制備烴的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及制備單-不飽和的烯烴的方法，其包括使脂肪族單-不飽和的羧酸與包含與SEQ ID NO:1具有至少21％序列同一性的氨基酸序列的Fdc1多肽和包含與SEQ ID NO:2具有至少17％序列同一性的氨基酸序列的Pad1多肽接觸。
【專利說明】制備烴的方法 【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001] 本發(fā)明涉及改良的產(chǎn)生在生物燃料和/或生物化學(xué)品的生產(chǎn)中有用的烯烴的方 法，及在該方法中有用的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 隨粗礦物油減少的供給，使用可再生的能源對(duì)于生產(chǎn)液體燃料和/或化學(xué)品而言 變得越來越重要。這些來自可再生的能源的燃料和/或化學(xué)品常常被稱為生物燃料。優(yōu)選 源于非-可食用可再生的能源的生物燃料和/或生物化學(xué)品，由于這些不與食品生產(chǎn)競(jìng)爭(zhēng)。
[0003] 烴諸如烯烴是燃料和/或化學(xué)品生產(chǎn)中的重要成分。因此會(huì)期望自非-可食用可 再生的能源產(chǎn)生烯烴（有時(shí)也被稱為生物-烯烴）。
[0004] 【發(fā)明概述】
[0005] 本發(fā)明的第1方面提供制備單-不飽和的烯烴的方法，其包括使脂肪族單-不飽 和的羧酸與包含與SEQ ID NO: 1具有至少21%序列同一性的氨基酸序列的Fdcl多肽（在 本文也被稱為阿魏酸脫羧酶多肽或阿魏酸脫羧酶）和包含與SEQ ID N0:2具有至少17%序 列同一性的氨基酸序列的Padl多肽（在本文也被稱為苯丙烯酸脫羧酶多肽或苯丙烯酸脫 羧酶）接觸。
[0006] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供制備末端單-不飽和的烯烴的方法，其包括使 脂肪族α，β -單-不飽和的羧酸與下列多肽接觸：具有阿魏酸脫羧酶活性的第1多肽，該 第1多肽包含與SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列其有至少21%，優(yōu)選至少30%序列同一性， 更優(yōu)選至少50%序列同一性的第1氨基酸序列，及具有苯丙烯酸脫羧酶活性的第2多肽， 該第2多肽包含與SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列具有至少17%，優(yōu)選至少37%序列同一 性，更優(yōu)選至少60%序列同一性的第2氨基酸序列。
[0007] 不被任何種理論束縛，相信在環(huán)境條件下工作的由生物學(xué)催化劑的羧酸脫羧常常 需要使用發(fā)揮瞬時(shí)電子受體作用的輔因子（例如硫胺素；生物素；金屬）。認(rèn)為，產(chǎn)生CO 2的 C-C鍵的異裂鍵斷裂可產(chǎn)生高度不穩(wěn)定的碳負(fù)離子，除非電子對(duì)可離域。不需要輔因子的酶 已有報(bào)道，但該酶常常具有非常嚴(yán)格的底物需求。
[0008] 所謂的Fdcl/Padl酶系統(tǒng)屬于廣義地催化芳族基的可逆的脫羧的酶家族。家族成 員的輔因子需求，機(jī)理或個(gè)體性質(zhì)至今未見任何詳細(xì)報(bào)道。
[0009] 酵母Fdcl和Padl酶已牽涉芳族底物的脫羧（見Mukai N et ah (2010) J. Biosci. Bioeng. 109, 564-569的文章）。Padl酶也已單獨(dú)牽涉山梨酸的脫羧（見Stratford M et al. (2007) Appl. Environ. Microbiol. 73, 6534-6542 的文章）。全部這些底物都最少具有與 羧酸基相鄰的2個(gè)雙鍵，其已預(yù)期是酶機(jī)理的關(guān)鍵。意外地，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，使用Fdcl和Padl 的組合，通過在α和β位置之間具有碳雙鍵的脂肪族單-不飽和的羧酸的脫羧而產(chǎn)生末 端烯烴是可能的。
