赤桉木虱防治劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及昆蟲物種中RNA介導(dǎo)基因沉默的領(lǐng)域。本發(fā)明部分地基于發(fā)明人的桉樹入侵物種Gb害蟲赤桉木虱(Glycaspis brimblecombei)的基因測(cè)序。在某些方面，本發(fā)明提供Gb核酸、其衍生物，以及此類核酸和衍生物作為Gb防治劑的用途。
【專利說明】赤桉木虱防治劑
[0001] 序列表
[0002] 本申請(qǐng)包含以ASCII格式經(jīng)電子存檔提交的序列表，在此將其全部?jī)?nèi)容引入以作 參考。將2013年4月18日制作的所述ASCII副本命名為30407-0004W01_SL.txt，其大小 為50, 196字節(jié)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及昆蟲物種中雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的基因沉默領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0004] 赤按木風(fēng)（redgumlerppsyllid,Glycaspisbrimblecombei,Gb)為僅發(fā)現(xiàn)于按 樹上的吸汁害蟲（sap-suckingpest)(半翅目（OrderHemiptera):木虱科（Psyllidae))。 Gb侵?jǐn)_已發(fā)生于許多國(guó)家，并對(duì)非洲、南北美洲、印度、澳大利亞以及地中海地區(qū)的自然種 群和商業(yè)桉樹種植構(gòu)成威脅。桉樹物種在它們對(duì)受到Gb攻擊的敏感性方面存在不同。赤 桉（E.camaldulensis)和細(xì)葉桉（E.tereticornis)高度易感，而巨桉（E.grandis)更加耐 受。Gb為迅速傳播的侵略性害蟲。Gb侵?jǐn)_的癥狀包括葉片損失和主根（leadshoots)的 干枯。嚴(yán)重的侵?jǐn)_可引起完全脫葉和樹木死亡。
[0005] 雌性Gb每個(gè)生命周期產(chǎn)下45-700個(gè)之間的卵。卵在10至20天內(nèi)孵化，并且出 現(xiàn)的蛹用它們的口針（stylet) (口器）刺入桉樹組織中，在木質(zhì)部和韌皮部上進(jìn)食。隨著 蛹以來自葉片的植物糖類為食，它們分泌蜜露，借此它們?cè)谄渥陨碇車鷺?gòu)建了蠟狀保護(hù)蓋 ("昆蟲蜜（lerp)"）。昆蟲蜜帶白色的，且形狀為圓錐形，并且在發(fā)育期間庇護(hù)昆蟲，直至 它們達(dá)到成蟲期。在澳大利亞，典型地每年有2至4個(gè)Gb世代。
[0006] 對(duì)防治桉樹的Gb感染所做的努力已包括嘗試將天然抗性植物與天然捕食者隔 離。然而，這種努力已遇到限制或不成功。
[0007] Gb的化學(xué)殺蟲劑防治昂貴且環(huán)境不友好?；瘜W(xué)殺蟲劑可能不利于環(huán)境，不是選擇 性的，且可能對(duì)非目標(biāo)作物和動(dòng)物群有害。化學(xué)殺蟲劑存留于環(huán)境中并通常代謝緩慢，或根 本不代謝?；瘜W(xué)殺蟲劑在食物鏈中，特別是在較高的捕食者物種內(nèi)積累，它們可在較高的捕 食者物種中充當(dāng)誘變劑和/或致癌物以引起不可逆且有害的遺傳修飾。此外，由于重復(fù)使 用相同的殺蟲劑或具有相同作用模式的殺蟲劑可使作物害蟲發(fā)展出對(duì)化學(xué)殺蟲劑的抗性。
[0008] RNA干擾或"RNAi"為由與要下調(diào)的靶基因區(qū)序列互補(bǔ)的雙鏈RNA(dsRNA)引發(fā)的 序列特異性下調(diào)基因表達(dá)的過程（還稱作"基因沉默"或"RNA介導(dǎo)的基因沉默"）。多細(xì)胞 生物中借助RNA干擾（RNAi)的靶基因下調(diào)已成為行之有效的技術(shù)。美國(guó)專利申請(qǐng)公布US 2009/0285784A1和US2009/0298787涉及dsRNA作為昆蟲防治劑，并在此將其各自的全部 內(nèi)容引入于此以作參考。美國(guó)專利6, 506, 559號(hào)、美國(guó)專利申請(qǐng)公布2003/00150017A1、國(guó) 際公布WO00/01846、W0 01/37654、W0 2005/019408、W0 2005/049841、W0 05/047300 涉及 RNAi保護(hù)植物抵抗昆蟲的用途。2012年3月30日提交的國(guó)際申請(qǐng)PCT/US12/31423涉及 青銅蝽（GallWasp)家族中桉樹害蟲的RNA-介導(dǎo)的防治。在此將前述專利和公布的申請(qǐng) 的全部?jī)?nèi)容分別引入于此以作參考。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明部分地基于發(fā)明人的桉樹的赤桉木虱入侵物種，赤桉木虱（Glycaspis brimblecombei,Gb)的基因測(cè)序。在某些方面，本發(fā)明由此提供Gb核酸、其衍生物和此類核 酸和衍生物作為Gb防治劑的用途。
[0010] 在某些方面，本發(fā)明提供分離的核酸，所述核酸在高嚴(yán)格雜交條件下與SEQID NO: 1-56和71-80中示出的序列及其互補(bǔ)序列選擇性雜交。
[0011] 在某些方面，本發(fā)明提供分離的核酸，所述核酸與SEQIDNO: 1-56和71-80中示 出的序列及其互補(bǔ)序列的同一性為90-99. 99%。
[0012] 在某些方面，本發(fā)明提供分離的核酸，所述核酸包括SEQIDNO: 1-56和71-80中 示出的序列及其互補(bǔ)序列的至少17個(gè)鄰接核苷酸。
[0013] 在某些方面，本發(fā)明提供來自Gb的核酸，所述核酸包括與所述核酸的蜜蜂直向同 源物（ortholog)的同一,性為約80%以下的上述所示的核酸。
[0014] 在某些方面，本發(fā)明提供包括可操作地連接至表達(dá)控制序列（expression controlsequence)的來自Gb的核酸或此類序列的反向互補(bǔ)體的載體。
[0015] 在某些方面，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)化有和/或承載有包括可操作地連接至表達(dá)控制序列 的來自Gb的核酸或此類序列的反向互補(bǔ)體的載體的宿主細(xì)胞。
[0016] 在某些方面，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)化有和/或承載有包括可操作地連接至表達(dá)控制序列 的來自Gb的核酸的載體的植物組織，例如葉組織和種子。
[0017] 在某些方面，本發(fā)明提供抑制Gb核酸表達(dá)的分離的小抑制性核糖核酸（siRNA)分 子。
[0018] 在某些方面，本發(fā)明提供分離的雙鏈核糖核酸（dsRNA)分子，所述分子包括與SEQ IDNO: 1-56和71-80中的至少17個(gè)鄰接核苷酸基本上同一的第一鏈核苷酸和與第一鏈核 苷酸基本上互補(bǔ)的第二鏈核苷酸。
[0019] 在某些方面，本發(fā)明提供雙鏈核糖核酸（dsRNA)分子，其與來自Gb的mRNA(Gb的 靶向dsRNA)高度同源（大于80%)，包括與dsRNA的蜜蜂直向同源物的同一性為約80%以 下的上述所示的dsRNA分子。
[0020] 在某些方面，本發(fā)明提供包括可操作地連接至作為來自Gb的dsRNA的一條鏈或兩 條鏈的模板的核苷酸序列的表達(dá)控制序列的載體。
[0021] 在某些方面，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)化有和/或承載有載體的宿主細(xì)胞，所述載體包括可 操作地連接至作為來自Gb的dsRNA的一條鏈或兩條鏈的模板的核苷酸序列的表達(dá)控制序 列。
[0022] 在某些方面，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)化有和/或承載有載體的植物組織，所述載體包括可 操作地連接至作為來自Gb的dsRNA的一條鏈或兩條鏈的模板的核苷酸序列的表達(dá)控制序 列。
[0023] 在某些方面，本發(fā)明提供抑制Gb的必需基因的表達(dá)的分離的小抑制性核糖核酸 (siRNA)分子。
[0024] 在某些方面，本發(fā)明提供通過在植物中或者在植物的繁殖或生殖材料中表達(dá)Gb 的dsRNA來生產(chǎn)抗害蟲植物的方法。
[0025] 在某些方面，本發(fā)明提供通過在桉樹中或者在桉樹的繁殖或生殖材料中表達(dá)Gb 的RNA來生產(chǎn)抗害蟲桉樹的方法。
[0026] 在某些方面，本發(fā)明提供通過在桉樹中或者在桉樹的繁殖或生殖材料中表達(dá)Gb 的靶向dsRNA來生產(chǎn)抗Gb感染和/或侵?jǐn)_的桉樹的方法。
[0027] 在某些方面，本發(fā)明提供抗植物病原害蟲的植物的生產(chǎn)方法，所述方法用表達(dá) dsRNA的重組DNA構(gòu)建體或構(gòu)建體的組合來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植物；和 在適于所述重組DNA構(gòu)建體表達(dá)的條件下使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞生長(zhǎng)。
[0028] 本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)將于下述附圖和說明書中示出。從說明書和 附圖以及從權(quán)利要求來看，本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)勢(shì)將顯而易見。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1示意性描述了某些根據(jù)本發(fā)明的非限制性核酸。（A)使用來自三個(gè)Gb基 因的序列構(gòu)建沉默構(gòu)建體的示意圖。轉(zhuǎn)基因Pl(啟動(dòng)子1)至T1(終止序列1)編碼發(fā)夾 RNA(hpRNA)用于沉默Gb，其通過將來自三個(gè)不同Gb基因（Gbl、Gb2和Gb3)的每個(gè)100bp融 合，通過合成所得序列為反向重復(fù)，并將環(huán)序列插入相應(yīng)的正義和反向重復(fù)序列之間來構(gòu) 建。轉(zhuǎn)基因P2(啟動(dòng)子2)至T2(終止序列2)編碼具有來自三個(gè)Gb基因的相應(yīng)融合100bp 序列的mRNA。由轉(zhuǎn)基因P2至T2轉(zhuǎn)錄的mRNA為沉默信號(hào)胞質(zhì)增強(qiáng)用模板。（B)通過轉(zhuǎn)基因 P1至T1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的hpRNA分子的示意圖。（C)通過轉(zhuǎn)基因P2至T2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA 的示意圖。
[0030] 圖2示意性描述了某些根據(jù)本發(fā)明的非限制性核酸。（A)根據(jù)圖1所示的總體 方案由來自三個(gè)Gb基因的序列構(gòu)建的沉默構(gòu)建體#1的示意圖。（B)通過轉(zhuǎn)基因P1至T1 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的hpRNA分子的示意圖。（C)通過轉(zhuǎn)基因P2至T2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA的示 意圖。定義：Pl_CaMV35S啟動(dòng)子（SEQIDN0:57) ;P2-sgFMV啟動(dòng)子（SEQIDN0:58); Tl-AtActin7Terminator(SEQIDN0:59) ;T2-Nos終止子（SEQIDN0:60) ;Gbl2-SEQID N0:13;Gbl3-SEQIDN0:15;Gb29-SEQIDN0:27;L-環(huán)序列位點(diǎn)（SEQIDN0:61)。
[0031] 圖3示意性描述某些根據(jù)本發(fā)明的非限制性核酸。（A)根據(jù)圖1所示的總體方案 由來自三個(gè)Gb基因的序列構(gòu)建的沉默構(gòu)建體#2的示意圖。（B)通過轉(zhuǎn)基因P1至T1的轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)生的hpRNA分子的示意圖。（C)通過轉(zhuǎn)基因P2至T2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA的示意圖。定 義：Pl-CaMV35S啟動(dòng)子（SEQIDN0:57) ;P2-sgFMV啟動(dòng)子（SEQIDN0:58) ;Tl-AtActin7 終止子（SEQIDN0:59) ;T2-Nos終止子（SEQIDN0:60) ;Gb31-SEQIDN0:32;Gb35-SEQ IDNO: 38 ;Gb56-SEQIDNO: 56 ;L-環(huán)序列位點(diǎn)（SEQIDNO:61)。
[0032] 圖4示意性描述了某些根據(jù)本發(fā)明的非限制性核酸。（A)根據(jù)圖1所示的總體方 案由來自三個(gè)Gb基因的序列構(gòu)建的沉默構(gòu)建體#3示意圖。（B)通過轉(zhuǎn)基因P1至T1的轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)生的hpRNA分子的示意圖。（C)通過轉(zhuǎn)基因P2至T2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA的示意圖。定 義：Pl-CaMV35S啟動(dòng)子（SEQIDN0:57) ;P2-sgFMV啟動(dòng)子（SEQIDN0:58) ;Tl-AtActin7 終止子（SEQIDN0:59) ;T2-Nos終止子（SEQIDN0:60) ;Gb41-SEQIDN0:44;Gb53-SEQ IDNO: 50 ;Gb54-SEQIDNO: 52 ;L-環(huán)序列位點(diǎn)（SEQIDNO:61)。
