靶向b-細(xì)胞成熟抗原的嵌合抗原受體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種分離的且純化的核酸序列，其編碼針對B-細(xì)胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受體(CAR)。本發(fā)明還提供了表達(dá)CAR的宿主細(xì)胞，諸如T-細(xì)胞或自然殺傷(NK)細(xì)胞，和用于破壞多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的方法。
【專利說明】靶向B-細(xì)胞成熟抗原的嵌合抗原受體
[0001] 相關(guān)申請的奪叉引用
[0002] 本專利申請要求2012年4月11日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?1/622,600的權(quán) 益，其通過引用整體并入本文。
[0003] 電子遞奪的材料通討引用并入
[0004] 通過引用整體并入本文的是，與本文一起提交并如下標(biāo)識(shí)的計(jì)算機(jī)可讀的核苷酸 /氨基酸序列表：一個(gè)42, 589字節(jié)的ASCII (文本）文件，名稱為"712361_ST25. TXT"，創(chuàng)建 于2013年3月14日。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 多發(fā)性骨髓瘤（MM)是以克隆漿細(xì)胞的積累為特征的惡性腫瘤（參見，例如， Palumbo 等人，New England J. Med.，364 (11) : 1046-1060 (2011)，和 Lonial 等人，Clinical Cancer Res. ,17(6): 1264-1277 (2011))。MM的當(dāng)前療法經(jīng)常造成緩解，但是幾乎所有 的患者最終會(huì)復(fù)發(fā)和死亡（參見，例如，Lonial等人，出處同上，和Rajkumar, Nature Rev.Clinical 0ncol.，8(8):479_491(2011))。已經(jīng)證實(shí)，同種異體造血干細(xì)胞移植 會(huì)誘導(dǎo)免疫介導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞的消除；但是，該方案的毒性較高，且鮮有患者被治愈 (參見，例如，Lonial 等人，出處同上，和 Salit 等人，Clin. Lymphoma, Myeloma, and Leukemia, 11 (3) :247-252 (2011))。當(dāng)前，MM尚不存在臨床上有效的、FDA批準(zhǔn)的單克隆抗 體或自體 T-細(xì)胞療法（參見，例如，Richardson 等人，British J. Haematology, 154 (6): 7 45-754(2011)，和 Yi, Cancer Journal, 15(6):502-510(2009))。
[0007] 經(jīng)過遺傳修飾以識(shí)別惡性腫瘤相關(guān)抗原的T-細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移正在顯示出作為 治療癌癥的新方案的希望（參見，例如，Morgan等人，Science, 314(5796) : 126-129(200 6) ;Brenner 等人，Current Opinion in Immunology, 22 (2) : 251-257 (2010) ；Rosenberg 等人，Nature Reviews Cancer, 8(4):299-308(2008) ,Kershaw 等人，Nature Reviews Immunology, 5 (12) : 928-940 (2005);和 Pule 等人，Nature Medicine, 14 (I I) : 1264-1270 (2 008))。可以將T-細(xì)胞遺傳修飾成表達(dá)嵌合抗原受體（CAR)，所述嵌合抗原受體是包含抗原 識(shí)別部分和T-細(xì)胞活化結(jié)構(gòu)域的融合蛋白（參見，例如，Kershaw等人，出處同上，Eshhar 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (2) : 720-724 (1993)，和 Sadelain 等人，Curr. Opin. Immunol.，21 (2):215-223(2009))。
[0008] 就B-細(xì)胞譜系惡性腫瘤而言，在開發(fā)利用抗-⑶19CAR的過繼性T-細(xì) 胞方案中已經(jīng)取得了廣泛的進(jìn)展（參見，例如，Jensen等人，Biology of Blood and Marrow Transplantation, 16 : 1245-1256 (2010) ；Kochenderf er 等 人，Blood, 116(20):4099-4102(2010) ;Porter 等人，The New England Journal of Medicine, 365(8):725-733(2011) ;Savoldo 等人，Journal of Clinical Investigatio n，121 (5):1822-1826(2011), Cooper 等人，Blood, 101(4):1637-1644(2003) ;Brentjens 等人，Nature Medicine，9(3):279_286(2003);和 Kalos 等人，Science Translational Medicine, 3 (95) :95ra73 (2011))。過繼轉(zhuǎn)移的、抗-CD19-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T-細(xì)胞已經(jīng)治 愈了小鼠中的白血病和淋巴瘤（參見，例如，Cheadle等人，Journal of Immunolog y，184(4):1885-1896(2010) ;Brentjens 等人，Clinical Cancer Research, 13(18Pt I) : 5426-5435 (2007);和 Kochenderfer 等人，Blood, 116 (19) : 3875-3886 (2010))。在早期 臨床試驗(yàn)中，過繼轉(zhuǎn)移的、用抗-CD 19CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T-細(xì)胞會(huì)根除白血病和淋巴瘤患者中的 正常和惡性 B-細(xì)胞（參見，例如，Kochenderfer 等人，Blood, 116(20) :4099-4102(2010); Porter 等人，出處同上，Brentjens 等人，Blood, 118(18):4817-4828(2011);和 Kochenderfer等人，Blood, 2011年12月8日（印刷之前的電子出版物（2012))。但是，CD19 僅罕見地在多發(fā)性骨髓瘤的惡性漿細(xì)胞上表達(dá)（參見，例如，Gupta等人，Amer. J. Clin. Pathology, 132(5) :728-732(2009);和 Lin 等人，Amer. J. Clin. Pathology, 121(4) :482-48 8(2004))。
[0009] 因而，仍然需要可以用在治療多發(fā)性骨髓瘤的方法中的組合物。本發(fā)明提供了這 樣的組合物和方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]
[0011] 本發(fā)明提供了一種分離的或純化的編碼嵌合抗原受體（CAR)的核酸序列，其中所 述CAR包含抗原識(shí)別部分和T-細(xì)胞活化部分，且其中所述抗原識(shí)別部分是針對B-細(xì)胞成 熟抗原（BCMA)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖IA和IB的圖描繪的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解釋了跨多種人細(xì)胞類型的BCM的表達(dá)模式，如 使用定量PCR所確定的。將結(jié)果表示為每IO 5肌動(dòng)蛋白cDNA拷貝的BCM cDNA拷貝的數(shù) 目。
[0013] 圖2A-2L的圖描繪的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解釋了，細(xì)胞表面BCM表達(dá)在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系 上檢測到，但是沒有在其它類型的細(xì)胞上檢測到，如在實(shí)施例1中所述。對于所有圖，實(shí)線 代表用抗-BCM抗體染色，且虛線代表用同種型匹配的對照抗體染色。所有圖均為在活細(xì) 胞上門控的。
[0014] 圖3A的簡圖描繪了一種編碼抗-BCM CAR的核酸構(gòu)建體。從N-端至C-端， 抗-BCM CAR包括：抗-BCM scFv、⑶8 α分子的鉸鏈和跨膜區(qū)域、⑶28分子的細(xì)胞質(zhì)部分 和⑶3 ζ分子的細(xì)胞質(zhì)部分。
[0015] 圖3B-3D的圖描繪的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解釋了，抗-bcmalCAR、抗-bcma2CAR和SP6CAR(在 實(shí)施例2中描述）在T-細(xì)胞的表面上表達(dá)。在未轉(zhuǎn)導(dǎo)的（UT)細(xì)胞上發(fā)生微小抗-Fab染 色。所述圖為在CD3+淋巴細(xì)胞上門控的。圖上的數(shù)字是每個(gè)象限中的細(xì)胞的百分比。
[0016] 圖4A-4C的圖描繪的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解釋了，表達(dá)抗-BCM CAR的T-細(xì)胞以BCM-特異 性的方式將T-細(xì)胞脫粒，如在實(shí)施例3中所述。所述圖為在活CD3+淋巴細(xì)胞上門控的。圖 上的數(shù)字是每個(gè)象限中的細(xì)胞的百分比。
[0017] 圖5A-?的圖描繪的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解釋了，表達(dá)抗-BCM CAR的T-細(xì)胞以BCM-特異 性的方式將T-細(xì)胞脫粒，如在實(shí)施例3中所述。所述圖為在活CD3+淋巴細(xì)胞上門控的。圖 上的數(shù)字是每個(gè)象限中的細(xì)胞的百分比。
[0018] 圖6A-6C的圖描繪的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解釋了，表達(dá)抗-BCM CAR的T-細(xì)胞以BCM-特異 性的方式產(chǎn)生細(xì)胞因子IFN γ、IL-2和TNF，如在實(shí)施例3中所述。所述圖為在活⑶3+淋巴 細(xì)胞上門控的。圖上的數(shù)字是每個(gè)象限中的細(xì)胞的百分比。
[0019] 圖7A的圖描繪的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解釋了，表達(dá)抗-bcma2CAR的T-細(xì)胞特異性地響應(yīng)于 BCM而增殖。圖6B的圖描繪的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解釋了，表達(dá)SP6CAR的T-細(xì)胞沒有特異性地響應(yīng) 于BCM而增殖。