[0010] 【發(fā)明詳述】
[0011] 除非在本文另外定義，本文所用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)會(huì)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通 常明白的含義。
[0012] 一般而言，在本文描述的在生物化學(xué)，酶學(xué)，分子和細(xì)胞生物學(xué)，微生物學(xué)，遺傳學(xué) 和蛋白和核酸化學(xué)和交叉科學(xué)的關(guān)聯(lián)技術(shù)使用的命名法是本領(lǐng)域熟知的及通常使用的那 些。
[0013] 本文提及的常規(guī)方法和技術(shù)更詳細(xì)解釋于，例如，Sambrook等人。（分子克隆，實(shí) 驗(yàn)室手冊(cè)[第2版]Sambrook等人.冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1989)。
[0014] 本說明書中提到的氨基酸序列和核苷酸序列如說明書結(jié)尾部分的表3所示。術(shù)語(yǔ) 〃多核苷酸〃，〃多核苷酸序列〃和〃核酸序列〃在本文互換使用。術(shù)語(yǔ)〃多肽〃，〃多肽序 列"和"氨基酸序列"同樣在本文互換使用。由本發(fā)明包括的其他序列在序列表中提供及 參照GenBank登錄號(hào)列于表4和5。
[0015] 本說明書通篇提到的酶學(xué)委員會(huì)（EC)號(hào)（在本文也被稱為"類〃）根據(jù)國(guó)際生 物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)的命名委員會(huì)（NC-IUBMB)(例如，在http://www. chem. qmul. ac. uk/iubmb/enzyme/可利用的其資源〃酶命名法〃（1992，包括補(bǔ)充6-17)中）。此是基 于由各酶類催化的化學(xué)反應(yīng)的數(shù)字分類方案（酶命名法1992 recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes. Webb，E. C. (1992) 〇 San Diego :由學(xué)術(shù)出版社為國(guó)際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)出版.ISBN 0-12-227164-5)。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可例如使用可獲自國(guó)際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUBMB)的方法容 易確定是否酶落入在本文提到的任何特定酶類之內(nèi)。
[0016] 術(shù)語(yǔ)〃Fdcl多肽〃指屬于EC類No. 4. I. 1的阿魏酸脫羧酶。術(shù)語(yǔ)〃Fdcl多肽〃與 術(shù)語(yǔ)〃Fdcl酶〃和〃Fdcl蛋白〃在本文互換使用?！ň哂邪⑽核崦擊让富钚缘牡?多肽〃 優(yōu)選是"Fdcl多肽"。"Fdcl多肽〃或〃具有阿魏酸脫羧酶活性的第1多肽〃可包含氨基 酸序列 SEQ ID NO: 1(啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae)Fdcl 蛋白）或與 SEQ ID NO: 1具有至少21 %同一性，更優(yōu)選至少30%，甚至更優(yōu)選至少50%或至少55%同一性的變 體氨基酸序列（例如，表4中所列的序列，諸如SEQ ID NO: 1和16?26)。更優(yōu)選〃Fdcl 多肽〃或〃具有阿魏酸脫羧酶活性的第1多肽〃基本上由氨基酸序列SEQ ID NO: 1或與 SEQ ID NO: 1具有至少21 %同一性，更優(yōu)選至少30%，甚至更優(yōu)選至少50%或至少55%同 一性的變體氨基酸序列組成。最優(yōu)選"Fdcl多肽"或"具有阿魏酸脫羧酶活性的第1多肽 〃由氨基酸序列SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少21 %同一性，更優(yōu)選至少30%，甚 至更優(yōu)選至少50%或至少55%同一'丨生的變體氨基酸序列組成。