[0033] 圖5示意性描述了某些根據(jù)本發(fā)明的非限制性核酸。（A)使用來自單一Gb基因的 序列構(gòu)建的沉默構(gòu)建體的示意圖。轉(zhuǎn)基因P1至T1編碼發(fā)夾RNA(hpRNA)用于沉默Gb，其由lOObpGb基因通過合成該序列為反向重復(fù)并將環(huán)序列插入相應(yīng)的正義和反向重復(fù)序列之間 來構(gòu)建。轉(zhuǎn)基因P2至T2編碼具有來自Gb基因的lOObp序列的mRNA。由轉(zhuǎn)基因P2至T2 轉(zhuǎn)錄的mRNA為沉默信號(hào)胞質(zhì)增強(qiáng)用模板。（B)通過轉(zhuǎn)基因P1至T1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的hpRNA分 子的示意圖。（C)通過轉(zhuǎn)基因P2至T2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA的示意圖。
[0034] 圖6示意性描述了某些根據(jù)本發(fā)明的非限制性核酸。（A)使用來自兩種Gb基因的 序列構(gòu)建的沉默構(gòu)建體的示意圖。轉(zhuǎn)基因P1至T1編碼發(fā)夾RNA(hpRNA)用于沉默Gb，其由 來自兩種不同Gb基因的每個(gè)100bp，通過合成所得序列為反向重復(fù)，并將環(huán)序列插入相應(yīng) 的正義和反向重復(fù)序列之間來構(gòu)建。轉(zhuǎn)基因P2至T2編碼具有相應(yīng)的來自Gb基因的融合 的lOObp序列的mRNA。由轉(zhuǎn)基因P2至T2轉(zhuǎn)錄的mRNA為沉默信號(hào)胞質(zhì)增強(qiáng)用模板。（B) 通過轉(zhuǎn)基因P1至T1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的hpRNA分子的示意圖。（C)通過轉(zhuǎn)基因P2至T2的轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)生的mRNA的示意圖。
[0035] 各圖中相似的參考符號(hào)表示相似的元件。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 本發(fā)明人已進(jìn)行了天然桉樹害蟲Gb青銅蝽（Thaumastocorisperegrinus,Tp)的 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并發(fā)掘各自的轉(zhuǎn)錄組來鑒定對(duì)應(yīng)于GbmRNA的Gb基因的開放閱讀框。GbRNA 的鑒定允許設(shè)計(jì)介導(dǎo)Gb基因下調(diào)（沉默）的siRNA和dsRNA。因此，將此類siRNA和dsRNA 用作生物防治劑來殺滅或抑制Gb的進(jìn)展，并抑制植物的Gb感染。
[0037] 因此，本發(fā)明描述基于核酸來防治Gb害蟲的方法。此類基于核酸的方法包括，但 不限于，基于Gb雙鏈（dsRNA)、反義RNA和mRNA表達(dá)的方法。
[0038] 本發(fā)明的方法發(fā)現(xiàn)在期望抑制Gb的活力、生長(zhǎng)、發(fā)育或生殖，或者降低昆蟲的病 原性或感染性的任何【技術(shù)領(lǐng)域】實(shí)際應(yīng)用。本發(fā)明的方法進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在期望具體下調(diào)Gb昆 蟲中的一種或多種靶基因表達(dá)的情況中實(shí)際應(yīng)用。特別有用的實(shí)際應(yīng)用包括，但不限于保 護(hù)植物抵抗Gb害蟲侵?jǐn)_（pestinfestation)。
[0039] 在某些方面，防治Gb侵?jǐn)_的活性成分為雙鏈RNA(dsRNA)或可促進(jìn)或?qū)е庐a(chǎn)生 dsRNA的核酸，可將其用作殺蟲制劑。dsRNA可在宿主植物、植物部分（plantpart)、植物 細(xì)胞或種子中表達(dá)以保護(hù)植物抵抗Gb。dsRNA的序列對(duì)應(yīng)于Gb必需基因的部分或全部， 并經(jīng)RNA干擾（RNAi)引起昆蟲靶基因的下調(diào)。作為mRNA下調(diào)的結(jié)果，dsRNA阻止昆蟲靶 蛋白的表達(dá)并引起昆蟲的死亡、生長(zhǎng)停滯或不育。在該方面，用于防止昆蟲侵?jǐn)_對(duì)昆蟲感染 敏感的細(xì)胞或植物的siRNA防治昆蟲生長(zhǎng)通過使昆蟲與借助退火互補(bǔ)鏈產(chǎn)生的dsRNA接觸 來起作用，所述互補(bǔ)鏈之一具有與昆蟲靶基因的至少部分核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。 dsRNA在被昆蟲攝食然后由昆蟲經(jīng)腸吸收的植物組織中表達(dá)，從而控制生長(zhǎng)或防止侵?jǐn)_。參 見Huvenne等，2010,JInsectPhysiol56:227-35。
[0040] 用于siRNA介導(dǎo)的干擾的Gb革El基因包括優(yōu)選非冗余的活力基因（vitalgene)。 活力靶基因可為當(dāng)被抑制時(shí)干擾昆蟲生長(zhǎng)或存活或病原性或感染性的任何基因。此類活 力靶基因?qū)τ诶ハx的活力、生長(zhǎng)、發(fā)育或生殖是必需的，或者是參與昆蟲病原性或感染性， 以致特異性抑制靶基因?qū)е轮滤辣硇突蚪档突蛲Ｖ估ハx侵?jǐn)_的任何基因。此類活力靶基 因的下調(diào)（其活性不能由其他相關(guān)基因補(bǔ)充）導(dǎo)致害蟲幼蟲的嚴(yán)重?fù)p傷并提供針對(duì)無柄 (SeSSile)Gb害蟲的有效的害蟲防治系統(tǒng)。靶基因可為在此所述的任何靶基因，例如害蟲活 力、生長(zhǎng)、發(fā)育或生殖所必需的靶基因。靶基因的實(shí)例包括，例如參與蛋白質(zhì)合成和/或新 陳代謝和/或RNA合成和代謝和/或細(xì)胞進(jìn)程的基因。這些靶基因的微小敲除將對(duì)許多其 它基因和進(jìn)程產(chǎn)生影響，最終導(dǎo)致對(duì)靶害蟲的致死效應(yīng)。此類下調(diào)靶基因?qū)?dǎo)致昆蟲的死 亡，或停止或延遲昆蟲的生殖或生長(zhǎng)。此類靶基因?qū)τ诶ハx活力是至關(guān)重要的并稱為活力 基因。
[0041] 潛在的靶基因可基于與其它昆蟲物種基因的同源性來鑒定。公布的全基因組RNAi 介導(dǎo)的基因干擾庫(kù)（15, 16)可用于鑒定當(dāng)基于這些基因的RNAi表達(dá)并通過攝食或任何其 它手段引入靶害蟲有機(jī)體時(shí)使其它有機(jī)體致死的基因。因此，果蠅中鑒定為RNAi-致死的 基因可用于篩選膜翅目物種的直向同源物。此類膜翅目直向同源物可進(jìn)一步用于篩選用于 潛在靶標(biāo)的Gb物種。
[0042]Gb靶基因的核苷酸序列包括，例如SEQIDNO: 1-56和71-80中示出的序列、該序 列的互補(bǔ)體、該序列的反向互補(bǔ)體和與該序列和互補(bǔ)體在高嚴(yán)格雜交條件下選擇性雜交的 序列。靶基因的實(shí)例包括，但不限于編碼EQIDN0:ll、14、26、30、37、55、43、49和51的基 因。
[0043] 用于dsRNA-介導(dǎo)的Gb靶基因下調(diào)的核苷酸序列包括，例如，⑴SEQIDN0:l-56 和71-80中示出的序列及該序列的互補(bǔ)體；（ii)與SEQIDNO: 1-56和71-80中示出的序 列的同一性為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%的 序列，及該序列的互補(bǔ)體；（iii)包括SEQIDNO: 1-56和71-80的至少17個(gè)鄰接核苷酸， 及該序列的互補(bǔ)體；和（iv)與該序列和互補(bǔ)體在高嚴(yán)格雜交條件下選擇性雜交的序列。 [0044] 本文所使用的"分離的"核酸為已從其天然環(huán)境的組分中鑒定并分離和/或回收 的核酸。
[0045] 本文所使用的"防治害蟲"是指殺死害蟲，或防止害蟲發(fā)育或生長(zhǎng)，或防止害蟲感 染或侵?jǐn)_。本文所使用的防治害蟲還包括防治害蟲的后代（發(fā)育的卵）。本文所使用的防 治害蟲還包括抑制害蟲活力、生長(zhǎng)、發(fā)育或生殖，或降低害蟲的病原性或感染性。本文所使 用的化合物和/或組合物可用于保持有機(jī)體健康并可治療性、預(yù)防性或系統(tǒng)性地用于防治 害蟲或避免生長(zhǎng)或發(fā)育或感染或侵?jǐn)_。
[0046] 特別地，設(shè)想的通過本文所述方法防治的害蟲為植物病原性有害昆蟲。因此本文 所使用的"防治昆蟲"包括防治昆蟲后代（例如發(fā)育中的卵）。本文所使用的防治昆蟲包 括抑制昆蟲的活力、生長(zhǎng)、發(fā)育或生殖，或降低昆蟲的病原性或感染性。如本文所使用的，防 治昆蟲可指抑制昆蟲的生物學(xué)活性，產(chǎn)生一種或多種下列屬性：昆蟲進(jìn)食減少、昆蟲活力減 少、昆蟲死亡、昆蟲的分化和發(fā)育抑制、昆蟲有性生殖能力的缺失或降低。
[0047] 本文所述的化合物和/或組合物可用于保持有機(jī)體健康并可治療性、預(yù)防性或系 統(tǒng)性地用于防治昆蟲或避免昆蟲生長(zhǎng)或發(fā)育或感染或侵?jǐn)_。因此，本發(fā)明可允許之前易感 的有機(jī)體發(fā)育出抵抗昆蟲有機(jī)體侵?jǐn)_的抗性。
[0048] 術(shù)語"與……的至少部分互補(bǔ)"是指在超過10個(gè)核苷酸上，例如在至少15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24或更多個(gè)鄰接核苷酸上與靶標(biāo)核苷酸序列完全互補(bǔ)的核苷酸序列。 盡管如此，"與……的至少部分互補(bǔ)"還可包括在超過20個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度上，例如在至少 20、21、22、23、24或更多個(gè)鄰接核苷酸長(zhǎng)度上與靶標(biāo)序列的核苷酸序列的互補(bǔ)大于80%的 互補(bǔ)序列[13, 14]。
[0049] 在某些方面，本發(fā)明提供下調(diào)昆蟲中靶基因表達(dá)的方法，所述方法包括使昆蟲與 dsRNA接觸，其中，dsRNA包括退火的互補(bǔ)鏈，其中之一具有與要下調(diào)的昆蟲靶基因的核苷 酸序列至少部分互補(bǔ)的核苷酸序列，從而使dsRNA攝入昆蟲內(nèi)，進(jìn)而下調(diào)昆蟲靶基因的表 達(dá)。
[0050] 術(shù)語"昆蟲"包括所有類型和處于包括卵、幼蟲或稚蟲、蛹和成蟲階段的所有發(fā)育 階段的昆蟲。
[0051] 如本文所使用的，術(shù)語"植物"包括期望治療以預(yù)防或降低昆蟲生長(zhǎng)和/或昆蟲侵 擾的任何植物材料。其包括尤其是整株植物、秧苗、繁殖或生殖材料如種子、插條、接枝、夕卜 植體等，以及植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)物。植物材料應(yīng)表達(dá)或具有表達(dá)RNA分子的能力，所述 RNA分子包括為害蟲有機(jī)體的至少一種靶基因的正義鏈的至少部分核苷酸序列的RNA互補(bǔ) 體或表示其RNA等同物（equivalent)的至少一種核苷酸序列，以使RNA分子在植物-害蟲 相互作用時(shí)被害蟲攝取，所述RNA分子能夠通過RNA干擾抑制靶基因或下調(diào)靶基因的表達(dá)。
[0052] 術(shù)語"基因表達(dá)下調(diào)"和"基因表達(dá)抑制"可交換使用，并且是指在來自靶基因的 蛋白質(zhì)產(chǎn)物和/或mRNA產(chǎn)物水平上，基因表達(dá)的可測(cè)量或可觀察的減少，或可檢測(cè)的基因 表達(dá)的完全消除。dsRNA對(duì)基因表達(dá)的下調(diào)效果可計(jì)算為與正常基因表達(dá)相比時(shí)的至少 30 %、40 %、50 %、60 %，優(yōu)選70 %、80 %，或甚至更優(yōu)選90 %或95 %。根據(jù)靶基因的性質(zhì)， 昆蟲細(xì)胞中基因表達(dá)的下調(diào)或抑制可通過細(xì)胞或整個(gè)昆蟲的表型分析，或者通過使用分子 技術(shù)如RNA液相雜交（solutionhybridization)、PCR、核酸酶保護(hù)、RNA雜交（Northern hybridization)、反轉(zhuǎn)錄、利用微陣列的基因表達(dá)監(jiān)控、抗體結(jié)合、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)、蛋白質(zhì)印跡（Westernblotting)、放射免疫測(cè)定（RIA)、其它免疫測(cè)定或熒光激活 細(xì)胞分析（FACS)測(cè)量mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)來證實(shí)。
[0053] 必需基因的下調(diào)導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制。取決于所使用的測(cè)定，與已用對(duì)照dsRNA處理的 害蟲有機(jī)體相比，生長(zhǎng)抑制可定量為大于約5 %、10 %，更優(yōu)選約20 %、25 %、33 %、50 %、 60%、75%、80%，最優(yōu)選約90%、95%，或約99%。
[0054] "靶基因"可為期望受到抑制的必需的任何基因，因?yàn)槠涓蓴_昆蟲的生長(zhǎng)或病原性 或感染性。例如，如果本發(fā)明的方法被用于防止昆蟲生長(zhǎng)和/或侵?jǐn)_，則優(yōu)選篩選對(duì)昆蟲活 力、生長(zhǎng)、發(fā)育或生殖必需的靶基因，或者參與昆蟲病原性或感染性的任何基因，以致靶基 因的特異性抑制導(dǎo)致致死表型或降低或停止昆蟲侵?jǐn)_。
[0055] 根據(jù)一個(gè)非限制性實(shí)施方案，靶基因?yàn)楫?dāng)使用本發(fā)明的方法其表達(dá)下調(diào)或受抑制 時(shí)昆蟲死亡或者昆蟲的生殖或生長(zhǎng)停止或遲緩的此類靶基因。這種靶基因被認(rèn)為是對(duì)昆蟲 活力所必需的，并稱為必需基因。因此，本發(fā)明包括如此處所述的方法，其中所述靶基因?yàn)?必需基因。