[0020] 圖7C和7D的圖描繪的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解釋了，得自供體A的表達(dá)抗-bcma2CAR的T-細(xì) 胞在4小時(shí)細(xì)胞毒性測定中在不同的效應(yīng)物：靶細(xì)胞比率下特異性地殺死了多發(fā)性骨髓瘤 細(xì)胞系H929 (圖6C)和RPMI8226 (圖6D)。用陰性對照SP6CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T-細(xì)胞在所有效應(yīng) 物：靶標(biāo)比率下誘導(dǎo)了低得多的細(xì)胞毒性水平。對于所有效應(yīng)物：靶標(biāo)比率，一式兩份地 確定細(xì)胞毒性，并將結(jié)果表示為平均值土平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0021] 圖8A的圖描繪的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解釋了，BCM在得自骨髓瘤患者3的原發(fā)性骨髓多發(fā) 性骨髓瘤細(xì)胞的表面上表達(dá)，如在實(shí)施例5中所述。該圖為在CD38 SCD56+漿細(xì)胞（它們構(gòu) 成骨髓細(xì)胞的40% )上門控的。
[0022] 圖8B的圖描繪的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解釋了，得自供體C的用抗-bcma2CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的同種異體 T-細(xì)胞在與骨髓瘤患者3的未操作的骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)以后產(chǎn)生IFN γ，如在實(shí)施例5中所 述。圖7B也表明，得自同一同種異體供體的、表達(dá)抗-bcma2CAR的T-細(xì)胞當(dāng)與得自骨髓瘤 患者3的外周血單核細(xì)胞（PBMC) -起培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生了少得多的IFNy。另外，得自供體C的、 表達(dá)SP6CAR的T-細(xì)胞沒有特異性地識(shí)別骨髓瘤患者3的骨髓。
[0023] 圖8C的圖描繪的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解釋了，從骨髓瘤患者1切除的漿細(xì)胞瘤含有93%的漿 細(xì)胞，且這些原代漿細(xì)胞表達(dá)BCMA，如通過針對BCM的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)（實(shí)線）和同種型 匹配的對照染色（虛線）揭示的。該圖為在漿細(xì)胞上門控的。
[0024] 圖8D的圖描繪的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解釋了，得自骨髓瘤患者1的、表達(dá)抗-bcma2CAR的 T-細(xì)胞特異性地響應(yīng)于自體漿細(xì)胞瘤細(xì)胞而產(chǎn)生IFN γ。
[0025] 圖8E的圖描繪的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解釋了，得自骨髓瘤患者1的、表達(dá)抗-bcma2CAR的 T-細(xì)胞在低效應(yīng)物：靶標(biāo)比率下特異性地殺死了自體漿細(xì)胞瘤細(xì)胞。相反，得自骨髓瘤患 者1的、表達(dá)SP6CAR的T-細(xì)胞表現(xiàn)出對自體漿細(xì)胞瘤細(xì)胞的低細(xì)胞毒性水平。對于所有 的效應(yīng)物：靶標(biāo)比率，一式兩份地確定細(xì)胞毒性，并將結(jié)果表示為平均值土平均值標(biāo)準(zhǔn)誤 差。
[0026] 圖9A的圖描繪的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解釋了，用抗_bcma2CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T-細(xì)胞可以破壞在小 鼠中建立的多發(fā)性骨髓瘤腫瘤。圖9B的圖描繪了用表達(dá)抗-bcma2CAR的T-細(xì)胞治療的荷 瘤小鼠相對于對照的存活。
[0027] 發(fā)明的詳細(xì)描沭
[0028] 本發(fā)明提供了一種分離的或純化的編碼嵌合抗原受體（CAR)的核酸序列，其中所 述CAR包含抗原識(shí)別部分和T-細(xì)胞活化部分。嵌合抗原受體（CAR)是人工構(gòu)建的雜合蛋 白或多肽，其含有與T-細(xì)胞信號傳導(dǎo)或T-細(xì)胞活化結(jié)構(gòu)域連接的抗體（例如，單鏈可變片 段（scFv))的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。CAR具有利用單克隆抗體的抗原結(jié)合性質(zhì)以非-MHC限制 的方式將T-細(xì)胞特異性和反應(yīng)性重新指向選定靶標(biāo)的能力。非-MHC限制的抗原識(shí)別會(huì)給 表達(dá)CAR的T-細(xì)胞提供不依賴于抗原加工而識(shí)別抗原的能力，由此繞過腫瘤逃逸的主要機(jī) 制。此外，當(dāng)在T-細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，CAR有利地不會(huì)與內(nèi)源性T-細(xì)胞受體（TCR) α和β鏈 二聚化。
[0029] "核酸序列"意圖包括DNA或RNA的聚合物（即，多核苷酸），其可以是單鏈的或雙 鏈的，且其可以含有非天然的或改變的核苷酸。本文中使用的術(shù)語"核酸"和"多核苷酸"表 示任意長度的核苷酸的聚合形式，無論是核糖核苷酸（RNA)還是脫氧核糖核苷酸（DNA)。這 些術(shù)語表示分子的一級結(jié)構(gòu)，且因而包括雙鏈和單鏈DNA、以及雙鏈和單鏈RNA。該術(shù)語包 括作為等同物的、從核苷酸類似物和經(jīng)修飾的多核苷酸（例如、但不限于甲基化的和/或加 帽的多核苷酸）產(chǎn)生的RNA或DNA的類似物。
[0030] "分離的"是指從其天然環(huán)境取出核酸。"純化的"是指，給定的核酸的純度已經(jīng)增 力口，其中"純度"是相對術(shù)語，而不是"絕對純度"，所述給定的核酸是已經(jīng)從自然界中取出的 核酸（包括基因組DNA和mRNA)或在實(shí)驗(yàn)室條件下合成的（包括cDNA)和/或擴(kuò)增的核酸。 但是，應(yīng)當(dāng)理解，核酸和蛋白可以用稀釋劑或佐劑配制，且仍然為了實(shí)用目的而分離。例如， 當(dāng)用于引入細(xì)胞中時(shí)，通常將核酸與可接受的載體或稀釋劑混合。
[0031] 本發(fā)明核酸序列編碼這樣的CAR:其包含針對B-細(xì)胞成熟抗原（BCMA，也被稱 作CD269)的抗原識(shí)別部分。BCM是腫瘤壞死因子受體超家族的一個(gè)成員（參見，例 如，Thompson 等人，J.Exp. Medicine, 192(1) :129-135(2000),和 Mackay 等人，Annu. Rev. Immunol. ,21:231-264(2003))。BCMA 結(jié)合 B-細(xì)胞活化因子（BAFF)和誘導(dǎo)增殖的 配體（APRIL)(參見，例如，Mackay等人，出處同上，和Kalled等人，Immunological Reviews, 204:43-54(2005))。在非惡性細(xì)胞中，已經(jīng)報(bào)道BCMA主要在漿細(xì)胞和成熟 B-細(xì)胞的子集中表達(dá)（參見，例如，Laabi等人，EMBO J.，11(11) :3897-3904(1992); Laabi 等人，Nucleic Acids Res. ,22(7) :1147-1154(1994) ;Kalled 等人，出 處同上；O'Connor 等人，J.Exp. Medicine，199 (I) :91-97 (2004);和 Ng 等人，J. Immunol. ,173(2) :807-817 (2004))。BCMA缺陷型小鼠是健康的，且具有正常數(shù)目的 B-細(xì)胞，但是長壽漿細(xì)胞的存活是受損的（參見，例如，0' Connor等人，出處同上； Xu 等人，Mol.Cell. Biol. ,21(12) :4067-4074(2001);和 Schiemann 等人，Science，2 93(5537) :2111-2114(2001))。幾個(gè)研究人員已經(jīng)在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中普遍地檢測 出BCMA RNA，且已經(jīng)在得自多發(fā)性骨髓瘤患者的漿細(xì)胞的表面上檢測出BCMA蛋白（參 見，例如，Novak 等人，Blood, 103(2) :689-694(2004) ;Neri 等人，Clinical Cancer Research, 13(19) :5903-5909(2007) ;Bellucci 等人，Blood, 105(10) :3945-3950(2005); 和 Moreaux 等人，Blood, 103 (8) : 3148-3157 (2004))。
[0032] 本發(fā)明核酸序列編碼包含抗原識(shí)別部分的CAR，所述抗原識(shí)別部分含有針對BCM 的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。本文中使用的術(shù)語"單克隆抗體"表示這樣的抗體：其由 B-細(xì)胞的單一克隆產(chǎn)生，并結(jié)合相同表位。相比之下，"多克隆抗體"表示這樣的抗體群：其 由不同的B-細(xì)胞產(chǎn)生，且結(jié)合相同抗原的不同表位。由本發(fā)明核酸序列編碼的CAR的抗原 識(shí)別部分可以是完整抗體或抗體片段。完整抗體通常由4條多肽組成：兩條相同的重（H) 鏈多肽拷貝和兩條相同的輕（L)鏈多肽拷貝。每條重鏈含有一個(gè)N端可變（V h)區(qū)和三個(gè)C 端恒定（CHp CHjPCH3)區(qū)，并且每條輕鏈含有一個(gè)N端可變（VJ區(qū)和一個(gè)C端恒定（Q) 區(qū)。每對輕鏈和重鏈的可變區(qū)形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。V 1^P'區(qū)具有相同的基本結(jié)構(gòu)， 每個(gè)區(qū)域包含四個(gè)框架區(qū)，所述框架區(qū)的序列是相對保守的。所述框架區(qū)通過三個(gè)互補(bǔ)性 決定區(qū)（⑶R)相連。所述三個(gè)⑶R(被稱作⑶RlXDR2和⑶R3)形成抗體的"高變區(qū)"，其負(fù) 責(zé)抗原結(jié)合。
