Nadp依賴性丙氨酸脫氫酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis ）丙氨酸脫氫酶的氨基酸序列或其變體的多肽，其中Leu197或位于氨基酸序列中同源位置的氨基酸交換為具有帶正電的側(cè)鏈的氨基酸，涉及編碼此類多肽的核酸分子，并涉及用于產(chǎn)生丙氨酸或化合物（通過丙氨酸消耗生成）的方法，所述方法包括通過將丙酮酸與根據(jù)本發(fā)明的多肽或根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞接觸來使丙酮酸與銨和NADPH反應(yīng)以生成丙氨酸的步驟。
【專利說明】NADP依賴性丙氨酸脫氫酶
[0001] 本發(fā)明涉及包含枯草芽孢桿菌丙氨酸脫氫酶（AlaDH)的氨 基酸序列或其變體的多肽，其中Leul97或位于氨基酸序列中同源位置的氨基酸交換為具 有帶正電的側(cè)鏈的氨基酸，涉及編碼此類多肽的核酸分子，并涉及用于產(chǎn)生丙氨酸或化合 物(通過丙氨酸消耗生成）的方法，所述方法包括通過將丙酮酸與根據(jù)本發(fā)明的多肽或根據(jù) 本發(fā)明的細(xì)胞接觸來使丙酮酸與銨和NADPH反應(yīng)以生成丙氨酸的步驟。
[0002] 胺用作化學(xué)工業(yè)的多種產(chǎn)物的合成單元，諸如環(huán)氧樹脂、聚氨酯泡沫、異氰酸酯和 尤其是聚酰胺。后者是一類特征在于重復(fù)的酰胺基團(tuán)的聚合物。與化學(xué)相關(guān)的蛋白不同， 措辭"聚酰胺"通常涉及合成的、可商購(gòu)的、熱塑性塑料。聚酰胺衍生自可從在化石烴的裂 化過程中產(chǎn)生的烷中獲得的伯胺或仲胺。然而，胺衍生物，更準(zhǔn)確地為氨基羧酸、內(nèi)酰胺和 二胺，還可以用于制備基于酰胺的聚合物。其他感興趣的起始物質(zhì)為短鏈氣態(tài)烷，其可以借 助于生物技術(shù)方法獲自可再生原材料，并隨后胺化。
[0003] 大量商業(yè)需求的許多聚酰胺從內(nèi)酰胺開始制備。例如，"聚酰胺-6"可以通過將 ε_(tái)己內(nèi)酰胺聚合來獲得，并且"聚酰胺-12"通過將十二內(nèi)酰胺聚合來獲得。其他商業(yè)上 感興趣的產(chǎn)物包括內(nèi)酰胺的共聚物，例如ε-己內(nèi)酰胺和十二內(nèi)酰胺的共聚物。
[0004] 常規(guī)化學(xué)技術(shù)生產(chǎn)胺依賴于化石原材料的供應(yīng)，效率低下并且產(chǎn)生大量不期望的 副產(chǎn)物，在一些合成步驟中高達(dá)80 %。此類方法的一個(gè)實(shí)例是制備十二內(nèi)酰胺，其常規(guī)通過 丁二烯的三聚化來獲得。將三聚化產(chǎn)物環(huán)十二碳三烯氫化，并且產(chǎn)生的環(huán)十二烷被氧化以 生成環(huán)十二烷酮，其隨后與羥胺反應(yīng)來產(chǎn)生環(huán)十二烷肟（oxine)，其經(jīng)Beckmann重排反應(yīng) 最后轉(zhuǎn)化為十二內(nèi)酰胺。
[0005] 考慮到這些不利之處，開發(fā)了使用生物催化劑從可再生原材料獲得胺的方法。在 此，農(nóng)業(yè)產(chǎn)品諸如糖或脂肪酸(其可能已包含醇官能團(tuán)）被氧化以產(chǎn)生醛或酮。在隨后步驟 中，醛或酮隨后通過氨基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化為胺，并伴有消耗氨基酸。氨基酸有利地通過在氨基轉(zhuǎn) 移酶反應(yīng)過程中存在的氨基酸脫氫酶來再生，并伴有消耗無機(jī)氮鹽。
[0006] 例如，國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/EP 2008/067447描述了使用細(xì)胞制備ω-氨基羧酸的生 物系統(tǒng)，所述細(xì)胞具有一系列合適的酶活性，并且能夠轉(zhuǎn)化羧酸為對(duì)應(yīng)的ω-氨基羧酸。尤 其是，細(xì)胞包括來自惡臭假單胞菌)GP01的AlkBGT氧化酶系統(tǒng)，其首 先氧化ω-氨基羧酸以產(chǎn)生ω-羥基羧酸并隨后產(chǎn)生醛。這隨后為氧化產(chǎn)物通過同樣表達(dá) 的氨基轉(zhuǎn)移酶的胺化。
[0007] ΕΡ11174729. 1和ΕΡ11006458. 1描述了從烷或從醇開始制備胺的方法，所述方法 區(qū)別在于，其中醇或烷(其在第一方法步驟中被羥基化以產(chǎn)生醇）通過醇脫氫酶反應(yīng)并伴有 消耗NAD+以產(chǎn)生醛或酮，并且產(chǎn)物隨后通過氨基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)并伴有消耗作為胺供體的丙氨 酸來以產(chǎn)生胺。消耗的丙氨酸可以通過存在的丙氨酸脫氫酶來再生，并伴有消耗丙酮酸和 銨，因此，總體上，丙氨酸不需要補(bǔ)充。
[0008] 在文獻(xiàn)中描述的丙氨酸脫氫酶中，枯草芽孢桿菌丙氨酸脫氫酶及其變體適合于此 類方法。這一特定組的丙氨酸脫氫酶的缺點(diǎn)在于它們是NADH依賴性的，也就是說它們消耗 另一種還原的氧化還原因子而非在醇氧化過程中大量NAD依賴性醇脫氫酶(其已證實(shí)在生 物技術(shù)中是尤其有利的）產(chǎn)生的氧化還原因子。
[0009] 在體外反應(yīng)的情況下，這意味著每反應(yīng)的醇分子必須向反應(yīng)提供一個(gè)NAD+分子和 一個(gè)NADPH分子。相反，如果反應(yīng)體內(nèi)使用全細(xì)胞催化劑進(jìn)行，那么細(xì)胞可以原則上經(jīng)初級(jí) 代謝提供各個(gè)氧化還原因子；然而，這對(duì)于代謝是相當(dāng)程度的負(fù)擔(dān)，其導(dǎo)致降低的產(chǎn)物產(chǎn)量 和/或縮短的細(xì)胞使用壽命。
[0010] 針對(duì)這一背景，本發(fā)明基于的目標(biāo)是提供用于胺化醇的氧化還原中性酶系統(tǒng)，即 包含用于催化醇轉(zhuǎn)化為胺并再生丙氨酸不需要供應(yīng)外部產(chǎn)生的NAD+或NADPH或其他氧化 還原因子的酶的系統(tǒng)。
[0011] 本發(fā)明基于的進(jìn)一步的目標(biāo)在于提供丙氨酸脫氫酶，其適合于在NADPH存在的情 況下酶促催化地轉(zhuǎn)化醇為胺，并且其以盡可能高的酶變率（Wechselzahl) (S卩，每秒反應(yīng)的 底物分子的數(shù)量）催化所述反應(yīng)。
[0012] 本發(fā)明基于的進(jìn)一步的目標(biāo)在于以這樣的方式修飾枯草芽孢桿菌丙氨酸脫氫酶， 使得所述酶以對(duì)作為底物的NADPH更高的親和力催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙氨酸，并且所述酶對(duì) NADPH的親和力優(yōu)選高于對(duì)NADH的親和力，更優(yōu)選相對(duì)于野生型酶的酶變率，其酶變率不 會(huì)顯著降低。
[0013] 本發(fā)明基于的進(jìn)一步的目標(biāo)在于提供胺化醇的氧化還原中性系統(tǒng)，所述系統(tǒng)適合 于在溫和反應(yīng)條件下的一鍋反應(yīng)，所述溫和條件具體而言是指不具有極端溫度或PH值并 且不存在含重金屬的催化劑或其他毒性化合物的那些條件。