[0056] 在不受理論束縛下，靶基因?yàn)楫?dāng)其下調(diào)時(shí)使得昆蟲的侵?jǐn)_或感染、昆蟲引起的損 害、和/或昆蟲侵?jǐn)_或感染宿主有機(jī)體和/或引起此類損害的能力降低的此類靶基因。術(shù) 語"侵?jǐn)_"（動(dòng)詞，infest)和"感染"（動(dòng)詞，infect)或者"侵?jǐn)_"（名詞，infestion)和 "感染"（名詞，infection)通常全文可交換使用。這種靶基因被認(rèn)為參與昆蟲的病原性或 感染性。因此，本發(fā)明延伸至此處所述的方法，其中所述靶基因參與昆蟲的病原性或感染 性。選擇后一種類型的靶基因的優(yōu)勢(shì)在于，阻斷昆蟲進(jìn)一步感染植物或植物部分，并且抑制 形成下一代。
[0057] 在防治特定昆蟲在宿主細(xì)胞或宿主有機(jī)體內(nèi)或上生長(zhǎng)或侵?jǐn)_的dsRNA-介導(dǎo)的方 法中，優(yōu)選dsRNA不與任何宿主基因共享，或至少不與宿主的任何必需基因共享任何顯著 同源性。由此而言，優(yōu)選dsRNA顯不小于30%、更優(yōu)選小于20%、更優(yōu)選小于10 %和甚至更 優(yōu)選小于5%的與宿主細(xì)胞的任何基因的核酸序列同一性。百分序列同一性應(yīng)以dsRNA區(qū) 的全長(zhǎng)計(jì)算。如果宿主有機(jī)體的基因組序列數(shù)據(jù)是可獲得的，則可使用標(biāo)準(zhǔn)生物信息學(xué)工 具再確認(rèn)與dsRNA的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，在dsRNA和宿主序列之間的21個(gè)鄰 接核苷酸上沒有序列同一性，意味著由此而言，優(yōu)選dsRNA的21個(gè)鄰接堿基對(duì)未出現(xiàn)在宿 主有機(jī)體的編碼序列（CDS)中。在另一實(shí)施方案中，在dsRNA的24個(gè)鄰接核苷酸上與來自 宿主物種的任何核苷酸序列的序列同一性小于約10%或小于約12%。
[0058] dsRNA包括退火的互補(bǔ)鏈，其中之一具有與要下調(diào)的靶基因的靶核苷酸序列相對(duì) 應(yīng)的核苷酸序列。dsRNA的另一鏈能夠與第一鏈堿基配對(duì)。
[0059] 靶昆蟲基因的"靶區(qū)"或"靶核苷酸序列"的表述可為基因的任何適合的區(qū)域或核 苷酸序列。革E區(qū)應(yīng)包括革E基因的至少17、至少18或至少19個(gè)連續(xù)核苷酸（consecutive nucleotide)，更優(yōu)選革El基因的至少20或至少21個(gè)核苷酸，仍更優(yōu)選革El基因的至少22、23 或24個(gè)核苷酸。
[0060] 優(yōu)選dsRNA(至少其部分）將與昆蟲靶基因的靶區(qū)共享100%的序列同一性。然 而，將理解，在雙鏈區(qū)全長(zhǎng)上的100%序列同一性對(duì)于功能性RNA抑制不是必需的。相對(duì)于 靶基因具有插入、缺失和單點(diǎn)突變的RNA序列也被發(fā)現(xiàn)對(duì)RNA抑制是有效的。
[0061] 術(shù)語"對(duì)應(yīng)于"或"與……互補(bǔ)"在此可交換使用，并且當(dāng)這些術(shù)語用于指dsRNA 與革G基因的革El區(qū)之間的序列對(duì)應(yīng)性（sequencecorrespondence)時(shí)，它們可以相應(yīng)地解讀 為，即不絕對(duì)要求100%的序列同一性。然而，dsRNA與靶區(qū)之間的百分序列同一性通常為 至少80 %或85 %同一，優(yōu)選至少90 %、95 %、96 %，或更優(yōu)選至少97 %、98 %，并仍更優(yōu)選至 少99%。當(dāng)兩條核酸鏈的至少85%的堿基配對(duì)時(shí)，這兩條核酸鏈"基本上互補(bǔ)"。
[0062] 本文所使用的術(shù)語"互補(bǔ)"涉及DNA-DNA互補(bǔ)、RNA-RNA互補(bǔ)和DNA-RNA互補(bǔ)的全 部。依此類推，術(shù)語"RNA等同物"基本上是指在DNA序列中，堿基"T"可由核糖核酸中通常 存在的相應(yīng)堿基"U"所代替。
[0063] 盡管dsRNA包含對(duì)應(yīng)于靶基因的靶區(qū)的序列，但對(duì)應(yīng)于靶區(qū)序列的整個(gè)dsRNA不 是必要的。例如，dsRNA可包含位于特異性靶序列側(cè)翼的短的非靶區(qū)，條件是此類序列在 RNA抑制中不對(duì)dsRNA的性能影響到實(shí)質(zhì)程度（materialextent)。
[0064] dsRNA可包含一種或多種置換堿基以便優(yōu)化在RNAi中的性能。如何依次改變 dsRNA的各堿基并（例如在適合的體外試驗(yàn)體系中）測(cè)試所得dsRNA的活性從而優(yōu)化所的 dsRNA的性能，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說將是顯而易見的。
[0065] dsRNA可進(jìn)一步包含DNA堿基、非天然堿基或糖-磷酸骨架的非天然骨架連接或修 飾，從而例如增強(qiáng)保存期間的穩(wěn)定性或增強(qiáng)被核酸酶降解的抗性。
[0066] 約21bp的干擾RNA(siRNA)對(duì)于基因沉默的是有用的。優(yōu)選將dsRNA的長(zhǎng)度增加 到至少約80-100bp可提高dsRNA被害蟲有機(jī)體攝取的效率。此類較長(zhǎng)的片段可在基因沉 默中更加有效，可能是由于這些長(zhǎng)dsRNA被無脊椎動(dòng)物更有效地?cái)z取。
[0067] 由具有29bp莖區(qū)（stem)和2-nt3'突出端的27-mer平端的或短發(fā)夾（sh)RNA 的RNA雙鏈體（duplex)也可用作siRNA。因此，基于上述鑒定的靶標(biāo)且為具有29bp莖區(qū)和 2-nt3'突出端的27-mer平端或短發(fā)夾（sh)RNA的靶標(biāo)的分子也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0068] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，dsRNA片段（或區(qū)域）本身將優(yōu)選為至少17bp長(zhǎng)，優(yōu)選 18或19bp長(zhǎng)，更優(yōu)選至少20bp，更優(yōu)選至少21bp、或至少22b、或至少23bp、或至少24bp、 25bp、26bp或至少27bp長(zhǎng)。"雙鏈RNA片段"或"雙鏈RNA區(qū)"的表述是指對(duì)應(yīng)于靶基因（的 部分）的dsRNA的小實(shí)體（entity)。
[0069] 更普遍地，雙鏈RNA優(yōu)選在約17-1500bp之間、甚至更優(yōu)選在約80-1000bp之間， 并最優(yōu)選在約17_27bp之間或在約80-250bp之間；例如約17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、 22bp、23bp、24bp、25bp、27bp、50bp、80bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、 450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、900bp、100bp、llOObp、1200bp、1300bp、1400bp或 1500bp的雙鏈RNA區(qū)。
[0070] dsRNA長(zhǎng)度的上限可取決于i)dsRNA被昆蟲攝取的要求和ii)dsRNA在細(xì)胞中被加 工成指導(dǎo)RNAi的片段的要求。所選長(zhǎng)度還可受到RNA合成方法和RNA運(yùn)送至細(xì)胞的模式 的影響。優(yōu)選在本發(fā)明的方法中要使用的dsRNA將為小于10, 000bp長(zhǎng)，更優(yōu)選1000bp以 下、更優(yōu)選500bp以下、更優(yōu)選300bp以下、更優(yōu)選100bp以下。對(duì)于任何給定的靶基因和 昆蟲，對(duì)于有效抑制的dsRNA的最佳長(zhǎng)度可通過實(shí)驗(yàn)確定。
[0071] dsRNA可完全或部分雙鏈化。部分dsRNA可在雙鏈部分的一端或兩端包含短單鏈 突出端，條件是RNA仍能夠被昆蟲攝取并指導(dǎo)RNAi。dsRNA還可包含內(nèi)部非互補(bǔ)區(qū)。
[0072] 本發(fā)明的方法包括向同一昆蟲同時(shí)或連續(xù)供給兩種或更多種不同的dsRNA或RNA 構(gòu)建體，以便實(shí)現(xiàn)多種靶基因的下調(diào)或抑制，或者實(shí)現(xiàn)單個(gè)靶基因更強(qiáng)有力的抑制。
[0073] 可選地，通過提供命中多種靶序列的一種dsRNA來命中多種靶標(biāo)，通過存在對(duì)應(yīng) 于靶基因的雙鏈RNA片段的超過一個(gè)拷貝來更有效地抑制單個(gè)靶標(biāo)。因此，在某些方面， dsRNA構(gòu)建體包括多個(gè)dsRNA區(qū)，每一個(gè)dsRNA區(qū)的至少一條鏈包括與昆蟲靶基因的靶核苷 酸序列的至少部分互補(bǔ)的核苷酸序列。RNA構(gòu)建體中的dsRNA區(qū)可與相同或不同的靶基因 互補(bǔ)和/或dsRNA區(qū)可與來自相同或不同昆蟲物種的靶標(biāo)互補(bǔ)。
[0074] 術(shù)語"命中（hit、hits和hitting) "是表示至少一條dsRNA鏈與革巴基因或核苷酸 序列互補(bǔ)并且其本身可結(jié)合至靶基因或核苷酸序列的可選詞匯。
[0075] 在一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈RNA區(qū)包括與靶基因互補(bǔ)的核苷酸序列的多個(gè)拷貝。可 選地，dsRNA命中相同靶基因的超過一個(gè)靶序列。本發(fā)明因而包括包含與昆蟲靶標(biāo)的核苷 酸序列的至少部分互補(bǔ)的所述核苷酸序列的至少兩個(gè)拷貝的分離的雙鏈RNA構(gòu)建體。
[0076] 如本文所述的術(shù)語"多個(gè)（種）"是指至少兩個(gè)（種）、至少三個(gè)（種）、至少四個(gè) (種）、至少五個(gè)（種）、至少六個(gè)（種）等。
[0077] "其它靶基因"或"至少一種其它靶基因"的表述是指例如第二種、第三種或第四種 等靶基因。
[0078] 開發(fā)命中超過一種上述革E1標(biāo)的dsRNA或者與上述革E1標(biāo)不同的不同dsRNA的組合并 用于本發(fā)明的方法。
[0079] 雙鏈RNA中的dsRNA區(qū)（或片段）可如下組合：a)當(dāng)靶向單個(gè)靶基因的多個(gè) dsRNA區(qū)組合時(shí)，它們可以在RNA構(gòu)建體中以原始順序組合（S卩，其中所述區(qū)域出現(xiàn)在靶基 因中的順序）；b)可選地，片段的原始順序可忽略，以便它們以任何順序隨機(jī)或有意地顛倒 (scrambled)和組合為雙鏈RNA構(gòu)建體中；c)可選地，在dsRNA構(gòu)建體中一個(gè)單獨(dú)片段可重 復(fù)多次，例如1-10次，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，或d)dsRNA區(qū)（靶向單個(gè)或不同靶 基因）可以以正義或反義方向組合。
[0080] 革E1向單個(gè)或不同弱基因（weakgene)的多個(gè)dsRNA區(qū)可組合來獲得更強(qiáng)的RNAi 效果。"昆蟲特異性"基因或序列，例如Gb特異性的、特別是Gb特異性基因和序列，包括當(dāng) 可通過生物信息學(xué)同源性檢索，例如通過BLAST檢索來確定時(shí)，在非昆蟲有機(jī)體中不具有 實(shí)質(zhì)上同源的對(duì)應(yīng)物（counterpart)的基因。特異性革E1基因的選擇產(chǎn)生種特異性RNAi效 果，而對(duì)非祀標(biāo)有機(jī)體（non-targetorganism)沒有效果或沒有實(shí)質(zhì)（不利）效果。"保守 基因"包括在靶標(biāo)有機(jī)體和非靶標(biāo)有機(jī)體之間保守（在氨基酸水平上）的基因。為了減少 對(duì)非靶標(biāo)物種可能的作用，分析此類有效但保守的基因，并選擇來自這些保守基因的可變 區(qū)的序列被RNA構(gòu)建體中的dsRNA區(qū)靶向。在核酸序列水平上評(píng)價(jià)保守性。此類可變區(qū)因 而至少包括保守靶基因的在核酸序列水平上的保守部分。根據(jù)本發(fā)明的RNA構(gòu)建體從不同 的生物學(xué)途徑靶向多基因，導(dǎo)致廣泛的細(xì)胞RNAi效果和更佳有效的昆蟲防治。在某些實(shí)施 方案中，dsRNA由序列，例如與蜜蜂直向同源物的序列的同一性等于或小于80%的Gb轉(zhuǎn)錄 組序列構(gòu)建。
[0081] 在某些方面，dsRNA構(gòu)建體構(gòu)建有影響不同類型細(xì)胞功能的基因序列。此類細(xì)胞功 能類型的實(shí)例包括，但不限于，（i)蛋白質(zhì)合成和代謝，（ii)RNA合成和代謝，和（iii)細(xì)胞 進(jìn)程。在某些實(shí)施方案中，dsRNA構(gòu)建體包括來自前述各權(quán)利要求即三種類型的序列。在 某些實(shí)施方案中，dsRNA構(gòu)建體包括來自前述類型中的兩種類型，如蛋白質(zhì)合成和代謝以及 RNA合成和代謝；蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞進(jìn)程；或RNA合成和代謝以及細(xì)胞進(jìn)程的序列。
[0082] dsRNA區(qū)包括與本文所記載的任一種靶基因的核苷酸序列的至少部分或一部分互 補(bǔ)的至少一條鏈。然而，假如雙鏈RNA區(qū)之一包括與本文所記載的任一種靶基因的核苷酸 序列的一部分互補(bǔ)的至少一條鏈，則其它雙鏈RNA區(qū)可包括與任何其它昆蟲靶基因（包括 已知的靶基因）的一部分互補(bǔ)的至少一條鏈。
