啤酒花品種的識(shí)別方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及利用由品種間不同的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性構(gòu)成的識(shí)別標(biāo)記的用于識(shí)別啤酒花品種的方法以及該識(shí)別標(biāo)記的制備方法。本發(fā)明還提供用于該識(shí)別啤酒花品種的方法中使用的引物或探針及包含該識(shí)別標(biāo)記的區(qū)域的核酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供檢測(cè)啤酒花試樣中不同品種混入的方法。
【專利說明】啤酒花品種的識(shí)別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及利用了由品種間不同的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性構(gòu)成的識(shí)別標(biāo)記的 用于識(shí)別啤酒花品種的方法以及該識(shí)別標(biāo)記的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 啤酒花（學(xué)名：Humulus lupulus)為屬于大麻科的雌雄異株的蔓性（攀援）植物。 雌株具有稱為"球花"的像松果形的花的結(jié)構(gòu)，該球花為啤酒的原料。未受精的球花中，有 稱為蛇麻素的黃色顆粒，其為啤酒獨(dú)特的香味、清爽苦味的來源。啤酒花具有賦予啤酒略帶 苦味、爽快的香味、提高泡持性、使啤酒的光澤（色澤）良好、抑制雜菌繁殖的作用，是啤酒 釀造中不可缺少的原料之一。
[0003] 啤酒花在以德國、美國為首的捷克、英國、法國、中國、斯洛文尼亞、南非、澳大利 亞、新西蘭、日本等國栽培，其栽培品種也多種多樣。啤酒花品種中有香型啤酒花和苦型啤 酒花。香型啤酒花為賦予芬芳香味和溫和苦味的啤酒花，苦型啤酒花為賦予具有收斂性的 苦味的啤酒花。如此，啤酒花因各品種的香味、味道不同，所以在釀造高品質(zhì)的啤酒時(shí)，篩選 符合目的的啤酒花品種非常重要。而且，為了穩(wěn)定維持其品質(zhì)，準(zhǔn)確檢查所訂購的原料啤酒 花是否能正確進(jìn)貨非常重要。至今為止，根據(jù)供貨商所提供的品質(zhì)保證書、蛇麻素中所含有 的α酸等成分含量的不同、球花外觀上的差異進(jìn)行確認(rèn)。但是，在日本，通常是購入將啤酒 花的球花干燥、粉碎、壓縮整形制成顆粒狀的啤酒花來用于啤酒釀造。因此，很難從球花外 觀上的特征來識(shí)別品種。此外，從球花中得到的苦味成分、精油成分等的化學(xué)成分也易受環(huán) 境因素的影響，還有因品種關(guān)系而顯示近似值的啤酒花等，所以作為識(shí)別的指標(biāo)具有局限 性。
[0004] 另一方面，近年來，開發(fā)了一些應(yīng)用基因工程的品種識(shí)別方法。這些方法通過檢 測(cè)品種間堿基序列的不同，即檢測(cè)多態(tài)性來進(jìn)行品種識(shí)別。啤酒花中，國際公開公報(bào)（W0 1997/005281)中公開了以下方法，通過RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)法尋找品種間不同的 DNA區(qū)域，設(shè)計(jì)可擴(kuò)增該區(qū)域的引物，通過使用該引物的PCR來擴(kuò)增多態(tài)性區(qū)域，通過分析 擴(kuò)增片段的有無或其大小的差異來識(shí)別啤酒花品種，此外，日本特開平11 一 103895公報(bào)中 公開了以下方法，通過使用高濃度的氯化鋰，從啤酒花中高效提取?純化適合PCR的基因 組DNA，相對(duì)于該基因組DNA使用隨機(jī)引物、STS (序列標(biāo)簽位點(diǎn)）標(biāo)記的引物等的引物進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增可識(shí)別啤酒花品種的DNA，通過擴(kuò)增DNA的有無來判別啤酒花品種，而且，日本特 開2006 - 34142公報(bào)中還公開了以下方法，通過使用設(shè)計(jì)成可擴(kuò)增包含品種間多態(tài)性的微 衛(wèi)星區(qū)域的引物來進(jìn)行PCR，擴(kuò)增微衛(wèi)星DNA，通過分析擴(kuò)增DNA片段長度的差異來識(shí)別品 種。
[0005] 通過利用啤酒花基因組上的多態(tài)性來識(shí)別啤酒花品種的上述方法雖不受啤酒花 的栽培環(huán)境、收獲時(shí)期或保存方法的影響，為可準(zhǔn)確識(shí)別啤酒花品種的有效手段，但因這些 方法均需從PCR擴(kuò)增的有無或大小的差異來進(jìn)行識(shí)別，所以易受酶反應(yīng)、電泳、凝膠染色等 條件不統(tǒng)一的影響，在再現(xiàn)性上存在問題。即難于區(qū)別是因 PCR、染色的不良好而未出現(xiàn)條 帶，或還是因?yàn)樵揪臀磾U(kuò)增，所以，具有錯(cuò)誤判斷結(jié)果的危險(xiǎn)性。此外，上述方法因是通過 毛細(xì)管電泳及激光的DNA片段檢測(cè)、通過凝膠電泳的試樣染色的檢測(cè)等，所以，即使可特定 作為被測(cè)物的啤酒花品種、甚至可推測(cè)有無不同品種混入，但還是難于推斷或特定混入品 種、分析混入品種的混入比例。而且，由于被測(cè)物的劣化、損傷等使DNA發(fā)生碎片化時(shí)，會(huì)降 低分析精度，有錯(cuò)誤判斷結(jié)果的危險(xiǎn)性。
[0006] 作為極為有用且容易利用的多態(tài)性標(biāo)記，單核苷酸多態(tài)性（以下也稱為"SNP"。） 受人注目。SNP(single nucleotide polymorphism)是基于1個(gè)堿基的不同的堿基序列的 多態(tài)性。因 SNP不受反應(yīng)條件不統(tǒng)一的影響，所以，無疑似結(jié)果，易判斷，且SNP數(shù)據(jù)可轉(zhuǎn)換 為（〇，1)的數(shù)字信號(hào)來進(jìn)行信息處理，所以，容易進(jìn)行樣品處理和數(shù)據(jù)分析的自動(dòng)化，可使 用龐大的SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行各種各樣的分析。此外，用設(shè)計(jì)具有各種各樣長度的非特異性Tail 的引物等的方法，可一次性進(jìn)行大量的SNP分析。
[0007] 但是，啤酒花具有二倍體的20條（雙鏈為10對(duì)）染色體，基因組大小為約27? 30億堿基對(duì)（2.7?3GB)，非常龐大，與結(jié)構(gòu)基因的關(guān)聯(lián)性尚不明確。因此，還未實(shí)施過從 基因組分析的結(jié)果中找出可進(jìn)行多品種識(shí)別程度的充分?jǐn)?shù)量的啤酒花品種間SNP的工作， 至今為止，將SNP用作多態(tài)性標(biāo)記的啤酒花品種的識(shí)別方法還不為人所知。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0009] 專利文獻(xiàn)
[0010] 專利文獻(xiàn)1國際公開公報(bào)第W01997/005281號(hào)公報(bào)
[0011] 專利文獻(xiàn)2日本特開平11 一 103895號(hào)公報(bào)
[0012] 專利文獻(xiàn)3日本特開2006 - 34142號(hào)公報(bào)
【發(fā)明內(nèi)容】
[0013] 本發(fā)明提供利用由品種間的單核苷酸多態(tài)性組成的識(shí)別標(biāo)記的用于識(shí)別啤酒花 品種的方法以及該識(shí)別標(biāo)記的制備方法。
[0014] 強(qiáng)烈希望開發(fā)出如下啤酒花品種的識(shí)別方法，即在確認(rèn)訂購的原料啤酒花是否為 所訂貨的品種且是否混入了不同品種時(shí)，可不受酶反應(yīng)、電泳、凝膠染色等的條件不統(tǒng)一的 影響而準(zhǔn)確特定品種，檢測(cè)有無不同品種混入，不僅如此，在不同品種混入時(shí)，還可推斷或 特定混入品種，可分析其混入比例。
[0015] 本
【發(fā)明者】為解決上述課題，對(duì)基于DNA分析的啤酒花品種的識(shí)別方法進(jìn)行了深入 研究。對(duì)于DNA分析，至今為止已報(bào)道了 SSR(簡單重復(fù)序列）法、RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA)法、RFLP(限制性片段長度多態(tài)性）法、AFLP(擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）法等、基于PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、其限制性內(nèi)切酶片段的大小的不同、有無的方法。但是，這些方法大多操作繁雜， 且易受酶反應(yīng)、電泳、凝膠染色等的條件不統(tǒng)一的影響，再現(xiàn)性令人擔(dān)心，而且在其他品種 混入時(shí)其檢測(cè)大多較為困難。我們?cè)诮陙硎褂冒l(fā)達(dá)的超高速DNA序列分析技術(shù)獲得大量 的數(shù)據(jù)，更加廣泛且高效地搜索SNP，將這些作為識(shí)別標(biāo)記，開發(fā)出了準(zhǔn)確且簡便地進(jìn)行啤 酒花品種識(shí)別的方法。
[0016] 即方式之一中，本發(fā)明可以為以下內(nèi)容。
[0017] (1) 一種方法，其為啤酒花品種的識(shí)別方法，其特征在于，所述方法包含以下工 序：
[0018] ⑴擴(kuò)增來自被測(cè)物啤酒花的DNA中的包含品種識(shí)別區(qū)域的DNA片段的工序，該品 種識(shí)別區(qū)域包含由啤酒花品種間不同的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP)構(gòu)成的識(shí)別標(biāo)記；
[0019] (ii)鑒定上述工序（i)中擴(kuò)增的DNA片段中的單核苷酸多態(tài)性的基因型的工序；
[0020] (iii)將上述工序（ii)所鑒定的被測(cè)物啤酒花DNA中的品種識(shí)別區(qū)域中的單核苷 酸多態(tài)性的基因型與已知啤酒花品種DNA所對(duì)應(yīng)的區(qū)域中的單核苷酸多態(tài)性的基因型進(jìn) 行對(duì)比，分析該區(qū)域中的單核苷酸多態(tài)性的基因型在被測(cè)物啤酒花和已知啤酒花品種之間 為一致或不一致的工序；
[0021] (iv)根據(jù)上述工序（iii)的分析結(jié)果，特定被測(cè)物啤酒花品種的工序。
[0022] (2)根據(jù)⑴中所述的方法，其特征在于，工序（ii)如下進(jìn)行，鑒定工序⑴中擴(kuò) 增的DNA片段中的品種識(shí)別區(qū)域的堿基序列，且
[0023] 工序（iii)如下進(jìn)行，將工序（ii)所鑒定的被測(cè)物啤酒花DNA中的品種識(shí)別區(qū)域 的堿基序列與已知啤酒花品種DNA所對(duì)應(yīng)的區(qū)域的堿基序列進(jìn)行對(duì)比，分析該區(qū)域中的識(shí) 別標(biāo)記在被測(cè)物啤酒花和已知啤酒花品種之間為一致或不一致。
[0024] (3)根據(jù)⑴中所述的方法，其特征在于，工序（ii)為如下工序，通過使工序⑴ 中擴(kuò)增的DNA片段與檢測(cè)啤酒花品種間不同的單核苷酸多態(tài)性的探針及/或引物接觸，而 鑒定單核苷酸多態(tài)性的基因型。
[0025] (4)根據(jù)⑴?⑶中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，品種識(shí)別區(qū)域?yàn)榘ㄟ^ 包含以下工序的方法而制備的識(shí)別標(biāo)記的區(qū)域：
[0026] (a)使用2個(gè)以上不同品種的啤酒花，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的工序；
[0027] (b)基于由上述工序（a)的結(jié)果得到的DNA片段的堿基序列，對(duì)各品種進(jìn)行組裝的 工序；
[0028] (C)將由上述工序（b)的結(jié)果得到的重疊群及/或單拷貝進(jìn)行品種間對(duì)比，進(jìn)行品 種間不同的單核苷酸多態(tài)性（SNP)的搜索的工序；
[0029] (d)根據(jù)上述工序（c)的SNP搜索的結(jié)果，選擇包含SNP的區(qū)域，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增該 區(qū)域的引物的工序；
[0030] (e)通過使用上述工序（d)中設(shè)計(jì)的引物，以從啤酒花中提取的DNA為模板，確認(rèn) 上述工序（d)中選擇的區(qū)域可擴(kuò)增，確定該堿基序列，從而確定識(shí)別區(qū)域和可擴(kuò)增該識(shí)別 區(qū)域的引物的工序；
[0031] (f)使用上述工序（e)中確定的引物，以從識(shí)別對(duì)象品種的啤酒花中提取的DNA為 模板擴(kuò)增識(shí)別區(qū)域，確定識(shí)別區(qū)域的堿基序列的工序；及
[0032] (g)將上述工序（f)中確定的識(shí)別區(qū)域的堿基序列進(jìn)行品種間對(duì)比，確定由用于 識(shí)別識(shí)別對(duì)象品種所必需的SNP的組合構(gòu)成的識(shí)別標(biāo)記的工序。
[0033] (5)根據(jù)⑴?⑶中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，品種識(shí)別區(qū)域?yàn)榘x自 序列號(hào)9、序列號(hào)10、序列號(hào)11、序列號(hào)12、序列號(hào)13、序列號(hào)14及序列號(hào)15中的1個(gè)以上 的堿基序列的一部分或全部，且還包含圖1、圖2、圖3、圖4及圖6中特定的單核苷酸多態(tài)性 或插入缺失部分的至少一個(gè)的區(qū)域。
[0034] (6)根據(jù)⑴?⑶中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，品種識(shí)別區(qū)域?yàn)檫x自包含 序列號(hào)9表不的喊基序列的區(qū)域、包含序列號(hào)10表不的喊基序列的區(qū)域、包含序列號(hào)11表 不的喊基序列的區(qū)域、包含序列號(hào)12表不的喊基序列的區(qū)域、包含序列號(hào)13表不的喊基序 列的區(qū)域、包含序列號(hào)14表示的堿基序列的區(qū)域及包含序列號(hào)15表示的堿基序列的區(qū)域 中的1個(gè)以上的區(qū)域。