[0014] 這些和其他目的通過本申請(qǐng)的主題和尤其還通過所附的獨(dú)立權(quán)利要求的主題來 實(shí)現(xiàn)，其中實(shí)施方案可見于從屬權(quán)利要求中。
[0015] 在第一方面，本發(fā)明基于的問題通過以下解決：包含枯草芽孢桿菌丙氨酸脫氫酶 的氨基酸序列或其變體的多肽，其中Leul97或位于氨基酸序列中的同源位置的氨基酸交 換為具有帶正電的側(cè)鏈的氨基酸。
[0016] 在第一方面的第一個(gè)實(shí)施方案中，所述問題通過多肽來解決，其中帶正電側(cè)鏈的 氨基酸是精氨酸。
[0017] 在第一方面的第二個(gè)實(shí)施方案中，其也是第一方面的一個(gè)實(shí)施方案，所述問題通 過多肽來解決，其中另外地Aspl96或位于氨基酸序列中同源位置的氨基酸交換為具有中 性的或帶正電的側(cè)鏈的氨基酸。
[0018] 在第一方面的第三個(gè)實(shí)施方案中，其也是第一至第二方面的一個(gè)實(shí)施方案，所述 問題通過多肽來解決，其中具有中性的或帶正電的側(cè)鏈的氨基酸是選自丙氨酸、甘氨酸、絲 氨酸和半胱氨酸的氨基酸，優(yōu)選丙氨酸。
[0019] 在第一方面的第四個(gè)實(shí)施方案中，其也是第一至第二方面的一個(gè)實(shí)施方案，所述 問題通過多肽來解決，其是顯示于SEQ ID No. 1中的多肽。
[0020] 在第二方面，本發(fā)明基于的問題通過核酸分子來解決，所述核酸分子包含編碼根 據(jù)第一方面及其實(shí)施方案的多肽的核苷酸序列。
[0021] 在第二方面的第一個(gè)實(shí)施方案中，所述問題通過核酸分子來解決，其是顯示于SEQ IDNo. 2中的核苷酸序列。
[0022] 在第三方面，本發(fā)明基于的問題通過載體來解決，所述載體包含根據(jù)第二方面及 其實(shí)施方案的核酸分子。
[0023] 在第四方面，本發(fā)明基于的問題通過細(xì)胞來解決，所述細(xì)胞包含根據(jù)第一方面的 多肽、根據(jù)第二方面的核酸分子或第三方面及各個(gè)實(shí)施方案的載體。
[0024] 在第四方面的第一個(gè)實(shí)施方案中，所述問題通過細(xì)胞來解決，所述細(xì)胞此外表達(dá) NADP+依賴性醇脫氫酶。
[0025] 在第四方面的第二個(gè)實(shí)施方案中，其也是第一方面的一個(gè)實(shí)施方案，所述問題通 過根據(jù)第四方面或第四方面的第一個(gè)實(shí)施方案的細(xì)胞來解決，所述細(xì)胞此外表達(dá)氨基轉(zhuǎn)移 酶。
[0026] 在第四方面，本發(fā)明基于的問題通過用于產(chǎn)生丙氨酸或化合物(通過丙氨酸消耗 生成）的方法來解決，所述方法包括以下步驟： c)通過將丙酮酸與根據(jù)第一方面的多肽或與根據(jù)第二方面或各個(gè)實(shí)施方案之一的細(xì) 胞接觸來使丙酮酸與銨和NADPH反應(yīng)以生成丙氨酸。
[0027] 在第四方面的第一個(gè)實(shí)施方案中，所述問題通過方法來解決，所述方法進(jìn)一步包 括 a) 通過在NADP+存在的情況下與NADP+依賴性醇脫氫酶接觸而使伯醇或仲醇反應(yīng)以產(chǎn) 生醛或酮。
[0028] 在第四方面的第二個(gè)實(shí)施方案中，其也是第一方面的一個(gè)實(shí)施方案，所述問題通 過方法來解決，所述方法此外包括 b) 通過在丙氨酸存在的情況下與氨基轉(zhuǎn)移酶接觸而使步驟a)中制備的醛或酮反應(yīng)以 產(chǎn)生胺。
[0029] 在第四方面的第三個(gè)實(shí)施方案中，其也是第一至第二方面的一個(gè)實(shí)施方案，所述 問題通過方法來解決，其中步驟a)、b)和c)在相同的反應(yīng)混合物中進(jìn)行，優(yōu)選同時(shí)進(jìn)行。
[0030] 在第三或第四方面的進(jìn)一步的實(shí)施方案中或在第三或第四方面的一個(gè)實(shí)施方案 中，所述問題通過細(xì)胞或通過方法來解決，其中所述細(xì)胞胞內(nèi)定位表達(dá)所有來自包含權(quán)利 要求1-5之一的多肽的組的酶、NADP +依賴性醇脫氫酶和氨基轉(zhuǎn)移酶。
[0031] 在第三或第四方面的進(jìn)一步的實(shí)施方案中或在第三或第四方面的一個(gè)實(shí)施方案 中，所述問題通過細(xì)胞或通過方法來解決，其中NADP +依賴性醇脫氫酶為選自來自大腸桿菌 的醇脫氫酶（YjgB，數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)ZP_07117674，和YahK，數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)BAE76108. 1)和來自 青枯菌屬種sp.)的醇脫氫酶（SEQ ID No. 3)的NADP+依賴性醇脫氫酶，優(yōu)選 來自青枯菌屬種的醇脫氫酶（SEQ ID No. 5)，或其變體。
[0032] 在第三或第四方面的進(jìn)一步的實(shí)施方案中或在第三或第四方面的一個(gè)實(shí)施方案 中，所述問題通過細(xì)胞或通過方法來解決，其中氨基轉(zhuǎn)移酶是選自以下的氨基轉(zhuǎn)移酶：來自 青紫色素桿菌rio/acew?)(數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)NP_901695)、惡臭假單胞菌（數(shù) 據(jù)庫(kù)編號(hào) YP_〇〇1668026. 1 或 YP_001671460)和類球紅細(xì)菌(TPAoiZoAacier (菌株ATCC 17023;數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)YP_353455)的氨基轉(zhuǎn)移酶及其變體，優(yōu)選來自青紫色素桿 菌的氨基轉(zhuǎn)移酶（數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)ΝΡ_901695)。
[0033] 本發(fā)明基于發(fā)明人令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，即包含醇脫氫酶優(yōu)選NADP+依賴性醇脫氫酶、 氨基轉(zhuǎn)移酶和含有枯草芽孢桿菌丙氨酸脫氫酶的氨基酸序列或其變體的多肽(其中Leul97 或位于氨基酸序列中的同源位置的氨基酸交換為具有帶正電的側(cè)鏈的氨基酸）的酶系統(tǒng)可 以用于以氧化還原中性方式催化醇的胺化。
[0034] 此外，本發(fā)明基于發(fā)明人令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，即多肽(其包含枯草芽孢桿菌丙氨酸脫 氫酶的氨基酸序列）對(duì)于NADPH的親和力可以通過如下而得到提高：Leul97或位于氨基酸 序列中的同源位置的氨基酸被交換為具有帶正電的側(cè)鏈的氨基酸，而酶保持催化活性且能 夠以高酶變率催化反應(yīng)。