[0083] 在某些構(gòu)建體中，dsRNA可包括附加序列和任選的連接子。附加序列可包括，例如 (i)促進(jìn)dsRNA構(gòu)建體大規(guī)模生產(chǎn)的序列；（ii)影響dsRNA穩(wěn)定性的提高或降低的序列； (iii)允許蛋白質(zhì)或其它分子結(jié)合以促進(jìn)RNA構(gòu)建體被昆蟲攝取的序列；（iv)為結(jié)合昆蟲 表面上或胞質(zhì)中的受體或分子以促進(jìn)被昆蟲攝取、內(nèi)吞和/或胞轉(zhuǎn)的適配體（aptamer)的 序列；或（v)催化dsRNA區(qū)加工的附加序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接子為附有條件地自剪 切（self-cleaving)RNA序列，優(yōu)選pH敏感性連接子或疏水敏感性連接子。
[0084] dsRNA構(gòu)建體的多個(gè)dsRNA區(qū)可直接連接或者通過一個(gè)或多個(gè)連接子連接。連接 子可存在于RNA構(gòu)建體中將dsRNA區(qū)與另一個(gè)感興趣區(qū)分隔的位點(diǎn)。dsRNA構(gòu)建體的多個(gè) dsRNA區(qū)可在沒有連接子的情況下連接。
[0085] 當(dāng)連接子存在時(shí)，其可用于斷開害蟲有機(jī)體中的較小的dsRNA區(qū)。有利地，在該情 況下，連接子序列可在特定情況下促使長(zhǎng)dsRNA分成較小的dsRNA區(qū)，導(dǎo)致在這些情況下分 離的dsRNA區(qū)的釋放，并由這些較小的dsRNA區(qū)產(chǎn)生更有效的基因沉默。適合的附有條件 的自剪切連接子的實(shí)例為在高pH條件下自剪切的RNA序列。此類RNA序列的適合的實(shí)例 由Borda等人記載（NucleicAcidsRes. 2003May15 ;31 (10): 2595-600)，將該文獻(xiàn)引入于 此以作參考。該序列源自錘頭狀核酶HH16的催化中心。
[0086] 連接子還可定位于dsRNA構(gòu)建體中將dsRNA區(qū)與另一例如感興趣的附加序列分隔 的位點(diǎn)，所述感興趣的附加序列優(yōu)選為RNA構(gòu)建體提供某些附加功能。
[0087]dsRNA構(gòu)建體可包括適配體以促進(jìn)dsRNA被昆蟲攝取。將適配體設(shè)計(jì)為結(jié)合被昆 蟲攝取的物質(zhì)。此類物質(zhì)可來自昆蟲或植物來源。適配體的一個(gè)具體實(shí)例為結(jié)合至跨膜蛋 白，例如昆蟲的跨膜蛋白的適配體。可選地，適配體可結(jié)合被昆蟲攝取的（植物）代謝物或 營(yíng)養(yǎng)素。
[0088] 連接子可在內(nèi)涵體中進(jìn)行自剪切。當(dāng)本發(fā)明的構(gòu)建體經(jīng)胞吞或胞轉(zhuǎn)被昆蟲攝取， 并因而在昆蟲物種的內(nèi)涵體中被區(qū)室化時(shí)這可是有利的。內(nèi)涵體可具有低pH環(huán)境，導(dǎo)致連 接子的剪切。
[0089] 當(dāng)用于經(jīng)由細(xì)胞壁運(yùn)輸從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一個(gè)細(xì)胞時(shí)，例如當(dāng)穿過有害昆蟲有 機(jī)體的細(xì)胞壁時(shí)，在疏水條件下自剪切的連接子在dsRNA構(gòu)建體中特別有用。
[0090] 內(nèi)含子可用作連接子。本文所使用的"內(nèi)含子"可為信使RNA的任何非編碼RNA序 列。
[0091] 還可將范圍在約1堿基對(duì)至約10, 000堿基對(duì)的非互補(bǔ)性RNA序列用作連接子。
[0092] 在不希望受任何特定理論或機(jī)理的束縛下，認(rèn)為長(zhǎng)dsRNA被昆蟲從它們的附近環(huán) 境中攝取。dsRNA被攝取進(jìn)入腸并轉(zhuǎn)移至腸上皮細(xì)胞，然后在細(xì)胞中通過內(nèi)源核酸內(nèi)切酶的 作用加工成短dsRNA，稱為小干擾RNA(siRNA)。所得siRNA然后通過形成稱為RISC或RNA 干擾沉默復(fù)合體的多組分RNase復(fù)合體來介導(dǎo)RNAi。
[0093] 為了實(shí)現(xiàn)昆蟲細(xì)胞內(nèi)靶基因的下調(diào)，添加至細(xì)胞壁外部的dsRNA可為可被攝取進(jìn) 入細(xì)胞，接著在細(xì)胞內(nèi)加工成siRNA，進(jìn)而介導(dǎo)RNAi的任何dsRNA或dsRNA構(gòu)建體，或者添 加至細(xì)胞外部、本身是能夠可攝取進(jìn)入細(xì)胞且從而指導(dǎo)RNAi的siRNA的RNA。
[0094]siRNA通常為長(zhǎng)度在19-25堿基對(duì)或20-24堿基對(duì)范圍內(nèi)的短的dsRNA。在優(yōu)選 實(shí)施方案中，可使用對(duì)應(yīng)于要下調(diào)的靶基因，具有19、20、21、22、23、24或25個(gè)堿基對(duì)、特別 是21或22個(gè)堿基對(duì)的siRNA。然而，本發(fā)明不意欲限制此類siRNA的使用。
[0095]siRNA可包括在雙鏈部分的側(cè)翼的一端或兩端的單鏈突出端。siRNA可包含3'突 出核苷酸，優(yōu)選兩個(gè)3'突出胸苷（dTdT)或尿苷（UU)，如果在包含于dsRNA雙鏈部分中的序 列的緊接上游的靶基因序列為AA，則3'TT或UU突出端可包含于siRNA中。這使得siRNA 中的TT或UU突出端與靶基因雜交。盡管3'TT或UU突出端還可包含于siRNA的另一端， 但是包含于siRNA雙鏈部分中序列的靶序列的下游序列不必具有AA。由此而言，作為RNA/ DNA嵌合體的siRNA也是預(yù)期的。這些嵌合體包括，例如如上所述包括具有DNA堿基3'突 出端（如，dTdT)的dsRNA以及為其中一個(gè)或多個(gè)RNA堿基或核糖核苷酸、甚至整個(gè)鏈上的 所有核糖核苷酸被DNA堿基或脫氧核糖核苷酸代替的多核苷酸的dsRNA的siRNA。
[0096]dsRNA可由兩個(gè)單獨(dú)的（正義和反義）RNA鏈通過（非共價(jià)）堿基配對(duì)退火在一起 而形成?？蛇x地，dsRNA可具有折回莖-環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中dsRNA的兩個(gè)退火鏈共價(jià)連接。 在該實(shí)施方案中，dsRNA的正義和反義鏈由部分自身互補(bǔ)的單個(gè)多核苷酸分子的不同區(qū)域 形成。如果dsRNA通過在體內(nèi)例如在宿主細(xì)胞或有機(jī)體中表達(dá)，或者通過體外轉(zhuǎn)錄來合成， 則具有該結(jié)構(gòu)的RNA是便利的。連接兩個(gè)RNA鏈的"環(huán)"的確切性質(zhì)和序列，除了不應(yīng)損害 分子的雙鏈部分介導(dǎo)RNAi的能力以外，對(duì)本發(fā)明通常是不重要的。用于RNAi的"發(fā)夾"或 "莖-環(huán)"RNA的特征通常是本領(lǐng)域已知的（例如參見WO99/53050,將其內(nèi)容引入于此以作 參考）。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，環(huán)結(jié)構(gòu)可包括如上所述的連接子序列或附加序列。
[0097] 在某些方面，本文公開的Gb序列及此類序列的互補(bǔ)體還可通過使用本領(lǐng)域內(nèi) 已知的方法表達(dá)反義RNA或過表達(dá)正義RNA來用于抑制Gb核酸的表達(dá)。所述已知方 法，參見例如Frizzi等，PlantBiotechJ, (2010)8:655-677;Brodersen等，Trendsin Genetics, (2008)22:268-280 ;和美國(guó)專利5, 759, 829。使用本文所述的表達(dá)元件、載體和 方法，針對(duì)Gb靶基因的反義RNA或正義RNA在桉樹植物中表達(dá)。在被Gb害蟲攝食后，反義 或正義RNA抑制靶基因的表達(dá)，從而防治害蟲侵?jǐn)_。
[0098] 用于設(shè)計(jì)dsRNA構(gòu)建體的靶核苷酸序列優(yōu)選至少17個(gè)，優(yōu)選至少18、19、20或21 個(gè)，更優(yōu)選至少22、23或24個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。優(yōu)選的靶核苷酸序列的非限制性實(shí)例示于實(shí)施 例中。
[0099] 靶序列可包括與本文所述序列同源的序列。靶基因的同源物可使用本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員公知的方法來發(fā)現(xiàn)。優(yōu)選的同源物為包括與本文所公開的序列的同一性為 至少約85 %或87. 5 %、仍更優(yōu)選至少約90 %、仍更優(yōu)選至少約95 %和最優(yōu)選至少約 99%或99.9%的序列的基因，或其互補(bǔ)體。用于確定序列同一性的方法在本領(lǐng)域是常 規(guī)的，并包括使用Blast軟件和EMBOSS軟件（TheEuropeanMolecularBiologyOpen SoftwareSuite(2000)，Rice,P.Longden，I?和Bleasby，A.TrendsinGenetics16，（6)pp 276-277)。本文所使用的術(shù)語"同一性"是指核苷酸水平上序列之間的關(guān)系。" ％同一性" 的表述通過在比較窗口上比較，例如兩個(gè)或更多個(gè)最佳比對(duì)序列來確定，其中與用于序列 最佳比對(duì)的參考序列相比，比較窗口中的序列部分可包括插入或缺失。參考序列不包括插 入或缺失。參考窗口選自至少10個(gè)鄰接核苷酸至約50、約100或至約150個(gè)核苷酸之間， 優(yōu)選約50和150個(gè)核苷酸之間。然后通過確定窗口中序列之間相同的核苷酸數(shù)，將相同的 核苷酸數(shù)除以窗口中的核苷酸數(shù)，再乘以100來計(jì)算"百分率同一性"。
[0100] 術(shù)語"選擇性雜交"包括涉及在嚴(yán)格雜交條件下的核酸序列與特定核酸靶序列 的雜交使得可檢測(cè)程度大于其與非靶核苷酸序列的雜交（例如相對(duì)于背景至少2倍），并 基本上排除非靶核酸。選擇性雜交序列典型地彼此具有約至少40%的序列同一性，優(yōu)選 60-90 %的序列同一性，和最優(yōu)選100 %的序列同一性（即，互補(bǔ)）。
[0101] 術(shù)語"嚴(yán)格條件"或"嚴(yán)格雜交條件"包括涉及在該條件下探針將與其靶序列雜交 使得可檢測(cè)程度大于其它序列（例如，相對(duì)于背景至少2倍）的條件。嚴(yán)格條件是序列依 賴的并且在不同環(huán)境中不同。通過控制雜交的嚴(yán)格性和/或洗滌條件，可識(shí)別可與探針達(dá) 100%互補(bǔ)的靶序列（同源探測(cè)）。可選地，可調(diào)整嚴(yán)格條件來允許序列中的某些錯(cuò)配從而 檢測(cè)較低程度的相似性（異源探測(cè)）。最佳地，探針長(zhǎng)度為約500個(gè)核苷酸，但長(zhǎng)度可從小 于500個(gè)核苷酸至等于靶序列全長(zhǎng)大幅變化。
[0102] 典型地，嚴(yán)格條件將是其中在pH7.0至8. 3和溫度為至少約30°C(短探針，例如 10至50個(gè)核苷酸）和至少約60°C(長(zhǎng)探針，例如大于50個(gè)核苷酸）下鹽濃度小于約1. 5M Na離子，典型地約0. 01至1. 0MNa離子濃度（或其它鹽）的那些。嚴(yán)格條件還可添加去 穩(wěn)定劑如甲酰胺或Denhardt's來實(shí)現(xiàn)。示例性低嚴(yán)格條件包括在37°C下用30至35%甲 酰胺、1MNaCl、l%SDS(十二烷基硫酸鈉）的緩沖溶液雜交并在50至55°C下在IX至2X SSC(20XSSC= 3. 0MNaCl/0. 3M檸檬酸三鈉）中洗滌。示例性溫和嚴(yán)格條件包括在37°C下 在40至45%甲酰胺、1MNaCl、l%SDS中雜交并在55至60°C下在0. 5X至IXSSC中洗滌。 示例性高嚴(yán)格條件包括在37°C下在50%甲酰胺、1MNaCl、l%SDS中雜交并在60至65°C在 0. IXSSC中洗滌。
[0103] 特異性典型地為雜交后洗滌的功能，關(guān)鍵因素為最終洗滌液的離子強(qiáng)度和溫度。 對(duì)于DNA-DNA雜交，L可從Meinkoth和Wahl, (1984)Anal.Biochem.，138:267-84 等式估 算：!"= 81. 5°C+16. 6(logM)+0. 41(%GC)-〇. 61(%form)-500/L;其中M為單價(jià)陽(yáng)離子 的摩爾濃度（molarity)，％GC為鳥嗓呤和胞喃啶核苷酸在DNA中的百分比，％form為甲 酰胺在雜交液中的百分比，和L為堿基對(duì)中雜交體的長(zhǎng)度。^為（在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH 下）其中50%的互補(bǔ)靶序列與優(yōu)選匹配的探針雜交的溫度。！"相對(duì)于每1%的錯(cuò)配降低約 1°C;因此，可調(diào)整Tm、雜交和/或洗滌條件來與期望同一性的序列雜交。例如，如果搜尋到 >90%同一性的序列，Tm可降低10°C。通常，選擇在確定的離子強(qiáng)度和pH下比特異序列及其 互補(bǔ)體的熱熔點(diǎn)（TJ低約5°C的嚴(yán)格條件。然而，非常嚴(yán)格條件可使用在比熱熔點(diǎn)（TJ低 1、 2、3或4°C的雜交和/或洗滌；溫和嚴(yán)格條件可使用在比熱熔點(diǎn)（Tm)低6、7、8、9或10°C 的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可使用在比熱熔點(diǎn)（Tm)低11、12、13、14、15或20°〇的雜交 和/或洗滌。使用該等式、雜交和洗滌組成以及期望的Tm，普通技術(shù)人員將理解本質(zhì)上描述 了雜交和/或洗滌液的嚴(yán)格性的變化。如果期望的錯(cuò)配程度產(chǎn)生低于45°C(水溶液）或 32°C(甲酰胺溶液）的Tm，則優(yōu)選增加SSC濃度以便可使用更高的溫度。