[0033] 術(shù)語"抗體的片段"、"抗體片段"、"抗體的功能片段"和"抗原結(jié)合部分"在本文 中互換地用于表示抗體的一個(gè)或多個(gè)片段或部分，其保留特異性地結(jié)合抗原的能力（通 常，參見，Holliger 等人，Nat. Biotech.，23(9) :1126-1129(2005))。由本發(fā)明核酸序列 編碼的CAR的抗原識(shí)別部分可以含有任意結(jié)合BCM的抗體片段。所述抗體片段理想地包 含例如一個(gè)或多個(gè)CDR、可變區(qū)（或其部分）、恒定區(qū)（或其部分）或它們的組合。抗體 片段的例子包括，但不限于：（i) Fab片段，其是由'、Vh、（^和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段； (ii)F(ab'） 2片段，其是包含兩個(gè)在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接的Fab片段的二價(jià)片段；（iii) Fv片段，其由抗體的單個(gè)臂的' 和Vh結(jié)構(gòu)域組成；（iv)單鏈Fv(scFv)，其是由Fv片段 的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域（即，'和Vh)通過合成接頭連接組成的單價(jià)分子，所述合成接頭能夠使所 述兩個(gè)結(jié)構(gòu)域合成為單條多肽鏈（參見，例如，Bird等人，Science, 242:423-426 (1988); Huston 等人，Proc.Natl. Acad. Sci.USA，85:5879-5883 (1988);和 Osbourn 等人，Nat. Biotechnol.，16:778(1998));和（V)雙體，其為多肽鏈的二聚體，其中每條多肽鏈包含通 過肽接頭連接至 '的Vh，所述肽接頭因?yàn)樘潭辉试S在同一多肽鏈上的Vh與' 之間配 對，由此驅(qū)動(dòng)在不同Vh-'多肽鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域之間配對，以產(chǎn)生具有兩個(gè)功能性抗原結(jié) 合位點(diǎn)的二聚體分子?？贵w片段是本領(lǐng)域已知的，且更詳細(xì)地描述在例如美國專利申請公 開2009/0093024A1中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，由本發(fā)明核酸序列編碼的CAR的抗原識(shí)別部 分包含抗 -BCMA單鏈Fv (scFv)。
[0034] 單克隆抗體的抗原結(jié)合部分或片段可以是任意大小，只要該部分會(huì)結(jié)合BCMA。在 這方面，針對BCM的單克隆抗體（在本文中也被稱作"抗-BCM單克隆抗體"）的抗原結(jié)合 部分或片段理想地包含約5至18 (例如，約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或前 述值中的任意2個(gè)限定的范圍）個(gè)氨基酸。
[0035] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸序列編碼這樣的抗原識(shí)別部分：其包含抗-BCMA 單克隆抗體的可變區(qū)。在這方面，所述抗原識(shí)別部分包含抗-BCM單克隆抗體的輕鏈可變 區(qū)、重鏈可變區(qū)、或輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)二者。優(yōu)選地，由本發(fā)明核酸序列編碼的CAR 的抗原識(shí)別部分包含抗-BCM單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)。結(jié)合BCM的重鏈 和輕鏈單克隆抗體氨基酸序列公開在例如國際專利申請公開W02010/104949中。
[0036] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸序列編碼包含信號序列的CAR。所述信號序列可 以位于抗原識(shí)別部分的氨基端（例如，抗-BCM抗體的可變區(qū)）。所述信號序列可以包含任 意合適的信號序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述信號序列是人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因 子（GM-CSF)受體序列或CD8a信號序列。
[0037] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述CAR包含鉸鏈序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)明 白，鉸鏈序列是促進(jìn)抗體柔性的短氨基酸序列（參見，例如，Woof等人，Nat. Rev. Immunol.，4(2) :89-99(2004))。所述鉸鏈序列可以位于抗原識(shí)別部分（例如，抗-BCMA scFv)和T-細(xì)胞活化部分之間。所述鉸鏈序列可以是從任意合適的分子衍生出或得到的任 意合適的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，所述鉸鏈序列源自人CDSa分子或CD28分子。
[0038] 本發(fā)明核酸序列編碼包含T-細(xì)胞活化部分的CAR。T-細(xì)胞活化部分可以是從任 意合適分子衍生出或得到的任意合適部分。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述T-細(xì)胞活化部 分包含跨膜結(jié)構(gòu)域。所述跨膜結(jié)構(gòu)域可以是從本領(lǐng)域已知的任意分子衍生出或得到的任意 跨膜結(jié)構(gòu)域。例如，所述跨膜結(jié)構(gòu)域可以從CDSa分子或CD28分子得到或衍生出。CD8是 充當(dāng)T-細(xì)胞受體（TCR)的共受體的跨膜糖蛋白，并且主要在細(xì)胞毒性T-細(xì)胞的表面上表 達(dá)。⑶8的最常見形式作為由⑶8 α和⑶8 β鏈組成的二聚體存在。⑶28在T-細(xì)胞上表 達(dá)，并提供T-細(xì)胞活化所需的共刺激性信號。CD28是CD80 (Β7. 1)和CD86 (Β7. 2)的受體。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述⑶8 α和⑶28是人的。
[0039] 除了跨膜結(jié)構(gòu)域以外，所述T-細(xì)胞活化部分還包含細(xì)胞內(nèi)的（S卩，細(xì)胞質(zhì)的） T-細(xì)胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞內(nèi)T-細(xì)胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以得自或源自CD28分子、 ⑶3 ζ ( ζ )分子或其修飾形式、人Fc受體γ (FcR γ )鏈、⑶27分子、0X40分子、4-1ΒΒ分子 或本領(lǐng)域已知的其它細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)分子。如以上所討論的，CD28是在T-細(xì)胞共刺激中 至關(guān)重要的T-細(xì)胞標(biāo)志物。⑶3 ζ與TCR結(jié)合以產(chǎn)生信號，且含有基于免疫受體酪氨酸的 活化基序（ITAMs)。4-1ΒΒ (也被稱作CD137)將有效的共刺激信號傳送至T-細(xì)胞，從而促 進(jìn)T淋巴細(xì)胞的分化和增強(qiáng)其長期存活。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述⑶28、⑶3 ζ、4-1ΒΒ、 0X40和CD27是人的。
[0040] 由本發(fā)明核酸序列編碼的CAR的T-細(xì)胞活化結(jié)構(gòu)域可以包含前述跨膜結(jié)構(gòu)域中 的任一個(gè)與前述細(xì)胞間T-細(xì)胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域中的任意一個(gè)或多個(gè)的任意組合。例如， 本發(fā)明核酸序列可以編碼這樣的CAR :其包含⑶28跨膜結(jié)構(gòu)域以及⑶28和⑶3 ζ的細(xì)胞 內(nèi)T-細(xì)胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域?？商鎿Q地，例如，本發(fā)明核酸序列可以編碼這樣的CAR :其包含 ⑶8 α跨膜結(jié)構(gòu)域以及⑶28、⑶3 ζ、Fc受體γ (FcR γ )鏈和/或4-1BB的細(xì)胞內(nèi)T-細(xì)胞 信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
[0041] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸序列編碼這樣的CAR:從5'至3'，其包含粒細(xì) 胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體（GM-CSF受體）信號序列、抗-BCM scFv、人⑶8 α分子 的鉸鏈和跨膜區(qū)域、人CD28分子的細(xì)胞質(zhì)T-細(xì)胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和人CD3 ζ分子的T-細(xì) 胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸序列編碼這樣的CAR :從5'至3'，其 包含人⑶8 α信號序列、抗-BCM scFv、人⑶8 α分子的鉸鏈和跨膜區(qū)域、人⑶28分子的 細(xì)胞質(zhì)T-細(xì)胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和人CD3(分子的T-細(xì)胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，本發(fā)明核酸序列編碼這樣的CAR:從5'至3'，其包含人⑶8 α信號序列、抗-BCM scFv、人CD8 α分子的鉸鏈和跨膜區(qū)域、人4-1ΒΒ分子的細(xì)胞質(zhì)T-細(xì)胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和/ 或人0X40分子的細(xì)胞質(zhì)T-細(xì)胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和人CD3 ζ分子的T-細(xì)胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu) 域。例如，本發(fā)明核酸序列包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核酸序列或 由其組成。
[0042] 本發(fā)明還提供了分離的或純化的由本發(fā)明核酸序列編碼的嵌合抗原受體（CAR)。
[0043] 本發(fā)明核酸序列可以編碼任意長度的CAR，即，所述CAR可以包含任意數(shù)目的氨基 酸，前提條件是，所述CAR保留它的生物學(xué)活性，例如，特異性地結(jié)合抗原、檢測哺乳動(dòng)物中 的患病細(xì)胞、或治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的疾病等的能力。例如，所述CAR可以包含50或更 多（例如，60或更多、100或更多或500或更多）個(gè)氨基酸，但是小于1,000(例如，900或更 少、800或更少、700或更少或600或更少）個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，所述CAR是約50至約700 個(gè)氨基酸（例如，約70個(gè)、約80個(gè)、約90個(gè)、約150個(gè)、約200個(gè)、約300個(gè)、約400個(gè)、約 550個(gè)或約650個(gè)氨基酸）、約100個(gè)至約500個(gè)氨基酸（例如，約125個(gè)、約175個(gè)、約225 個(gè)、約250個(gè)、約275個(gè)、約325個(gè)、約350個(gè)、約375個(gè)、約425個(gè)、約450個(gè)或約475個(gè)氨 基酸）、或由前述值中的任意兩個(gè)限定的范圍。
[0044] 在本發(fā)明的范圍內(nèi)包括編碼本文中描述的CAR的功能部分的核酸序列。當(dāng)結(jié)合 CAR使用時(shí)，術(shù)語"功能部分"表示本發(fā)明的CAR的任何部分或片段，所述部分或片段保留其 來源CAR(親本CAR)的生物學(xué)活性。功能部分包括，例如，這樣的CAR部分：其保留識(shí)別靶 細(xì)胞或者檢測、治療或預(yù)防疾病的能力，達(dá)到與親本CAR相似的程度、相同的程度或更高的 程度。關(guān)于編碼親本CAR的核酸序列，編碼CAR的功能部分的核酸序列可以編碼這樣的蛋 白：其包含親本CAR的例如約10%、25%、30%、50%、68%、80%、90%、95%或更多。