[0035] 本發(fā)明涉及多肽，其包含枯草芽孢桿菌丙氨酸脫氫酶的氨基酸序列或其變體，其 中Leul97或位于氨基酸序列中的同源位置的氨基酸交換為具有帶正電的側(cè)鏈的氨基酸。 該多肽顯示于序列表中SEQ ID No. 1下。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本上下文中所用的 措辭"丙氨酸脫氫酶"應(yīng)理解為表示有酶活性的多肽，其催化丙酮酸同時(shí)消耗銨和NADH或 NADPH，優(yōu)選NADPH而轉(zhuǎn)化為丙氨酸和NAD+或NADP+，優(yōu)選NADP+?？莶菅挎邨U菌丙氨酸脫氫 酶的氨基酸序列以及本申請(qǐng)中通過說明數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)來指定的其他分子的序列或序列可見 于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中2012年4月1日在線版本中的數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)L20916下。
[0036] 然而，本發(fā)明的教導(dǎo)不僅可通過使用精確的氨基酸或核酸序列或施加至本文描述 的生物大分子的精確的氨基酸或核酸序列（例如數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)L20916下的丙氨酸脫氫酶）來 進(jìn)行，還可以使用或施加至可以通過一個(gè)或多于一個(gè)氨基酸或核酸的缺失、添加或取代來 獲得的此類大分子的變體來進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文上下文中所用的措辭 核酸序列或氨基酸序列的"變體"（其在下文中與措辭"同源物"同義且可交換使用）意指一 條不同的核酸或氨基酸序列，其相對(duì)于對(duì)應(yīng)的原始野生型核酸序列或野生型氨基酸序列， 具有70、75、80、85、90、92、94、96、98、99%或更高百分比的同源性(本文與同一性同義使用）， 其中優(yōu)選除形成催化活性中心的氨基酸或除對(duì)于結(jié)構(gòu)或折疊必需的氨基酸之外的氨基酸 被缺失或取代，或者后者僅保守取代，例如谷氨酸被取代為天冬氨酸或亮氨酸被取代為纈 氨酸。現(xiàn)有技術(shù)描述了可用于計(jì)算兩條序列同源性程度的算法，例如Arthur Lesk (2008)， Introduction to Bioinformatics,第3版。在本發(fā)明進(jìn)一步更優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸 或核酸序列的變體，優(yōu)選除上述序列同源性之外，具有與野生型分子和原始分子基本上相 同的酶活性。例如，具有丙氨酸脫氫酶的酶活性的多肽的變體具有相同或基本上相同的蛋 白水解活性，即能夠催化丙酮酸、銨和NAD(P)H (優(yōu)選NADPH)轉(zhuǎn)化為丙氨酸。在一個(gè)具體的 實(shí)施方案中，措辭"基本上相同的酶活性"表示關(guān)于野生型多肽的底物的活性，其顯著高于 背景活性和/或與野生型多肽關(guān)于相同底物的K m和/或kMt值差別為少于3、更優(yōu)選2、甚 至更優(yōu)選1個(gè)數(shù)量級(jí)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，措辭核酸或氨基酸序列的"變體"包括 核酸或氨基酸序列的至少一個(gè)活性部分或片段。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本上下文 所用的措辭"活性部分"表示氨基酸序列或核酸序列，其比氨基酸序列全長(zhǎng)短，或其編碼比 氨基酸序列全長(zhǎng)短的長(zhǎng)度，其中比野生型氨基酸序列長(zhǎng)度短的氨基酸序列或編碼的氨基酸 序列具有基本上與野生型多肽或其變體相同的酶活性。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，措辭核 酸的"變體"包括其互補(bǔ)鏈將優(yōu)選在嚴(yán)格條件下與野生型核酸結(jié)合的核酸。雜交反應(yīng)的嚴(yán)格 性可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定，并通常依賴于探針的長(zhǎng)度、洗滌過程中的溫度和鹽 濃度。通常，更長(zhǎng)的探針需要更高的雜交溫度，而更短的探針在低的溫度下操作。雜交是否 發(fā)生通常依賴于變性DNA與其環(huán)境中存在的互補(bǔ)鏈退火的能力，更確切地在低于解鏈溫度 下進(jìn)行退火的能力。雜交反應(yīng)的嚴(yán)格性和相應(yīng)的條件更詳細(xì)地描述于Ausubel等沒95。關(guān) 于借助于雜交鑒定DNA序列的信息可由本領(lǐng)域技術(shù)人員尤其在來自Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993)的教科書"The DIG System Users Guide for Filter Hybridization"和在 Liebl 等人（International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991))中發(fā)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，雜交在嚴(yán)格條件下發(fā)生，換言 之，僅產(chǎn)生其中探針與靶序列（即，用探針處理的多核苷酸）具有至少70%同一性的雜化 物。已知雜交的嚴(yán)格性(包括洗滌步驟）受改變緩沖液組成、溫度及鹽濃度所影響或由其確 定。通常，相比于洗漆步驟，雜交反應(yīng)在相對(duì)低的嚴(yán)格性下進(jìn)行（Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996)。例如，對(duì)于雜交反應(yīng)，可以利用在約 50°C _68°C的溫度下對(duì)應(yīng)于5 X SSC緩沖液的緩沖液。在此，探針還可以與對(duì)探針序列具 有低于70%同一性的多核苷酸雜交。此類雜交物是更不穩(wěn)定的，并且在嚴(yán)格條件下通過洗 滌而去除。嚴(yán)格洗滌條件可以通過例如降低鹽濃度至2x SSC且任選隨后至0.5x SSC來實(shí) 現(xiàn)（The DIG System UserrS Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995)，其中建立約 50°C _68°C、約 52°C _68°C、約 54°C _68°C、約 56°C _68°C、約 58°C _68°C、約 60°C _68°C、約 62°C _68°C、約 64°C _68°C、約 66°C -68°C的溫度，這是漸增的優(yōu)選次序。優(yōu)選約64°C - 68°C或約66°C - 68°C的溫度范圍。任選 地，可以降低鹽濃度至對(duì)應(yīng)于0.2 X SSC或0.1 X SSC的濃度。通過以1-2°C的步驟將雜交 溫度從50°C至68°C逐步提高，可以分離多核苷酸片段，例如其與使用的核酸分子序列具有 至少70 %或至少80 %或至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、 至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的同一性，這是漸增的優(yōu)選次序。關(guān)于雜交的 進(jìn)一步說明可以以所謂的"試劑盒"的形式商購(gòu)可得（例如來自Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany,的DIG Easy Hyb，目錄號(hào)1603558)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本 上下文所用，措辭核酸的"變體"包含編碼與原始核酸相同的氨基酸序列的或在遺傳密碼簡(jiǎn) 并性的范圍內(nèi)的該氨基酸序列的變體的任何核酸序列。