[0017] 術(shù)語(yǔ)〃Padl多肽〃指屬于EC類No. 4. I. 1的苯丙烯酸脫羧酶。術(shù)語(yǔ)〃Padl多肽〃 在本文與術(shù)語(yǔ)"Padl酶〃和"Padl蛋白〃互換使用。〃具有苯丙烯酸脫羧酶活性的第2多 肽〃優(yōu)選是〃多肽Padl"。"Padl多肽〃或〃具有苯丙烯酸脫羧酶活性的第2多肽〃可包 含氨基酸序列SEQ ID NO: 2 (啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae)Padl蛋白）或與 SEQ ID NO: 2具有至少17%同一性，更優(yōu)選至少37%，甚至更優(yōu)選至少60%或至少65%同 一性的變體氨基酸序列（例如，表5中所列的序列，諸如SEQ ID NO:2和27?37)。更優(yōu) 選〃Padl多肽〃或〃具有苯丙烯酸脫羧酶活性的第2多肽〃基本上由氨基酸序列SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少17%同一性，更優(yōu)選至少37%，甚至更優(yōu)選至少60%或至 少65%同一性的變體氨基酸序列組成。最優(yōu)選"Padl多肽〃或〃具有苯丙烯酸脫羧酶活性 的第2多肽〃由氨基酸序列SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少17%同一性，更優(yōu)選 至少37%，甚至更優(yōu)選至少60 %或至少65 %同一性的變體氨基酸序列組成。
[0018] 當(dāng)脂肪族單-不飽和的羧酸與Fdcl多肽和Padl多肽，分別與具有阿魏酸脫羧酶 活性的第1多肽和具有苯丙烯酸脫羧酶活性的第2多肽接觸時(shí)，產(chǎn)生烯烴是可能的，該烯烴 包含僅一個(gè)不飽和的碳-碳鍵。有利地，自在α和β位置之間具有碳雙鍵的脂肪族羧酸 產(chǎn)生末端烯烴是可能的。即，本發(fā)明有利地允許通過使在α和β位置之間具有碳雙鍵的 脂肪族單-不飽和的羧酸與Fdcl多肽和Padl多肽，分別與具有阿魏酸脫羧酶活性的第1 多肽和具有苯丙烯酸脫羧酶活性的第2多肽接觸來產(chǎn)生單-不飽和的末端烯烴。
[0019] 在本文理解的〃烯烴〃是包含至少一個(gè)碳-碳雙鍵的不飽和的脂肪族烴化合物?！?烴化合物〃在本文也被稱為〃烴"。在本文理解的〃烴化合物〃是由氫和碳組成的化合物。 可使用本發(fā)明的方法制備（即產(chǎn)生的）適合的烯烴的例具有線性或分支的形態(tài)的等于或多 于4至等于或少于30個(gè)碳原子及包含一個(gè)或更多雙鍵?？赏ㄟ^使用本發(fā)明的方法制備的 烯烴的特定例包括具有達(dá) 2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12,13,14,15,16,17,18,19 或達(dá) 20 個(gè) 碳原子的直鏈或支鏈烯烴。
[0020] 通過使用本發(fā)明的方法制備的一種或更多烯烴是單-不飽和的烯烴。在本文理解 的〃單-不飽和的烯烴〃是包含僅一個(gè)不飽和的碳-碳鍵的烯烴，該一個(gè)不飽和的碳-碳 鍵是碳-碳雙鍵。
[0021] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用本發(fā)明的方法制備的（即產(chǎn)生的）一種或更多烯烴是 末端烯烴。該〃末端烯烴〃可在本文也稱為例如〃 1-烯烴〃，〃 α -烯烴〃，〃 α -烯烴〃或 〃 α -烯烴"。在本文理解的〃末端烯烴〃是在烯烴中的末端碳原子和其相鄰碳原子之間包 含碳-碳雙鍵的烯烴。即，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過使用本發(fā)明的方法制備的一種或更多 烯烴是末端單-不飽和的烯烴。在本文理解的"脂肪族不飽和的羧酸"是包含不飽和的 碳-碳鍵的脂肪族羧酸。在本文理解的〃脂肪族單-不飽和的羧酸〃是具有僅一個(gè)不飽和 的碳-碳鍵的脂肪族不飽和的羧酸。不飽和的碳-碳鍵優(yōu)選是所謂的碳-碳雙鍵。因此， 脂肪族不飽和的羧酸優(yōu)選是包含單個(gè)碳-碳雙鍵的脂肪族不飽和的羧酸。