[0045] 本發(fā)明核酸序列可以編碼這樣的CAR功能部分：其含有位于所述部分的氨基或羧 基端或者兩端的額外氨基酸，所述額外氨基酸不存在于親本CAR的氨基酸序列中。理想地， 所述額外氨基酸不干擾所述功能部分的生物學(xué)功能，例如，識(shí)別靶細(xì)胞、檢測癌癥、治療或 預(yù)防癌癥等。更理想的是，與親本CAR的生物學(xué)活性相比，所述額外氨基酸增強(qiáng)所述CAR的 生物學(xué)活性。
[0046] 本發(fā)明還提供了編碼前述CAR的功能變體的核酸序列。本文中使用的術(shù)語"功能 變體"表示與由本發(fā)明核酸序列編碼的CAR具有基本或顯著序列同一性或相似性的CAR、多 肽或蛋白，所述功能變體保留所述功能變體作為其變體的CAR的生物學(xué)活性。功能變體包 括，例如，這樣的本文所述的CAR(親本CAR)的變體：所述變體保留識(shí)別靶細(xì)胞的能力，達(dá)到 與親本CAR相似的程度、相同的程度或更高的程度。關(guān)于編碼親本CAR的核酸序列，編碼所 述CAR的功能變體的核酸序列可以與編碼親本CAR的核酸序列具有例如約10%同一性、約 25%同一 1丨生、約30%同一1丨生、約50%同一1丨生、約65%同一1丨生、約80%同一 1丨生、約90%同一1丨生、 約95%同一性、或約99%同一性。
[0047] 功能變體可以，例如，包含由本發(fā)明核酸序列編碼的CAR的氨基酸序列，其具有 至少一個(gè)保守的氨基酸置換。短語"保守氨基酸置換"或"保守突變"表示，將一個(gè)氨基酸 替換為另一個(gè)具有共同性質(zhì)的氨基酸。定義各個(gè)氨基酸之間的共同性質(zhì)的一種有用方式 是，分析同源生物的對應(yīng)蛋白之間的歸一化氨基酸變化頻率（Schulz, G.E.和Schirmer, R. H. , Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)) 〇 根據(jù)這樣的 分析，可以定義氨基酸組，其中在組內(nèi)的氨基酸優(yōu)先彼此交換，且因此在它們對總蛋白結(jié)構(gòu) 的影響方面彼此最相似（Schulz，G.E.和Schirmer，R.H.，出處同上）。保守突變的例子包 括在上述亞組內(nèi)的氨基酸的氨基酸置換，例如，用賴氨酸置換精氨酸，反之亦然，使得可以 維持正電荷；用谷氨酸置換天冬氨酸，反之亦然，使得可以維持負(fù)電荷；用絲氨酸置換蘇氨 酸，使得可以維持游離-OH ;和用谷氨酰胺置換天冬酰胺，使得可以維持游離-NH2。
[0048] 可替換地或額外地，所述功能變體可以包含具有至少一個(gè)非保守氨基酸置換的親 本CAR的氨基酸序列。"非保守突變"涉及不同組之間的氨基酸置換，例如，用賴氨酸置換色 氨酸，或用苯丙氨酸置換絲氨酸等。在該情況下，優(yōu)選的是，所述非保守氨基酸置換不會(huì)干 擾或抑制所述功能變體的生物學(xué)活性。所述非保守氨基酸置換可能增強(qiáng)所述功能變體的生 物學(xué)活性，使得所述功能變體的生物學(xué)活性與親本CAR相比增加。
[0049] 本發(fā)明核酸序列可以編碼這樣的CAR(包括其功能部分和功能變體）：其包含合成 的氨基酸以替代一個(gè)或多個(gè)天然存在的氨基酸。這樣的合成的氨基酸是本領(lǐng)域已知的，且 包括，例如，氨基環(huán)己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高絲氨酸、S-乙酰基氨基甲基-半 胱氨酸、反式-3-和反式-4-羥脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、 4-羧基苯丙氨酸、β -苯基絲氨酸β -羥基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α -萘基丙氨酸、環(huán)己基 丙氨酸、環(huán)己基甘氨酸、吲哚啉-2-甲酸、1，2, 3, 4-四氫異喹啉-3-甲酸、氨基丙二酸、氨基 丙二酸單酰胺、Ν' -芐基-Ν' -甲基-賴氨酸、Ν'，Ν' -二芐基-賴氨酸、6-羥賴氨酸、鳥氨 酸、α-氨基環(huán)戊烷羧酸、α-氨基環(huán)己烷羧酸、α-氨基環(huán)庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰 烷）_甲酸、α， Υ-二氨基丁酸、α，β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
[0050] 本發(fā)明核酸序列可以編碼這樣的CAR(包括其功能部分和功能變體）：其被糖基 化、酰胺化、羧酸酯化、磷酸化、酯化、N-?；?、環(huán)化（例如經(jīng)由二硫鍵），或轉(zhuǎn)化成酸加成鹽， 和/或任選地二聚化或聚合、或綴合。
[0051] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸序列編碼這樣的CAR :其包含SEQ ID NO:4、SEQ IDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11*SEQ ID NO: 12的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列組成。
[0052] 使用本領(lǐng)域已知的方法，可以制備本發(fā)明核酸序列。例如，使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA 方法，可以重組產(chǎn)生核酸序列、多肽和蛋白（參見，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3 版,Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001 ;和 Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates andjohn Wiley&Sons, NY, 1994)。此外，可以從諸如植物、細(xì)菌、昆 蟲或哺乳動(dòng)物（例如，大鼠、人等）等來源分離和/或純化合成制備的編碼CAR的核酸序列。 分離和純化的方法是本領(lǐng)域眾所周知的?？商鎿Q地，可以商業(yè)地合成本文描述的核酸序列。 在這方面，本發(fā)明核酸序列可以是合成的、重組的、分離的和/或純化的。
[0053] 本發(fā)明還提供了一種載體，其包含編碼本發(fā)明的CAR的核酸序列。所述載體可以 是，例如，質(zhì)粒、粘粒、病毒載體（例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒）或噬菌體。合適的載體和載體 制備方法是本領(lǐng)域眾所周知的（參見，例如，Sambrook等人，出處同上，和Ausubel等人， 出處同上）。
[0054] 除了編碼CAR的本發(fā)明核酸序列以外，所述載體優(yōu)選地包含表達(dá)控制序列，諸如 啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、聚腺苷酰化信號、轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)等，其提供所述 核酸序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。示例性的表達(dá)控制序列是本領(lǐng)域已知的，且描述在，例如， Goeddel, Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,第 185 卷，Academic Press, San Diego, Calif. (1990)中
[0055] 得自多種不同來源的大量啟動(dòng)子（包括組成型、誘導(dǎo)型和阻抑型啟動(dòng)子）是本領(lǐng) 域眾所周知的。啟動(dòng)子的代表性來源包括，例如病毒、哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物、酵母和細(xì)菌，并 且得自這些來源的合適啟動(dòng)子是容易得到的，或者可以基于公眾可得到的序列（例如從保 藏機(jī)構(gòu)諸如ATCC以及其它商業(yè)或個(gè)體來源）合成地制備。啟動(dòng)子可以是單向的（即，在一 個(gè)方向起始轉(zhuǎn)錄）或雙向的（即，在3'或5'方向起始轉(zhuǎn)錄）。啟動(dòng)子的非限制性例子包 括例如T7細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)、pBAD(araA)細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)、巨細(xì)胞病毒（CMV)啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng) 子和RSV啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括例如Tet系統(tǒng)（美國專利5, 464, 758和5, 814, 618)、 蛻皮激素可誘導(dǎo)的系統(tǒng)（No 等人，Proc. Natl. Acad. Sci.，93:3346-3351 (1996))、T-REX? 系 統(tǒng)（Invitrogen, Carlsbad, CA)、LACSWITCH? 系統(tǒng)（Stratagene, San Diego, CA)和 Cre-ERT 他莫昔芬可誘導(dǎo)的重組酶系統(tǒng)（Indra等人，Nuc. Acid. Res.，27:4324-4327(1999) ;Nuc. Acid. Res.，28: e99 (2000);美國專利 7, 112, 715 ;和 Kramer&Fussenegger, Methods Mol. Biol.，308:123-144(2005))。
[0056] 本文中使用的術(shù)語"增強(qiáng)子"表示這樣的DNA序列：其增加例如它所可操作地連接 的核酸序列的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子可以位于核酸序列編碼區(qū)的數(shù)千堿基以外，并且可以介導(dǎo)調(diào)控 因子的結(jié)合、DNA甲基化的類型、或DNA結(jié)構(gòu)的改變。得自多種不同來源的大量增強(qiáng)子是本 領(lǐng)域眾所周知的，且可以作為克隆的多核苷酸得到或在克隆的多核苷酸內(nèi)（得自，例如保 藏機(jī)構(gòu)諸如ATCC以及其它商業(yè)或個(gè)體來源）。許多包含啟動(dòng)子（如常用的CMV啟動(dòng)子）的 多核苷酸也包含增強(qiáng)子序列。增強(qiáng)子可以位于編碼序列的上游、內(nèi)部或下游。術(shù)語"Ig增 強(qiáng)子"表示從位于免疫球蛋白（Ig)基因座內(nèi)的增強(qiáng)子區(qū)域衍生出的增強(qiáng)子元件（這樣的 增強(qiáng)子包括例如重鏈（mu) 5'增強(qiáng)子、輕鏈（κ) 5'增強(qiáng)子、κ和mu內(nèi)含子增強(qiáng)子和3'增 強(qiáng)子）（通常參見 Paul W. E.(編），F(xiàn)undamental Immunology,第 3 版，Raven Press, New York(1993)，第 353-363 頁；和美國專利 5, 885, 827)。