[0037] 為了進(jìn)行本發(fā)明的教導(dǎo)，需要的是使用的枯草芽孢桿菌丙氨酸脫氫酶不包含酶的 野生型序列，而是包含其中Leul97或位于氨基酸序列中的同源位置的氨基酸交換為具有 帶正電的側(cè)鏈的氨基酸的序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本上下文中所用的措辭"同源 位置"表示當(dāng)進(jìn)行所研究的分子的比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)位置呈現(xiàn)為對(duì)枯草芽孢桿菌丙氨酸脫氫酶 的氨基酸序列的位置X的同源物。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知大量軟件包和算法，借助其可以建 立氨基酸序列的比對(duì)。軟件包方法的實(shí)例包括由EMBL提供的ClustalW軟件包（Larkin等 人，2007; Goujon 等人 2010)或說明且描述于 Arthur M. Lesk (2008)，Introduction to Bioinformatics，第3版。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，措辭"氨基酸"或"丙氨酸"理解 為分別表示產(chǎn)生蛋白質(zhì)的（proteinogenic)L-氨基酸或L-丙氨酸，即自然界中由生物普遍 用于合成多肽的氨基酸。措辭"氨基酸"還包括對(duì)應(yīng)化合物的所有晶體形式、鹽形式或類似 形式，這如同本申請(qǐng)中提及的所有化合物。例如，組氨酸還包括質(zhì)子化組氨酸和氯離子的 鹽。
[0038] 對(duì)于丙氨酸脫氫酶活性必要的是催化的反應(yīng)的起始材料尤其是無機(jī)氮來源以足 量存在。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本上下文中所用的措辭"無機(jī)氮來源"理解為表示含 無機(jī)氮的鹽，其包括銨或其可以在細(xì)胞代謝中轉(zhuǎn)化為銨。實(shí)例包括氯化銨、硝酸銨、硫酸銨、 氫氧化銨、磷酸銨、碳酸銨等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中的銨濃度為〇. 05-5,更優(yōu) 選0. 1-3,最優(yōu)選0.5-3 g/Ι。細(xì)胞的無機(jī)氮來源優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明通過添加足量的相應(yīng)化合 物至反應(yīng)進(jìn)行的水相中來提供。
[0039] 具有帶正電的側(cè)鏈的氨基酸包括氨基酸精氨酸、賴氨酸和組氨酸，優(yōu)選精氨酸和 賴氨酸，最優(yōu)選精氨酸?？梢缘母鶕?jù)本發(fā)明的多肽包括例如突變Leul97Arg、Leul97Lys和 Leul97His。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的教導(dǎo)明確地還包含來自除枯草芽孢桿菌以 外的生物的丙氨酸脫氫酶，只要它們屬于枯草芽孢桿菌丙氨酸脫氫酶的變體組。
[0040] 在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的教導(dǎo)還包含多肽，其除了在Leul97位置的 上述交換外，還包括在位置Aspl96或在與其同源的位置上的進(jìn)一步的交換,其交換為具有 中性或帶正電的側(cè)鏈的氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有中性側(cè)鏈的氨基酸包括甘 氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、谷氨 酰胺、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和天冬酰胺。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有帶正電側(cè)鏈 的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸，優(yōu)選精氨酸和賴氨酸。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的核酸分子包括所有未修飾的或修飾的DNA和RNA分子，其包含編碼 根據(jù)本發(fā)明的多肽的核酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知分子生物學(xué)或合成化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法， 借助于所述方法可以制備此類核酸分子，例如借助聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或固相合成。在一個(gè)優(yōu) 選的實(shí)施方案中，核酸分子是包含或?yàn)镾EQ ID No. 2中顯不的核苷酸序列的核酸分子。 [0042] 本發(fā)明的教導(dǎo)可以不僅使用根據(jù)本發(fā)明的分離的多肽、核酸分子或載體進(jìn)行，還 可以使用根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞作為全細(xì)胞催化劑來進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本上 下文所用的措辭"全細(xì)胞催化劑"理解為表示完整的、有活力的且代謝上有活性的細(xì)胞，其 提供了期望的酶活性。全細(xì)胞催化劑可以轉(zhuǎn)運(yùn)待代謝的底物(在本發(fā)明的情況下為醇或從 其產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，在那它被細(xì)胞溶膠的酶所代謝，或它可以呈遞目標(biāo)酶在 它的表面上，其中它直接暴露于培養(yǎng)基中的底物。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于制備全細(xì)胞催 化劑的許多系統(tǒng)，例如來自DE 60216245。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞胞內(nèi)（即各個(gè) 酶在其表達(dá)后永久地位于細(xì)胞內(nèi)部，尤其是在細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中或作為膜蛋白或錨定于膜 中或投射入細(xì)胞的細(xì)胞溶膠內(nèi)的蛋白）表達(dá)具有NADPH依賴性丙氨酸脫氫酶活性的根據(jù)本 發(fā)明的多肽、氨基轉(zhuǎn)移酶和/或NADP +依賴性醇脫氫酶。