[0035] (7)根據(jù)⑴?⑶中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，品種識(shí)別區(qū)域?yàn)椴粌H包含 以下：包含序列號(hào)9表不的喊基序列的區(qū)域、包含序列號(hào)10表不的喊基序列的區(qū)域，及包含 序列號(hào)11表示的堿基序列的區(qū)域的3種區(qū)域，且包含以下：序列號(hào)12及/或序列號(hào)14表 示的堿基序列的一部分或全部，且還包含圖4中特定的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失部分的 至少1個(gè)的區(qū)域。
[0036] (8)根據(jù)⑴?⑶中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，工序⑴通過使用以下引 物對(duì)的PCR反應(yīng)來進(jìn)行，為選自序列號(hào)1及序列號(hào)2的組合、序列號(hào)3及序列號(hào)4的組合、 序列號(hào)5及序列號(hào)6的組合及序列號(hào)7及序列號(hào)8的組合的引物對(duì)。
[0037] (9)根據(jù)⑴?⑶中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，工序⑴通過使用以下引 物對(duì)的PCR反應(yīng)來進(jìn)行：不僅為以下：序列號(hào)1及序列號(hào)2的組合、序列號(hào)3及序列號(hào)4的 組合以及序列號(hào)5及序列號(hào)6的組合的3種引物對(duì)，還為序列號(hào)7及序列號(hào)8的組合的引 物對(duì)。
[0038] (10) -種方法，其為由啤酒花品種間不同的單核苷酸多態(tài)性的組合構(gòu)成的識(shí)別標(biāo) 記的制備方法，其特征在于，所述方法包含以下工序：
[0039] (a)使用2個(gè)以上不同品種的啤酒花，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的工序；
[0040] (b)基于由上述工序（a)的結(jié)果得到的DNA片段的堿基序列，對(duì)各品種進(jìn)行組裝的 工序；
[0041] (C)將由上述工序（b)的結(jié)果得到的重疊群及/或單拷貝進(jìn)行品種間對(duì)比，進(jìn)行品 種間不同的單核苷酸多態(tài)性（SNP)的搜索的工序；
[0042] (d)根據(jù)上述工序（c)的SNP搜索的結(jié)果，選擇包含SNP的區(qū)域，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增該 區(qū)域的引物的工序；
[0043] (e)通過使用上述工序（d)中設(shè)計(jì)的引物，以從啤酒花中提取的DNA為模板，確認(rèn) 上述工序（d)中選擇的區(qū)域可擴(kuò)增，確定該堿基序列，從而確定識(shí)別區(qū)域和可擴(kuò)增該識(shí)別 區(qū)域的引物的工序；
[0044] (f)使用上述工序（e)中確定的引物，以從識(shí)別對(duì)象品種的啤酒花中提取的DNA為 模板擴(kuò)增識(shí)別區(qū)域，確定識(shí)別區(qū)域的堿基序列的工序；及
[0045] (g)將上述工序（f)中確定的識(shí)別區(qū)域的堿基序列進(jìn)行品種間對(duì)比，確定由用于 識(shí)別識(shí)別對(duì)象品種所必需的SNP的組合構(gòu)成的識(shí)別標(biāo)記的工序。
[0046] (11) -種核酸，其特征在于，包含通過（10)中所述的方法制備的識(shí)別標(biāo)記的至少 一部分。
[0047] (12) -種核酸，其特征在于，該核酸包含啤酒花的品種識(shí)別區(qū)域，而且，包含選自 序列號(hào)9、序列號(hào)10、序列號(hào)11、序列號(hào)12、序列號(hào)13、序列號(hào)14及序列號(hào)15中的1個(gè)以上 的堿基序列的一部分或全部，且還包含圖1、圖2、圖3、圖4及圖6中特定的單核苷酸多態(tài)性 或插入缺失部分的至少一個(gè)。
[0048] (13) -種引物，其特征在于，設(shè)計(jì)為可擴(kuò)增（11)或（12)中所述的核酸。
[0049] (14) 一種引物，其特征在于，由序列號(hào)1?8中任一個(gè)所記載的堿基序列組成，在 此，該引物用于啤酒花的品種識(shí)別。
[0050] (15) -種探針，其特征在于，用于檢測(cè)通過（10)中所述的方法鑒定的品種識(shí)別區(qū) 域中的啤酒花品種間不同的單核苷酸多態(tài)性。
[0051] (16) -種探針，其特征在于，可在選自序列號(hào)9、序列號(hào)10、序列號(hào)11、序列號(hào)12、 序列號(hào)13、序列號(hào)14及序列號(hào)15中的1個(gè)以上的堿基序列中，檢測(cè)圖1、圖2、圖3、圖4或 圖6中特定的位置中的至少1個(gè)單核苷酸多態(tài)性或插入缺失位點(diǎn)，且由此檢測(cè)啤酒花品種 間不同的單核苷酸多態(tài)性。
[0052] (17) -種方法，其為檢測(cè)啤酒花試樣中的不同品種混入的方法，所述方法包含以 下工序：
[0053] (i)擴(kuò)增從被測(cè)物啤酒花試樣中提取的DNA中的包含品種識(shí)別區(qū)域的DNA片段的 工序，該品種識(shí)別區(qū)域包含由啤酒花品種間不同的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP)構(gòu)成的 識(shí)別標(biāo)記；
[0054] (ii)分析上述工序⑴中擴(kuò)增的DNA片段中的品種識(shí)別區(qū)域的堿基序列，得到測(cè) 序數(shù)據(jù)的工序；
[0055] (iii)將上述工序（ii)中得到的測(cè)序數(shù)據(jù)中的構(gòu)成識(shí)別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性 位點(diǎn)的信息與正常品所對(duì)應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息進(jìn)行對(duì)比的工序；及
[0056] (iv)確定啤酒花試樣中有無不同品種混入的工序，在此，上述工序（ii)中得到的 測(cè)序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息與正常品所對(duì)應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息一 致時(shí)，判斷為無不同品種混入，或上述工序（ii)中得到的測(cè)序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn) 的信息與正常品所對(duì)應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息不一致時(shí)，判斷為有不同品種混入。
[0057] (18)根據(jù)（17)中所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包含接在工序（iv)后的以下工 序：
[0058] (V)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的測(cè)序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的 信息與正常品所對(duì)應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息不一致時(shí)，由上述工序（ii)中得到的 測(cè)序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)中出現(xiàn)的來自正常品以外的信息特定其堿基的工序；及
[0059] (vi)將上述工序（V)中特定的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的與正常品不同的堿基與識(shí) 別標(biāo)記對(duì)照，從而推斷或特定混入品種的工序。
[0060] (19)根據(jù)（17)中所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包含接在工序（iv)后的以下工 序：
[0061] (V)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的測(cè)序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的 信息與正常品所對(duì)應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息不一致時(shí)，由上述工序（ii)中得到的 測(cè)序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)中出現(xiàn)的來自正常品以外的信息特定其堿基，并求出混入 比例的工序；及
[0062] (vi)將上述工序（V)中特定的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的與正常品不同的堿基與識(shí) 別標(biāo)記對(duì)照，從而推斷或特定混入品種和其混入比例的工序。
[0063] (20)根據(jù)⑴?（9)中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，工序（iii)中包含有無 19?25堿基的插入序列的分析。
[0064] 通過可利用由品種間的單核苷酸多態(tài)性組成的識(shí)別標(biāo)記來識(shí)別啤酒花品種，在確 認(rèn)訂購的原料啤酒花是否為所訂貨的品種且是否混入了不同品種時(shí)，可準(zhǔn)確特定作為被測(cè) 物的啤酒花品種及檢測(cè)有無不同品種混入。而且不同品種混入時(shí)，不僅可分析有無混入，還 可推斷或特定混入品種，分析其混入比例
[0065] 此外，使用通過本發(fā)明的方法制備的構(gòu)成識(shí)別標(biāo)記的堿基的信息，可制備用于識(shí) 別目標(biāo)品種的引物、探針，通過使用利用該引物、探針的實(shí)時(shí)PCR法、新一代測(cè)序儀進(jìn)行分 析，可期待能對(duì)不同品種的混入比例進(jìn)行定量分析。
[0066] 由此，可穩(wěn)定供給目標(biāo)高品質(zhì)的啤酒。此外，即使被測(cè)物劣化、損傷時(shí)，也可識(shí)別品 種。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0067] 圖1為表示14品種啤酒花的Al區(qū)域中的SNP分析結(jié)果的圖及堿基的編碼表。SNP 的位置表示從Al區(qū)域的共有序列（序列號(hào)9)的5'側(cè)開始數(shù)的SNP的位置。分析后的SNP 為24處。用于分析的14種啤酒花被分為9類型（type)的雙體型。
[0068] 圖2為表示14品種啤酒花的Bl區(qū)域中的SNP分析結(jié)果的圖。SNP的位置表示從 Bl區(qū)域的共有序列（序列號(hào)10)的5'側(cè)開始數(shù)的SNP的位置。分析后的SNP為10處。用 于分析的14種啤酒花被分為7類型的雙體型。有關(guān)A、G、C、T以外的堿基的標(biāo)記參照?qǐng)D1 的編碼表。
[0069] 圖3為表示14品種啤酒花的Cl區(qū)域中的SNP分析結(jié)果的圖。SNP的位置表示從 Cl區(qū)域的共有序列（序列號(hào)11)的5'側(cè)開始數(shù)的SNP的位置。分析后的SNP為29處，其 中，序列號(hào)11的第129?134位的堿基為插入缺失（indel)部分。用于分析的14種啤酒 花被分為3類型的雙體型。有關(guān)A、G、C、T以外的堿基的標(biāo)記參照?qǐng)D1的編碼表。
[0070] 圖4為表不珍珠（Perle)及北釀（Northern Brewer)的Al - 2 - L區(qū)域及Al - 2 - R區(qū)域中的SNP分析結(jié)果的圖。SNP的位置表示分別從Al - 2 - L區(qū)域的2品種共有 序列（序列號(hào)12)及Al - 2 - R區(qū)域的2品種共有序列（序列號(hào)14)的5'側(cè)開始數(shù)的 SNP的位置。對(duì)Al - 2 - L區(qū)域進(jìn)行分析后的SNP為21處，其中，序列號(hào)12的第186? 194及第399位的堿基為插入缺失（indel)部分。對(duì)Al - 2 - R區(qū)域進(jìn)行分析后的SNP 為67處，其中，序列號(hào)14的第57?59及第65位的堿基為插入缺失（indel)部分。珍珠 (Perle)及北釀（Northern Brewer)表不不同的雙體型。
[0071] 圖5為歸納用于品種識(shí)別試驗(yàn)的啤酒花品種和識(shí)別標(biāo)記的雙體型的表。
[0072] 圖6為表示斯拉德克（Slddek)、斯派爾特（Spalter)、珍珠（Perle)、泰特南 (Tettnang)及北釀（Northern Brewer)的 Al - 2 - L 區(qū)域及 Al - 2 - R 區(qū)域中的 SNP 分 析結(jié)果的圖。SNP的位置表示分別從Al - 2 - L區(qū)域的5品種共有序列（序列號(hào)13)及 Al - 2 - R區(qū)域的5品種共有序列（序列號(hào)15)的5'側(cè)開始數(shù)的SNP的位置。對(duì)Al - 2 - L區(qū)域進(jìn)行分析后的SNP為23處，其中，序列號(hào)13的第12、第183?191及第396位 的堿基為插入缺失（indel)部分。對(duì)Al - 2 - R區(qū)域進(jìn)行分析后的SNP為28處，其中，序 列號(hào)15的第437位的堿基為插入缺失（indel)部分。表示用于分析的5個(gè)品種啤酒花的 Al - 2 - L區(qū)域中的各個(gè)不同的雙體型，在Al - 2 - R區(qū)域中被分為4類型的雙體型。
[0073] 圖7為歸納斯拉德克（Slddek)、斯派爾特（Spalter)、珍珠（Perle)、泰特南 (Tettnang)及北釀（Northern Brewer)的Al - 2 - L區(qū)域（序列號(hào)13)中識(shí)別標(biāo)記的雙 體型的表。
[0074] 圖8為表示分析薩茲（Saaz)及普萊米特（Premiant)的混合試樣的Al區(qū)域堿基 序列的結(jié)果的電泳圖。Al區(qū)域的堿基號(hào)根據(jù)序列號(hào)9中的堿基號(hào)。
【具體實(shí)施方式】