[0057] 載體還可以包含"選擇性標(biāo)記基因"。本文中使用的術(shù)語"選擇性標(biāo)記基因"表示 這樣的核酸序列：其在有對應(yīng)選擇劑存在下允許表達(dá)所述核酸序列的細(xì)胞被特異性選擇 或抑制。合適的選擇性標(biāo)記基因是本領(lǐng)域已知的，且描述于，例如，國際專利申請公開WO 1992/08796 和 WO 1994/28143 ;Wigler 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:3567 (1980); O' Hare 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527(1981) ;Mulligan&Berg，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072(1981) ;Colberre-Garapin 等人，J.Mol.Biol·，150:1 (1981); Santerre 等人，Gene, 30:147(1984) ;Kent 等人，Science, 237:901-903(1987); Wigler 等人，Cell, 11:223 (1977) ;Szybalska&Szybalski，Proc.Natl. Acad. Sci. USA，48:2026(1962);Lowy 等人，Cell, 22:817(1980);和美國專利 5, 122,464 和 5, 770, 359。
[0058] 在某些實(shí)施方案中，所述載體是"附加型表達(dá)載體"或"附加體"，其在有適當(dāng)?shù)倪x 擇壓力存在下能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制，并且作為染色體外DNA片段存在于宿主細(xì)胞中（參 見，例如，Conese等人，Gene Therapy, 11:1735-1742(2004))。代表性的商購可得的附加 型表達(dá)載體包括、但不限于：利用愛潑斯坦-巴爾核抗原I(EBNAl)和愛潑斯坦-巴爾病 毒（EBV)復(fù)制起點(diǎn)（oriP)的附加型質(zhì)粒。得自Invitrogen (Carlsbad, CA)的載體pREP4、 pCEP4、pREP7 和 pcDNA3. 1 以及得自 Stratagene (La Jolla, CA)的 pBK-CMV 代表使用 T-抗 原和SV40復(fù)制起點(diǎn)替代EBNAl和oriP的附加型載體的非限制性例子。
[0059] 其它合適的載體包括整合表達(dá)載體，其可以隨機(jī)整合進(jìn)宿主細(xì)胞的DNA中，或者 可能包括能夠?qū)崿F(xiàn)表達(dá)載體與宿主細(xì)胞的染色體之間的特異性重組的重組位點(diǎn)。這樣的整 合表達(dá)載體可以利用宿主細(xì)胞染色體的內(nèi)源性表達(dá)控制序列來實(shí)現(xiàn)期望蛋白的表達(dá)。以 位點(diǎn)特異性方式整合的載體的例子包括，例如，得自Invitrogen(Carlsbad, CA)的flp-in 系統(tǒng)的組件（例如，pcDNA?5/FRT)，或cre-lox系統(tǒng)，諸如可見于得自Stratagene(La Jolla，CA)的pExchange-6核心載體。隨機(jī)整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體中的載體的例子包括， 例如得自Invitrogen(Carlsbad, CA)的pcDNA3.1(在沒有T-抗原存在下引入）和得自 Promega(Madison, WI)的 pCI 或 pFNIOA(ACT)FLEXI?。
[0060] 還可以使用病毒載體。代表性的病毒表達(dá)載體包括，但不限于，基于腺病毒的載體 (例如，基于腺病毒的Per. C6系統(tǒng)，其可得自Crucell, Inc. (Leiden,荷蘭），基于慢病毒的 載體（例如，基于慢病毒的pLPl，其得自Life Technologies (Carlsbad, CA))，和逆轉(zhuǎn)錄病 毒載體（例如，得自Stratagene (La Jolla, CA)的pFB-ERV和pCFB-EGSH)。在優(yōu)選的實(shí)施 方案中，所述病毒載體是慢病毒載體。
[0061] 可以將包含編碼CAR的本發(fā)明核酸的載體引入能夠表達(dá)由其編碼的CAR的宿主細(xì) 胞中，所述宿主細(xì)胞包括任意合適的原核或真核細(xì)胞。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是這樣的宿主細(xì)胞： 其可以容易地且穩(wěn)定地生長，具有相當(dāng)快速的生長速率，具有確定地表征的表達(dá)系統(tǒng)，并且 可以被容易地和有效地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
[0062] 本文中使用的術(shù)語"宿主細(xì)胞"表示可以含有表達(dá)載體的任何類型的細(xì)胞。所述宿 主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，例如，植物、動(dòng)物、真菌或藻類，或者可以是原核細(xì)胞，例如，細(xì)菌或 原生動(dòng)物。所述宿主細(xì)胞可以是培養(yǎng)的細(xì)胞或原代細(xì)胞，即，直接分離自生物體（例如人） 的細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是粘附細(xì)胞或懸浮細(xì)胞，即，在混懸液中生長的細(xì)胞。合適的宿 主細(xì)胞是本領(lǐng)域已知的，并且包括，例如，DH5a大腸桿菌細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞、猴VERO 細(xì)胞、COS細(xì)胞、HEK293細(xì)胞等。為了擴(kuò)增或復(fù)制重組表達(dá)載體的目的，所述宿主細(xì)胞可以 是原核細(xì)胞，例如，DH5a細(xì)胞。為了制備重組CAR的目的，所述宿主細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物 細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞優(yōu)選地是人細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是任何細(xì)胞類型，可以源自任何 類型的組織，并且可以處于任何發(fā)育階段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞可以是外周血 淋巴細(xì)胞（PBL)、外周血單核細(xì)胞（PBMC)或自然殺傷（NK)細(xì)胞。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是 自然殺傷（NK)細(xì)胞。更優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是T-細(xì)胞。用于選擇合適的哺乳動(dòng)物宿主 細(xì)胞的方法和用于轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、繁殖、篩選和純化細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的。
[0063] 本發(fā)明提供了一種分離的宿主細(xì)胞，其表達(dá)編碼本文描述的CAR的本發(fā)明核酸序 列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是T-細(xì)胞。本發(fā)明的T-細(xì)胞可以是任意T-細(xì)胞， 諸如培養(yǎng)的T-細(xì)胞，例如，原代T-細(xì)胞，或者得自培養(yǎng)的T-細(xì)胞系的T-細(xì)胞，或得自哺乳 動(dòng)物的T-細(xì)胞。如果得自哺乳動(dòng)物，T-細(xì)胞可以得自眾多來源，包括、但不限于血液、骨髓、 淋巴結(jié)、胸腺或其它組織或流體。T-細(xì)胞也可以被富集或純化。T-細(xì)胞優(yōu)選地是人T-細(xì) 胞（例如，分離自人）。T-細(xì)胞可以處于任何發(fā)育階段，包括、但不限于，CD4+/CD8+雙陽性的 T-細(xì)胞、⑶4+輔助性T-細(xì)胞，例如，Th1和Th2細(xì)胞、⑶8+T-細(xì)胞（例如，細(xì)胞毒性的T-細(xì) 胞）、腫瘤浸潤細(xì)胞、記憶T-細(xì)胞、原初T-細(xì)胞等。在一個(gè)實(shí)施方案中，T-細(xì)胞是CD8+T-細(xì) 胞或⑶4+T-細(xì)胞。T-細(xì)胞系可得自，例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC,馬納薩斯，VA)和德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ)，且包括，例如，Jurkat 細(xì)胞 (ATCC TIB-152)、Sup-Tl 細(xì)胞（ATCC CRL-1942)、RPMI 8402 細(xì)胞（DSMZ ACC-290)、Karpas 45細(xì)胞（DSMZ ACC-545)、及其衍生物。
[0064] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是自然殺傷（NK)細(xì)胞。NK細(xì)胞是在先天 性免疫系統(tǒng)中起作用的一類細(xì)胞毒性的淋巴細(xì)胞。NK細(xì)胞被定義為大顆粒淋巴細(xì)胞，且 構(gòu)成從共同淋巴祖細(xì)胞（其也產(chǎn)生B和T淋巴細(xì)胞）分化成的第三類細(xì)胞（參見，例如， Immunobiology,第 5版，Janeway 等人，eds·，Garland Publishing, New York, NY (2001)) 〇 NK細(xì)胞在骨髓、淋巴結(jié)、脾、扁桃體和胸腺中分化并成熟。成熟以后，NK細(xì)胞作為具有特征 性的細(xì)胞毒性顆粒的大淋巴細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)中。NK細(xì)胞能夠識(shí)別和殺死一些異常細(xì)胞，例如， 一些腫瘤細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞，并且被認(rèn)為在對抗細(xì)胞內(nèi)病原體的先天性免疫防御中是 重要的。如上面結(jié)合T-細(xì)胞所述，NK細(xì)胞可以是任意NK細(xì)胞，諸如培養(yǎng)的NK細(xì)胞，例如， 原代NK細(xì)胞，或得自培養(yǎng)的NK細(xì)胞系的NK細(xì)胞，或得自哺乳動(dòng)物的NK細(xì)胞。如果得自哺 乳動(dòng)物，NK細(xì)胞可以得自眾多來源，包括、但不限于血液、骨髓、淋巴結(jié)、胸腺或其它組織或 流體。NK細(xì)胞也可以被富集或純化。NK細(xì)胞優(yōu)選地是人NK細(xì)胞（例如，分離自人）。NK 細(xì)胞系可得自，例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC，馬納薩斯，VA)，且包括，例如，NK-92 細(xì)胞（ATCC CRL-2407)、NK92MI 細(xì)胞（ATCC CRL-2408)、及其衍生物。