[0043] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用作全細(xì)胞催化劑的細(xì)胞或用作表達(dá)系統(tǒng)的細(xì) 胞是原核細(xì)胞，優(yōu)選細(xì)菌細(xì)胞。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，它是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在 進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，它是低等真核細(xì)胞，優(yōu)選酵母細(xì)胞。原核細(xì)胞的實(shí)例包 括埃希氏菌屬(hcAericAia )，尤其是大腸桿菌co/i )，和屬假單胞菌 屬)和棒桿菌屬（ieriw? )的菌株。低等真核細(xì)胞的實(shí)例包 括屬酵母屬)、假絲酵母屬)、畢赤酵母屬CPicAia )、耶羅維 亞酵母屬（Yarrowia)、裂殖酵母屬)，尤其是菌株熱帶假絲酵 母（t/a iropica/is)、粟酒裂殖酵母巴斯德畢 赤酵母CPicAia pasioris)、解脂耶羅維亞酵母（7arroria 和釀酒酵母 {Saccharomycescerivisiae)〇
[0044] 在使用根據(jù)本發(fā)明的全細(xì)胞催化劑的情況下，分子進(jìn)入全細(xì)胞催化劑的內(nèi)部在 一些底物尤其是具有長(zhǎng)烷基鏈的那些的情況下可能限制期望物質(zhì)的產(chǎn)生。在長(zhǎng)鏈烷及醇 的情況下，優(yōu)選全細(xì)胞催化劑包括AlkL多肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本上下文中 所用的"AlkL多肽"為在230個(gè)連續(xù)氨基酸的長(zhǎng)度上與惡臭假單胞菌AlkL (數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào) CAB69081)具有至少80、優(yōu)選90、甚至更優(yōu)選90%序列同一性的多肽和優(yōu)選具有促進(jìn)長(zhǎng)鏈 烷進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的能力的多肽。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，如本上下文所用的"AlkL家族的 多肽"是定位于革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜內(nèi)的多肽，所述多肽具有序列基序DXWAPAXQ(V/A) GXR，其中X是產(chǎn)生蛋白質(zhì)的氨基酸，并且所述多肽另外優(yōu)選是惡臭假單胞菌AlkL (數(shù)據(jù) 庫(kù)編號(hào)CAB69081)或其變體。AlkL家族的成員的實(shí)例包括來自惡臭假單胞菌的AlkL (數(shù) 據(jù)庫(kù)編號(hào)CAB69081)、來自水油海桿菌（Marinobacter aquaeolei) VT8的AlkL (數(shù)據(jù)庫(kù) 編號(hào) YP_957722)、來自亞歷山大海洋柄菌（Oceanicaulis alexandrii) HTCC2633 的 AlkL (數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào) ΖΡ_00%3584)、來自 Marinobacter manganoxydans MnI7-9 的 AlkL (數(shù) 據(jù)庫(kù)編號(hào)ZP_09158756)、來自柄桿菌屬種（Caulobacter sp.) K31的AlkL (數(shù)據(jù)庫(kù)編 號(hào)YP_001672217)、來自食油假單胞菌（Pseudomonas oleovorans)的AlkL(數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào) Q00595)及其變體。
[0045] 然而，根據(jù)本發(fā)明利用的酶活性多肽，尤其是醇脫氫酶、氨基轉(zhuǎn)移酶和丙氨酸脫氫 酶還可以在各種情況下為在整個(gè)純化階段(從粗裂解物到分離的多肽）的根據(jù)本發(fā)明的多 肽的制備物。細(xì)胞可以包含一種或多于一種核酸序列，其編碼根據(jù)本發(fā)明使用的酶，所述 核酸序列在質(zhì)粒上或整合入細(xì)胞基因中。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知大量方法，借助于所述方法 可以在合適細(xì)胞中過表達(dá)酶活性多肽并進(jìn)行純化或分離。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的全 部表達(dá)系統(tǒng)均可用于表達(dá)多肽，例如PET或pGEX型載體。適合于純化的方法是層析方法， 例如在組氨酸標(biāo)簽的情況下使用固定的配體(例如鎳離子)，在與目的蛋白融合的谷胱甘 肽-5·-轉(zhuǎn)移酶的情況下使用固定的谷胱甘肽，或在含麥芽糖結(jié)合蛋白的標(biāo)簽的情況下使用 固定的麥芽糖，通過親和層析純化標(biāo)簽化的重組蛋白。
[0046] 使用以分離的形式的本發(fā)明的多肽明確地推薦于一系列應(yīng)用中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，如本上下文所用的措辭"分離的"表示酶相比于其天然來源以更純的和/或濃縮 的形式存在。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)酶是多肽酶并且其總計(jì)為多于60、70、80、90或 優(yōu)選95質(zhì)量％的相應(yīng)制備物的蛋白含量，則考慮所述酶為分離的。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知大 量用于測(cè)量溶液中蛋白的質(zhì)量的方法，例如參考SDS-聚丙烯酰胺凝膠上對(duì)應(yīng)的蛋白條帶 厚度的視覺評(píng)估、NMR光譜法或基于質(zhì)譜的方法。
[0047] 純化的酶活性的多肽可以以可溶形式或固定形式來使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知合 適的方法，借助于所述方法多肽可以共價(jià)地或非共價(jià)地固定于有機(jī)或無機(jī)固相上，例如通 過巰基（Sulphhydryl)偶聯(lián)化學(xué)(例如來自Pierce的試劑盒)。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明使用的酶優(yōu)選是重組的酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文上下文 中所用的措辭"重組的"理解為表示相應(yīng)核酸分子不是天然存在的和/或其已使用基因技 術(shù)方法產(chǎn)生。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，考慮重組蛋白是其中相應(yīng)多肽由重組核酸編碼的 蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本上下文所用，將重組細(xì)胞理解為表示包括至少一種 重組核酸或重組多肽的細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知適合于產(chǎn)生重組分子或細(xì)胞的方法， 例如描述于 Sambrook/Fritsch/Maniatis (1989) : Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,第 2 版。