[0075] 以下具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些。本發(fā)明涉及利用由品種間不同的至 少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP)構(gòu)成的識(shí)別標(biāo)記的用于識(shí)別啤酒花品種的方法、該識(shí)別標(biāo)記 的制備方法、檢測(cè)利用該識(shí)別標(biāo)記的啤酒花試樣中不同品種混入的方法、該識(shí)別標(biāo)記、設(shè)計(jì) 為可擴(kuò)增具有該識(shí)別標(biāo)記的區(qū)域的品種識(shí)別引物及用于檢測(cè)該識(shí)別標(biāo)記的品種識(shí)別探針。
[0076] <本發(fā)明的概要>
[0077] 本申請(qǐng)涉及如下發(fā)明，其特征在于，使用由品種間不同的至少1個(gè)SNP構(gòu)成的識(shí)別 標(biāo)記來識(shí)別啤酒花品種。具體而言，提取被測(cè)物啤酒花的DNA，分析具有與由SNP組成的識(shí) 別標(biāo)記區(qū)域的堿基序列對(duì)應(yīng)的堿基序列中的識(shí)別標(biāo)記所對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的堿基是否與識(shí)別標(biāo)記 的堿基一致，為一致時(shí)，即將被測(cè)物啤酒花品種特定為識(shí)別標(biāo)記的品種。
[0078] < 定義 >
[0079] 本說明書中只要不特別定義，與本發(fā)明相關(guān)使用的科學(xué)用語及技術(shù)用語具有本領(lǐng) 域技術(shù)人員通常理解的意思。
[0080] 本說明書中，"識(shí)別標(biāo)記"是指用于識(shí)別啤酒花品種的指標(biāo)，由品種間不同的1以上 的單核苷酸多態(tài)性構(gòu)成。為使本發(fā)明的識(shí)別標(biāo)記在識(shí)別對(duì)象品種間不重復(fù)，將品種與識(shí)別 標(biāo)記以一一對(duì)應(yīng)的方式來確定，但也可根據(jù)作為識(shí)別對(duì)象的品種的數(shù)量、種類來變更構(gòu)成 識(shí)別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性。例如，需要識(shí)別的品種僅為2品種時(shí)，使用由1個(gè)單核苷酸多 態(tài)性構(gòu)成的識(shí)別標(biāo)記即足夠，需要識(shí)別的品種為多個(gè)的情況下，通過多個(gè)單核苷酸多態(tài)性 的組合（根據(jù)情況為多個(gè)識(shí)別區(qū)域的多個(gè)單核苷酸多態(tài)性的組合）以不重復(fù)的方式來確定 識(shí)別標(biāo)記。識(shí)別標(biāo)記原則上以不重復(fù)的方式來確定，但根據(jù)識(shí)別的目的，也可將識(shí)別標(biāo)記重 復(fù)的多個(gè)品種（即具有相同識(shí)別標(biāo)記的多個(gè)品種）看成1個(gè)組，與1個(gè)識(shí)別標(biāo)記對(duì)應(yīng)而使 用。
[0081] 本說明書中，"識(shí)別區(qū)域"是指包含來自啤酒花DNA中的識(shí)別標(biāo)記的區(qū)域。識(shí)別區(qū) 域不限于1個(gè)區(qū)域，也可為多個(gè)區(qū)域。而且，識(shí)別區(qū)域中，有時(shí)將品種識(shí)別時(shí)被測(cè)物的DNA 片段進(jìn)行擴(kuò)增的核酸區(qū)域特別記為"品種識(shí)別區(qū)域"。品種識(shí)別區(qū)域也可為與識(shí)別區(qū)域相同 的區(qū)域，還可根據(jù)品種識(shí)別的目的而另行設(shè)定。此外，品種識(shí)別區(qū)域不限于1個(gè)區(qū)域，也可 為多個(gè)區(qū)域。
[0082] <識(shí)別標(biāo)記的制各方法>
[0083] 本申請(qǐng)?zhí)峁┲苽溆糜谧R(shí)別啤酒花品種的識(shí)別標(biāo)記的方法。
[0084] 在方式之一中，本發(fā)明的識(shí)別標(biāo)記如下制備，使用2個(gè)以上不同品種的啤酒花，進(jìn) 行轉(zhuǎn)錄組分析，選定單核苷酸多態(tài)性（SNP)較多存在的區(qū)域，設(shè)計(jì)引物，確定識(shí)別區(qū)域和可 擴(kuò)增該識(shí)別區(qū)域的引物。而后通過從識(shí)別對(duì)象的品種中提取DNA、使用所述引物、擴(kuò)增識(shí)別 區(qū)域、確定堿基序列、進(jìn)行品種間對(duì)比，通過確定由識(shí)別對(duì)象品種的識(shí)別中必需的至少1個(gè) SNP構(gòu)成的識(shí)別標(biāo)記而來制備。
[0085] 具體而言，制備用于識(shí)別啤酒花品種的識(shí)別標(biāo)記的方法也可包含以下工序：
[0086] (a)使用2個(gè)以上不同品種的啤酒花，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的工序；
[0087] (b)基于由上述工序（a)的結(jié)果得到的DNA片段的堿基序列，對(duì)各品種進(jìn)行組裝的 工序；
[0088] (C)將由上述工序（b)的結(jié)果得到的重疊群及/或單拷貝進(jìn)行品種間對(duì)比，進(jìn)行品 種間不同的單核苷酸多態(tài)性（SNP)的搜索的工序；
[0089] (d)根據(jù)上述工序（c)的SNP搜索的結(jié)果，選擇包含SNP的區(qū)域，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增該 區(qū)域的引物的工序；
[0090] (e)通過使用上述工序（d)中設(shè)計(jì)的引物，以從啤酒花中提取的DNA為模板，確認(rèn) 上述工序（d)中選擇的區(qū)域可擴(kuò)增，確定該堿基序列，從而確定識(shí)別區(qū)域和可擴(kuò)增該識(shí)別 區(qū)域的引物的工序；
[0091] (f)使用上述工序（e)中確定的引物，以從識(shí)別對(duì)象品種的啤酒花中提取的DNA為 模板擴(kuò)增識(shí)別區(qū)域，確定識(shí)別區(qū)域的堿基序列的工序；及
[0092] (g)將上述工序（f)中確定的識(shí)別區(qū)域的堿基序列進(jìn)行品種間對(duì)比，確定由用于 識(shí)別識(shí)別對(duì)象品種所必需的SNP的組合構(gòu)成的識(shí)別標(biāo)記的工序。但本發(fā)明不限于這些方 法，也可將通常已知的其他方法適當(dāng)改變使用。
[0093] 對(duì)上述工序（a)?（g)如下進(jìn)行說明。
[0094] (a)彳申用啤酒花分析轉(zhuǎn)錄纟的工序
[0095] 為了搜索識(shí)別標(biāo)記中應(yīng)含有的候選SNP，首先，使用2個(gè)以上不同品種的啤酒花， 分別對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。
[0096] 轉(zhuǎn)錄組（transcriptome)是指某些特定狀態(tài)的組織、細(xì)胞中存在的總mRNA(或?yàn)?初級(jí)轉(zhuǎn)錄物、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（transcripts))的總體。
[0097] 以下將本發(fā)明中轉(zhuǎn)錄組分析的順序作為一例進(jìn)行說明，但不特別限定于此。首先， 分別從啤酒花的多個(gè)品種的組織中粗提取總RNA，純化總RNA中的總mRNA (poly (A)+RNA)， 進(jìn)行以該mRNA為模板的cDNA的合成。因所得到的cDNA文庫中表達(dá)量多的和少的混合存 在，所以，需校正表達(dá)量的不同（均一化），進(jìn)而進(jìn)行以大小（size)為基準(zhǔn)的純化。而后，使 用超高速DNA序列分析裝置進(jìn)行cDNA的測(cè)序分析。
[0098] 作為提取上述總RNA的啤酒花的組織，適合使用構(gòu)成芽、葉、莖、球花的各種組織， 但不特別限定于此。此外，從啤酒花植株上采集上述組織時(shí)，啤酒花植株的栽培方法、其生 長發(fā)育階段等也無特別限定。而且，作為啤酒花的組織，可為鮮組織，也可為干燥組織，還可 以加工成例如顆粒狀。但是，因 RNA易分解，所以，優(yōu)選立刻使用從啤酒花植株上采集的新 鮮組織，且作為富含RNA的組織，優(yōu)選使用嫩葉。此外，在采集分析用試樣時(shí)，優(yōu)選采取極力 防止RNA分解的措施，努力防止污染。
[0099] 此外，轉(zhuǎn)錄組分析中使用的啤酒花品種可使用2品種以上的不同品種，所使用的 品種、數(shù)量可根據(jù)目的不同來選擇。另外，為了檢測(cè)更大量的SNP，優(yōu)選使用3品種以上的不 同品種。此外，優(yōu)選從識(shí)別對(duì)象品種中選擇使用。
[0100] 啤酒花組織中的總RNA的提取?CDNA的測(cè)序分析的轉(zhuǎn)錄組分析的各步驟可采用 通常采用的方法進(jìn)行。
[01 01 ] (b)對(duì)各品種講_彳丁組裝的下序
[0102] 基于如上所述各品種中用轉(zhuǎn)錄組分析而明確的DNA片段（cDNA)的堿基序列，對(duì)各 品種進(jìn)行序列組裝。序列組裝是指由短的DNA片段再構(gòu)建原本的長的堿基序列。例如基于 由工序（a)的結(jié)果得到的DNA片段的堿基序列，對(duì)是否具有相互重疊的堿基序列進(jìn)行聚類 分析（Clustering)，尋找聚類后的一系列DNA片段中的重疊部分進(jìn)行拼接（組裝），而得到 一個(gè)序列。將如此組裝的序列總稱為"重疊群（contig) "，此外，將重疊群形成時(shí)未附加的 單端（single read)總稱為"單拷貝（singlet)"。通過序列組裝的重疊群的制備可通過通 常采用的方法進(jìn)行。
[0103] (c)檢測(cè)品種間對(duì)應(yīng)的喊某的不同的下序
[0104] 如上所述，基于對(duì)各品種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析而明確的DNA片段的堿基序列，以相互 重疊的序列部分為基礎(chǔ)進(jìn)行組裝而制備重疊群。使用由此得到的重疊群序列及/或單拷貝 序列，檢測(cè)品種間對(duì)應(yīng)的喊基的不同（在此為SNP)。
[0105] 檢測(cè)2品種以上品種間對(duì)應(yīng)的堿基的不同時(shí)，首先是將其中1品種作為參照序列 (參考序列）來選擇。而后，將所選擇的品種的重疊群及/或單拷貝（優(yōu)選為重疊群，更優(yōu) 選為重疊群及單拷貝）指定為參考序列，以此為基準(zhǔn)，將其他品種的單端以是否具有共有 部分的方式分別作圖（mapping)。進(jìn)而，從在分析軟件上開發(fā)的組裝信息中推斷出已作圖 (mapping)的單端成為構(gòu)成要素的重疊群。將如此得到的參考序列與其他品種的重疊群及 /或單拷貝進(jìn)行比對(duì)，以檢測(cè)SNP。另外，因僅1品種的參考序列中有忽略SNP的可能性，所 以，優(yōu)選將其他品種分別作為參考序列，與上述同樣進(jìn)行作圖（mapping)、比對(duì)而檢測(cè)SNP， 將這些結(jié)果綜合為SNP數(shù)據(jù)。通過將各種不同品種作為參考序列來檢測(cè)SNP，可檢測(cè)更多的 SNP，可選擇更適合作為識(shí)別標(biāo)記的SNP。且在檢測(cè)出本發(fā)明中3品種以上的品種間對(duì)應(yīng)的 喊基的不同時(shí)，在品種間對(duì)應(yīng)的喊基中，至少任意2品種間不同時(shí)，即可視為SNP。在檢測(cè)品 種間對(duì)應(yīng)的堿基的不同時(shí)，可用通常采用的方法進(jìn)行。上述方法為一例，但不限定于此。作 為其他方法，也可通過使用1品種的重疊群序列進(jìn)行BLAST搜索，來檢測(cè)不同。
[0106] (d)詵擇含有SNP的區(qū)域設(shè)計(jì)引物的工序
[0107] 如此，由使用重疊群序列及/或單拷貝序列檢測(cè)SNP的結(jié)果，選擇可用于識(shí)別的 SNP存在的區(qū)域。以多個(gè)品種的識(shí)別為目的時(shí)，希望選擇SNP大量存在的區(qū)域。更具體而 言，可例示從分析的容易度出發(fā)，優(yōu)選純合子（2倍體的各個(gè)雙鏈間堿基序列為一致）中的 SNP存在的區(qū)域，且選擇單位重疊群中SNP數(shù)多的區(qū)域，但無特別限定。
[0108] 其后，設(shè)計(jì)可擴(kuò)增該區(qū)域的引物。引物的設(shè)計(jì)可通過通常采用的方法進(jìn)行。
[0109] (e)確定識(shí)別區(qū)域和可擴(kuò)增該識(shí)別區(qū)域的引物的工序
[0110] 因如上所述設(shè)計(jì)的引物是基于從cDNA文庫中制備的重疊群序列或單拷貝序列而 設(shè)計(jì)的引物，所以，是否良好擴(kuò)增包含啟動(dòng)子區(qū)域、內(nèi)含子的基因組的DNA還不得而知。因 此，需要使用從啤酒花中提取的基因組DNA來確認(rèn)擴(kuò)增。此外，即使在擴(kuò)增時(shí)也要確認(rèn)插入 缺失（indel)、微衛(wèi)星的有無、目標(biāo)SNP的存在，所以，需要進(jìn)行根據(jù)雙脫氧測(cè)序法（SANGER) 等的堿基序列的確認(rèn)。因此，使用工序（d)中設(shè)計(jì)的引物，以啤酒花品種（優(yōu)選為工序（a) 中使用的啤酒花品種）的顆粒、干燥球花等中提取的基因組DNA為模板，擴(kuò)增含有SNP的區(qū) 域并進(jìn)行測(cè)序。由此，確認(rèn)能以適當(dāng)大小進(jìn)行擴(kuò)增及與基于所述轉(zhuǎn)錄組分析的堿基序列進(jìn) 行對(duì)比可適用于品種識(shí)別，以確定可用于識(shí)別的區(qū)域（識(shí)別區(qū)域）和可擴(kuò)增該區(qū)域的引物。 由于內(nèi)含子的存在等無法擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增大小、堿基序列中有不合適、不良好時(shí)，要進(jìn)行選擇 區(qū)域的再探討、引物的再設(shè)計(jì)。
[0111] 另外，用于制備識(shí)別標(biāo)記的識(shí)別區(qū)域不限于1個(gè)區(qū)域，也可選擇多個(gè)區(qū)域。通過選 擇多個(gè)區(qū)域可識(shí)別更多的品種。
[0112] 此外，識(shí)別區(qū)域中也可包含插入缺失（indel)部分。從廣義上講，單核苷酸多態(tài)性 (SNP)中也可包含插入缺失（indel)，本發(fā)明中，作為構(gòu)成識(shí)別標(biāo)記的SNP，也可利用插入缺 失（indel)部分。
[0113] (f)確定識(shí)別區(qū)域的堿某序列的工序及（g)確定識(shí)別對(duì)象品種的識(shí)別標(biāo)記的工序
[0114] 使用工序（e)中確定的可擴(kuò)增識(shí)別區(qū)域的引物，以從識(shí)別對(duì)象品種中提取的基因 組DNA為模板分別擴(kuò)增識(shí)別區(qū)域。