[0104] 對(duì)核酸雜交的深入介紹見Tijssen,LaboratoryTechniquesinBihemistryand MolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes，第I部分，第 2 章， "Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobe assays''，Elsevier,N.Y. (1993);和CurrentProtolsinMolecularBiology，第 2 章， Ausubel等，eds,GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork(1995) 〇 除非另 有說明，在本申請(qǐng)中，高嚴(yán)格性定義為在65°C下在4XSSC、5XDenhardt's(500ml水中5g 聚蔗糖、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白）、0.lmg/ml煮沸的鮭魚精子DNA和25mM磷 酸鈉中雜交和在65°C下在0.IXSSC、0. 1%SDS中洗滌。
[0105]dsRNA可通過宿主細(xì)胞或宿主有機(jī)體表達(dá)（例如在其中轉(zhuǎn)錄）。宿主細(xì)胞或有機(jī) 體可以是或可以不是對(duì)昆蟲侵?jǐn)_敏感或易受其侵害的宿主細(xì)胞或有機(jī)體。如果宿主細(xì)胞或 有機(jī)體為對(duì)昆蟲侵?jǐn)_敏感或易受其侵害的宿主細(xì)胞或有機(jī)體，作為控制昆蟲在宿主有機(jī)體 內(nèi)或上生長(zhǎng)和/或防止或減少宿主有機(jī)體的昆蟲侵?jǐn)_的機(jī)理，可使用RNAi介導(dǎo)的一種或多 種靶基因在昆蟲中的基因沉默。dsRNA在宿主有機(jī)體的細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)可因此賦予對(duì)特定昆 蟲或?qū)σ活惱ハx的抗性。假如dsRNA命中超過一種昆蟲靶基因，dsRNA在宿主有機(jī)體的細(xì) 胞中的表達(dá)可賦予對(duì)超過一種昆蟲或超過一類昆蟲的抗性。
[0106] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主有機(jī)體為植物，昆蟲為植物病原昆蟲。在該實(shí)施方 案中，通過在受植物病原昆蟲侵?jǐn)_或?qū)ζ淝謹(jǐn)_敏感或被其攝食的植物、植物組織或植物 細(xì)胞中表達(dá)dsRNA而使昆蟲與dsRNA相接觸。優(yōu)選的植物宿主有機(jī)體為桉樹。桉樹的 實(shí)例包括，但不限于以下物種：葡萄桉（E.botryoides)、蘋果桉（E.bridgesiana)、赤 按（E.camaldulesis)、灰按（E.cinerea)、藍(lán)按（E.globule)、巨按（E.grandis)、西達(dá)按 (E.gunii)、尼克爾桉（E.nicholii)、圓葉桉（E.pulverulenta)、大葉桉（E.robusta)、野桉 (E.rudis)、柳葉桉（E.saligna)、細(xì)葉桉（E.Tereticornis)、尾葉桉（E.Urophilla)、多枝 桉（E.viminalis)和任意前述物種特別是巨桉和尾葉桉的雜交種。優(yōu)選的植物病原昆蟲為 Gb，例如Gb。
[0107] 術(shù)語"植物"包括期望處理以防止或減少昆蟲生長(zhǎng)和/或昆蟲侵?jǐn)_的任何植物材 料。其包括尤其是整株植物、秧苗、繁殖或生殖材料如種子、插條、接枝、外植體等，以及植物 細(xì)胞和組織培養(yǎng)物。植物材料應(yīng)當(dāng)表達(dá)對(duì)應(yīng)于昆蟲的一種或多種靶基因的dsRNA或具備表 達(dá)該dsRNA的能力。
[0108] 在某些方面，本發(fā)明提供表達(dá)或能夠表達(dá)至少一種dsRNA的植物，優(yōu)選轉(zhuǎn)基因植 物、或（轉(zhuǎn)基因）植物的繁殖或生殖材料、或植物細(xì)胞培養(yǎng)物，其中dsRNA包括退火的互 補(bǔ)鏈，其中之一具有與昆蟲的靶基因的至少部分靶核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，以便使 dsRNA在植物-昆蟲相互作用時(shí)被昆蟲攝取，所述雙鏈RNA能夠通過RNA干擾抑制靶基因或 下調(diào)靶基因的表達(dá)。靶基因可為本文所述靶基因的任一種，例如昆蟲活力、生長(zhǎng)、發(fā)育或生 殖所必須的靶基因。
[0109] 植物可以以在一種或多種細(xì)胞、細(xì)胞類型或組織中活躍表達(dá)（轉(zhuǎn)錄）dsRNA的形式 提供。可選地，植物可為"能夠表達(dá)"的，指其用轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化，所述轉(zhuǎn)基因編碼期望的dsRNA 的轉(zhuǎn)基因，但當(dāng)提供該植物（和以提供植物的形式）時(shí)轉(zhuǎn)基因在該植物中不活躍。包括編 碼dsRNA或dsRNA構(gòu)建體的核苷酸序列的重組DNA構(gòu)建體可因而被可操作地連接至至少一 個(gè)調(diào)節(jié)序列。優(yōu)選地，調(diào)節(jié)序列選自包括如下所述的組成型啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子的 組。
[0110] 靶基因可為本文所述的任一種靶基因。優(yōu)選地，調(diào)控元件為在植物細(xì)胞中活躍的 調(diào)控元件。更優(yōu)選地，調(diào)控元件源自植物。術(shù)語"調(diào)控序列"將在廣義上理解，并指能夠影 響可操作地連接的序列表達(dá)的調(diào)控核酸。
[0111] 前述術(shù)語包括啟動(dòng)子和激活或增強(qiáng)核酸的轉(zhuǎn)錄的核酸或合成融合分子或其衍生 物，所謂的激活子或增強(qiáng)子。本文所使用的術(shù)語"可操作地連接"是指啟動(dòng)子序列與目標(biāo)基 因之間的功能性連接，以使啟動(dòng)子序列能夠起始目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。
[0112] 舉例來說，編碼dsRNA的轉(zhuǎn)基因核苷酸序列可位于誘導(dǎo)性或者生長(zhǎng)或發(fā)育階 段-特異性啟動(dòng)子控制下，通過添加誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物或當(dāng)達(dá)到生長(zhǎng)或發(fā)育特定階段 時(shí)所述啟動(dòng)子允許dsRNA轉(zhuǎn)錄的開啟。
[0113] 可選地，編碼dsRNA的轉(zhuǎn)基因位于強(qiáng)組成型啟動(dòng)子如選自包括CaMV35S啟動(dòng)子、 CaMV35S雙啟動(dòng)子、泛素啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、核酮糖二磷酸羧化酶（rubisco)啟動(dòng)子、 G0S2啟動(dòng)子、玄參花葉病毒（Figwortmosaicvirus，F(xiàn)MV)34S啟動(dòng)子、木薯葉脈（cassaya vein)花葉病毒（CsVMV)啟動(dòng)子的組的任一種的調(diào)控下（VerdaguerB.等，PlantMol. Biol.199837(6):1055-67)。
[0114] 可選地，編碼dsRNA的轉(zhuǎn)基因位于組織特異性啟動(dòng)子如選自包括編碼PsMTA類型 III幾丁質(zhì)酶基因的根特異性啟動(dòng)子，光合組織特異性啟動(dòng)子如cabl和cab2、rbcS、gapA、 gapB和ST-LS1蛋白的啟動(dòng)子，JAS啟動(dòng)子，查耳酮合成酶啟動(dòng)子和來自草莓的RJ39的啟動(dòng) 子的組的任一種的調(diào)控下。
[0115] 編碼dsRNA的轉(zhuǎn)基因還可位于昆蟲誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如馬鈴薯蛋白酶抑制劑 11(卩;[1111)啟動(dòng)子（0皿11乂等，似1:.13;[(^6(3111101.1996，14(4):494-8));或傷害誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子，例如茉莉酸醋（jasmonate)和乙稀誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、roFl.2啟動(dòng)子（MannersJM等， PlantMol.Biol. 1998, 38(6): 1071-80)的調(diào)控下；或者防御相關(guān)的啟動(dòng)子，例如水楊酸 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和植物病原相關(guān)蛋白（PR蛋白）啟動(dòng)子（PR1啟動(dòng)子（CornelissenBJ等，NucleicAcidsRes. 1987, 15(17) :6799-811 ;C0MT啟動(dòng)子（ToquinV等，卩1&拉]?〇1. Biol. 2003, 52(3) :495-509)下。
[0116] 當(dāng)使用本文所述的方法來開發(fā)抗昆蟲的轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，將編碼dsRNA的核酸位于 組織特異性啟動(dòng)子控制下可以是有益的。為了改善dsRNA從植物細(xì)胞向昆蟲的轉(zhuǎn)移，植 物可優(yōu)選在首先被植物害蟲接近或破壞的植物部分表達(dá)。在植物病原性昆蟲的情況下， 優(yōu)選的表達(dá)dsRNA的組織為葉、莖、根和種子。因此，在本文所公開的方法中，可使用植物 組織-優(yōu)選的啟動(dòng)子，例如葉特異性啟動(dòng)子、莖特異性啟動(dòng)子、韌皮部特異性啟動(dòng)子、木 質(zhì)部特異性啟動(dòng)子、根特異性啟動(dòng)子或種子特異性啟動(dòng)子（蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（sucrose transportergene)AtSUC啟動(dòng)子（BaudS等，PlantJ. 2005,43(6) :824_36)、小麥高分子 量麥谷蛋白基因啟動(dòng)子（RobertLS等，PlantCell. 1989, 1(6) :569-78.))。
[0117] 根特異性啟動(dòng)子的適合的實(shí)例為PsMTA(Fordam-Skelton，A.P.，等，1997Plant MolecularBiology34:659-668.)和類型III幾丁質(zhì)酶啟動(dòng)子。同樣被光活化的葉和 莖特異性或光合組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例為來自甜菜的兩種葉綠素結(jié)合蛋白（cabl和 cab2)的啟動(dòng)子（StahlD.J.，等，2004BMCBiotechnology20044:31)、由rbcS編碼的 核酮糖 _ 二磷酸羧化酶（Rubisco)(NomuraM?等，2000PlantMol.Biol. 44:99-106)、 葉綠體甘油醛_3_磷酸脫氫酶A(gapA)和B(gapB)亞單位（ConleyT.R.等.19941〇1. Cell.Biol. 19:2525-33;KwonH.B?等.1994PlantPhysiol. 105:357-67)、編碼葉和莖 特異性蛋白的馬鈴薯（Solanumtuberosum)基因（ST-LS1)的啟動(dòng)子（ZaidiM.A?等， 2005TransgenicRes. 14:289-98)、莖調(diào)控的防御誘導(dǎo)性基因，如JAS啟動(dòng)子（專利公布 號(hào)20050034192/US-A1)?；ㄌ禺愋詥?dòng)子的實(shí)例為例如，查耳酮合成酶啟動(dòng)子（Faktor 0.等.1996PlantMol.Biol. 32:849)，果實(shí)特異性啟動(dòng)子的實(shí)例為例如來自草莓的 RJ39(W0 98 31812)〇
[0118] 使用用于表達(dá)dsRNA的其它啟動(dòng)子，其包括但不限于來自RNAPoll、RNAPoll、 RNAPolIII、T7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子典型地用于體外生產(chǎn) dsRNA，之后將dsRNA誘導(dǎo)入抗殺蟲劑，例如誘導(dǎo)入抗殺蟲液、噴霧劑或粉劑中。
[0119] 本文所描述的dsRNA或RNA構(gòu)建體可通過以下步驟產(chǎn)生：（i)使分離的核酸或重 組DNA構(gòu)建體與無細(xì)胞組分接觸；或（ii)在允許核酸或重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的條件下將分 離的核酸或重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入（例如，通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或注射）細(xì)胞中，從而產(chǎn)生dsRNA 或RNA構(gòu)建體。
[0120] 任選地，還可將一種或多種轉(zhuǎn)錄終止序列引入重組構(gòu)建體中。術(shù)語"轉(zhuǎn)錄終止序 列"包括轉(zhuǎn)錄單元末端的控制序列，其傳導(dǎo)初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的3'加工和多聚腺苷?；约稗D(zhuǎn)錄 終止的信號(hào)。可將額外的調(diào)控元件，例如轉(zhuǎn)錄或翻譯增強(qiáng)子引入表達(dá)構(gòu)建體中。
[0121] 重組構(gòu)建體可進(jìn)一步包括在特定的細(xì)胞類型中保持和/或復(fù)制所需的復(fù)制起點(diǎn)。 一個(gè)實(shí)例為當(dāng)需要表達(dá)構(gòu)建體作為細(xì)胞中的附加型遺傳元件（例如，質(zhì)粒或柯斯質(zhì)粒分 子）保持于細(xì)菌細(xì)胞中時(shí)，優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)包括，但不限于fl-ori和colElori。