[0049] 使用本發(fā)明的教導(dǎo)的先決條件是存在水相，即含水培養(yǎng)基或反應(yīng)介質(zhì)，其適合于 至少暫時(shí)維持或培養(yǎng)細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的多肽的活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知大量含水培養(yǎng) 基，其適合于維持或培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是生物技術(shù)上重要的細(xì)胞。這些不僅包括完全培養(yǎng)基諸 如LB培養(yǎng)基，還包括基本培養(yǎng)基諸如M9培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基，例如具有高鹽濃度且因此僅 允許嗜鹽或至少耐鹽生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本上下文中所用的 措辭"水相"理解為表示基于水的反應(yīng)介質(zhì)或培養(yǎng)基，其基本上不與疏水性溶劑混溶，且其 關(guān)于所有相關(guān)因素尤其是pH、鹽含量和溫度是這樣的，從而使得其至少暫時(shí)維持或促進(jìn)其 中存在的細(xì)胞(優(yōu)選微生物)的生存力。多種生物技術(shù)上重要的細(xì)胞的溫度要求可見于微生 物學(xué)和分子生物學(xué)的教科書中，例如Fuchs/Schlegl，2008。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在 接觸發(fā)生時(shí)，含水培養(yǎng)基的pH為4-9,更優(yōu)選4. 5-8. 5,最優(yōu)選6. 5-7. 5。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí) 施方案中，溫度為5-42°C，更優(yōu)選15-40°C，最優(yōu)選20-37°C。
[0050] 酶的使用需要所有必需底物的存在。例如，丙氨酸脫氫酶的活性需要存在底物 銨、合適的還原的氧化還原因子和丙酮酸。此外，酶活性需要合適的水溶液，即這樣的溶 液，其關(guān)于存在的所需的緩沖劑、pH、溫度、鹽濃度、所需的輔因子或活性促進(jìn)或活性維持其 他多肽的存在和其他相關(guān)因子，適合于至少暫時(shí)維持酶的活性。選擇合適的溶液和酶測(cè)試 (借助于其可以測(cè)定酶的活性）的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的且描述于現(xiàn)有技術(shù)中， 例如在 Cornish-Bowden (1995), Fundamentals of Enzyme Kinetics, Portland Press Limited 中。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞不僅表達(dá)修飾的枯草芽孢桿菌丙氨酸脫氫酶，在 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，還表達(dá)NADP +依賴性醇脫氫酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本上 下文所用的措辭"醇脫氫酶"理解為表示氧化醛或酮以產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的伯醇或仲醇或其他醇的 酶。實(shí)例包括來自大腸桿菌的NADP +依賴性醇脫氫酶（YjgB，數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)ZP_07117674，和 YahK，數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)BAE76108. 1)和來自青枯菌屬種的醇脫氫酶（SEQ ID No. 5)及其各個(gè) 變體。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，其是來自青枯菌屬種的醇脫氫酶（SEQ ID No. 5)。
[0052] 根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞不僅表達(dá)修飾的枯草芽孢桿菌的丙氨酸脫氫酶和 /或NADP +依賴性醇脫氫酶，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，還表達(dá)氨基轉(zhuǎn)移酶。在一個(gè)優(yōu)選的 實(shí)施方案中，如本上下文所用的措辭"氨基轉(zhuǎn)移酶"理解為表示這樣的酶，其催化氨基從供 體分子(優(yōu)選氨基酸）轉(zhuǎn)移至受體分子(優(yōu)選酮羧酸)。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基 轉(zhuǎn)移酶選自來自青紫色素桿菌（CXroffioAacieriiffl? rio/acew?)(數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)NP_901695)、 惡臭假單胞菌（數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)YP_〇〇1668026)、惡臭假單胞菌（數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)YP_001668026. 1 或 ΥΡ_001671460);類球紅細(xì)菌(菌株ATCC 17023;數(shù)據(jù)庫(kù)編 號(hào)ΥΡ_353455)的ω-氨基轉(zhuǎn)移酶及其變體，并且其優(yōu)選為來自青紫色素桿菌的氨基轉(zhuǎn)移酶 (數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)ΝΡ_901695)。
[0053] 在使用至少一種全細(xì)胞催化劑的情況下，且如果反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，應(yīng)考慮條件與 至少一種用作全細(xì)胞催化劑的細(xì)胞的生存力相容。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在標(biāo)準(zhǔn)操作(例如 Fuchs/Schlegel (2007) Allgemeine Mikrobiologie, 2008，Georg Thieme Verlag)中找 到使此類細(xì)胞維持活力狀態(tài)的條件和溶液。