[0115] 本說明書中，識(shí)別對(duì)象品種是指作為識(shí)別的對(duì)象而選擇的啤酒花品種，包含2個(gè) 以上不同品種。啤酒花只要是被分類為學(xué)名Humulus lupulus的植物，無特別限定。例如 可列舉以德國、美國、捷克、英國、法國、中國、斯洛文尼亞、南非、澳大利亞、新西蘭、日本等 為原產(chǎn)國的啤酒花。
[0116] 作為歐洲原產(chǎn)的啤酒花的例子，可列舉薩茲（Saaz)、斯拉德克（Slddek)、普萊米 特（Premiant)、傳統(tǒng)（Tradition)、斯派爾特（Spalter)、斯派爾特精選（Spalter Select)、 珍珠（Perle)、泰特南（Tettnang)、金釀（Brewer，s Gold)、北釀（Northern Brewer)、馬格 努門（Magnum)、海格立斯（Herkules)、德國努格特（German Nugget)、陶若斯（Taurus)、阿 德米瑞（Admiral)、奧羅拉（Aurora)、赫斯布魯克（Hersbrucker)、哈拉道默克（Hallertau Merkur)、Hallertau Mittelfrueh、塔格特（Target)等，但不限于這些。
[0117] 作為美國原產(chǎn)的啤酒花的例子，可列舉阿瑪里洛（Amarillo)、卡斯卡特 (Cascade)、世紀(jì)（Centennial)、奇努克（Chinook)、克雷斯特（Cluster)、哥倫布 (Columbus)、水晶（Crystal)、富格爾（Fuggle)、格林納（Galena)、哥爾?。℅olding)、 Horizon、自由（Liberty)、胡德峰（Mount Hood)、努格特（Nugget)、Santiam、斯特林 (Sterling)、薩米特（Summit)、超級(jí)格林納（Super Galena)、泰特楠捷（Tettnanger)、戰(zhàn)斧 (Tomahawk)、烏爾特拉（Ultra)、威廉麥特（Willamette)、宙斯（Zeus)等，但不限于這些。
[0118] 根據(jù)識(shí)別的目的不同，可自由設(shè)定對(duì)象品種的種類、數(shù)量。例如，可選擇與栽培地 鄰近的品種等，可根據(jù)其各個(gè)時(shí)期的目的不同而選擇對(duì)象品種。
[0119] 作為方式之一，識(shí)別對(duì)象品種為實(shí)施例1的表4中所示的以德國及捷克為原產(chǎn)國 的14種啤酒花。
[0120] 對(duì)于此種根據(jù)目的而選擇的識(shí)別對(duì)象品種，進(jìn)行擴(kuò)增DNA片段的測(cè)序，確定堿基 序列。
[0121] 對(duì)工序（f)中確定的各識(shí)別對(duì)象品種的識(shí)別區(qū)域的堿基序列進(jìn)行比對(duì)，提取SNP 部分。為使識(shí)別對(duì)象品種間不重復(fù)，以品種和識(shí)別標(biāo)記為一一對(duì)應(yīng)的方式來組合所提取的 SNP，確定識(shí)別標(biāo)記。
[0122] 在此，上述工序（f)及（g)可根據(jù)以下（1)?（11)中所示的順序進(jìn)行。
[0123] (1)啤酒花的獲得
[0124] 本發(fā)明中使用的"DNA"可通過從啤酒花的組織中提取DNA來得到。作為啤酒花的 組織，適合使用構(gòu)成芽、葉、莖、球花的各種組織，但不特別限定于此。此外，從啤酒花植株上 采集上述組織時(shí)，對(duì)啤酒花植株的栽培方法、其生長發(fā)育階段等也無特別限定。而且作為啤 酒花的組織，可為鮮組織，也可為干燥組織，此外，也可為例如加工成顆粒狀的啤酒花的組 織。
[0125] (2) DNA 的提取
[0126] DNA的提取可使用CTAB(十六燒基三甲基溴化銨：Cetyltrimethyl ammonium bromide)法、市售試劑盒的Qiagen DNeasy Tissue Kit(QIAGEN公司）、IS0PLANT II(日本 基因公司）等本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法提取。從操作性和經(jīng)濟(jì)性的方面考慮，優(yōu)選CTAB 法。
[0127] (3) DNA片段的擴(kuò)增
[0128] 通過PCR法擴(kuò)增如上所述提取的DNA。本發(fā)明中使用的PCR法無特別限定，不僅包 含公知的PCR法，還包含各種改良方法。以下為其中一例。
[0129] 即除了引物對(duì)、模板DNA以外，混合Tris - HCl、KCl、MgCl2、各dNTP、TaqDNA聚合 酶等的試劑類，作為PCR反應(yīng)液。PCR的1個(gè)循環(huán)由熱變性、退火、通過DNA聚合酶的DNA鏈 的延伸（合成）反應(yīng)的3步組成。各步反應(yīng)各有不同，根據(jù)情況需要同一反應(yīng)溫度和反應(yīng) 時(shí)間，這些可通過應(yīng)擴(kuò)增的DNA區(qū)域的堿基序列、其長度等適當(dāng)確定。此種操作可使用市售 的基因擴(kuò)增儀進(jìn)行。
[0130] 作為本發(fā)明中使用的引物，使用所述工序（e)中確定的可擴(kuò)增識(shí)別區(qū)域的引物 對(duì)。例如可使用本
【發(fā)明者】確定的引物對(duì)（Al - 3L/A1 - 3R(序列號(hào)1及2))、引物對(duì)（BI - 1L/B1 - 1R(序列號(hào)3及4))、引物對(duì)（Cl 一 1L/C1 一 1R(序列號(hào)5及6))及/或引物對(duì) (Al - 2 - 1L/A1 - 2 - 1R(序列號(hào) 7 及 8))。
[0131] (4)通過PCR的擴(kuò)增的確認(rèn)
[0132] 作為PCR結(jié)果（PCR產(chǎn)物）的評(píng)價(jià)方法，使用可鑒定特定DNA片段的任意方法，例如 電泳、凝膠過濾、雜交，確認(rèn)目的大小的DNA片段進(jìn)行了擴(kuò)增。例如，分別確認(rèn)出使用引物對(duì) (Al - 3L/A1 - 3R(序列號(hào)1及2))時(shí)，擴(kuò)增到大小為651堿基長；使用引物對(duì)（BI - IL/ Bl - 1R(序列號(hào)3及4))時(shí)，擴(kuò)增到大小為729堿基長；使用引物對(duì)（Cl 一 1L/C1 一 IR(序 列號(hào)5及6))時(shí)，擴(kuò)增到大小為646堿基長；使用引物對(duì)（Al - 2 - 1L/A1 - 2 - IR(序列 號(hào)7及8))時(shí)，擴(kuò)增到大小為約1500堿基長。
[0133] (5) PCR產(chǎn)物的純化
[0134] 所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物因作為循環(huán)測(cè)序反應(yīng)的模板使用，所以與剩余的引物等的在反 應(yīng)中使用的成分分離。該純化例如可使用市售的QIAquick PCR Purific ation Kit (QIAGEN 公司），根據(jù)其產(chǎn)品中附帶的實(shí)驗(yàn)方法來進(jìn)行。
[0135] (6)循環(huán)測(cè)序反應(yīng)及測(cè)序產(chǎn)物的純化
[0136] 因進(jìn)行如上所述純化的PCR產(chǎn)物的測(cè)序，所以，以其為模板，進(jìn)行循環(huán)測(cè)序反應(yīng)。 該方法為如下方法，與PCR法類似，使用基因擴(kuò)增儀，重復(fù)進(jìn)行熱變性、退火、通過DNA聚合 酶的DNA鏈的延伸反應(yīng)的3步，使用其中任意1種引物，在用各個(gè)堿基不同的4種熒光色素 標(biāo)記的終止子存在下，合成長度不同的各種單鏈DNA。循環(huán)測(cè)序的方法例如可使用市售的 BigDye Terminator vl. ICycle Sequencing Kit (Life Technologies) 〇 具體而言，可根據(jù) 該試劑盒的日語版實(shí)驗(yàn)方法（P. 22 "單鏈DNA、雙鏈DNA的循環(huán)測(cè)序"、p. 25 "GeneAmpPCR System9700, 9600, 2700, 2400 中的循環(huán)測(cè)序"及 ρ· 38 - 40 "旋轉(zhuǎn)柱（和 Spin Plate)中的 純化法"）實(shí)施。且所使用的引物的堿基序列可與通過目的DNA片段的PCR的擴(kuò)增中使用的 堿基序列相同。即在根據(jù)需要用滅菌蒸餾水稀釋PCR產(chǎn)物的純化液后加入規(guī)定的物質(zhì)，制 備循環(huán)測(cè)序反應(yīng)液。將其加入PCR用微型離心管中，安裝在PCR裝置上，進(jìn)行變性（例如， 96°C、1分鐘）后，重復(fù)進(jìn)行例如25次變性（例如，96°C、10秒）、退火（例如，50°C、5秒）、 鏈延伸（例如，60°C、4分鐘）的反應(yīng)。另外，反應(yīng)終止后，不立即取出樣品時(shí)，可降低樣品模 塊的溫度來保持。
[0137] 其后，從上述中得到的反應(yīng)液中，純化測(cè)序產(chǎn)物、即單鏈DNA的混合液，制備以 后的用于測(cè)序儀的試樣。作為該方法的一例，可列舉使用CENTRISEP Spin C〇lumn(Life Technologies)的方法，根據(jù)附帶的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作，得到目的試樣。
[0138] (7) DNA片段的測(cè)序
[0139] 對(duì)于用上述Dye Terminator法得到的測(cè)序產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。作為方法，通常使用電 泳法，作為一例，可列舉使用ABI PRISM 310Genetic Analyzer進(jìn)行電泳，利用標(biāo)記中使用 的熒光物質(zhì)在各個(gè)堿基中的不同，通過激光熒光檢測(cè)儀依次確定堿基序列。
[0140] (8)堿基序列的分析
[0141] 分析所確定的堿基序列，得到測(cè)序數(shù)據(jù)。對(duì)照分別得到的測(cè)序數(shù)據(jù)，確定正確的堿 基序列。
[0142] (9)堿基序列的比對(duì)
[0143] 對(duì)如上所述得到的識(shí)別對(duì)象品種的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)。
[0144] (10)全部識(shí)別對(duì)象品種的上述堿基序列中保守的堿基除外
[0145] 如此，比對(duì)的結(jié)果，從上述堿基序列中，將由全部識(shí)別對(duì)象品種的上述堿基序列中 保守的1個(gè)或其以上的堿基形成的位點(diǎn)除外。如此，通過將全部的上述堿基序列中保守的 堿基位點(diǎn)除外，可明確地確認(rèn)單核苷酸多態(tài)性的存在，而且，在之后的工序中，可容易地進(jìn) 行基于單核苷酸多態(tài)性的識(shí)別標(biāo)記的確定。
[0146] 具體而言，從通過比對(duì)而得到的數(shù)據(jù)中，提取全部識(shí)別對(duì)象品種的堿基序列中堿 基保守的位點(diǎn)。"堿基保守"是指所得到的比對(duì)數(shù)據(jù)的縱列在全部識(shí)別對(duì)象品種的堿基序列 中均為相同的堿基。將所提取的位點(diǎn)全部除外。將所保守的位點(diǎn)全部除外的理由如下。
[0147] 即對(duì)比啤酒花品種的堿基序列時(shí)，認(rèn)為大部分的堿基在全部識(shí)別對(duì)象品種中共有 存在。但是，本發(fā)明的特征在于，著眼于除去與全部識(shí)別對(duì)象品種共有的部分的單核苷酸多 態(tài)性的部分，基于該單核苷酸多態(tài)性與品種具有相關(guān)性，從而制備識(shí)別標(biāo)記。
[0148] 提取的方法只要是可提取全部識(shí)別對(duì)象品種的堿基序列中保守的堿基的方法，也 可使用目測(cè)、機(jī)械操作等的任何方法。
[0149] (11)識(shí)別標(biāo)記的確定
[0150] 使用進(jìn)行了上述除外后剩余的SNP，確定識(shí)別標(biāo)記。如前所述，為使本發(fā)明的識(shí)別 標(biāo)記在識(shí)別對(duì)象品種間不重復(fù)，以一一對(duì)應(yīng)的方式確定品種和識(shí)別標(biāo)記。另外，識(shí)別標(biāo)記每 次均需根據(jù)其使用目的、即作為識(shí)別對(duì)象的品種的數(shù)量、種類，而確定構(gòu)成識(shí)別標(biāo)記的SNP。 例如，僅識(shí)別特定的2品種時(shí)，可選擇1處可進(jìn)行該2品種識(shí)別的SNP來作為識(shí)別標(biāo)記。此 夕卜，需要識(shí)別多個(gè)品種時(shí)，可通過將多處的SNP (根據(jù)情況，將多個(gè)識(shí)別區(qū)域的多處的SNP) 組合，確定識(shí)別標(biāo)記，使其在該品種間不重復(fù)。
[0151] 例如，將以下實(shí)施例1中記載的如表4中所示的14品種啤酒花作為識(shí)別對(duì)象時(shí)， 該14品種中，Al區(qū)域（序列號(hào)9)中存在的24處SNP可分為9類型，Bl區(qū)域（序列號(hào)10) 中存在的10處SNP可分為7類型，Cl區(qū)域（序列號(hào)11)中存在的29處SNP(其中，相當(dāng)于 序列號(hào)11的第129?134位的堿基的6處為插入缺失部分）可分為3類型，通過將這些組 合，可將14品種分為13類型。即對(duì)14品種中的12品種，可通過Al區(qū)域、Bl區(qū)域、Cl區(qū)域 中分別存在的SNP，使識(shí)別標(biāo)記和品種一一對(duì)應(yīng)。而且因剩余的1類型適合類似的2品種， 所以，作為識(shí)別這些類似的2品種的區(qū)域，可通過Al - 2 - L區(qū)域（序列號(hào)12)中存在的 21處SNP (其中，10處為插入缺失部分）及Al - 2 - R區(qū)域（序列號(hào)14)中存在的67處 SNP(其中，4處為插入缺失部分）的任一個(gè)，使識(shí)別標(biāo)記與2品種對(duì)應(yīng)。如此，在識(shí)別上述 的14品種時(shí)，可將Al區(qū)域的24處SNP、Bl區(qū)域的10處SNP、Cl區(qū)域的29處SNP (其中，6 處為插入缺失部分）以及Al - 2 - L區(qū)域及Al - 2 - R區(qū)域中的任意1個(gè)的SNP的合計(jì) 64處SNP確定為識(shí)別標(biāo)記。此外，例如從上述14品種中選擇一些品種作為識(shí)別對(duì)象時(shí)，也 可從上述64處SNP中選擇用于識(shí)別該識(shí)別對(duì)象品種所必需的SNP，而確定為識(shí)別標(biāo)記。