[0022] 由此，優(yōu)選脂肪族單-不飽和的羧酸是鏈烯酸。鏈烯酸在本文也被稱為〃烯酸"。 在本文理解的鏈烯酸是包含碳-碳雙鍵的不飽和的脂肪族羧酸。脂肪族單-不飽和的羧酸 更優(yōu)選是α -鏈烯酸（有時(shí)也被稱為例如α -鏈烯酸或2-鏈烯酸）。在本文理解的α -鏈 烯酸是在碳鏈的α和β位置（相對(duì)于羧基）之間包含碳-碳雙鍵的不飽和的脂肪族羧酸。 當(dāng)脂肪族單-不飽和的羧酸是該α -鏈烯酸時(shí)，在本發(fā)明的方法中制備的烯烴可有利地是 末端烯烴。
[0023] 在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，脂肪族單-不飽和的羧酸是脂肪族α，β_單-不飽和 的羧酸。在本文理解的該〃脂肪族α，β-單-不飽和的羧酸〃是包含僅一個(gè)單不飽和的 碳-碳鍵的脂肪族羧酸，讀單不飽和的碳-碳鍵位于羧酸的α-碳和β-碳之間。脂肪族 α，β_單-不飽和的羧酸優(yōu)選是具有單個(gè)碳-碳雙鍵的脂肪族α，β_單-不飽和的羧酸。 該具有單個(gè)碳-碳雙鍵的脂肪族α，β-單-不飽和的羧酸可在本文也稱為〃α，β-單-不 飽和的鏈烯酸"。因此，脂肪族單-不飽和的羧酸優(yōu)選是脂肪族α，β -單-不飽和的鏈烯 酸。如以上解釋，當(dāng)使用該脂肪族α，β_單-不飽和的鏈烯酸時(shí)，制備的烯烴可有利地是 末端單-不飽和的烯烴。
[0024] 在實(shí)施方法之前，可在單步驟中使多于一種類型的羧酸與Fdcl和Padl多肽接觸， 導(dǎo)致烯烴的混合物產(chǎn)生，依賴于起初存在的羧酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過接觸包含至少 一種或更多α，β-單-不飽和的鏈烯酸的脂肪族不飽和的羧酸的混合物來制備包含至少 一種或更多末端單-不飽和的烯烴的烯烴混合物。
[0025] 方法可隨后包括分離烯烴和/或烯烴的混合物。術(shù)語(yǔ)"分離烯烴"指從其他非-烴 組分分離烯烴，或烯烴的混合物。此可指在分離之后，例如，以重量計(jì)至少約50%的樣品由， 例如，至少約 60%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98 % 99 %或 100 %烯烴 組成。在本發(fā)明的工作期間產(chǎn)生的烯烴可由任何知道的技術(shù)分離（即，分離）。一種例示 過程是2-相（雙-相）分離過程，涉及經(jīng)一段時(shí)期和/或在對(duì)于允許在有機(jī)相中收集烯烴 足夠的條件下實(shí)施該方法，及自水相分離有機(jī)相。此可尤其相關(guān)聯(lián)，當(dāng)，例如，該方法在宿主 細(xì)胞諸如微-生物之內(nèi)實(shí)施時(shí)，如下所述。雙-相分離使用烴的相對(duì)不混溶性來輔助分離。 "不混溶性"指稱化合物相對(duì)不能溶解于水中，及由化合物的分配系數(shù)定義，如本領(lǐng)域技術(shù) 人員會(huì)熟知。
[0026] 在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，F(xiàn)dcl和/或Padl多肽（分別〃具有阿魏酸脫羧酶活 性的第1多肽〃和/或〃具有苯丙烯酸脫羧酶活性的第2多肽"）由重組宿主細(xì)胞，諸如重 組微-生物表達(dá)。因此，本發(fā)明的第1方面的方法可在宿主細(xì)胞之內(nèi)發(fā)生，即，方法可至少 部分為體內(nèi)方法。宿主細(xì)胞可為重組體和可為，例如，遺傳修飾的微生物。因此，微-生物 可遺傳修飾，即，自其天然的狀態(tài)人工改變，以表達(dá)Fdcl和/或Padl多肽（分別〃具有阿 魏酸脫羧酶活性的第1多肽"和/或"具有苯丙烯酸脫羧酶活性的第2多肽"）中的至少 一種及，優(yōu)選，這兩種。本文所述的其他酶也可由微-生物表達(dá)。優(yōu)選地，酶是外源的，即， 在修飾之前不存在于細(xì)胞內(nèi)，已通過使用微生物方法導(dǎo)入，諸如在本文所述。此外，在本發(fā) 明的方法中，酶可各由重組宿主細(xì)胞，在相同的宿主細(xì)胞之內(nèi)或在分離的宿主細(xì)胞中表達(dá)。 烴可自其所形成的宿主細(xì)胞分泌。