[0054] 根據(jù)本發(fā)明的方法可應(yīng)用于大量的工業(yè)上相關(guān)的醇。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 采用ω-羥基羧酸或酯，優(yōu)選其甲酯的形式，其被氧化并胺化以產(chǎn)生ω-氨基羧酸。在進(jìn)一 步的實(shí)施方案中，它是二醇，其被氧化并胺化以產(chǎn)生二胺。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，伯 醇是羥基烷基胺。碳鏈的長(zhǎng)度在該情況下可變，且X為至少3。優(yōu)選地，碳鏈具有多于三個(gè) C 原子，即 X = 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多。化合物的實(shí)例 包括ω-羥基月桂酸、ω-羥基月桂酸甲酯、和烷二醇，尤其是1，8-辛二醇和1，10-癸二醇。
[0055] 其他合適的有α-羥基羧酸，優(yōu)選可氧化以產(chǎn)生α-酮羧酸的那些，即式Rs-C(OH) H-COOH的那些，其依次可以通過胺化轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)生蛋白質(zhì)的氨基酸，其中尤其是必需氨基 酸諸如甲硫氨酸和賴氨酸。特定實(shí)例包括那些酸，其中Rs為選自Η、甲基、-(CH2)4-ΝΗ 2、 (CH2) 3-NH-NH-NH2、-CH2-CH2-S-CH 3' -CH(CH3)2' -CH2-CH(CH3)2' -CH2-QH- B引哚-3-基）、 CH(OH) -CH3、-CH2-苯基、-CH(CH3) -CH2-CH3的取代基。其他仲醇包含2-烷醇類，例如2-丙 醇、2-丁醇、2-戊醇、2-己醇等。其他合適的有多元仲醇，例如烷二醇類諸如乙二醇，烷三醇 類諸如甘油和季戊四醇。其他實(shí)例包括環(huán)烷醇，優(yōu)選環(huán)己醇和雙（對(duì)羥基環(huán)己基）甲烷、基 團(tuán) H3C - C (OH) H - (CH2) x - R4 的醇，其中 R4 選自-OH、- SH、- NH2 和-C00R5, X 為至少 3,且 R5選自H、烷基和芳基。
[0056] 在式醇H3C-C(OH)H- (CH2)x-R4的醇的情況下，碳鏈長(zhǎng)度可變，且X至少為3。優(yōu) 選地，碳鏈包括多于三個(gè)碳原子，即 X = 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20或更多。大量仲醇是可商購(gòu)的且可直接以商購(gòu)形式使用。或者，仲醇可以經(jīng)生物技術(shù)預(yù) 先或原地產(chǎn)生，例如通過用合適的烷氧化酶優(yōu)選單加氧酶將烷羥基化。
[0057] 在式H3C - C(OH)H - (CH2)x - R4的仲醇的情況下，在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，R4選 自-OH和-C00R 5, X為至少11，且R5選自H、甲基、乙基和丙基。
[0058] 伯醇或仲醇尤其優(yōu)選為糖醇，其如在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案(諸如本文）中所用，應(yīng) 理解為表示具有至少一個(gè)羥基的碳水化合物。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，它是雙環(huán) 的糖醇。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，諸如本文，"雙環(huán)的糖醇"應(yīng)理解為表示能夠形成兩個(gè) 環(huán)系統(tǒng)(至少暫時(shí)地）的糖醇。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，糖醇為雙脫水己糖醇或選自 1，4:3, 6-雙脫水-D-甘露醇、1，4:3, 6-雙脫水-D-山梨醇（異山梨醇）和1，4:3, 6-雙脫 水-L-艾杜糖醇的化合物。
[0059] 如果根據(jù)本發(fā)明待轉(zhuǎn)化的醇如此無法獲得，而僅以烷前體的形式，則存在根據(jù)本 發(fā)明的細(xì)胞另外表達(dá)單加氧酶或在根據(jù)本發(fā)明的方法中擴(kuò)展其中單加氧酶羥基化烷的步 驟的選項(xiàng)。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，單加氧酶是來自AlkB家族的單加氧酶。AlkB是 來自惡臭假單胞菌AlkBGT系統(tǒng)的氧化還原酶，且已知它的羥化酶活性。這依賴于另兩個(gè)多 肽AlkG和AlkT。將AlkT表征為FAD依賴性紅素氧還蛋白還原酶，其從NADH向AlkG轉(zhuǎn)移 電子。AlkG是紅素氧還蛋白，一種含鐵的氧化還原蛋白，其作為AlkB的直接電子供體起作 用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本上下文中所用的措辭"來自alkB家族的單加氧酶"理 解為表示膜結(jié)合的烷羥化酶。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，將同一措辭"alkB型的烷羥化 酶"理解為表示與惡臭假單胞菌Gpol的AlkB的序列(數(shù)據(jù)庫(kù)代碼：CAB54050. 1，本文中所 用的該數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)及所有其他數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)均來自于在2011年11月9日可用釋放的NCBI 的Genbank蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)）具有至少75、80、85、90、92、94、96、98或99% (優(yōu)先漸增）的序列同 源性的多肽。如本上下文所用的措辭"序列"可以指多肽的氨基酸序列和/或編碼其的核 酸序列。
[0060] 在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，單加氧酶是CYP153家族的細(xì)胞色素 P450單加氧酶。 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，措辭"CYP153家族的細(xì)胞色素 P450單加氧酶"理解為表示作為 3組分系統(tǒng)的部分的細(xì)胞溶膠氧化酶，所述3組分系統(tǒng)還包含鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還 原酶，所述細(xì)胞溶膠氧化酶具有烷結(jié)合位點(diǎn)和能夠羥基化烷。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案 中，它是與來自泊庫(kù)島食烷菌SK2的CYP153家族的細(xì)胞色素 P450單加氧酶（數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào) YP_691921)具有至少80,優(yōu)選90,最優(yōu)選95或99 %的序列同一性的酶，或包含與來自泊庫(kù) 島食烷菌SK2的CYP153家族的細(xì)胞色素 P450單加氧酶（數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)YP_691921)具有至 少80,優(yōu)選90,最優(yōu)選95或99%的序列同一性的多肽序列并此外具有烷羥化酶活性的酶。 