[0152] 此外，例如僅將上述類似2品種作為識(shí)別對(duì)象品種時(shí)，可將Al - 2 - L區(qū)域及 Al - 2 - R區(qū)域中的任一個(gè)SNP確定為識(shí)別標(biāo)記。而且，將如以下實(shí)施例1中記載的表4 中所示的14品種啤酒花中的斯拉德克（Slddek)、斯派爾特（Spalter)、珍珠（Perle)、泰特 南（Tettnang)及北釀（Northern Brewer)的5品種作為識(shí)別對(duì)象品種時(shí)，可將Al - 2 - L區(qū)域（序列號(hào)13)中存在的23處SNP(其中，11處為插入缺失部分）確定為識(shí)別標(biāo)記。
[0153] 上述記載中，作為識(shí)別對(duì)象品種，將實(shí)施例1的表4中所示的以德國及捷克為原產(chǎn) 國的14種啤酒花的情況作為例子來進(jìn)行說明，包含以美國為原產(chǎn)國的品種的更多品種的 識(shí)別方式希望參照實(shí)施例5。如表20中所示，方框中所包圍的22堿基（堿基號(hào)64 - 85) 被認(rèn)定是普萊米特（Premiant)和薩米特（Summit),相對(duì)于此，宙斯（Zeus)中不存在其插 入序列。如此，插入序列的有無也可作為品種識(shí)別的要素。插入序列的長度無特別限制，例 如為19?25堿基。而且，該插入序列中也確認(rèn)有SNP (堿基號(hào)64位、67位、75位），也可 將插入序列中的SNP作為識(shí)別標(biāo)記。作為進(jìn)一步的識(shí)別要素，該插入序列之后直到堿基號(hào) 141的（CA)或（TA)的重復(fù)序列的長度也成為識(shí)別要素。例如，與普萊米特（Premiant)和 宙斯（Zeus)相比，薩米特（Summit)為12堿基長的結(jié)構(gòu)。
[0154] 此外，如上所述，將表4中所示的14品種啤酒花作為識(shí)別對(duì)象時(shí)，Bl區(qū)域（序列號(hào) 10) 中存在的10處SNP可分為7類型，包含以美國為原產(chǎn)國的品種（例如格林納（Galena)) 時(shí)，第245?248位的堿基也為SNP，成為識(shí)別標(biāo)記。
[0155] 而且，如上所述，將表4中所示的14品種啤酒花作為識(shí)別對(duì)象時(shí)，Cl區(qū)域（序列號(hào) 11) 中存在的29處SNP可分為3類型，包含以美國為原產(chǎn)國的品種（例如格林納（Galena)) 時(shí)，第 76 ?80、93、136、138、163、165、245、313、321、373、376、435、438位的堿基也5咿，成為 識(shí)別標(biāo)記。
[0156] 在其他方式中，本發(fā)明的識(shí)別標(biāo)記也可使用來自2個(gè)以上不同品種啤酒花的基因 組DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA來制備。優(yōu)選為也可使用來自2個(gè)以上不同品種啤酒花的 基因組DNA。
[0157] 在制備用于使用基因組DNA、線粒體DNA或葉綠體DNA識(shí)別啤酒花品種的識(shí)別標(biāo)記 時(shí)，制備識(shí)別標(biāo)記的方法也可包含以下工序：
[0158] (a-Ι)從2個(gè)以上不同品種的啤酒花的組織中提取基因組DNA、線粒體DNA或葉綠 體DNA的工序；
[0159] (a-2)隨機(jī)切割由上述工序（a-Ι)的結(jié)果得到的DNA，篩選適合尺寸的片段的工 序；
[0160] (a-3)確定上述工序（a-2)中得到的DNA片段的堿基序列的工序；
[0161] (b)基于由上述工序（a-3)的結(jié)果得到的DNA片段的堿基序列，對(duì)各品種進(jìn)行組裝 的工序；
[0162] (C)將由上述工序（b)的結(jié)果得到的重疊群及/或單拷貝進(jìn)行品種間對(duì)比，進(jìn)行品 種間不同的單核苷酸多態(tài)性（SNP)的搜索的工序；
[0163] ⑷根據(jù)上述工序（c)的SNP搜索的結(jié)果，選擇包含SNP的識(shí)別區(qū)域，設(shè)計(jì)用于擴(kuò) 增該區(qū)域的引物的工序；
[0164] (f)使用上述工序（d)中設(shè)計(jì)的引物，以從識(shí)別對(duì)象品種的啤酒花中提取的DNA為 模板擴(kuò)增識(shí)別區(qū)域，確定識(shí)別區(qū)域的堿基序列的工序；及
[0165] (g)將上述工序（f)中確定的識(shí)別區(qū)域的堿基序列進(jìn)行品種間對(duì)比，確定由用于 識(shí)別識(shí)別對(duì)象品種所必需的SNP的組合構(gòu)成的識(shí)別標(biāo)記的工序。
[0166] 工序（a-Ι)?（a-3)可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。特別是為了得到大 量的DNA片段，在確定DNA片段的堿基序列時(shí)，優(yōu)選使用超高速DNA序列分析裝置。
[0167] 工序（b)?（d)及（f)?（g)可用作為上述記載的方式的通過轉(zhuǎn)錄組分析的方法 中說明的方法來進(jìn)行。
[0168] 此外，通過轉(zhuǎn)錄組分析的方法中，基于不含內(nèi)含子的mRNA搜索翻譯區(qū)域或5'或3' 非翻譯區(qū)域的SNP，相對(duì)于此，在使用基因組DNA、線粒體DNA或葉綠體DNA的方式中，進(jìn)行 包含內(nèi)含子的DNA的全部區(qū)域的SNP搜索。由此，使用基因組DNA、線粒體DNA或葉綠體DNA 時(shí)，可省略如下工序（e)，相當(dāng)于在通過轉(zhuǎn)錄組分析的識(shí)別標(biāo)記的制備方法中，確認(rèn)通過用 于擴(kuò)增含有SNP的區(qū)域而設(shè)計(jì)的引物的該區(qū)域的擴(kuò)增的工序。
[0169] 使用上述轉(zhuǎn)錄組的方式及使用基因組DNA(核基因組）、線粒體DNA或葉綠體DNA 的方式中，首先，用以下2步方法制備識(shí)別標(biāo)記，即在開始使用2種以上不同的啤酒花品種 進(jìn)行SNP搜索而確定識(shí)別區(qū)域和引物后，使用全部識(shí)別對(duì)象品種，對(duì)比識(shí)別區(qū)域的堿基序 列，確定適合識(shí)別標(biāo)記的SNP，但也可從最初開始，使用全部識(shí)別對(duì)象品種進(jìn)行SNP搜索而 確定識(shí)別區(qū)域和引物后，對(duì)比該識(shí)別區(qū)域的堿基序列，確定適合識(shí)別標(biāo)記的SNP。即在上述 記載的2個(gè)方式中，從開始即使用全部識(shí)別對(duì)象品種時(shí)，不需要確定識(shí)別對(duì)象品種的識(shí)別 區(qū)域的喊基序列的工序（f)。
[0170] <啤酒花品種的識(shí)別方法>
[0171] 本發(fā)明還提供用于識(shí)別啤酒花品種的方法。具體而言，啤酒花品種的識(shí)別方法還 可包含以下工序：
[0172] ⑴擴(kuò)增來自被測(cè)物啤酒花的DNA中的包含品種識(shí)別區(qū)域的DNA片段的工序，該品 種識(shí)別區(qū)域包含由啤酒花品種間不同的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP)構(gòu)成的識(shí)別標(biāo)記；
[0173] (ii)鑒定上述工序（i)中擴(kuò)增的DNA片段中的單核苷酸多態(tài)性的基因型的工序；
[0174] (iii)將上述工序（ii)所鑒定的被測(cè)物啤酒花DNA中的品種識(shí)別區(qū)域中的單核苷 酸多態(tài)性的基因型與已知啤酒花品種DNA所對(duì)應(yīng)的區(qū)域中的單核苷酸多態(tài)性的基因型進(jìn) 行對(duì)比，分析該區(qū)域中的單核苷酸多態(tài)性的基因型在被測(cè)物啤酒花和已知啤酒花品種之間 為一致或不一致的工序；
[0175] (iv)根據(jù)上述工序（iii)的分析結(jié)果，特定被測(cè)物啤酒花品種的工序。
[0176] 被測(cè)物啤酒花只要是被分類為學(xué)名Humulus lupulus的植物，無特別限定。例如， 可列舉識(shí)別標(biāo)記的制備方法的項(xiàng)目中列舉的歐洲原產(chǎn)的啤酒花、美國原產(chǎn)的啤酒花，但不 限于這些。
[0177] 作為方式之一，被測(cè)物啤酒花為實(shí)施例1的表4中所示的14種啤酒花。
[0178] 對(duì)上述的工序（i)?（iv)，如下進(jìn)行說明。
[0179] (i)擴(kuò)增何含品種識(shí)別區(qū)域的DNA片段的工序
[0180] 包含品種識(shí)別區(qū)域的DNA片段：從需要識(shí)別品種的被測(cè)物啤酒花中提取基因組 DNA，以其為模板，使用可擴(kuò)增具有作為基準(zhǔn)的識(shí)別標(biāo)記的區(qū)域的品種識(shí)別引物擴(kuò)增包含品 種識(shí)別區(qū)域的DNA片段。基因組DNA的提取及DNA片段的擴(kuò)增例如可根據(jù)上述<識(shí)別標(biāo)記 的制備方法>中的"（f)確定識(shí)別區(qū)域的堿基序列的工序及（g)確定識(shí)別對(duì)象品種的識(shí)別 標(biāo)記的工序"的項(xiàng)目中（1)啤酒花的獲得?（3)DNA片段的擴(kuò)增中所記載的方法或按照該方 法來進(jìn)行。
[0181] 品種識(shí)別區(qū)域?yàn)榘ㄟ^上述識(shí)別標(biāo)記的制備方法制備的識(shí)別標(biāo)記的區(qū)域。構(gòu)成 識(shí)別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性存在于多個(gè)區(qū)域中時(shí)，品種識(shí)別區(qū)域也可為該多個(gè)區(qū)域。此外， 存在多個(gè)構(gòu)成識(shí)別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性時(shí)，品種識(shí)別區(qū)域可以為存在這些全部的1個(gè)區(qū) 域，還可以為具有多個(gè)存在至少1個(gè)單核苷酸多態(tài)性的區(qū)域。作為具體的品種識(shí)別區(qū)域，可 列舉包含
[0182] 序列號(hào) 9(A1 區(qū)域）的堿基序列的第 74、77、87、103、116、118、121、125、134、135、 148、192、195、197、199、203、204、226、230、235、306、316、330、532 位；
[0183] 序列號(hào) 10(B1 區(qū)域）的堿基序列的第 178、204、227、234、370、426、439、547、562、 624 位；
[0184] 序列號(hào) 11 (Cl 區(qū)域）的堿基序列的第 3、13、17、87、88、129、130、131、132、133、134、 254、331、356、375、380、396、398、399、421、460、474、475、476、477、480、481、500、547 位（第 129?134位為插入缺失（indel)部分）；序列號(hào)12 (Al - 2 - L區(qū)域）的堿基序列的第34、 101、118、124、164、168、171、186、187、188、189、190、191、192、193、194、392、398、399、459、 502位（第186?194及第399位為插入缺失（indel)部分）；
[0185] 序列號(hào) 13 (Al - 2 -L 區(qū)域）的堿基序列的第 2、12、31、98、115、121、161、165、168、 183、184、185、186、187、188、189、190、191、389、395、396、456、499位（第12、183?191及第 396位為插入缺失（indel)部分）；
[0186] 序列號(hào) 14(A1 - 2 - R區(qū)域）的堿基序列的第 1、2、3、5、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、20、21、25、26、27、28、29、30、31、33、35、36、37、38、41、42、43、44、46、47、48、50、51、 56、57、58、59、63、65、68、72、78、79、84、86、88、90、92、118、153、154、191、205、206、226、228、 2 33、254、289、315、 35〇、392、4〇5 位（第 57 ?59 及第 65 位為插入缺失（indel)部分）；
[0187] 序列號(hào) 15(A1 - 2 - R 區(qū)域）的堿基序列的第 2、6、12、13、18、20、22、24、26、36、 52、87、88、125、139、140、160、162、167、188、223、249、273、284、326、339、421、437位（第437 位的插入缺失（indel)部分）；
[0188] 中記號(hào)η所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域。
[0189] 在方式之一中，品種識(shí)別區(qū)域可為包含序列號(hào)9 (Al區(qū)域）的堿基序列的一部分或 全部且還包含記號(hào)η所示的單核苷酸多態(tài)性的至少一個(gè)的區(qū)域，品種識(shí)別區(qū)域也可為包含 序列號(hào)9的堿基序列的區(qū)域。或品種識(shí)別區(qū)域可為包含序列號(hào)10 (BI區(qū)域）的堿基序列的 一部分或全部且還包含記號(hào)η所示的單核苷酸多態(tài)性的至少一個(gè)的區(qū)域，品種識(shí)別區(qū)域也 可為包含序列號(hào)10的堿基序列的區(qū)域?；蚱贩N識(shí)別區(qū)域可為包含序列號(hào)11 (Cl區(qū)域）的 堿基序列的一部分或全部且還包含記號(hào)η所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分 的至少一個(gè)的區(qū)域，品種識(shí)別區(qū)域也可為包含序列號(hào)11的堿基序列的區(qū)域。進(jìn)而，品種識(shí) 別區(qū)域可為包含序列號(hào)12或13 (Al - 2 - L區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含 記號(hào)η所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域，品種識(shí)別區(qū)域 也可為包含序列號(hào)12或13的堿基序列的區(qū)域。此外，品種識(shí)別區(qū)域可為包含序列號(hào)14或 15 (Al - 2 - R區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含記號(hào)η所示的單核苷酸多態(tài)性 或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域，品種識(shí)別區(qū)域也可為包含序列號(hào)14或15的 喊基序列的區(qū)域。