[0027] 宿主細(xì)胞可由本領(lǐng)域技術(shù)人員知道適宜于此目的的任何方式遺傳修飾。此包括在 質(zhì)?；蛘沉；蛟谒拗骷?xì)胞之內(nèi)繁殖的其他表達(dá)載體上導(dǎo)入目標(biāo)基因，諸如一種或更多編碼 Fdcl和/或Padl多肽（分別〃具有阿魏酸脫羧酶活性的第1多肽〃和/或〃具有苯丙烯 酸脫羧酶活性的第2多肽"）的基因?；蛘?，質(zhì)?；蛘沉NA或質(zhì)粒或粘粒DNA的部分或線 性DNA序列可，例如由同源重組整合進(jìn)宿主基因組。為了實(shí)施遺傳修飾，可將DNA由天然的 攝取導(dǎo)入或轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)胞或由過程諸如電穿孔介導(dǎo)。遺傳修飾可涉及在導(dǎo)入的啟動(dòng)子控制下 表達(dá)基因。導(dǎo)入的DNA可編碼可發(fā)揮酶的作用或可調(diào)控其他基因的表達(dá)的蛋白。
[0028] 該宿主細(xì)胞可包含編碼Fdcl和/或Padl多肽（分別〃具有阿魏酸脫羧酶活性的 第1多肽"和/或"具有苯丙烯酸脫羧酶活性的第2多肽"）的核酸序列。例如，細(xì)胞可 包含包含下列之至少一種的至少一種核酸序列：多核苷酸序列SEQ ID NO:3?7或38? 59或其補(bǔ)體，或編碼酶Fdcl和/或Padl，例如本文所述的酶的功能變體或片段的該多核 苷酸的片段。編碼酶的核酸序列可為外源，即，不天然存在于宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的第2 方面，重組宿主細(xì)胞，諸如微-生物，優(yōu)選包含至少一種多肽，所述多肽是Fdcl酶，例如，具 有與SEQ ID NO: 1具有至少21 %同一性的氨基酸序列及屬于EC類4. 1.1.-(例如SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19, 20, 21，22, 23, 24, 25和/或26之任一個(gè)）；和/或優(yōu)選包含至少一種多 肽，所述多肽是Padl酶，例如，具有與SEQ ID NO: 2具有至少17%同一性的氨基酸序列及 屬于EC 類 4. I. L-(例如，SEQ ID N0:27,28,29,30,31，32,33,34,35,36 和 / 或37 之任 一個(gè)），或這些序列之任何的功能變體或片段。例如，重組宿主細(xì)胞可包含編碼與SEQ ID NO: 1具有至少21 %同一性的多肽或編碼與SEQ ID NO: 2具有至少17%同一性的多肽，或這 些之功能變體或片段的多核苷酸。因此，多核苷酸可包含下列多核苷酸序列中的至少一種： SEQ ID N0:3,4,5,6 和 / 或 7 和 / 或 38,39,40,41，42,43,44,45,46,47,48,49,50,51，52， 53, 54, 55, 56, 57, 58和/或59。在一實(shí)施方式中，重組宿主細(xì)胞含有包含與SEQ ID NO: 1 具有至少21 %同一性的氨基酸序列（例如，選自在本文表4中列出的序列，諸如SEQ ID NO: 1 和 16, 17, 18, 19, 20, 21，22, 23, 24, 25 和 26)的多肽和包含與 SEQ ID NO: 2 具有至少 21%同一性的氨基酸序列（例如，選自在本文表5中列出的序列，諸如SEQ ID N0:2和 27, 28, 29, 30, 31，32, 33, 34, 35, 36和37)的多肽。