[0122] 重組構(gòu)建體可任選地包括選擇標(biāo)記基因。如本文所述，術(shù)語"選擇標(biāo)記基因"包 括任一種基因，其賦予細(xì)胞以表型，其中該基因的表達(dá)促進(jìn)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化有本發(fā)明的表達(dá)構(gòu) 建體的細(xì)胞的識(shí)別和/或選擇。適合的選擇標(biāo)記的實(shí)例包括抗氨芐青霉素（Ampr)、四環(huán)素 (Ter)、卡那霉素（Kanr)、膦絲菌素（phosphinothricin)和氯霉素（CAT)基因的抗性基因。 其它適合的標(biāo)記基因提供代謝特性，例如manA。還可使用可視化標(biāo)記基因，并且包括例如 0-葡糖醛酸酶（GUS)、熒光素酶和綠色熒光蛋白（GFP)。
[0123] 已穩(wěn)定轉(zhuǎn)化有編碼dsRNA的轉(zhuǎn)基因的植物可提供為不活躍表達(dá)dsRNA但具有活躍 表達(dá)dsRNA的能力的種子、生殖材料、繁殖材料或細(xì)胞培養(yǎng)材料。植物可以以其中在一種或 多種細(xì)胞、細(xì)胞類型或組織中活躍表達(dá)（轉(zhuǎn)錄）RNA分子的形式提供。可選地，植物可為"能 夠表達(dá)"的，指利用編碼期望的RNA分子的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化，但當(dāng)提供該植物（并且以其中提供 植物的形式）時(shí)轉(zhuǎn)基因在該植物中不活躍。許多載體可用于該目的，并且適合的載體的選 擇將主要取決于插入載體的核酸大小和要轉(zhuǎn)化有載體的特定宿主細(xì)胞。
[0124] 為了RNAi的目的在植物中表達(dá)外源dsRNA的通用技術(shù)是本領(lǐng)域已知的（參見 BaulcombeD, 2004,Nature. 431 (7006):356-63.RNAsilencinginplants，將其內(nèi)容共引 入于此以作參考）。更特別地，為了下調(diào)植物害蟲如線蟲或昆蟲中的基因表達(dá)的目的而在植 物中表達(dá)dsRNA的方法也是本領(lǐng)域已知的。類似的方法可以以類似的方式應(yīng)用，從而在植 物中表達(dá)dsRNA以下調(diào)植物病原昆蟲中靶基因的表達(dá)。為了實(shí)現(xiàn)該效果，對(duì)于植物來說，必 須僅在要與昆蟲接觸的植物的部分表達(dá)（轉(zhuǎn)錄）dsRNA，由此dsRNA可被昆蟲攝取。取決于 昆蟲的性質(zhì)及其與宿主植物的關(guān)系，dsRNA的表達(dá)可發(fā)生在昆蟲在其生命周期期間存在的 植物細(xì)胞或組織內(nèi)，包括脈管系統(tǒng)，或者RNA可分泌至細(xì)胞之間，例如在昆蟲的生命周期期 間被昆蟲占據(jù)的質(zhì)外體。
[0125] 此外，dsRNA可位于植物細(xì)胞如細(xì)胞溶膠中，或者位于植物細(xì)胞細(xì)胞器如葉綠體、 線粒體、液泡或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。dsRNA可進(jìn)一步在韌皮部中和/或轉(zhuǎn)運(yùn)至韌皮部表達(dá)，例如在葉 韌皮部或木質(zhì)部其可被吸汁害蟲攝食。參見Pitino等，PLoS0NE，6(10):e25709(2011)和 Mlotshwa等，PlantCell, 14:S289-S301 (2002)〇
[0126] 發(fā)育期間，Gb幼蟲由于攝食（例如攝食質(zhì)外體）或細(xì)胞溶解而暴露于包括脈管系 統(tǒng)在內(nèi)的細(xì)胞外環(huán)境以及細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)容物。
[0127] 可選地，dsRNA可由植物細(xì)胞分泌，并由植物分泌至植物外部。由此，dsRNA可在植 物表面上形成保護(hù)層。
[0128] 在另一方面，本發(fā)明還提供用于預(yù)防或保護(hù)植物免受害蟲侵?jǐn)_的方法和組合物的 組合。例如，一種手段提供使用植物轉(zhuǎn)基因方法與使用dsRNA分子表達(dá)的方法和使用此類 Bt殺蟲蛋白表達(dá)的方法相結(jié)合。
[0129] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于控制昆蟲生長(zhǎng)和/或防止或減少昆蟲侵 擾的組合物，其至少包括包含至少一種dsRNA的植物部分、植物細(xì)胞、植物組織或種子，其 中所述dsRNA包括退火的互補(bǔ)鏈，其中之一具有與昆蟲靶基因的至少部分核苷酸序列互補(bǔ) 的核苷酸序列。任選地，組合物進(jìn)一步包括至少一種適合的載體、賦形劑或稀釋劑。靶基因 可為本文所述的任何靶基因。優(yōu)選地，昆蟲靶基因?qū)τ诶ハx的活力、生長(zhǎng)、發(fā)育或生殖是必 須的。
[0130] 無論何時(shí)術(shù)語"一種"在"一種靶基因"的語境中使用，這是指"至少一種"靶基因。 對(duì)于"一種"靶有機(jī)體是指"至少一種"靶有機(jī)體，和"一種"RNA分子或宿主細(xì)胞是指"至少 一種"RNA分子或宿主細(xì)胞同樣適用。
[0131] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的方法依賴于存在于昆蟲外部的dsRNA被昆蟲攝取 (如，進(jìn)食），并且不需要在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)dsRNA。此外，本發(fā)明還包括如上所述的其中昆 蟲與包括dsRNA的組合物接觸的方法。
[0132] 本發(fā)明進(jìn)一步提供用于下調(diào)靶有機(jī)體（其能夠攝食植物、植物部分、植物細(xì)胞或 種子）中至少一種靶基因表達(dá)的方法，所述方法包括向靶有機(jī)體喂養(yǎng)植物、植物部分、植物 細(xì)胞或種子，所述植物、植物部分、植物細(xì)胞或種子表達(dá)dsRNA。
[0133] 在更優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供用于下調(diào)靶有機(jī)體（其能夠攝取宿主細(xì)胞或其提取 物）中至少一種靶基因的方法，所述方法包括向靶有機(jī)體喂養(yǎng)宿主植物、植物部分、植物細(xì) 胞或種子，所述宿主植物、植物部分、植物細(xì)胞或種子表達(dá)dsRNA，所述dsRNA包括與至少一 種靶基因的至少部分核苷酸序列的RNA等同物互補(bǔ)或表示至少一種靶基因的至少部分核 苷酸序列的RNA等同物的核苷酸序列，從而宿主植物、植物部分、植物細(xì)胞或種子被靶有機(jī) 體的攝食引起和/或?qū)е轮辽僖环N靶基因的表達(dá)下調(diào)。
[0134] 本發(fā)明提供如本文所定義的植物、植物部分、植物細(xì)胞或種子用于下調(diào)昆蟲靶基 因表達(dá)的用途。在更詳細(xì)的方面，本發(fā)明提供如本文所定義的宿主細(xì)胞和/或包括核苷酸 序列的RNA分子用于下調(diào)靶基因表達(dá)的用途，所述核苷酸序列包括來自靶有機(jī)體的靶基因 的至少部分核苷酸序列的RNA等同物的RNA互補(bǔ)體或表示來自靶有機(jī)體的靶基因的至少部 分核苷酸序列的RNA等同物，所述包括核苷酸序列的RNA分子通過，例如在商品制造時(shí)，在 植物、植物部分、植物細(xì)胞或種子中轉(zhuǎn)錄核酸分子來生產(chǎn)。
[0135] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的方法依賴于遺傳改良生物（GMO)法，其中dsRNA通過 受昆蟲侵?jǐn)_或?qū)ハx侵?jǐn)_敏感的細(xì)胞或有機(jī)體表達(dá)。優(yōu)選地，所述細(xì)胞為植物細(xì)胞或所述 有機(jī)體為植物。
[0136] 對(duì)于siRNA介導(dǎo)的昆蟲基因的下調(diào)，dsRNA直接或間接地引入和/或表達(dá)于昆蟲 細(xì)胞中。dsRNA可人工添加至昆蟲食物或通過轉(zhuǎn)基因食物來源如細(xì)菌和植物來生產(chǎn)[2, 8]。 包含昆蟲基因特異性序列的反向重復(fù)RNA被轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)錄，可將其加工成dsRNA并稍后 加工成siRNA(為沉默通路中的第一產(chǎn)物的小干擾RNA)。消化此類轉(zhuǎn)基因植物的昆蟲受植 物合成的dsRNA和siRNA的影響[5]。該昆蟲防治法可用于保護(hù)植物有效對(duì)抗特定的害蟲 [2, 8]。然而，不需要在植物材料中將dsRNA加工成siRNA。dsRNA可被有害昆蟲攝食并在 昆蟲細(xì)胞內(nèi)首次加工成siRNA。
[0137] 用于向植物引入外源基因的許多方法是已知的，并可用于將NT多核苷酸 插入植物宿主中，包括生物學(xué)和物理植物轉(zhuǎn)化法。例如，參見Miki等，"Procedure forIntroducingForeignDNAintoPlants，"inMethodsinPlantMolecular BiologyandBiotechnology,GlickandThompson,eds. ,CRCPress,Inc.,Boca Raton，pp. 67-88 (1993)。所選方法根據(jù)宿主植物而變化，并包括化學(xué)轉(zhuǎn)染法如磷酸鈣、微生 物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移如農(nóng)桿菌屬（Horsch等，Science227:1229_31 (1985))、電穿孔、顯微注 射和生物射彈轟擊（biolisticbombardment)。
[0138] 用于植物細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)化和植物再生的表達(dá)盒和載體以及體外培養(yǎng)方法是已知 且可獲得的。參見例如Gruber等，"VectorsforPlantTransformation，"inMethodsin PlantMolecularBiologyandBiotechnology，supra，pp.89_119〇
[0139] 分離的多核苷酸或多肽可通過一種或多種典型用于直接遞送進(jìn)入細(xì)胞的技術(shù)引 入植物中。此類方法可取決于基因修飾所靶向的有機(jī)體、細(xì)胞、植物或植物細(xì)胞的類型，即 單子葉植物或雙子葉植物而變化。適合的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法包括顯微注射（Crossway， 等，（1986)Biotechniques4:320-334 ;和U.S.Pat.No. 6, 300, 543)、電穿孔（Riggs，等， (1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5602-5606、直接基因轉(zhuǎn)移（Paszkowski等，（1984) ￡]\?0<1.3:2717-2722)和彈道粒子加速（參見，例如331^〇1'(1，等，美國(guó)專利號(hào)4,945,050 ; TO91/10725;和McCabe，等，（1988)Biotechnology6:923-926)。還參見，Tomes等， "DirectDNATransferintoIntactPlantCellsViaMicroprojectileBombardment". 第 197-213 頁(yè)，PlantCell,TissueandOrganCulture,FundamentalMethods,eds. 0.L.Gamborg&G.C.Phillips.Springer-VerlagBerlinHeidelbergN.Y.，1995 ;美國(guó) 專利號(hào) 5, 736, 369(分生組織）；Weissinger，等，（1988)Ann.Rev.Genet. 22:421-477; Sanford，等，（1987)ParticulateScienceandTechnology5:27-37 (洋蔥）；Christou， 等，（1988)PlantPhysiol. 87:671_674(大豆）；Datta，等，（1990)Biotechnology 8:736-740(水稻）；Klein，等，（1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4305-4309(玉米）； Klein，等，（1988)Biotechnology6:559_563(玉米）；W091/10725(玉米）；Klein，等， (1988)PlantPhysiol.91:440_444(玉米）；Fromm，等，（1990)Biotechnology8:833-839; 和Gordon-Kamm，等，（1990)PlantCell2:603_618(玉米）；Hooydaas_VanSlogteren &Hooykaas(1984)Nature(英國(guó)）311:763_764;Bytebierm，等，（1987)Proc.Natl. Acad.Sci.USA84:5345-5349 (Liliaceae);DeWet，等，（1985)InTheExperimental ManipulationofOvuleTissues,ed.G.P.Chapman,等，pp. 197-209.Longman，N.Y?(花 粉）；Kaeppler，等，（1990)PlantCellReports9:415-418 ;和Kaeppler，等，（1992) Theor.Appl.Genet. 84:560-566 (晶須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化）；美國(guó)專利號(hào)5, 693, 512 (聲處理）； D'Halluin，等，（1992)PlantCell4:1495-1505(電穿孔）；Li，等，（1993)PlantCell Reports12:250-255;和ChristouandFord，（1995)AnnalsofBotany75:407_413(水 稻）；〇sjoda，等，（1996)NatureBiotech. 14:745-750 ;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化（美 國(guó)專利號(hào) 5, 981，840);碳化硅晶須法（Frame，等，（1994)PlantJ. 6:941-948);激光 法（Guo，等，（1995)PhysiologiaPlantarum93:19-24);聲處理法（Bao，等，（1997) UltrasoundinMedicine&Biology23:953-959；FinerandFiner, (2000)LettAppl Microbiol. 30:406-10 ;Amoah，等，（2001)JExpBot52:1135-42);聚乙二醇法（Krens，等， (1982)Nature296:72-77);單子葉和雙子葉植物細(xì)胞的原生質(zhì)可使用電穿孔（Fromm，等， (1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:5824-5828)和顯微注射（Crossway，等，（1986)Mol. Gen.Genet. 202:179-185)轉(zhuǎn)化；將其所有引入于此以作參考。