[0190] 在其他方式中，品種識(shí)別區(qū)域可為選自以下區(qū)域的2個(gè)以上的區(qū)域，為包含序列 號(hào)9(A1區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷酸多態(tài)性的至少一個(gè) 的區(qū)域；為包含序列號(hào)10 (BI區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷 酸多態(tài)性的至少一個(gè)的區(qū)域；為包含序列號(hào)11 (Cl區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還 包含η所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域；為包含序列號(hào) 12或13 (Al - 2 - L區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷酸多態(tài)性 或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域；及為包含序列號(hào)14或15 (Al - 2 - R區(qū)域） 的堿基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分的 至少一個(gè)的區(qū)域?；蚱贩N識(shí)別區(qū)域可為選自以下區(qū)域的2個(gè)以上、3個(gè)以上、4個(gè)以上或5個(gè) 全部的區(qū)域，包含序列號(hào)9(A1區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域、包含序列號(hào)10(B1區(qū)域）的堿基 序列的區(qū)域、包含序列號(hào)11 (Cl區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域、包含序列號(hào)12或13 (Al - 2 - L區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域及包含序列號(hào)14或15 (Al - 2 - R區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域。
[0191] 而且在其他方式中，品種識(shí)別區(qū)域不僅為選自以下區(qū)域的1以上的區(qū)域，為包含 序列號(hào)9 (Al區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷酸多態(tài)性的至少 一個(gè)的區(qū)域，為包含序列號(hào)10 (BI區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含η所示的單 核苷酸多態(tài)性的至少一個(gè)的區(qū)域及為包含序列號(hào)11 (Cl區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部 且還包含η所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域，還可為以 下區(qū)域，為包含序列號(hào)12或13 (Al - 2 - L區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含η 所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域或?yàn)榘蛄刑?hào)14或 15 (Al - 2 - R區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷酸多態(tài)性或插 入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域?；蚱贩N識(shí)別區(qū)域不僅為選自以下的1個(gè)以上、優(yōu)選 為2個(gè)以上、進(jìn)一步優(yōu)選為3個(gè)全部的區(qū)域，包含序列號(hào)9 (Al區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域，包 含序列號(hào)1〇(Β1區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域及包含序列號(hào)11(C1區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域， 還可為以下序列，為包含序列號(hào)12或13 (Al - 2 - L區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且 還包含η所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域或?yàn)榘蛄?號(hào)14或15(A1 - 2 - R區(qū)域）的堿基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷酸多 態(tài)性或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)的區(qū)域?；蚱贩N識(shí)別區(qū)域不僅為選自以下的1個(gè) 以上、優(yōu)選為2個(gè)以上、進(jìn)一步優(yōu)選為3個(gè)全部的區(qū)域，包含序列號(hào)9 (Al區(qū)域）的堿基序列 的區(qū)域、包含序列號(hào)10 (BI區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域及包含序列號(hào)11 (Cl區(qū)域）的堿基序 列的區(qū)域，還可為以下區(qū)域，包含序列號(hào)12或13(A1 - 2 - L區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域或 包含序列號(hào)14或15 (Al - 2 - R區(qū)域）的堿基序列的區(qū)域。
[0192] 品種識(shí)別引物可為制備識(shí)別標(biāo)記時(shí)確定的可擴(kuò)增識(shí)別區(qū)域的引物，還可為為了可 擴(kuò)增含有識(shí)別標(biāo)記的區(qū)域（品種識(shí)別區(qū)域）而另行設(shè)計(jì)的引物。構(gòu)成識(shí)別標(biāo)記的單核苷酸 多態(tài)性存在于多個(gè)區(qū)域中時(shí)，品種識(shí)別引物也可為可擴(kuò)增各個(gè)區(qū)域的引物。此外，存在多個(gè) 構(gòu)成識(shí)別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性時(shí)，品種識(shí)別引物可為可擴(kuò)增存在這些全部的1個(gè)區(qū)域的 引物，還可為可分別擴(kuò)增存在至少1個(gè)單核苷酸多態(tài)性的多個(gè)區(qū)域的多個(gè)引物。
[0193] 作為品種識(shí)別引物而可利用的引物中，包含由序列號(hào)1?8中記載的堿基序列組 成的引物。工序（i)中用于DNA片段擴(kuò)增的引物對(duì)的例子，可列舉選自以下的1個(gè)以上的 組合的引物對(duì)，由序列號(hào)1及2的堿基序列組成的引物的組合、由序列號(hào)3及4的堿基序列 組成的引物的組合、由序列號(hào)5及6的堿基序列組成的引物的組合以及由序列號(hào)7及8的 堿基序列組成的引物的組合。
[0194] 在其他方式中，工序（i)通過使用選自以下組合的1個(gè)以上、優(yōu)選為2個(gè)以上、進(jìn) 一步優(yōu)選為3個(gè)全部的引物對(duì)的PCR反應(yīng)來進(jìn)行，由序列號(hào)1及2的堿基序列組成的引物 的組合、由序列號(hào)3及4的堿基序列組成的引物的組合以及由序列號(hào)5及6的堿基序列組 成的引物的組合。
[0195] 在另一方式中，工序（i)不僅通過使用以下3個(gè)組合的引物對(duì)的PCR反應(yīng)來進(jìn)行， 由序列號(hào)1及2的堿基序列組成的引物的組合、由序列號(hào)3及4的堿基序列組成的引物的 組合以及由序列號(hào)5及6的堿基序列組成的引物的組合，還通過使用由序列號(hào)7及8的堿 基序列組成的引物的組合引物對(duì)的PCR反應(yīng)來進(jìn)行。
[0196] (ii)鑒定單核苷酸多杰件的某閔型的工序
[0197] 鑒定工序（i)中擴(kuò)增的DNA片段中的單核苷酸多態(tài)性的基因型。
[0198] 在方式之一中，單核苷酸多態(tài)性的基因型的鑒定可通過鑒定包含品種識(shí)別區(qū)域的 DNA片段的堿基序列來進(jìn)行。堿基序列的分析例如可根據(jù)上述<識(shí)別標(biāo)記的制備方法>中 的"（f)確定識(shí)別區(qū)域的堿基序列的工序及（g)確定識(shí)別對(duì)象品種的識(shí)別標(biāo)記的工序"的項(xiàng) 目中的（5)PCR產(chǎn)物的純化?（8)堿基序列的分析中記載的方法或也可按照該方法來進(jìn)行。
[0199] 在其他方式中，單核苷酸多態(tài)性的基因型的鑒定可通過使所擴(kuò)增的DNA片段與構(gòu) 成識(shí)別標(biāo)記的檢測(cè)啤酒花品種間不同的單核苷酸多態(tài)性的探針及/或引物接觸來進(jìn)行。檢 測(cè)單核苷酸多態(tài)性的探針及/或引物可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來設(shè)計(jì)及制備。使 用如此得到的探針的單核苷酸多態(tài)性的基因型的鑒定例如可利用DNA微陣列法等的本領(lǐng) 域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行。此外，使用引物的單核苷酸多態(tài)性的基因型的鑒定除了根據(jù) 序列分析以外，還可根據(jù)SNaPshot (注冊(cè)商標(biāo)）法（Life Technologies公司）等，利用使 用如下設(shè)計(jì)的引物的鑒定方法，根據(jù)應(yīng)檢測(cè)的單核苷酸多態(tài)性，產(chǎn)生長度不同的擴(kuò)增產(chǎn)物。 而且，使用探針及引物的單核苷酸多態(tài)性的基因型的鑒定可利用并用MGB(Minor Groove Binder)探針（Life Technologies公司）和設(shè)計(jì)為夾著該探針的引物的實(shí)時(shí)PCR法等。
[0200] (iii)對(duì)比、分析品種識(shí)別區(qū)域中的單核苷酸多杰件的某閔型的工序
[0201] 工序（iii)中，將被測(cè)物啤酒花DNA中的品種識(shí)別區(qū)域中的構(gòu)成識(shí)別標(biāo)記的單核 苷酸多態(tài)性的基因型與已知啤酒花品種DNA所對(duì)應(yīng)的區(qū)域中的單核苷酸多態(tài)性的基因型 進(jìn)行對(duì)比。且在該對(duì)比中，分析構(gòu)成識(shí)別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性的基因型在被測(cè)物啤酒花 和已知啤酒花品種之間為一致或不一致。
[0202] 對(duì)比可通過視覺檢查、數(shù)學(xué)計(jì)算來進(jìn)行?；蛞部墒褂糜?jì)算機(jī)程序。此外，對(duì)比也可 通過將包含品種識(shí)別區(qū)域的DNA片段的堿基序列與已知啤酒花品種DNA所對(duì)應(yīng)的區(qū)域的堿 基序列進(jìn)行對(duì)比來進(jìn)行。對(duì)比可通過通常在被測(cè)物的基因上具有的單核苷酸多態(tài)性的檢驗(yàn) (SNP分型）中所采用方法來進(jìn)行。
[0203] 以下，將直接對(duì)比堿基序列時(shí)的具體的對(duì)比方法使用分析用計(jì)算機(jī)程序的情況進(jìn) 行例示。即準(zhǔn)備包含表示通過上述識(shí)別標(biāo)記的制備方法得到的識(shí)別標(biāo)記的堿基的數(shù)據(jù)和表 示所述堿基的堿基序列位置的數(shù)據(jù)的識(shí)別標(biāo)記表，存儲(chǔ)到SeqScape (Life Technologies) 等的分析用計(jì)算機(jī)程序運(yùn)行的計(jì)算機(jī)中。所存儲(chǔ)的識(shí)別標(biāo)記表可為1個(gè)或多個(gè)。且將包含 表示從作為被測(cè)物的啤酒花中得到的堿基的數(shù)據(jù)的被測(cè)物堿基序列的序列表存儲(chǔ)到所述 計(jì)算機(jī)中。
[0204] 且參照所述識(shí)別標(biāo)記表的表示所述堿基序列位置的數(shù)據(jù)，將表示被測(cè)物堿基序列 的序列表與所述識(shí)別標(biāo)記表之間對(duì)應(yīng)的堿基序列位置上的堿基的數(shù)據(jù)用所述計(jì)算機(jī)進(jìn)行 對(duì)比。對(duì)比通過將運(yùn)用所述分析用計(jì)算機(jī)程序的兩組堿基序列進(jìn)行比對(duì)來進(jìn)行。
[0205] (iv)特定被測(cè)物啤酒花品種的工序
[0206] 工序（iv)中，根據(jù)工序（iii)的分析結(jié)果，特定被測(cè)物啤酒花品種。
[0207] 具體而言，分析相當(dāng)于被測(cè)物堿基序列中的識(shí)別標(biāo)記的位點(diǎn)的堿基與所述識(shí)別標(biāo) 記的堿基是否完全一致，完全一致時(shí)，被測(cè)物特定為所述識(shí)別標(biāo)記的品種。
[0208] 如此，使用本發(fā)明的識(shí)別標(biāo)記時(shí)，可特定作為被測(cè)物的啤酒花品種。使用計(jì)算機(jī)進(jìn) 行分析時(shí)，預(yù)先記錄具有與多個(gè)品種相關(guān)的識(shí)別標(biāo)記的區(qū)域的堿基序列，通過將被測(cè)物的 堿基序列依次與各品種的堿基序列進(jìn)行對(duì)比？分析，可簡便且迅速特定作為被測(cè)物的啤酒 花品種。
[0209] 另外，通過將作為識(shí)別標(biāo)記而確定的特定的堿基著色，也可容易地進(jìn)行上述對(duì)比。 即首先，將具有著色的對(duì)照堿基（識(shí)別標(biāo)記）的堿基序列與被測(cè)物的堿基序列進(jìn)行比對(duì)后， 僅將著色的堿基抽出，制成將兩者進(jìn)行對(duì)比的表。由此可容易地識(shí)別堿基的種類和存在的 位置是否完全一致，可容易的辨別作為被測(cè)物的啤酒花是否為其識(shí)別標(biāo)記的品種。另外，因 該方法可同時(shí)分析多個(gè)被測(cè)物，所以優(yōu)選。
[0210] <何含識(shí)別標(biāo)記的核酸>