重組宿主細(xì)胞可包含多肽，所述多肽包含 SEQ ID NO: 1和2二者和/或與SEQ ID NO: 1具有至少21 %同一性的氨基酸序列（例如， 表 4 中序列之任一個(gè)，諸如 SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19, 20, 21，22, 23, 24, 25 或 26)和與 SEQ ID NO: 2具有至少17%同一性的氨基酸序列（例如，表5中序列之任一個(gè)，諸如SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31，32, 33, 34, 35, 36或37)。該多肽可為，例如，融合蛋白。在例示實(shí)施方 式中，重組宿主細(xì)胞可包含下列多核苷酸序列之一種或更多：SEQ ID N0:3,4,5,6和/或7。 在其他實(shí)施方式中，重組宿主細(xì)胞可包含下列多核苷酸序列之一種或更多：SEQ ID N0:38， 39,40,41，42,43,44,45,46,47,48,49,50,51，52,53,54,55,56,57,58 和 / 或 59。
[0029] 在本發(fā)明的第3方面，適合的多核苷酸可優(yōu)選由同源重組導(dǎo)入細(xì)胞和/或可形成 包含下列多核苷酸序列中的至少一種的表達(dá)載體的部分=SEQ ID N0:3,4,5,6和/或7(或 SEQ ID N0:38, 39, 40, 41，42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,49,50,51，52,53,54,55,56,57,58和/或 59)或其補(bǔ)體。對(duì)于該表達(dá)載體的構(gòu)建適合的載體為本領(lǐng)域所熟知（例在以上提及）和可 被排列而包含與一個(gè)或更多表達(dá)控制序列可操作地連接的多核苷酸，以對(duì)于在宿主細(xì)胞， 上述例如微-生物中表達(dá)需要的酶有用。
[0030] 在一些實(shí)施方式中，貫穿此說明書提及的重組體或遺傳修飾的宿主細(xì)胞可為任何 微-生物或微 -生物的部分，所述微-生物選自：真菌（諸如糖酵母屬（Saccharomyces) 的成員），原生生物，藻，細(xì)菌（包括藍(lán)細(xì)菌）和古細(xì)菌。細(xì)菌可包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或 革蘭氏陰性細(xì)菌和/或可選自埃希氏菌屬（Escherichia),芽孢桿菌屬（Bacillus),乳桿 菌屬（Lactobacillus)，紅球菌屬（Rhodococcus)，假單胞菌屬（Pseudomonas)或鏈霉菌 屬（Streptomyces)。藍(lán)細(xì)菌可選自：細(xì)長(zhǎng)聚球藻（Synechococcus elongatus)，集胞藻 屬（Synechocystis)，海洋原綠球藻（Prochlorococcus marinus)，多變魚渥藻（Anabaena variabilis)，點(diǎn)形念珠藻（Nostoc punctiforme)，青紫粘桿菌（Gloeobacter violaceus)， 藍(lán)絲菌屬（Cyanothece sp.)和聚球藻屬（Synechococcus sp·)。選擇適合的微-生物（或 其他表達(dá)系統(tǒng)）在本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)能力之內(nèi)。特別適合的微-生物包括大腸埃希氏 菌（Escherichia coli)和啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae)，例如。
[0031] 在本發(fā)明的相關(guān)的實(shí)施方式中，F(xiàn)dcl和/或Padl多肽或這些的功能變體或片段 可在非-微-生物細(xì)胞諸如培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可 包括CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞，VERO細(xì)胞，BHK細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，Cvl細(xì)胞，MDCK細(xì)胞，293細(xì)胞， 3T3細(xì)胞和/或PC12細(xì)胞中表達(dá)。