[0140] 用于將表達(dá)載體引入植物的最廣泛利用的方法是基于農(nóng)桿菌的自然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。根 癌農(nóng)桿菌（A.tumefaciens)和毛根農(nóng)桿菌（A.rhizogenes)為植物病原土壤細(xì)菌，其在遺傳 學(xué)上轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。根癌農(nóng)桿菌和毛根農(nóng)桿菌的Ti和Ri質(zhì)粒分別攜帶負(fù)責(zé)植物遺傳轉(zhuǎn)化 的基因。參見，例如Kado，（1991)Crit.Rev.PlantSci. 10:U農(nóng)桿菌載體系統(tǒng)和農(nóng)桿菌介導(dǎo) 的基因轉(zhuǎn)移的方法的描述提供于Gruber，等，上述；Miki，等，上述；和Moloney，等，（1989) PlantCellReports8:238〇
[0141] 類似地，基因可插入分別來源于根癌農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌的Ti或Ri質(zhì)粒的T-DNA 區(qū)。因此，表達(dá)盒可使用這些質(zhì)粒如上構(gòu)建。已知許多控制序列當(dāng)其與異源編碼序列結(jié)合并 轉(zhuǎn)化至宿主有機(jī)體中時(shí)相對(duì)于原始編碼序列的組織/器官特異性在基因表達(dá)中顯示保真 性。參見例如Benfey和Chua, (1989)Science244:174-81。特別適合的用于這些質(zhì)粒的控 制序列為在各種靶植物中的基因的組成型葉特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。其它有用的控制序列包 括來自胭脂堿合酶基因（NOS)的啟動(dòng)子和終止子。NOS啟動(dòng)子和終止子存在于質(zhì)粒pARC2， 可由美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心（AmericanTypeCultureCollection)獲得并命名為ATCC 67238。如果使用此類系統(tǒng)，則來自Ti或Ri質(zhì)粒的毒性（vir)基因也必須或者與T-DNA部 分一起或者經(jīng)其中vir基因存在于單獨(dú)載體的二元體系存在。在其中使用的此類系統(tǒng)、載 體和轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法記載于美國(guó)專利4, 658, 082號(hào)；1986年10月1日提交的美國(guó)專 利申請(qǐng)系列號(hào)913, 914,參考1993年11月6日公布的美國(guó)專利5, 262, 306號(hào)；和Simpson, 等，（1986)PlantMol.Biol.6:403-15m，將其全部?jī)?nèi)容引入于此以作參考。
[0142] 一旦構(gòu)建，這些質(zhì)?？芍糜诿r(nóng)桿菌或根癌農(nóng)桿菌中以及用于轉(zhuǎn)化通常對(duì)鐮刀 菌屬（Fusarium)或鏈格孢屬（Alternaria)感染敏感的植物物種的細(xì)胞的這些載體中。根 癌農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌的選擇將取決于由此轉(zhuǎn)化的植物。通常根癌農(nóng)桿菌是優(yōu)選的轉(zhuǎn)化有 機(jī)體。大多數(shù)雙子葉植物、一些裸子植物和少數(shù)單子葉植物（如百合目（Liliales)和天南 星目（Arales)的某些成員）對(duì)根癌農(nóng)桿菌感染敏感。毛根農(nóng)桿菌還具有廣泛的宿主范圍， 包含大多數(shù)雙子葉植物和一些裸子植物，其包括豆科（Leguminosae)、菊科（Compositae) 和藜科（Chenopodiaceae)的成員。如今轉(zhuǎn)化單子葉植物已取得一些成功。歐洲專利申請(qǐng) 604 662A1號(hào)公開了使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法。歐洲專利申請(qǐng)672752A1號(hào)公 開了使用未成熟胚胎的盾片（scutellum)利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法。Ishida等 討論了通過將未成熟胚胎暴露于根癌農(nóng)桿菌來轉(zhuǎn)化玉米的方法（NatureBiotechnology 14:745-50(1996))。
[0143] 一旦轉(zhuǎn)化，這些細(xì)胞可用于再生轉(zhuǎn)基因植物。例如，可通過造成植物創(chuàng)傷然后將 載體引入傷口部位，用這些載體感染整個(gè)植物。植物的任何部分可造成創(chuàng)傷，包括葉、莖和 根?？蛇x地，外植體形式的植物組織，例如子葉組織或葉盤可接種這些載體，并在促進(jìn)植物 再生的條件下培養(yǎng)。通過用包含編碼伏馬菌素（fumonisin)降解酶基因的毛根農(nóng)桿菌或根 癌農(nóng)桿菌接種植物組織而轉(zhuǎn)化的根或嫩枝可用作植物組織來源，從而經(jīng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生或 器官發(fā)生來再生伏馬菌素-抗性轉(zhuǎn)基因植物。此類用于再生植物組織的方法的實(shí)例公開于 Shahin, (1985)Theor.Appl.Genet. 69:235-40 ;美國(guó)專利號(hào) 4, 658, 082 ;Simpson,等，上述； 和美國(guó)專利申請(qǐng)913, 913和913, 914號(hào)，二者均于1986年10月1日提交，參考1993年11 月16日公布的美國(guó)專利5, 262, 306號(hào)，將其中全部公開內(nèi)容引入于此以作參考。
[0144] 作為農(nóng)桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的替代方法已開發(fā)了幾種植物轉(zhuǎn)化方法（統(tǒng)稱為直接基 因轉(zhuǎn)移）。
[0145] 植物轉(zhuǎn)化的普遍適用的方法為微粒-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（mircoprojectile-mediated transformation)，其中在尺寸為約1至4ym的微粒表面上攜帶DNA。利用將微粒加速至 300至600m/s速度，足以穿透植物細(xì)胞壁和膜的生物射彈裝置（biolisticdevice)將表 達(dá)載體引入的植物組織（Sanford,等，（1987)Part.Sci.Technol. 5:27 ;Sanford, (1988) TrendsBiotech6:299 ;Sanford, (1990)Physiol.Plant79:206;和Klein,等，（1992) Biotechnology10:268)〇
[0146] 物理遞送DNA至植物的另一方法為如Zang等描述的靶細(xì)胞的聲處理（（1991) BioTechnology9:996)。可選地，脂質(zhì)體或原生質(zhì)體融合已用于將表達(dá)載體引入植物中。 參見例如Deshayes等，（1985)EMB0J.4:2731;和Christou,等，（1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3962。還已報(bào)道了使用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鳥氨酸將DNA直接攝取 進(jìn)入原生質(zhì)體中。參見例如Hain等，（1985)Mol.Gen.Genet. 199:161 ;和Draper等，（1982) PlantCellPhysiol. 23:451。
[0147] 還記載了原生質(zhì)體和整個(gè)細(xì)胞和組織的電穿孔。參見例如Donn等，（1990) AbstractsoftheVllthInt' 1.CongressonPlantCellandTissueCulture IAPTC，A2-38,p.53 ;D，Halluin等，（1992)PlantCell4:1495-505;和Spencer等，（1994) PlantMol.Biol. 24:51-61。
[0148] 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后，進(jìn)行植物繁殖。最常見的植物繁殖方法是通過種子。然而，通過種子 繁殖的再生具有使作物中缺少均勻性的雜合性引起的缺陷，這是因?yàn)榉N子是植物根據(jù)孟德 爾法則支配的遺傳變異而產(chǎn)生的?；旧?，每個(gè)種子在遺傳學(xué)上是不同的，且每個(gè)將以其自 身特有的特征生長(zhǎng)。因此，優(yōu)選轉(zhuǎn)化植物以使再生植物具有親本轉(zhuǎn)基因植物同一的特征和 特性這樣的方式產(chǎn)生。
[0149] 轉(zhuǎn)化植物可通過微體繁殖（micropropagation)來再生，所述微體繁殖使轉(zhuǎn)化植 物快速、一致的生殖。微體繁殖為由從選擇的親本植物或培養(yǎng)植物中切離的單片組織長(zhǎng)成 新一代植物的方法。該方法允許具有表達(dá)融合蛋白的優(yōu)選組織的植物的規(guī)?；敝?。所產(chǎn) 生的新一代植物在遺傳學(xué)上與原始植物同一，并具有原始植物所有的特性。微體繁殖使得 優(yōu)質(zhì)植物材料在短時(shí)間內(nèi)規(guī)?；a(chǎn)，并使所選栽培植物快速增殖，保留原始轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn) 化植物的特性?？寺≈参锏膬?yōu)勢(shì)為植物增殖速度和所產(chǎn)生的植物優(yōu)良和一致。
[0150] 微體繁殖為多階段步驟，需要在階段之間改變培養(yǎng)基或生長(zhǎng)條件。因此，微體繁殖 方法涉及四個(gè)基本階段：階段一，初始組織培養(yǎng)；階段二，組織培養(yǎng)增殖；階段三，分化和植 物形成；和階段四，溫室培養(yǎng)和強(qiáng)化（hardening)。在階段一初始組織培養(yǎng)期間，建立組織 培養(yǎng)并證實(shí)無污染物。在階段二期間，繁殖初始組織培養(yǎng)物，直至產(chǎn)生足以滿足生產(chǎn)目標(biāo)數(shù) 量的組織樣品。在階段三期間，將在階段二中生長(zhǎng)的組織樣品分離并生長(zhǎng)為單獨(dú)的小植株。 在階段四中，將轉(zhuǎn)化的小植株轉(zhuǎn)移至溫室來強(qiáng)化，其中植物對(duì)光的耐受性逐漸增加，從而可 在自然環(huán)境中生長(zhǎng)。
[0151] 在某些方面，本發(fā)明提供抗植物病原害蟲的植物的生產(chǎn)方法，所述方法為用重組 DNA構(gòu)建體或表達(dá)dsRNA的構(gòu)建體的組合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植物；和在 適于表達(dá)所述重組DNA構(gòu)建體的條件下使轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞生長(zhǎng)。
[0152] 本發(fā)明的方法適用于對(duì)由RNA干擾產(chǎn)生的基因沉默敏感且能夠從其周圍環(huán)境內(nèi) 在化dsRNA的Gb物種。本發(fā)明適用于處于任何發(fā)育階段的昆蟲。由于昆蟲具有非生長(zhǎng)的 外骨骼，它們不能以均一的速度生長(zhǎng)，而是在通過周期性脫落其外骨骼的各階段中生長(zhǎng)。該 過程稱為蛻皮或換羽。蛻皮之間的階段稱為"齡"，且根據(jù)本發(fā)明可靶向這些階段。另外，根 據(jù)本發(fā)明還可靶向昆蟲的卵或幼蟲。根據(jù)本發(fā)明可靶向包括有翅昆蟲的變形在內(nèi)的發(fā)育周 期中的所有階段。因此，個(gè)體階段如幼蟲、蛹、稚蟲等發(fā)育階段都可靶向。
[0153] Gb為桉樹的害蟲。因此，本文所述的核酸、dsRNA和方法對(duì)于處理或抑制Gb感染 和侵?jǐn)_桉樹是有用的。
[0154] 實(shí)施例
[0155] 實(shí)施例1
[0156] Gb轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