[0211] 本發(fā)明還提供如下核酸，其包含通過制備上述識(shí)別標(biāo)記的方法制備的識(shí)別標(biāo)記的 至少一部分。
[0212] 在此，"核酸"是指由2種以上的核苷酸構(gòu)成的脫氧核糖核酸（DNA)或核糖核酸 (RNA)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，對(duì)于DNA的堿基序列中記載的核酸意指RNA時(shí)，可將 DNA的堿基序列的胸腺嘧啶取代為尿嘧啶。此外，核酸可為單鏈，也可為與互補(bǔ)鏈雜交的雙 鏈。
[0213] 具體而言，包含識(shí)別標(biāo)記的至少一部分的核酸也可為如下核酸，包含選自以下的 堿基序列的一部分，序列號(hào)9 (Al區(qū)域）、序列號(hào)10 (BI區(qū)域）、序列號(hào)11 (Cl區(qū)域）、序列號(hào) 12或13 (Al - 2 - L區(qū)域）、序列號(hào)14或15 (Al - 2 - R區(qū)域），且在該喊基序列中包含記 號(hào)η所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)。優(yōu)選為包含識(shí)別標(biāo)記的 至少一部分的核酸也可為包含選自以下堿基序列的核酸，序列號(hào)9 (Al區(qū)域）、序列號(hào)10 (BI 區(qū)域）、序列號(hào)11 (Cl區(qū)域）、序列號(hào)12或13 (Al - 2 - L區(qū)域）及序列號(hào)14或15 (Al - 2 一 R區(qū)域）。
[0214] < 引物 >
[0215] 本發(fā)明也提供如下引物，其可擴(kuò)增包含上述識(shí)別標(biāo)記的至少一部分的核酸。
[0216] 引物只要是設(shè)計(jì)為可擴(kuò)增包含上述識(shí)別標(biāo)記的至少一部分的核酸的引物，無特別 限定。
[0217] < 探針 >
[0218] 本發(fā)明還提供如下探針，其用于檢測(cè)構(gòu)成識(shí)別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性。
[0219] 探針為可檢測(cè)例如選自序列號(hào)9 (Al區(qū)域）、序列號(hào)10 (BI區(qū)域）、序列號(hào)11 (Cl區(qū) 域）、序列號(hào)12或13 (Al - 2 - L區(qū)域）及序列號(hào)14或15 (Al - 2 - R區(qū)域）的堿基序列 中η所示的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失（indel)部分的至少一個(gè)。
[0220] <檢測(cè)不同品種混入的方法>
[0221] 在擔(dān)心不同品種混入時(shí)，利用本發(fā)明的識(shí)別標(biāo)記，例如可用以下所述的方法檢測(cè) 不同品種混入。
[0222] 其為檢測(cè)啤酒花試樣中的不同品種混入的方法，所述方法包含以下工序：
[0223] ⑴擴(kuò)增從被測(cè)物啤酒花試樣中提取的DNA中的包含品種識(shí)別區(qū)域的DNA片段的 工序，該品種識(shí)別區(qū)域包含由啤酒花品種間不同的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP)構(gòu)成的 識(shí)別標(biāo)記；
[0224] (ii)分析上述工序⑴中擴(kuò)增的DNA片段中的品種識(shí)別區(qū)域的堿基序列，得到測(cè) 序數(shù)據(jù)的工序；
[0225] (iii)將上述工序（ii)中得到的測(cè)序數(shù)據(jù)中的構(gòu)成識(shí)別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性 位點(diǎn)的信息與正常品所對(duì)應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息進(jìn)行對(duì)比的工序；及
[0226] (iv)確定啤酒花試樣中有無不同品種混入的工序，在此，上述工序（ii)中得到的 測(cè)序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息與正常品所對(duì)應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息一 致時(shí)，判斷為無不同品種混入，或上述工序（ii)中得到的測(cè)序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn) 的信息與正常品所對(duì)應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息不一致時(shí)，判斷為有不同品種混入。
[0227] 而且，通過在（iv)之后繼續(xù)進(jìn)行以下的工序，可進(jìn)行混入品種的推斷或特定。即 包含
[0228] (V)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的測(cè)序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的 信息與正常品所對(duì)應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息不一致時(shí)，由上述工序（ii)中得到的 測(cè)序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)中出現(xiàn)的來自正常品以外的信息特定其堿基的工序；及
[0229] (Vi)將上述工序（V)中特定的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的與正常品不同的堿基與識(shí) 別標(biāo)記對(duì)照，從而推斷或特定混入品種的工序。
[0230] 此外，通過進(jìn)一步在（iv)之后繼續(xù)進(jìn)行以下的工序，可分析混入比例。即包含
[0231] (V)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的測(cè)序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的 信息與正常品所對(duì)應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息不一致時(shí)，由上述工序（ii)中得到的 測(cè)序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)中出現(xiàn)的來自正常品以外的信息特定其堿基，并求出混入 比例的工序；及
[0232] (Vi)將上述工序（V)中特定的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的與正常品不同的堿基與識(shí) 別標(biāo)記對(duì)照，從而推斷或特定混入品種和其混入比例的工序。
[0233] 在此，測(cè)序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息是指例如由測(cè)序的結(jié)果得到的單核 苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的形狀、數(shù)值，具體而言，可列舉由測(cè)序的結(jié)果得到的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn) 的電泳圖（測(cè)序的時(shí)得到的表示各堿基的顏色分開的波形），將擴(kuò)增片段克隆到大腸桿菌 等中，對(duì)所得到的多個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，通過對(duì)這些序列進(jìn)行對(duì)比而得到的單核苷酸多態(tài)性 位點(diǎn)上的堿基的含有比率等。
[0234] 此外，此處的正常品是指為單一品種，指已確立構(gòu)成識(shí)別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性 位點(diǎn)的信息的啤酒花品種。根據(jù)情況，所謂正常品的記載也有時(shí)指包含已確立構(gòu)成識(shí)別標(biāo) 記的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息的僅單一品種的試樣。
[0235] 使用電泳圖檢測(cè)不同品種混入時(shí)，由于在作為被測(cè)物的啤酒花試樣的電泳圖中重 疊出現(xiàn)與正常品的波形不同的其他波形，所以，可確認(rèn)不同品種的存在。且通過由單核苷酸 多態(tài)性位點(diǎn)上出現(xiàn)的與正常品不同的波形特定其堿基，與識(shí)別標(biāo)記對(duì)照，從而可推斷或特 定混入品種。只要各識(shí)別標(biāo)記（SNP)中的其品種上特征性的堿基完全被確認(rèn)，即可特定混 入品種。而且，通過將這些波形的重疊狀況、高度等與另外實(shí)施的預(yù)先已知混入比例的其他 品種混合品的分析結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，可求出不同品種大約的混入比例。
[0236] 此外，在使用將擴(kuò)增片段克隆到大腸桿菌等中而得到的多個(gè)克隆的測(cè)序數(shù)據(jù)時(shí)， 通過將其多個(gè)克隆的序列進(jìn)行比對(duì)，求出各單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的堿基的含有比率，可檢 測(cè)不同品種的混入。即如未混入不同品種，則所有位點(diǎn)均與正常品的堿基為同樣堿基的含 有比率應(yīng)為100*%，在不同品種混入時(shí)，與正常品的喊基同樣的喊基不為100*%，可看出其 他的堿基的含有比率。如此，通過將與正常品的堿基不同的堿基與識(shí)別標(biāo)記對(duì)照，可特定混 入品種，求出含有比率。但是，在大腸桿菌上克隆的方法因需要分析大量的克隆，所以，會(huì)產(chǎn) 生需要大量勞力和時(shí)間的操作。
[0237] 作為求出各單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的堿基的含有比率的其他方法，通過將包含作為 被測(cè)物的啤酒花試樣的品種識(shí)別區(qū)域的DNA片段使用具有下一步驟中必需的附加序列的 特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，并將其用新一代測(cè)序儀大量測(cè)序，將這些進(jìn)行比對(duì)，求出各單核苷酸 多態(tài)性位點(diǎn)的堿基的含有比率，從而可更準(zhǔn)確地進(jìn)行混入品種的特定和求出混入比率。
[0238] 此外，還具有將引物在馬上進(jìn)行多態(tài)性（SNP)分析之前進(jìn)行設(shè)定，對(duì)僅使一堿基 伸長而摻入的堿基的種類進(jìn)行多態(tài)性分型的方法。例如，稱為SNaPshot (注冊(cè)商標(biāo)）法 (Life Technologies公司）的方法。此外，還有可使用MGB(Minor Groove Binder)探針 (Life Technologies公司），用實(shí)時(shí)PCR法對(duì)不同品種進(jìn)行定量分析的方法。
[0239] 實(shí)施例
[0240] 以下，通過實(shí)施例進(jìn)一步具體說明本發(fā)明。但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
[0241] 實(shí)施例1識(shí)別標(biāo)記的制各
[0242] (a)轉(zhuǎn)錄纟目分析
[0243] 為了得到啤酒花品種識(shí)別技術(shù)開發(fā)中必需的品種間DNA多態(tài)性區(qū)域，認(rèn)為需要使 用新一代測(cè)序儀得到大量的測(cè)序數(shù)據(jù)，從其中廣泛搜索SNP (檢測(cè)人基因組時(shí)的SNP的頻率 認(rèn)為是 1 個(gè)/100 - 300 喊基；http://www.eubios.info/hmba ck.htm)。因此，本
【發(fā)明者】著 眼于轉(zhuǎn)錄組。轉(zhuǎn)錄組分析與以全部基因組為對(duì)象時(shí)相比，以大約1/100左右的數(shù)據(jù)處理即 可實(shí)現(xiàn)，因而可控制交貨期、成本。而且雖然與全基因組相比可以說為少數(shù)，然而在我們的 計(jì)算中，可利用1萬5千個(gè)SNP數(shù)據(jù)。因此，設(shè)想得到了多品種識(shí)別所必需的SNP，利用本方 法，實(shí)施品種間的SNP分析。
[0244] (1)試樣的采集?保管
[0245] 從下一項(xiàng)表4中記載的識(shí)別對(duì)象品種中選擇3品種（從方便上，記為品種A、B、C)， 采集該品種的啤酒花鮮葉。即用以下所示的方法進(jìn)行采樣·保管。
[0246] a.組織一盡可能采集嫩葉（小、黃綠色、柔軟）。但表面上附著白色異物的葉除外。
[0247] b.方法一為了防止RNAse的附著，用帶上手術(shù)用手套的手采集葉。采集的同時(shí)，在 防止RNA分解用的試劑中浸漬。
[0248] C.保管一常溫下，至少1星期左右RNA為穩(wěn)定，但到進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析及SNP序列分 析的期間，盡可能放入冰箱內(nèi)保管。
[0249] (2)轉(zhuǎn)錄鉬分析
[0250] 對(duì)于如上所述采集的試樣，委托Eurofins公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。具體而言， 進(jìn)行了總RNA的提取、mRNA的純化、cDNA文庫的構(gòu)建、表達(dá)量的差的均一化、大小調(diào)整 (500?700bp)、GS FLX測(cè)序儀用的cDNA文庫的制備、通過使用"Titanium Chemistry"的 Roche/454Genome Sequencer FLX 進(jìn)行測(cè)序。
[0251] (b)纟目裝（重疊群的制各）
[0252] 使用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的SNP分析
[0253] 使用通過上述轉(zhuǎn)錄組分析而得到的測(cè)序數(shù)據(jù)，委托Eurofins公司進(jìn)行重疊群的制 備。具體而言，基于各啤酒花品種的DNA片段的堿基序列，進(jìn)行聚類和組裝。其結(jié)果，從各 品種中得到合計(jì)為約42000?45000種的重疊群（cDNA的一部分）的堿基序列。其中，具 有IOOObp以上的長度的重疊群為約4500?6700個(gè)。
[0254]【表1】
[0255]
【權(quán)利要求】