[0032] 重組宿主細(xì)胞或微-生物可用于由標(biāo)準(zhǔn)方法表達(dá)上述酶和獲得的無細(xì)胞的提取 物，用于在根據(jù)本發(fā)明的第1方面的方法中使用。
[0033] 本發(fā)明也包括本文定義的多肽的變體。如本文所用，〃變體〃是指氨基酸序列， 自其所來源的堿基序列，序列之內(nèi)的一個(gè)或更多氨基酸被其他氨基酸代替而不同的多肽。 例如，SEQ ID NO: 1的變體與SEQ ID NO: 1具有類似或同一阿魏酸脫羧酶特征，由上述 NC-IUBMB的酶命名法分類進(jìn)酶類EC 4. 1.1.-。其可具有與SEQ ID N0:1具有至少約21%同 一性，例如，至少約 25 %，30 %，35 %，40 %，45 %，50 %，55 %，60 %，65 %，70 %，75 %，80 %， 85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或約 100% 同一性的氨基酸 序列。適合的變體可包括表4中所列的蛋白，特定例是SEQ ID NO: 16?26之任何。變體 是變體序列與本文所述的具有非-變體氨基酸序列的酶具有類似或，優(yōu)選，同一功能酶活 性特征的功能變體（且此是貫穿此說明書使用的術(shù)語(yǔ)"功能變體"的含義）。以上提及的 與SEQ ID NO: 1類似或同一阿魏酸脫羧酶特征可例如，通過比較肉桂酸由變體（在SEQ ID NO: 2的存在下）轉(zhuǎn)變?yōu)楸揭蚁┑乃俣扰c在SEQ ID NO: 2的存在下由SEQ ID NO: 1達(dá)到的速 度來評(píng)定。對(duì)于功能變體，此速度可相同于或類似于，例如至少約60 %，70 %，80 %，90 %或 95%由SEQ ID N0:1(啤酒糖酵母（S. cerevisiae)Fdcl蛋白）達(dá)到的速度。
[0034] 同樣，SEQ ID NO: 2的變體與SEQ ID NO: 2具有類似或同一苯丙烯酸脫羧酶特征， 及分類進(jìn)酶類EC 4. 1.1.-。其可具有與SEQ ID N0:2具有至少約17%同一性，例如，至少 約 20%，25%，30%，35%，37%，40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%， 90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或約 100% 同一性的氨基酸序列。 適合的變體可包括表5中所列的蛋白，特定例是SEQ ID NO: 27?37之任何。再次，SEQ ID N0:2的變體的活性可通過測(cè)量肉桂酸由變體（在SEQ ID N0:1的存在下）轉(zhuǎn)變?yōu)楸揭蚁┑?速度與在SEQ ID NO: 1的存在下由SEQ ID NO:2達(dá)到的速度來測(cè)定。
[0035] 當(dāng)氨基酸被具有廣義地類似性質(zhì)的不同氨基酸取代時(shí)，氨基酸取代可被認(rèn)為是" 保守性的"。當(dāng)氨基酸被不同類型的氨基酸取代時(shí)是非-保守性取代。
[0036] "保守性取代"是指氨基酸被相同的類的另一氨基酸取代，其中類定義如下：
[0037]
【權(quán)利要求】
1. 制備單-不飽和的烯烴的方法，其包括使脂肪族單-不飽和的羧酸與下列多肽接 觸： 包含與SEQ ID NO: 1具有至少21%序列同一性的氨基酸序列的Fdcl多肽、和 包含與SEQ ID N0:2具有至少17%序列同一性的氨基酸序列的Padl多肽。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述脂肪族單-不飽和的羧酸是包含僅一個(gè)不飽和的 碳-碳鍵的脂肪族不飽和的羧酸，該一個(gè)不飽和的碳-碳鍵是碳-碳雙鍵。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述烯烴是末端烯烴。
4. 任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述烯烴是直鏈或支鏈烯烴。
5. 任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述烯烴包括4個(gè)和30個(gè)之間的碳原子。
6. 任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述Fdcl多肽具有與SEQ ID NO: 1具有至少50% 序列同一性，及優(yōu)選至少55 %序列同一性的氨基酸序列。
7. 任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述Padl多肽具有與SEQ ID NO: 2具有至少60% 序列同一'I"生，及優(yōu)選至少65 %序列同一'丨生的氨基酸序列。
8. 任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述Fdcl多肽和/或Padl多肽由重組宿主細(xì)胞表 達(dá)。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述Fdcl多肽具有選自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO: 1 和16?26和表4中所列的那些序列。
10. 權(quán)利要求8或9的方法，其中所述Padl多肽具有選自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:2和27?37和表5中所列的那些序列。
11. 權(quán)利要求8?10之任一項(xiàng)的方法，其中所述重組宿主細(xì)胞是被遺傳修飾為表達(dá)至 少一種選自下列的外源多肽的遺傳修飾的微生物：SEQ ID N0:l、2和16?37和表4和5中 所列的那些序列。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述宿主細(xì)胞包含至少一種編碼下列氨基酸序列之一個(gè) 或更多的核酸序列：SEQ ID NO: 1、2和16?37和表4和5中所列的那些序列。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述核酸序列選自下列之一個(gè)或更多：SEQ ID N0:3?7 和38?59。
14. 權(quán)利要求8?13之任一項(xiàng)的方法，其中所述重組宿主細(xì)胞是酵母或細(xì)菌。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述重組宿主細(xì)胞是酵母啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae)或重組宿主細(xì)胞是細(xì)菌大腸埃希氏菌（Escherichia coli)。
16. 任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述單-不飽和的烯烴隨后與一種或更多另外的 組分組合，及在生物燃料和/或生物化學(xué)品中使用。
17. 生產(chǎn)烷烴的方法，其包括： 使脂肪族單-不飽和的羧酸與下列多肽接觸而產(chǎn)生單-不飽和的烯烴： 包含與SEQ ID NO: 1具有至少21%序列同一性的氨基酸序列的Fdcl多肽、和 包含與SEQ ID N0:2具有至少17%序列同一性的氨基酸序列的Padl多肽； 任選地分離單-不飽和的烯烴；以及 氫化和/或氫異構(gòu)化所述，任選地分離的，單-不飽和的烯烴而產(chǎn)生烷烴。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中所述烷烴隨后與一種或更多另外的組分組合，及在生物 燃料和/或生物化學(xué)品中使用。
【文檔編號(hào)】C12P5/02GK104364382SQ201380029427
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2013年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月11日
【發(fā)明者】D·萊斯, A·J·莫菲, D·A·帕克, K·A·P·派因, N·S·斯克魯頓 申請(qǐng)人:國(guó)際殼牌研究有限公司