得到單核細胞或nk 細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及從末梢血分離可用于免疫細胞療法的細胞，并使其增殖的方法。本發(fā)明可提供免疫細胞療法中可利用的充分的數(shù)的免疫系統(tǒng)細胞。
【專利說明】得到單核細胞或NK細胞的方法
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明涉及從末梢血分離可用于免疫細胞療法的細胞，并使其增殖的方法，更具體涉及從末梢血分離單核細胞或NK細胞，并使其增殖的方法。
【【背景技術(shù)】】
[0002]近年在多個醫(yī)療機關(guān)實施作為免疫細胞療法的NK療法及單核細胞來源的樹突細胞療法。利用獲得性免疫的樹突細胞療法及利用自然免疫的NK療法由其益處而作為組合療法適用的情況多。
[0003]至今，上述組合療法的情況中，樹突細胞及NK細胞從獨立的血液得到。之后分化為樹突細胞的單核細胞由成分輸血(成分采血)進行成分采集。另一方面，NK細胞從末梢血采集,并增殖。從而,在上述組合療法中一般需要2次采血。
[0004]【現(xiàn)有技術(shù)文獻】
[0005]【非專利文獻】
[0006]非專利文獻 1:Castiello et al., