測序進行分析。結(jié)果顯示核心序列區(qū)域的良好擴增，提供>25個核苷酸讀數(shù)長度，表明良 好的提取和擴增：
[0118] 檢索模式：全檢索
[0119] 平均同一性評分：100%
[0120] 檢索引擎：PyroMark Q96 ID
[0121] 參考數(shù)據(jù)庫：HULPII
[0122] 參考序列：M. microti ATCC19422.
[0123] 樣品 I >CGGCTGCTGGCACGTAGTTGGCCGGTCCTTCTT
[0124] 樣品 2>CGGCTGCTGGCACGTAGTTGGCCGGTCCTTCTT
[0125] 樣品 3>CGGCTGCTGGCACGTAGTTGGCCGGTCC
[0126] 實施例5 :從全乳分離微牛物DNA
[0127] 全乳具有許多抑制劑對于PCR是一種困難的樣品類型。復(fù)合紙使用優(yōu)選的方法 (圖8中所示的）官能化。將官能化的紙的單個I. 5_片加上奶粉樣品添加至具有用于通用 16S核糖體DNA擴增的引物的標(biāo)準(zhǔn)PCR混合物。擴增的DNA在標(biāo)準(zhǔn)凝膠上跑膠。圖9顯示結(jié) 果。（泳道1 :分子量標(biāo)記物；泳道2 :5 ill大腸桿菌參比gDNA+1 ill 100% Si-QAC(3-TPAC) 溶液；泳道3 :5iil大腸桿菌參比gDNA+1 ill 10% Si-QAC(3-TPAC)溶液；泳道4 :5iil大腸 桿菌參比 gDNA+1 ill 1% Si-QAC(3-TPAC)溶液；泳道 5 :用 10% Si-QAC(3-TPAC)溶液官能 化的I. 5_片+20 ill全乳；泳道6 :用1 % Si-QAC (3-TPAC)溶液官能化的I. 5_片+20 ill 全乳；泳道7 :官能化的I. 5mm片+20 ii 1全乳；泳道8 :1 ii 1全乳）。
[0128] 顯示的數(shù)據(jù)證實，相比于未處理的紙（泳道6和7)，利用1% Si-QAC (3-TPAC)的 官能化增強擴增。
[0129] 通過接種用于乳細(xì)菌的富集培養(yǎng)基（蛋白胨5g/l、右旋糖lg/1、酵母提取物2.5g/ 1和脫脂奶粉lg/1) +4%瓊脂來檢查片的殘留細(xì)菌-R. C. MARSHALL (1993) Standard Methods for the Microbiological examination of dairy products(用于乳制品的微生物學(xué)考 察的標(biāo)準(zhǔn)方法）第16版（美國公共衛(wèi)生協(xié)會（American Public Health Association))。 過夜培養(yǎng)在用Si-QAC(3-TPAC)處理的片上不顯示細(xì)菌生長，但在未處理的片的培養(yǎng)板上 顯示匯合生長，確認(rèn)了官能化紙在15分鐘內(nèi)凈化液體。
[0130] 實施例6 :提取自來自血清的HIV病毒的RNA的#用官能化的卡片的rt-Dcr
[0131] 概述
[0132] 利用來自被診斷為陽性的匿名患者的血漿樣品，將官能化的卡片用于HIV K103 擴增子的RT-巢式PCR。利用來自不同患者（也被診斷為陽性）的全血樣品的平行測定在 PCR(在1%瓊脂糖凝膠中沒有檢測到片段）或焦磷酸測序中都沒有給出結(jié)果。
[0133] 測定描述
[0134] 兩個卡片使用純化溶液（PF溶液，含有3-TPAC)依照標(biāo)準(zhǔn)方案官能化：
[0135] 1?打開卡片并施加在緩沖液（5mM Tris HCl(pH 9.0)，(V 2mM MgC12)中稀釋的 20微升I/100PF溶液
[0136] 2.干燥15分鐘
[0137] 3.施加20微升的樣品*
[0138] 4.干燥15分鐘
[0139] 5.打孔出單個片并添加至RT
[0140] *樣品是來自外周HIV陽性血液⑴和外周HIV陽性血液⑵的血漿
[0141] 使用的 RT 混合物為 Applied Biosystems Superscript VILO cDNA 合成試劑盒， 如在使用者手冊中所述的，調(diào)節(jié)至30微升的終體積。
[0142] 隨后以以下方式準(zhǔn)備PCR :
[0143] H20-5. 8 U 1
[0144] IOx PCR 緩沖液-5 ii 1
[0145] MgC12[50mM]-2u I
[0146] dNTPs ? IOmM ? -I. 2 U I
[0147] 1849+ ? IOuM ? -In I
[0148] 3500- ? IOuM ? -Iu I
[0149] Ultratools Taq 聚合酶[lu/ U 1]-I U I
[0150] 來自 Superscript VILO cDNA 合成試劑盒的 cDNA-30 u I
[0151] 使用的引物為：
[0152] 1849+ 5' -GATGACAGCATGTCAGGGAG
[0153] 3500- 5' -CTATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA
[0154] PCR 程序：
[0155] 94°C 2min，接著45個循環(huán)的
[0156] 94°C 30sec
[0157] 50°C 30sec
[0158] 72°C Imin 30sec ;接著
[0159] 72 °C 5min
[0160] 10°C ①
[0161] 此PCR的產(chǎn)物為1702bp長并且含有HIVl的gag-pro-pol區(qū)域。此擴增子用作用 于第二PCR的模板。
[0162] 以以下方式準(zhǔn)備第二PCR :
[0163] H20-20 U 1
[0164] IOx PCR 緩沖液-4 U 1
[0165] MgC12[50mM]-l. 6u I
[0166] dNTPs ? IOmM ? -〇. 8 U I
[0167] K103F ? IOuM ? -3. 2u I
[0168] BioK103F ? 10 U M ? -3. 2 U I
[0169] Biotools Taq 聚合酶[lu/U 1] _0? 5 U I
[0170] 來自巢式PCR的PCR產(chǎn)物-5 ill
[0171] 使用的引物為：
[0172] K193F 5'-GGAATACCACATCCYGCAGG
[0173] BioK103R 5,-[生物素 ]AATATTGCTGGTGATCCTTTCC
[0174] PCR 程序：
[0175] 95°C 5min ;接著30個循環(huán)的
[0176] 95°C 30sec
[0177] 55〇C 30sec
[0178] 72°C 30sec ;接著
[0179] 72 °C 5min
[0180] 10°C ①
[0181] 來自第二個PCR的PCR產(chǎn)物為203bp并且用于依照圖10所示的富集方法的焦磷 酸測序反應(yīng)中。
[0182] 結(jié)果
[0183] 依照所述的方案，僅血漿樣品在焦磷酸測序儀中產(chǎn)生良好信號，血液樣品根本沒 有產(chǎn)生結(jié)果。使用的測序引物為K103F(5' -GGAATACCACATCCYGCAGG)并且獲得的序列使用 NCBI的BLAST工具針對完全HIV基因組進行匹配。該序列成功地與所述HIV匹配-參見 圖11。
【權(quán)利要求】
1. 從生物樣品制備核酸的方法，所述生物樣品包含a)具有細(xì)胞膜的細(xì)胞材料，或b)具 有細(xì)胞壁的細(xì)胞材料，或c)具有病毒包膜的病毒材料或d)具有病毒衣殼的病毒材料；所述 方法包括使所述樣品與基底接觸，所述基底被用殺蟲劑官能化，所述殺蟲劑能夠i)弱化所 述細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、病毒包膜或病毒衣殼；或ii)溶解細(xì)胞或病毒材料；其中所述殺蟲劑包 含多個官能團，所述多個官能團包括涉及將所述殺蟲劑結(jié)合至所述基底的結(jié)合部分；疏水 部分；和帶電荷部分。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括在所述接觸步驟之后使所述樣品經(jīng)受熱的 步驟。
3. 權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述基底是纖維素材料；優(yōu)選地是纖維素濾紙或 纖維素基質(zhì)。
4. 權(quán)利要求3所述的方法，其中所述纖維素材料是復(fù)合紙。
5. 權(quán)利要求4所述的方法，其中所述復(fù)合紙包括側(cè)流層，以從沉積在所述紙的表面上 的樣品除去液體以及低分子量污染物和抑制劑。
6. 權(quán)利要求1或2中任一項所述的方法，其中所述基底是玻璃或塑料。
7. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述基底為微觀流體通道或反應(yīng)容器或其他容 器的形式。
8. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述疏水部分包含烷基鏈，例如C5-C30烷基， 優(yōu)選地C10-C20烷基。
9. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述帶電荷部分是帶正電荷的。
10. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述帶電荷部分是季銨基團。
11. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述結(jié)合部分包含羥基。
12. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述官能團是烷基鏈、甲硅烷基基團和氯化銨 基團。
13. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述殺蟲劑是甲硅烷基化的季銨化合物 (SiQAC)。
14. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述殺蟲劑是3-(三甲氧基甲硅烷基）丙基二 甲基十八烷基氯化銨。
15. 權(quán)利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述殺蟲劑選自： a) 遙爪聚（2-烷基-1，3-噁唑啉）； b) 具有抗微生物的DDA基團的纖維素； c) 皂角苷。
16. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述生物樣品包含具有細(xì)胞壁的細(xì)胞材料。
17. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述細(xì)胞材料包含原核細(xì)胞。
18. 權(quán)利要求1至16中任一項所述的方法，其中所述細(xì)胞材料包含植物或真菌細(xì)胞。
19. 權(quán)利要求1至15中任一項所述的方法，其中所述生物樣品包含真核動物細(xì)胞。
20. 權(quán)利要求1至15中任一項所述的方法，其中所述生物樣品包含病毒材料。
21. 擴增生物樣品中的核酸的方法，所述方法包括：根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項所 述的方法制備核酸；和對所制備的酸進行核酸擴增步驟，優(yōu)選是聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)擴增。
22. 用于從生物樣品制備核酸的裝置，所述生物樣品包含a)具有細(xì)胞膜的細(xì)胞材料， 或b)具有細(xì)胞壁的細(xì)胞材料，或c)具有病毒包膜的病毒材料或d)具有病毒衣殼的病毒材 料；所述裝置包括用殺蟲劑官能化的基底，所述殺蟲劑能夠i)弱化所述細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、病 毒包膜或病毒衣殼；或ii)溶解細(xì)胞或病毒材料，其中所述殺蟲劑包含多個官能團，所述多 個官能團包括涉及將所述殺蟲劑結(jié)合至所述基底的結(jié)合部分；疏水部分；和帶電荷部分。
23. 權(quán)利要求22所述的裝置，其中所述基底是纖維素材料；優(yōu)選地是纖維素濾紙或纖 維素基質(zhì)。
24. 權(quán)利要求23所述的裝置，其中所述纖維素材料是復(fù)合紙。
25. 權(quán)利要求22所述的裝置，其中所述基底是玻璃或塑料。
26. 權(quán)利要求22至25中任一項所述的裝置，其中所述基底為微觀流體通道或反應(yīng)容器 或其他容器的形式。
27. 權(quán)利要求22至26中任一項所述的裝置，其中所述疏水部分包含烷基鏈，例如 C5-C30烷基，優(yōu)選地C10-C20烷基。
28. 權(quán)利要求22至27中任一項所述的裝置，其中所述帶電荷部分是帶正電荷的。
29. 權(quán)利要求22至28中任一項所述的裝置，其中所述帶電荷部分是季銨基團。
30. 權(quán)利要求22至29中任一項所述的裝置，其中所述結(jié)合部分包含羥基。
31. 權(quán)利要求22至30中任一項所述的裝置，其中所述官能團是烷基鏈、甲硅烷基基團 和氯化銨基團。
32. 權(quán)利要求22至31中任一項所述的裝置，其中所述殺蟲劑是甲硅烷基化的季銨化合 物（SiQAC)。
33. 權(quán)利要求22至32中任一項所述的裝置，其中所述殺蟲劑是3-(三甲氧基甲硅烷 基）丙基-甲基十八燒基氣化按。
34. 權(quán)利要求22所述的裝置，其中所述殺蟲劑選自： a) 遙爪聚（2-烷基-1，3-噁唑啉）； b) 具有抗微生物的DDA基團的纖維素； c) 皂角苷。
35. 權(quán)利要求22至34中任一項所述的裝置，其中所述基底被整合到樣品制備盒等之 中。
【文檔編號】C12N15/10GK104334726SQ201380027100
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年5月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月25日
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