1. 一種方法，其為啤酒花品種的識(shí)別方法，其特征在于，所述方法包含以下工序： (i) 擴(kuò)增來自被測(cè)物啤酒花的DNA中的包含品種識(shí)別區(qū)域的DNA片段的工序，該品種識(shí) 別區(qū)域包含由啤酒花品種間不同的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性即SNP構(gòu)成的識(shí)別標(biāo)記； (ii) 鑒定上述工序（i)中擴(kuò)增的DNA片段中的單核苷酸多態(tài)性的基因型的工序； (iii) 將上述工序（ii)所鑒定的被測(cè)物啤酒花DNA中的品種識(shí)別區(qū)域中的單核苷酸多 態(tài)性的基因型與已知啤酒花品種DNA所對(duì)應(yīng)的區(qū)域中的單核苷酸多態(tài)性的基因型進(jìn)行對(duì) t匕，分析該區(qū)域中的單核苷酸多態(tài)性的基因型在被測(cè)物啤酒花和已知啤酒花品種之間為一 致或不一致的工序； (iv) 根據(jù)上述工序（iii)的分析結(jié)果，特定被測(cè)物啤酒花品種的工序。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于，工序（ii)如下進(jìn)行，鑒定工序（i)中擴(kuò) 增的DNA片段中的品種識(shí)別區(qū)域的堿基序列，且 工序（iii)如下進(jìn)行，將工序（ii)所鑒定的被測(cè)物啤酒花DNA中的品種識(shí)別區(qū)域的堿 基序列與已知啤酒花品種DNA所對(duì)應(yīng)的區(qū)域的堿基序列進(jìn)行對(duì)比，分析該區(qū)域中的識(shí)別標(biāo) 記在被測(cè)物啤酒花和已知啤酒花品種之間為一致或不一致。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于，工序（ii)為如下工序，通過使工序（i) 中擴(kuò)增的DNA片段與檢測(cè)啤酒花品種間不同的單核苷酸多態(tài)性的探針及/或引物接觸，而 鑒定單核苷酸多態(tài)性的基因型。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，品種識(shí)別區(qū)域?yàn)榘ㄟ^包 含以下工序的方法而制備的識(shí)別標(biāo)記的區(qū)域： (a) 使用2個(gè)以上不同品種的啤酒花，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的工序； (b) 基于由上述工序（a)的結(jié)果得到的DNA片段的堿基序列，對(duì)各品種進(jìn)行組裝的工 序； (c) 將由上述工序（b)的結(jié)果得到的重疊群及/或單拷貝進(jìn)行品種間對(duì)比，進(jìn)行品種間 不同的單核苷酸多態(tài)性即SNP的搜索的工序； (d) 根據(jù)上述工序（c)的SNP搜索的結(jié)果，選擇包含SNP的區(qū)域，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增該區(qū)域 的引物的工序； (e) 通過使用上述工序（d)中設(shè)計(jì)的引物，以從啤酒花中提取的DNA為模板，確認(rèn)上述 工序（d)中選擇的區(qū)域可擴(kuò)增，確定該堿基序列，從而確定識(shí)別區(qū)域和可擴(kuò)增該識(shí)別區(qū)域 的引物的工序； (f) 使用上述工序（e)中確定的引物，以從識(shí)別對(duì)象品種的啤酒花中提取的DNA為模板 擴(kuò)增識(shí)別區(qū)域，確定識(shí)別區(qū)域的堿基序列的工序；及 (g) 將上述工序（f)中確定的識(shí)別區(qū)域的堿基序列進(jìn)行品種間對(duì)比，確定由用于識(shí)別 識(shí)別對(duì)象品種所必需的SNP的組合構(gòu)成的識(shí)別標(biāo)記的工序。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，品種識(shí)別區(qū)域?yàn)榘x自序 列號(hào)9、序列號(hào)10、序列號(hào)11、序列號(hào)12、序列號(hào)13、序列號(hào)14及序列號(hào)15中的1個(gè)以上的 堿基序列的一部分或全部，且還包含圖1、圖2、圖3、圖4及圖6中特定的單核苷酸多態(tài)性或 插入缺失部分的至少一個(gè)的區(qū)域。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，品種識(shí)別區(qū)域?yàn)檫x自包含序 列號(hào)9表不的喊基序列的區(qū)域、包含序列號(hào)10表不的喊基序列的區(qū)域、包含序列號(hào)11表不 的喊基序列的區(qū)域、包含序列號(hào)12表不的喊基序列的區(qū)域、包含序列號(hào)13表不的喊基序列 的區(qū)域、包含序列號(hào)14表不的喊基序列的區(qū)域及包含序列號(hào)15表不的喊基序列的區(qū)域中 的1個(gè)以上的區(qū)域。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，品種識(shí)別區(qū)域?yàn)椴粌H包含以 下：包含序列號(hào)9表不的喊基序列的區(qū)域、包含序列號(hào)10表不的喊基序列的區(qū)域及包含序 列號(hào)11表示的堿基序列的區(qū)域的3種區(qū)域，且包含以下：序列號(hào)12及/或序列號(hào)14表示 的堿基序列的一部分或全部，且還包含圖4中特定的單核苷酸多態(tài)性或插入缺失部分的至 少1個(gè)的區(qū)域。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，工序（i)通過使用以下引物 對(duì)的PCR反應(yīng)來進(jìn)行，為選自序列號(hào)1及序列號(hào)2的組合、序列號(hào)3及序列號(hào)4的組合、序 列號(hào)5及序列號(hào)6的組合及序列號(hào)7及序列號(hào)8的組合的引物對(duì)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，工序（i)通過使用以下引物 對(duì)的PCR反應(yīng)來進(jìn)行：不僅為以下：序列號(hào)1及序列號(hào)2的組合、序列號(hào)3及序列號(hào)4的組 合以及序列號(hào)5及序列號(hào)6的組合的3種引物對(duì)，還為序列號(hào)7及序列號(hào)8的組合的引物 對(duì)。
10. -種方法，其為由啤酒花品種間不同的單核苷酸多態(tài)性的組合構(gòu)成的識(shí)別標(biāo)記的 制備方法，其特征在于，所述方法包含以下工序： (a) 使用2個(gè)以上不同品種的啤酒花，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的工序； (b) 基于由上述工序（a)的結(jié)果得到的DNA片段的堿基序列，對(duì)各品種進(jìn)行組裝的工 序； (c) 將由上述工序（b)的結(jié)果得到的重疊群及/或單拷貝進(jìn)行品種間對(duì)比，進(jìn)行品種間 不同的單核苷酸多態(tài)性即SNP的搜索的工序； (d) 根據(jù)上述工序（c)的SNP搜索的結(jié)果，選擇包含SNP的區(qū)域，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增該區(qū)域 的引物的工序； (e) 通過使用上述工序（d)中設(shè)計(jì)的引物，以從啤酒花中提取的DNA為模板，確認(rèn)上述 工序（d)中選擇的區(qū)域可擴(kuò)增，確定該堿基序列，從而確定識(shí)別區(qū)域和可擴(kuò)增該識(shí)別區(qū)域 的引物的工序； (f) 使用上述工序（e)中確定的引物，以從識(shí)別對(duì)象品種的啤酒花中提取的DNA為模板 擴(kuò)增識(shí)別區(qū)域，確定識(shí)別區(qū)域的堿基序列的工序；及 (g) 將上述工序（f)中確定的識(shí)別區(qū)域的堿基序列進(jìn)行品種間對(duì)比，確定由用于識(shí)別 識(shí)別對(duì)象品種所必需的SNP的組合構(gòu)成的識(shí)別標(biāo)記的工序。
11. 一種核酸，其特征在于，包含通過權(quán)利要求10中所述的方法制備的識(shí)別標(biāo)記的至 少一部分。
12. -種核酸，其特征在于，該核酸包含啤酒花的品種識(shí)別區(qū)域，而且，包含選自序列號(hào) 9、序列號(hào)10、序列號(hào)11、序列號(hào)12、序列號(hào)13、序列號(hào)14及序列號(hào)15中的1個(gè)以上的堿基 序列的一部分或全部，且還包含圖1、圖2、圖3、圖4及圖6中特定的單核苷酸多態(tài)性或插入 缺失部分的至少一個(gè)。
13. -種引物，其特征在于，設(shè)計(jì)為可擴(kuò)增權(quán)利要求11或12中所述的核酸。
14. 一種引物，其特征在于，由序列號(hào)1?8中任一個(gè)所記載的堿基序列組成，在此，該 引物用于啤酒花的品種識(shí)別。
15. -種探針，其特征在于，用于檢測(cè)通過權(quán)利要求10中所述的方法鑒定的品種識(shí)別 區(qū)域中的啤酒花品種間不同的單核苷酸多態(tài)性。
16. -種探針，其特征在于，可在選自序列號(hào)9、序列號(hào)10、序列號(hào)11、序列號(hào)12、序列號(hào) 13、序列號(hào)14及序列號(hào)15中的1個(gè)以上的堿基序列中，檢測(cè)圖1、圖2、圖3、圖4或圖6中 特定的位置中的至少1個(gè)單核苷酸多態(tài)性或插入缺失位點(diǎn)，且由此檢測(cè)啤酒花品種間不同 的單核苷酸多態(tài)性。
17. -種方法，其為檢測(cè)啤酒花試樣中的不同品種混入的方法，所述方法包含以下工 序： (i) 擴(kuò)增從被測(cè)物啤酒花試樣中提取的DNA中的包含品種識(shí)別區(qū)域的DNA片段的工序， 該品種識(shí)別區(qū)域包含由啤酒花品種間不同的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性即SNP構(gòu)成的識(shí)別 標(biāo)記； (ii) 分析上述工序⑴中擴(kuò)增的DNA片段中的品種識(shí)別區(qū)域的堿基序列，得到測(cè)序數(shù) 據(jù)的工序； (iii) 將上述工序（ii)中得到的測(cè)序數(shù)據(jù)中的構(gòu)成識(shí)別標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn) 的信息與正常品所對(duì)應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息進(jìn)行對(duì)比的工序；及 (iv) 確定啤酒花試樣中有無不同品種混入的工序，在此，上述工序（ii)中得到的測(cè)序 數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息與正常品所對(duì)應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息一致時(shí)， 判斷為無不同品種混入，或上述工序（ii)中得到的測(cè)序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信 息與正常品所對(duì)應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息不一致時(shí)，判斷為有不同品種混入。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17中所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包含接在工序（iv)后的以下 工序： (v) 上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的測(cè)序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息 與正常品所對(duì)應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息不一致時(shí)，由上述工序（ii)中得到的測(cè)序 數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)中出現(xiàn)的來自正常品以外的信息特定其堿基的工序；及 (vi) 將上述工序（v)中特定的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的與正常品不同的堿基與識(shí)別標(biāo) 記對(duì)照，從而推斷或特定混入品種的工序。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17中所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包含接在工序（iv)后的以下 工序： (v)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的測(cè)序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息 與正常品所對(duì)應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息不一致時(shí)，由上述工序（ii)中得到的測(cè)序 數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)中出現(xiàn)的來自正常品以外的信息特定其堿基，并求出混入比例 的工序；及 (Vi)將上述工序（V)中特定的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的與正常品不同的堿基與識(shí)別標(biāo) 記對(duì)照，從而推斷或特定混入品種和其混入比例的工序。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1?9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，工序（iii)中包含有無 19?25堿基的插入序列的分析。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104350151SQ201380029975
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年6月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月7日
【發(fā)明者】山內(nèi)啟正, 古久保進(jìn) 申請(qǐng)人:三得利控股株式會(huì)社