[0065] 通過"轉(zhuǎn)染"、"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)"，可以將編碼CAR的本發(fā)明核酸序列引入細(xì)胞中。本 文中使用的"轉(zhuǎn)染"、"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)"表示，使用物理或化學(xué)方法，將一個(gè)或多個(gè)外源多核苷 酸引入宿主細(xì)胞中。許多轉(zhuǎn)染技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，且包括，例如，磷酸鈣DNA共沉淀（參 見，例如，Murray E.J.(編），Methods in Molecular Biology,第7卷，Gene Transfer and Expression Protocols，Humana Press(1991)) ;DEAE_ 葡聚糖；電穿孔；陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo) 的轉(zhuǎn)染；鎢顆粒促進(jìn)的微粒轟擊（J〇hnston，Nature，346:776-777(1990));和磷酸鍶DNA共 沉淀（Brash等人，Mol. Cell Biol. ,7:2031-2034(1987))。使傳染性顆粒在合適的包裝細(xì) 胞（其中的許多是商購可得的）中生長以后，可以將噬菌體或病毒載體引入宿主細(xì)胞中。 [0066] 不受特定理論或機(jī)制的約束，據(jù)信，通過引起針對BCMA的抗原特異性的應(yīng)答，由 本發(fā)明核酸序列編碼的CAR會(huì)提供下述一項(xiàng)或多項(xiàng)：靶向和破壞表達(dá)BCM的癌細(xì)胞，減少 或消除癌細(xì)胞，促進(jìn)免疫細(xì)胞向腫瘤部位的滲透，和增強(qiáng)/延長抗癌應(yīng)答。因而，本發(fā)明提 供了一種破壞多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括：使一個(gè)或多個(gè)前述分離的T-細(xì)胞 或自然殺傷細(xì)胞與表達(dá)BCM的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞群體接觸，由此產(chǎn)生CAR，其結(jié)合多發(fā)性 骨髓瘤細(xì)胞上的BCMA，并且破壞所述多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。如本文所討論的，多發(fā)性骨髓瘤 (也被稱作漿細(xì)胞性骨髓瘤或卡勒氏?。┦菨{細(xì)胞的癌癥，其為通常引起抗體產(chǎn)生的白血 細(xì)胞類型（Raab等人，Lancet, 374:324-329 (2009))。多發(fā)性骨髓瘤每年影響1-4/100,000 的人。該疾病在男性中更常見，并且由于仍然未知的原因，在非洲裔美國人中的發(fā)病率是在 高加索美國人中的2倍。多發(fā)性骨髓瘤是最少見的血液學(xué)惡性腫瘤（14%)，占所有癌癥的 1% (Raab等人，出處同上）。多發(fā)性骨髓瘤的治療通常涉及高劑量化學(xué)療法和隨后的造血 干細(xì)胞移植（同種異體的或自體的）；但是，高復(fù)發(fā)率在已經(jīng)接受這樣的治療的多發(fā)性骨髓 瘤患者中是常見的。如以上所討論的，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞高度表達(dá)BCMA (參見，例如，Novak 等人，出處同上；Neri等人，出處同上；Bellucci等人，出處同上；和Moreaux等人，出 處同上）。
[0067] 可以使一個(gè)或多個(gè)分離的T-細(xì)胞（其表達(dá)編碼本文描述的抗-BCMCAR的本 發(fā)明核酸序列）離體、在體內(nèi)或在體外與表達(dá)BCM的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞群體接觸。"離 體"表示在生物體以外的人工環(huán)境中在細(xì)胞或組織內(nèi)部或表面上進(jìn)行的方法，所述人工 環(huán)境具有天然條件的最小改變。相反，術(shù)語"體內(nèi)"表示在活生物體內(nèi)部進(jìn)行的方法，所 述活生物體處于它們的正常完整狀態(tài)，而"體外"方法使用生物體的組分進(jìn)行，所述組分 已經(jīng)從它的通常生物學(xué)背景中分離。本發(fā)明的方法優(yōu)選地涉及離體和體內(nèi)組分。在這 點(diǎn)上，例如，可以將上述的分離的T-細(xì)胞在表達(dá)編碼抗-BCMA CAR的本發(fā)明核酸序列的 條件下離體培養(yǎng)，然后直接轉(zhuǎn)移進(jìn)受多發(fā)性骨髓瘤影響的哺乳動(dòng)物（優(yōu)選人）中。這樣 的細(xì)胞轉(zhuǎn)移方法在本領(lǐng)域中被稱作"過繼性細(xì)胞轉(zhuǎn)移（ACT) "，其中免疫衍生的細(xì)胞被動(dòng) 地轉(zhuǎn)移進(jìn)新受體宿主中，以將供體免疫衍生的細(xì)胞的功能性轉(zhuǎn)移給新宿主。用于治療不 同類型的癌癥（包括血液學(xué)癌癥諸如骨髓瘤）的過繼性細(xì)胞轉(zhuǎn)移方法是本領(lǐng)域已知的， 且公開在，例如，Gattinoni 等人，Nat. Rev. Tmmunol. , 6 (5) : 383-393 (2006) ； June, CH, J. Clin. Invest.，117(6) :1466-76(2007) ;Rapoport 等人，Blood, 117(3) :788-797(2011);和 Barber 等人，Gene Therapy, 18:509-516(2011))中。
[0068] 本發(fā)明還提供了一種破壞霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的方法?；羝娼鹆馨土觯ㄒ郧氨?稱作霍奇金?。┦且环N免疫系統(tǒng)的癌癥，其特征在于被稱作Reed-Sternberg細(xì)胞的多 核細(xì)胞類型的存在?；羝娼鹆馨土龅?種主要類型包括經(jīng)典的霍奇金淋巴瘤和結(jié)節(jié) 性淋巴細(xì)胞占優(yōu)勢的霍奇金淋巴瘤。目前用輻射療法、化學(xué)療法或造血干細(xì)胞移植來 治療霍奇金淋巴瘤，治療的選擇取決于患者的年齡和性別，以及疾病的階段、體積和組 織學(xué)亞型。已經(jīng)在霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的表面上檢測到BCMA表達(dá)（參見，例如，Chiu等 人，Blood, 109 (2) : 729-739 (2007))。
[0069] 當(dāng)將T-細(xì)胞或NK細(xì)胞施用給哺乳動(dòng)物時(shí)，所述細(xì)胞對于所述哺乳動(dòng)物而言可以 是同種異體的或自體的。在"自體"施用方法中，將細(xì)胞（例如，形成血液的干細(xì)胞或淋巴 細(xì)胞）從哺乳動(dòng)物取出，儲(chǔ)存（并任選地修飾），并返回該相同哺乳動(dòng)物。在"同種異體"施 用方法中，哺乳動(dòng)物從遺傳上類似的、但是不同的供體接受細(xì)胞（例如，形成血液的干細(xì)胞 或淋巴細(xì)胞）。優(yōu)選地，所述細(xì)胞對于所述哺乳動(dòng)物而言是自體的。
[0070] 理想地將T-細(xì)胞或NK細(xì)胞以組合物（諸如藥物組合物）的形式施用給人?？商?換地，可以將編碼CAR的本發(fā)明核酸序列或包含編碼CAR的核酸序列的載體配制在組合物 (諸如藥物組合物）中，并施用給人。本發(fā)明的藥物組合物可以包含表達(dá)本發(fā)明的CAR的 T-細(xì)胞或NK細(xì)胞的群體。除了本發(fā)明核酸序列或表達(dá)本發(fā)明的CAR的宿主細(xì)胞以外，所 述藥物組合物可以包含其它藥學(xué)活性劑或藥物，諸如化學(xué)治療劑，例如，天門冬酰胺酶、白 消安、卡鉬、順鉬、柔紅霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利 妥昔單抗、長春堿、長春新堿等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含表達(dá)本發(fā)明的 CAR的分離的T-細(xì)胞或NK細(xì)胞，更優(yōu)選表達(dá)本發(fā)明的CAR的T-細(xì)胞或NK細(xì)胞的群體。
[0071] 本發(fā)明的T-細(xì)胞或NK細(xì)胞可以以鹽（例如，藥學(xué)上可接受的鹽）的形式提供。 合適的藥學(xué)上可接受的酸加成鹽包括源自無機(jī)酸（諸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸 和硫酸）和有機(jī)酸（諸如酒石酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、富馬酸、苯甲酸、羥乙酸、葡糖 酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如，對甲苯磺酸）的那些鹽。
[0072] 載體的選擇將部分地取決于特定的本發(fā)明核酸序列、載體或表達(dá)CAR的宿主細(xì) 胞、以及用于施用本發(fā)明核酸序列、載體或表達(dá)CAR的宿主細(xì)胞的特定方法。因此，存在本 發(fā)明的藥物組合物的多種合適制劑。例如，所述藥物組合物可以含有防腐劑。合適的防腐 齊阿以包括，例如，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉和苯扎氯銨?？梢匀芜x 地使用2種或更多種防腐劑的混合物。防腐劑或其混合物通常以總組合物的約0. 0001重 量％至約2重量％的量存在。
[0073] 另外，在所述組合物中可以使用緩沖劑。合適的緩沖劑包括，例如，檸檬酸、檸檬酸 鈉、磷酸、磷酸鉀、和多種其它酸和鹽?？梢匀芜x地使用2種或更多種緩沖劑的混合物。所 述緩沖劑或其混合物通常以總組合物的約〇. 001重量％至約4重量％的量存在。
[0074] 用于制備可施用的（例如，可胃腸外施用的）組合物的方法是本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的，且更詳細(xì)地描述在，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams&Wilkins ;第 21 版（2005 年 5 月 I 日）。
[0075] 可以將組合物（其包含編碼CAR的本發(fā)明核酸序列或表達(dá)CAR的宿主細(xì)胞）配 制為包合絡(luò)合物（諸如環(huán)糊精包合絡(luò)合物）或脂質(zhì)體。脂質(zhì)體可以用于將宿主細(xì)胞（例 如，T-細(xì)胞或NK細(xì)胞）或本發(fā)明核酸序列靶向特定組織。脂質(zhì)體也可以用于增加本發(fā) 明核酸序列的半衰期。許多方法可用于制備脂質(zhì)體，諸如在例如下述文獻(xiàn)中描述的那些： Szoka等人，Ann. Rev. Biophys. Bioeng.，9:467(1980)，和美國專利 4, 235, 871、4, 501，728、 4, 837, 028 和 5, 019, 369。
[0076] 所述組合物可以采用限時(shí)釋放、延遲釋放和持續(xù)釋放遞送系統(tǒng)，使得本發(fā)明的組 合物的遞送提前發(fā)生，且具有足夠的時(shí)間以造成要治療的部位的致敏。許多類型的釋放遞 送系統(tǒng)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可得到的和已知的。這樣的系統(tǒng)可以避免所述組合物的重復(fù) 施用，由此增加受試者和醫(yī)師的便利，且可以特別適合用于本發(fā)明的某些組合物實(shí)施方案。