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本上下文所用的措辭"烷羥化酶活性"理解為表示催化烷或包 含至少5個(gè)、優(yōu)選12個(gè)碳物質(zhì)基團(tuán)的未取代的直鏈烷基的羥基化的能力。在進(jìn)一步優(yōu)選 的實(shí)施方案中，措辭"CYP153家族的細(xì)胞色素 Ρ450單加氧酶"理解為表示非膜結(jié)合的氧化 酶，其包括對(duì)于烷、包含至少5個(gè)、優(yōu)選12個(gè)碳物質(zhì)基團(tuán)的未取代的直鏈烷基、或單羥基化 的烷的結(jié)合位點(diǎn)，并且其多肽鏈包括基序LL(I/L) (V/I)GGNDTTRN。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案 中，如本上下文所用的"CYP153家族的細(xì)胞色素 P450單加氧酶"是來自泊庫(kù)島食烷菌SK2 的CYP153家族的細(xì)胞色素 P450單加氧酶（數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)YP_691921)或其變體，其優(yōu)選具有 烷羥化酶活性。
[0061] 本發(fā)明包括具有以下多肽（Polyp)-及核苷酸（DNA)序列的序列表：
【權(quán)利要求】
1. 細(xì)胞，其包含 含有枯草芽孢桿菌丙氨酸脫氫酶的氨基酸序列或其變體的多 肽，其中Leul97或位于氨基酸序列中的同源位置的氨基酸交換為具有帶正電的側(cè)鏈的氨 基酸， 或含有編碼所述多肽的核苷酸序列的核酸分子。
2. 產(chǎn)生丙氨酸或通過丙氨酸消耗生成的化合物的方法，其包括步驟： c)通過將丙酮酸與權(quán)利要求1的細(xì)胞或 與含有枯草芽孢桿菌)丙氨酸脫氫酶的氨基酸序列或其變體的多 肽接觸，其中Leul97或位于氨基酸序列中的同源位置的氨基酸交換為具有帶正電的側(cè)鏈 的氨基酸，使丙酮酸與銨和NADPH反應(yīng)以產(chǎn)生丙氨酸。
3. 權(quán)利要求2的方法，其還包括 a) 通過在NADP+存在的情況下與NADP+依賴性醇脫氫酶接觸而使伯醇或仲醇反應(yīng)以產(chǎn) 生醛或酮。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其還包括 b) 通過丙氨酸存在的情況下與氨基轉(zhuǎn)移酶接觸而使步驟a)中制備的醛或酮反應(yīng)以產(chǎn) 生胺。
5. 權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)的方法，其中步驟a)、b)和c)在相同反應(yīng)混合物中進(jìn)行，優(yōu) 選同時(shí)進(jìn)行。
6. 權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)的細(xì)胞或方法，其中所述細(xì)胞還表達(dá)NADP+依賴性醇脫氫酶。
7. 權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)的細(xì)胞或方法，其中所述細(xì)胞還表達(dá)氨基轉(zhuǎn)移酶。
8. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的細(xì)胞或方法，其中，在多肽細(xì)胞中，所有選自多肽、NADP+依 賴性醇脫氫酶和氨基轉(zhuǎn)移酶的酶胞內(nèi)定位表達(dá)。
9. 權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的細(xì)胞或方法，其中所述NADP+依賴性醇脫氫酶為選自 來自大腸桿菌的醇脫氫酶（YjgB，數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)ZP_07117674，和YahK，數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào) BAE76108. 1)和來自青枯菌屬種sp.)的醇脫氫酶（SEQ ID No. 10)的NADP+依 賴性醇脫氫酶，優(yōu)選來自青枯菌屬種的醇脫氫酶（SEQ ID No. 10)或其變體。
10. 權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的細(xì)胞或方法，其中所述氨基轉(zhuǎn)移酶為選自來自青紫 色素桿菌Fio/acea?)(數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)NP_901695)、惡臭假單胞菌 (數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào) YP_001668026)、惡臭假單胞菌 (數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)YP_001668026. 1 或YP_001671460);類球紅細(xì)菌（TPAot/oAacter (菌株ATCC 17023 ;數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)YP_353455)的氨基轉(zhuǎn)移酶及其變體，優(yōu)選為來自青紫色素 桿菌的氨基轉(zhuǎn)移酶（數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)NP_901695)。
11. 權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的細(xì)胞或方法，其中所述具有帶正電的側(cè)鏈的氨基酸為精 氨酸。
12. 權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的細(xì)胞或方法，其中另外地Aspl96或位于氨基酸序列中的 同源位置的氨基酸交換為具有中性的或帶正電的側(cè)鏈的氨基酸。
13. 權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的細(xì)胞或方法，其中所述具有中性的或帶正電的側(cè)鏈的氨 基酸為選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸的氨基酸，優(yōu)選丙氨酸。
14. 權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的細(xì)胞或方法，其中所述多肽為SEQ ID No. 1中顯示的多 肽。
15. 權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的細(xì)胞或方法，其中所述核苷酸序列為SEQ ID No. 2中顯 示的核苷酸序列。
16. 權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的細(xì)胞或方法，其中所述核酸分子為包含核酸分子的載 體。
【文檔編號(hào)】C12P7/24GK104350147SQ201380030225
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月20日
【發(fā)明者】T.哈斯, J.C.普費(fèi)弗, A.斯克拉, A.萊希納, A.雅拉施 申請(qǐng)人:贏創(chuàng)工業(yè)集團(tuán)股份有限公司