[0157]Gb樣品從自來自巴西圣保羅州桉樹的感染的葉采集。總RNA由在各個(gè)發(fā)育階段的 蛹（nymphs)和成蟲的混合物獲得。將各批100個(gè)樣品置于冰上的各微管中。然后將管密封 并立即冷凍于液氮中并保存在-80°C直至進(jìn)一步處理。使用MasterPureRNA純化試劑盒和 操作手冊(cè)（MRC85102_EpicentereBiotechnologies)分離總RNA?？俁NA體積為 50yl。然 后用DNAse處理總RNA以除去殘留DNA，接著分離polyAmRNA(MicroPoly(A)Purist,小規(guī) 模mRNA純化試劑盒，AM1919Ambion)。mRNA終體積為20y1。純化的mRNA保存在-80°C直 至進(jìn)行454測(cè)序。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作手冊(cè)進(jìn)行454測(cè)序，從而提供靶害蟲的轉(zhuǎn)錄組。組裝序列，并 使用羅氏軟件包基于與已知公開的半翅目豌豆財(cái)（PeaAphidAcyrthosiphonpisum，Ap) 血吸蟲的序列比對(duì)注釋結(jié)果，并使用Blast2Go程序（可于http://www.blast2go.org/中 獲得）注釋。
[0158] 實(shí)施例2
[0159] Gb靶基閔和序列的鑒宙
[0160] 特定組織或整個(gè)有機(jī)體的細(xì)胞進(jìn)程或適當(dāng)?shù)陌l(fā)育進(jìn)程所必需的獨(dú)特的至關(guān)重要 的Gb基因鑒定為基因沉默的革E1標(biāo)?；诠_的黑腹果幡（Drosophilamelanogaster,Dm)) [15, 16]列表中的RNAi文庫(kù)產(chǎn)生591個(gè)顯示在RNAi轉(zhuǎn)基因Dm中致死的基因。該列表進(jìn)一 步縮小為參與翻譯、轉(zhuǎn)錄和發(fā)育的基因。所得140個(gè)基因的亞群參與下列中的一種或多種： 蛋白質(zhì)合成和/或代謝、RNA合成和代謝，和細(xì)胞進(jìn)程。
[0161] 將鑒定為由于果蠅中RNAi而在表達(dá)時(shí)致死的140個(gè)基因的BLAST(NCBI)比較用 于鑒定128個(gè)來自豌豆蚜（Ap)的直系同源序列。將鑒定的Ap序列的比較進(jìn)一步用于篩選 Gb454轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的潛在靶基因。潛在的Gb靶基因限于在開放閱讀框中包括至少350bp或 為預(yù)測(cè)的全長(zhǎng)基因的至少50%的Gb454轉(zhuǎn)錄組序列。Gb454轉(zhuǎn)錄組的篩選鑒定了 27個(gè)潛 在的青銅蝽祀標(biāo)。
[0162] 27個(gè)潛在的Gb祀標(biāo)進(jìn)一步篩選以鑒定與蜜蜂意蜂（Apismellifera,Ap))序列共 享有限同源性的序列。使用公開可用的NCBIB12Seq分析程序（可于
[0163]http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ?PAGE_TYPE= BlastSearch&PR0G_DEF=blastn&BLAST_PR0G_DEF=megaBlast&SHOff_DEFAULTS= on&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_L0C=align2seq獲得）進(jìn)行比較，以鑒定來自各Gb革巴 標(biāo)的與相應(yīng)的Am基因共享限定（即小于80%)同一性的100bp序列（或者，當(dāng)不能鑒定具 有小于80%的同一性的100bp序列時(shí)，鑒定此類序列的較短片段）。鑒定的區(qū)域與相應(yīng)的 蜜蜂序列都顯示38-74%的同一性。
[0164] 鑒定的具有與Ap序列限定同源性的各Gb靶基因和序列在SEQIDN0:1-58中示 出。表1示出其中鑒定的具有有限同源性的各Gb靶基因和序列的SEQIDNOs。
[0165] 表1?具有與密峰（意峰（Apis mellifera))序列有限同一十生的Gb革巴基因矛口片段
[0166]

【權(quán)利要求】
1. 一種分離的小的抑制性核糖核酸分子（dsRNA)，其抑制Gb的必需基因的表達(dá)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的dsRNA，其包括與來自所述必需基因的至少17個(gè)鄰接核苷酸 基本上同一的第一鏈核苷酸和與所述第一鏈核苷酸基本上互補(bǔ)的第二鏈核苷酸的單元。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的dsRNA，其中所述核苷酸第一鏈和第二鏈為至少約25、35、50、 70或100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的dsRNA，其中所述核苷酸第一鏈和第二鏈在它們各 自的長(zhǎng)度上與所述必需基因的同一性為70-100 %。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的dsRNA，其包括至少兩（2)個(gè)所述單元。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的dsRNA，其中所述至少兩個(gè)單元源自不同的必需基因。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的dsRNA，其中所述至少兩個(gè)單元源自單一物種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的dsRNA，其中所述至少兩個(gè)單元源自不同物種。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2-8任一項(xiàng)所述的dsRNA，其進(jìn)一步包括分隔所述核苷酸第一鏈和所 述第二鏈的環(huán)區(qū)。
10. -種載體，其包括可操作地連接至作為根據(jù)權(quán)利要求2-9任一項(xiàng)的一條鏈或兩條 鏈的模板的核苷酸序列的表達(dá)控制序列。
11. 一種宿主細(xì)胞，其包括根據(jù)權(quán)利要求10所述的表達(dá)載體。
12. -種植物組織，其包括根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的dsRNA。
13. -種植物組織，其包括根據(jù)權(quán)利要求10所述的載體。
14. 一種植物組織，其包括根據(jù)權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞。
15. -種分離的核酸，其包括在高嚴(yán)格雜交條件下與選自由SEQ ID N0:30、l-29、31-56 和71-80及其互補(bǔ)序列組成的組的序列選擇性雜交的序列。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的分離的核酸，其中所述核酸與所述選自由SEQ ID NO: 1-56 和71-80及其互補(bǔ)序列組成的組的序列的同一性為90-99. 99%。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的分離的核酸，其中所述核酸包括選自由SEQ ID NO: 1-56和71-80及其互補(bǔ)序列組成的組的序列的至少17個(gè)鄰接核苷酸。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的分離的核酸，其中所述核酸包括選自由SEQ ID NO: 1-56和 71-80及其互補(bǔ)序列組成的組的序列的至少25個(gè)鄰接核苷酸。
19. 根據(jù)權(quán)利要求15-18任一項(xiàng)所述的分離的核酸，其中所述核酸與所述核酸的蜜蜂 直向同源物的同一性小于約80%。
20. -種載體，其包括可操作地連接至表達(dá)控制序列的根據(jù)權(quán)利要求15-19任一項(xiàng)所 述的分離的核酸。
21. -種宿主細(xì)胞，其包括根據(jù)權(quán)利要求20所述的載體。
22. -種植物組織，其包括根據(jù)權(quán)利要求20所述的載體。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的植物組織，其中所述組織選自由葉組織、葉脈、韌皮部、木 質(zhì)部、葉柄、小枝、枝、花、干、果實(shí)和種子組成的組。
24. -種分離的小的抑制性核糖核酸分子（siRNA)，其抑制編碼CG3590、CG5451、Tef、 eIF3-S8、Hel25E、Uev 1A、Mor、Trip 或 tws 基因的 Gb 核酸分子的表達(dá)。
25. -種分離的雙鏈核糖核酸分子（dsRNA)，其包括與SEQ ID NO: 1-56和71-80中所 示的至少17個(gè)鄰接核苷酸基本上同一的第一鏈核苷酸和與所述第一鏈核苷酸基本上互補(bǔ) 的第二鏈核苷酸的單元。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的分離的dsRNA，其中所述核苷酸第一鏈與SEQ ID NO: 1-56 和71-80中所示的至少17個(gè)鄰接核苷酸基本上同一。
27. 根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的分離的dsRNA，其中所述核苷酸第一鏈和第二鏈為至 少約25、35、50、70或100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。
28. 根據(jù)權(quán)利要求25-27任一項(xiàng)所述的dsRNA，其中所述核苷酸第一鏈和第二鏈在它們 各自的長(zhǎng)度上與SEQ ID NO: 1-56和71-80的同一性為70-100%。
29. 根據(jù)權(quán)利要求25-28任一項(xiàng)所述的dsRNA，其中所述核苷酸第一鏈和第二鏈的序列 與所述核苷酸第一鏈和第二鏈的蜜蜂直向同源物的序列的同一性小于約80%。
30. 根據(jù)權(quán)利要求25-29任一項(xiàng)所述的dsRNA，其包括至少兩（2)個(gè)所述單元。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的dsRNA，其中所述至少兩個(gè)單元源自選自由SEQ ID NO: 1-56和71-80組成的組的不同序列。
32. 根據(jù)權(quán)利要求25-31任一項(xiàng)所述的dsRNA，其進(jìn)一步包括分隔所述核苷酸第一鏈和 所述第二鏈的環(huán)區(qū)。
33. -種載體，其包括可操作地連接至作為根據(jù)權(quán)利要求25-32任一項(xiàng)的一條鏈或兩 條鏈的模板的核苷酸序列的表達(dá)控制序列。
34. -種宿主細(xì)胞，其包括根據(jù)權(quán)利要求33所述的表達(dá)載體。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主為細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主為農(nóng)桿菌。
37. -種植物組織，其被根據(jù)權(quán)利要求36所述的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
38. -種植物組織，其包括根據(jù)權(quán)利要求25-36任一項(xiàng)所述的dsRNA。
39. -種抗害蟲植物的生產(chǎn)方法，其包括在所述植物或者在所述植物的繁殖或生殖材 料中表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1-9或權(quán)利要求25-32任一項(xiàng)所述的dsRNA。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述植物為桉樹。
41. 根據(jù)權(quán)利要求39或40所述的方法，其中所述害蟲為Gb。
42. -種害蟲侵?jǐn)_的抑制方法，其包括培養(yǎng)包含根據(jù)權(quán)利要求11-18或權(quán)利要求25-33 任一項(xiàng)所述的dsRNA的植物，從而抑制所述侵?jǐn)_。
43. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述植物為桉樹。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述害蟲為Gb。
45. -種抗植物病原害蟲的植物的生產(chǎn)方法，其包括： (a) 用表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1-9或權(quán)利要求25-32任一項(xiàng)所述的dsRNA的重組DNA構(gòu)建 體或構(gòu)建體的組合來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞； (b) 由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞來再生植物；和 (c) 在適于所述重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的條件下使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞生長(zhǎng)， 與未轉(zhuǎn)化植物相比，所述長(zhǎng)成的轉(zhuǎn)化植物因此抗所述害蟲。
46. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其進(jìn)一步包括用表達(dá)與所述dsRNA的一條鏈或其片 段互補(bǔ)的單鏈RNA的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所述植物細(xì)胞。
47. 根據(jù)權(quán)利要求45或46所述的方法，其中所述植物為桉樹。
48. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述害蟲為Gb。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK104508134SQ201380033221
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2013年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月23日
【發(fā)明者】D·阿維薩爾, D·西格爾, Z·薩尼 申請(qǐng)人:富優(yōu)基尼以色列股份有限公司