[0077] 所述組合物理想地包含可有效地治療或預(yù)防多發(fā)性骨髓瘤或霍奇金淋巴瘤的量 的表達(dá)編碼CAR的本發(fā)明核酸序列的宿主細(xì)胞、或包含本發(fā)明核酸序列的載體。本文中使 用的術(shù)語"治療"等表示，獲得期望的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效應(yīng)。優(yōu)選地，所述效應(yīng)是治療 性的，即所述效應(yīng)部分地或完全地治愈疾病和/或可歸因于疾病的不利癥狀。為此目的，本 發(fā)明的方法包括施用"治療有效量"的組合物，所述組合物包含表達(dá)編碼CAR的本發(fā)明核酸 序列的宿主細(xì)胞、或包含本發(fā)明核酸序列的載體。"治療有效量"表示在必要的劑量和時(shí)間 段內(nèi)有效地達(dá)到期望治療結(jié)果的量。治療有效量可以根據(jù)諸如以下因素而變化：個(gè)體的疾 病狀態(tài)、年齡、性別和重量，以及CAR在個(gè)體中引起期望應(yīng)答的能力。例如，本發(fā)明的CAR的 治療有效量是結(jié)合多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞上的BCM并破壞它們的量。
[0078] 可替換地，所述藥理學(xué)和/或生理學(xué)效應(yīng)可以是預(yù)防性的，即該效應(yīng)完全地或部 分地預(yù)防疾病或其癥狀。在這方面，本發(fā)明的方法包括：給易患多發(fā)性骨髓瘤或霍奇金淋巴 瘤的哺乳動(dòng)物施用"預(yù)防有效量"的組合物，所述組合物包含表達(dá)編碼CAR的本發(fā)明核酸序 列的宿主細(xì)胞、或包含本發(fā)明核酸序列的載體。"預(yù)防有效量"表示在必要的劑量和時(shí)間段 內(nèi)有效地達(dá)到期望預(yù)防結(jié)果（例如，預(yù)防疾病發(fā)作）的量。
[0079] 施用給哺乳動(dòng)物（例如，人）的宿主細(xì)胞的典型量可以是，例如，在100萬至1000 億個(gè)細(xì)胞的范圍內(nèi)；但是，低于或高于該示例性范圍的量是在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，本發(fā)明 的宿主細(xì)胞的每日劑量可以是約100萬至約500億個(gè)細(xì)胞（例如，約500萬個(gè)細(xì)胞、約2500 萬個(gè)細(xì)胞、約5億個(gè)細(xì)胞、約10億個(gè)細(xì)胞、約50億個(gè)細(xì)胞、約200億個(gè)細(xì)胞、約300億個(gè)細(xì) 胞、約400億個(gè)細(xì)胞、或由前述值中的任意兩個(gè)限定的范圍），優(yōu)選約1000萬至約1000億個(gè) 細(xì)胞（例如，約2000萬個(gè)細(xì)胞、約3000萬個(gè)細(xì)胞、約4000萬個(gè)細(xì)胞、約6000萬個(gè)細(xì)胞、約 7000萬個(gè)細(xì)胞、約8000萬個(gè)細(xì)胞、約9000萬個(gè)細(xì)胞、約100億個(gè)細(xì)胞、約250億個(gè)細(xì)胞、約 500億個(gè)細(xì)胞、約750億個(gè)細(xì)胞、約900億個(gè)細(xì)胞、或由前述值中的任意兩個(gè)限定的范圍）， 更優(yōu)選約1億個(gè)細(xì)胞至約500億個(gè)細(xì)胞（例如，約1. 2億個(gè)細(xì)胞、約2. 5億個(gè)細(xì)胞、約3. 5億 個(gè)細(xì)胞、約4. 5億個(gè)細(xì)胞、約6. 5億個(gè)細(xì)胞、約8億個(gè)細(xì)胞、約9億個(gè)細(xì)胞、約30億個(gè)細(xì)胞、 約300億個(gè)細(xì)胞、約450億個(gè)細(xì)胞、或由前述值中的任意兩個(gè)限定的范圍）。
[0080] 通過定期評估接受治療的患者，可以監(jiān)測治療或預(yù)防效力。對于持續(xù)若干天或更 久的重復(fù)給藥而言，根據(jù)情況，重復(fù)所述治療直至疾病癥狀得到期望的抑制。但是，其它劑 量方案可能是有用的，且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通過所述組合物的單次推注施用，通過所述組 合物的多次推注施用，或通過所述組合物的連續(xù)輸注施用，可以遞送期望的劑量。
[0081] 使用標(biāo)準(zhǔn)施用技術(shù)，可以給哺乳動(dòng)物施用所述組合物，所述組合物包含表達(dá)本發(fā) 明的編碼CAR的核酸序列的宿主細(xì)胞、或包含本發(fā)明的編碼CAR的核酸序列的載體，所述標(biāo) 準(zhǔn)施用技術(shù)包括口服的、靜脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、皮下的、肺的、透皮的、肌肉內(nèi)的、鼻內(nèi)的、含 服的、舌下的、或栓劑施用。所述組合物優(yōu)選地適合于胃腸外施用。本文中使用的術(shù)語"胃 腸外"包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、直腸、陰道和腹膜內(nèi)施用。更優(yōu)選地，通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi) 或皮下注射，利用外周全身遞送將所述組合物施用給哺乳動(dòng)物。
[0082] 可以將所述組合物（其包含表達(dá)本發(fā)明的編碼CAR的核酸序列的宿主細(xì)胞、或包 含本發(fā)明的編碼CAR的核酸序列的載體）與一種或多種其它治療劑一起施用，所述其它治 療劑可以共同施用給哺乳動(dòng)物。"共同施用"是指，在時(shí)間上足夠接近地施用一種或多種其 它治療劑以及包含本發(fā)明的宿主細(xì)胞或本發(fā)明的載體的組合物，使得本發(fā)明的CAR可以增 強(qiáng)一種或多種其它治療劑的作用，或反之亦然。在這點(diǎn)上，可以首先施用包含本發(fā)明的宿主 細(xì)胞或本發(fā)明的載體的組合物，然后可以施用一種或多種其它治療劑，或反之亦然。可替換 地，可以同時(shí)施用包含本發(fā)明的宿主細(xì)胞或本發(fā)明的載體的組合物以及一種或多種其它治 療劑?？梢耘c包含本發(fā)明的宿主細(xì)胞或本發(fā)明的載體的組合物共同施用的治療劑的一個(gè)例 子是IL-2。
[0083] 將所述組合物（其包含表達(dá)本發(fā)明的編碼CAR的核酸序列的宿主細(xì)胞、或包含本 發(fā)明的編碼CAR的核酸序列的載體）施用給哺乳動(dòng)物（例如，人）以后，通過本領(lǐng)域已知的 任意合適方法，可以測量CAR的生物學(xué)活性。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述CAR結(jié)合多發(fā)性骨髓 瘤細(xì)胞上的BCMA，并破壞所述多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法，包括例 如ELISA和流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)，可以測定所述CAR與多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的表面上的BCMA的結(jié) 合。使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法，諸如在例如以下文獻(xiàn)中描述的細(xì)胞毒性測定，可以測 量CAR的破壞多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的能力：Kochenderfer等人，J. Immunotherapy, 32(7) : 689 -702 (2009)，和 Herman 等人· J. Immunological Methods, 285 (1) : 25-40 (2004)。通過測定 某些細(xì)胞因子（諸如⑶107a、IFN γ、IL-2和TNF)的表達(dá)，也可以測量CAR的生物學(xué)活性。 [0084] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)容易地認(rèn)識(shí)到，可以以任意數(shù)目的方式修飾本發(fā)明的編碼 CAR的核酸序列，從而通過所述修飾增加 CAR的治療或預(yù)防效力。例如，可以將CAR直接地或 通過接頭間接地綴合至靶向部分。將化合物（例如，CAR)與靶向部分綴合的實(shí)踐是本領(lǐng)域 已知的。參見，例如，Wadwa 等人，J. Drug Targeting 3:111(1995)和美國專利 5, 087, 616。
[0085] 下述實(shí)施例進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，但是，當(dāng)然不應(yīng)該解釋為以任何方式限制本 發(fā)明的范圍。
[0086] 實(shí)施例1
[0087] 本實(shí)施例證實(shí)了 BCMA在人細(xì)胞中的表達(dá)模式。
[0088] 使用BCMA-特異性的引物和探針集合（Life Technologies, Carlsbad, CA)，對 一組cDNA樣品進(jìn)行定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR)，所述cDNA樣品得自人主要組織qPCR Panel II (Origine Technologies, Rockville, MD)中所含的寬范圍的正常組織。分析得 自漿細(xì)胞瘤的細(xì)胞的cDNA作為陽性對照，所述漿細(xì)胞瘤從患有晚期多發(fā)性骨髓瘤的患者 切除。用RNeasy微型試劑盒（Qiagen, Inc. ,Valencia, CA)從楽細(xì)胞瘤細(xì)胞提取RNA，并 使用標(biāo)準(zhǔn)方法合成cDNA。通過在載體DNA中稀釋編碼全長BCMA cDNA的質(zhì)粒（Origine Technologies, Rockville, MD)，建立BCMA qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。所述qPCR準(zhǔn)確地檢測每 個(gè)反應(yīng)IO2-IO9個(gè)BCM拷貝的拷貝數(shù)。用TaqmanP-肌動(dòng)蛋白引物和探針試劑盒（Life Technologies, Carlsbad, CA)，定量相同組織中的β -肌動(dòng)蛋白cDNA拷貝的數(shù)目。通過擴(kuò)增 β-肌動(dòng)蛋白質(zhì)粒的系列稀釋物，建立β-肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。在Roche LightCycler480 機(jī)器（Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN)上進(jìn)行所有 qPCR 反應(yīng)。
[0089] qPCR分析的結(jié)果顯示在圖IA和IB中。如通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)確定的，93%的得 自漿細(xì)胞瘤樣品的細(xì)胞為漿細(xì)胞。漿細(xì)胞瘤樣品中的BCM表達(dá)顯著高于任意其它組織中 的BCMA表達(dá)。在幾種血液學(xué)組織（諸如外周血單核細(xì)胞（PBMC)、骨髓、脾、淋巴結(jié)和扁桃 體）中檢測到BCM cDNA。在大多數(shù)胃腸器官（諸如十二指腸、直腸和胃）中檢測到低水平 的BCMA cDNA。胃腸器官中的BCMA表達(dá)可能是存在于腸相關(guān)的淋巴樣組織（諸如固有層和 派伊爾斑）中的楽細(xì)胞和B-細(xì)胞的結(jié)果（參見，例如，Brandtzaeg, Immunological Invest igations，39(4-5) :303-355(2010))。也在睪丸和氣管中檢測到低水平的BCMA cDNA。在氣 管中檢測到的低水平的BCM cDNA可能是由于漿細(xì)胞在氣管固有層中的存在（參見，例如， Soutar，Thorax, 31(2):158-166(1976))。
[0090] 使用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)（參見圖2A-2L)進(jìn)一步表征了 BCM在不同細(xì)胞類型的表面 上的表達(dá)，所述細(xì)胞類型包括多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系H929、U266和RPMI8226。多發(fā)性骨髓瘤 細(xì)胞系H929、U266和RPMI8226都表達(dá)細(xì)胞表面BCMA。相反，肉瘤細(xì)胞系TC71、T-細(xì)胞白 血病系CCRF-CEM和腎細(xì)胞系293T-17不表達(dá)細(xì)胞表面BCMA。原代⑶34+造血細(xì)胞、原代小 氣道上皮細(xì)胞、原代支氣管上皮細(xì)胞和原代腸上皮細(xì)胞都缺乏細(xì)胞表面BCMA表達(dá)。
[0091] 本實(shí)施例的結(jié)果證實(shí)，BCMA在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的表面上表達(dá)，并且它在正常組 織中具有受限的表達(dá)模式。
[0092] 實(shí)施例2
[0093] 本實(shí)施例描述了編碼抗-BCM嵌合抗原受體（CAR)的本發(fā)明核酸序列的構(gòu)建。
[0094] 從國際專利申請公開WO 2010/104949 (Kalled等人）得到被命名為"C12A3. 2"和 "C11D5. 3"的2種小鼠-抗-人-BCM抗體的抗體序列。使用這些抗體的重鏈可變區(qū)和輕 鏈可變區(qū)的氨基酸序列，設(shè)計(jì)具有下述通式結(jié)構(gòu)的單鏈可變片段（scFv):
[0095] 輕鏈可變區(qū)-接頭-重鏈可變區(qū)。
[0096] 所述接頭具有下述氨基酸序列：GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID N0:7)(參見，例如， Cooper 等人，Blood, 101 (4) : 1637-1644 (2003))。
[0097] 設(shè)計(jì)了編碼2種嵌合抗原受體的DNA序列，其中的每一種從5'至3'含有下述元 件：⑶8 α信號序列、前述抗-BCM scFv、人⑶8 α分子的鉸鏈和跨膜區(qū)域、⑶28分子的細(xì) 胞質(zhì)部分和CD3 ζ分子的細(xì)胞質(zhì)部分。這些編碼CAR的核酸序列的示意圖描繪在圖3Α中。 并入得自C12A3. 2和C11D5. 3的可變區(qū)的CAR分別被命名為抗-bcmal和抗-bcma2。
[0098] 設(shè)計(jì)了編碼5種其它嵌合抗原受體（基于上述的抗_bcma2CAR)的DNA序列，其中 的每一種含有不同的信號序列和T-細(xì)胞活化結(jié)構(gòu)域。在這方面，8ss-抗-bcma2CAR從5' 至3'含有下述元件：⑶8 α信號序列、scFv、人⑶8 α分子的鉸鏈和跨膜區(qū)域、⑶28分子 的細(xì)胞質(zhì)部分和⑶3 ζ分子的細(xì)胞質(zhì)部分。G-抗-bcma2CAR從5'至3'含有下述元件：人 GM-CSF受體信號序列、scFv、人⑶8 α分子的鉸鏈和跨膜區(qū)域、⑶28分子的細(xì)胞質(zhì)部分和 ⑶3 ζ分子的細(xì)胞質(zhì)部分?？?bcma2-BB CAR從5'至3'含有下述元件：⑶8 α信號序列、 scFv、人⑶8 α分子的鉸鏈和跨膜區(qū)域、4-1ΒΒ分子的細(xì)胞質(zhì)部分和C'D3^分子的細(xì)胞質(zhì)部 分?？?bcma2-0X40CAR從5'至3'含有下述元件：CD8 α信號序列、scFv、人CD8 α分子的 鉸鏈和跨膜區(qū)域、0X40分子的細(xì)胞質(zhì)部分（參見，例如，Latza等人，European Journal of Immunology, 24:677-683(1994))和 0)3ζ 分子的細(xì)胞質(zhì)部分?？?bcma2-BB0X40 從 5' 至 3'含有下述元件：⑶8 α信號序列、scFv、人⑶8 α分子的鉸鏈和跨膜區(qū)域、4-1BB分子的細(xì) 胞質(zhì)部分、0X40分子的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域和CD3(分子的細(xì)胞質(zhì)部分。在表1描繪了存在于7種 CAR序列中的每一種內(nèi)的元件。
[0099] 表 1
[0100]

【權(quán)利要求】
1. 分離的或純化的編碼嵌合抗原受體（CAR)的核酸序列，其中所述CAR包含抗原識(shí)別 部分和T-細(xì)胞活化部分，且其中所述抗原識(shí)別部分針對B-細(xì)胞成熟抗原（BCMA)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的或純化的核酸序列，其中所述抗原識(shí)別部分包含針對 BCMA的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的或純化的核酸序列，其中所述抗原識(shí)別部分包含針對 BCMA的單克隆抗體的可變區(qū)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的分離的或純化的核酸序列，其中所述T-細(xì)胞活 化部分包含下述蛋白中的任一種的T-細(xì)胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域：人CD8-a蛋白、人CD28蛋白、 人⑶3-(蛋白、人FcRy蛋白、⑶27蛋白、0X40蛋白、人4-1BB蛋白、前述任一種的修飾形 式或前述的任意組合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的分離的或純化的核酸序列，其包含SEQIDN0:1、 SEQIDN0:2 或SEQIDN0:3 的核酸序列。
6. 分離的或純化的CAR，其由權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的核酸序列編碼。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的或純化的CAR，其包含SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQ IDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDNO: 10、SEQIDNO: 11 或SEQIDNO: 12 的氨 基酸序列。
8. 載體，其包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的分離的或純化的核酸序列。
9. 分離的宿主細(xì)胞，其表達(dá)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的核酸序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的宿主細(xì)胞，其表達(dá)包含SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、 SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDNO: 10、SEQIDNO: 11 或SEQIDNO: 12 的氨基酸序列的CAR。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9或權(quán)利要求10所述的分離的宿主細(xì)胞，其為T-細(xì)胞。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9或權(quán)利要求10所述的分離的宿主細(xì)胞，其為自然殺傷（NK)細(xì)胞。
13. 破壞多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括：使表達(dá)BCMA的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞 與權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的分離的或純化的核酸序列接觸，由此產(chǎn)生CAR，且所述CAR 結(jié)合所述多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞上的BCMA，并破壞所述多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。
14. 破壞多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括：使表達(dá)BCMA的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞 與權(quán)利要求8所述的載體接觸，由此產(chǎn)生CAR，且所述CAR結(jié)合所述多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞上的 BCMA，并破壞所述多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。
15. 破壞多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括：使表達(dá)BCMA的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞 與一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求11所述的分離的T-細(xì)胞接觸，由此產(chǎn)生CAR，且所述CAR結(jié)合所述 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞上的BCMA，并破壞所述多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。
16. 破壞多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括：使表達(dá)BCMA的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞 與一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求12所述的分離的NK細(xì)胞接觸，由此產(chǎn)生CAR，且所述CAR結(jié)合所述 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞上的BCMA，并破壞所述多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。
17. 根據(jù)權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞在人體中。
18. 根據(jù)權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞在體外。
【文檔編號】C12N15/62GK104379179SQ201380027676
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月11日
【發(fā)明者】詹姆斯·諾布爾·科亨德費(fèi)爾 申請人:美國衛(wèi)生和人力服務(wù)部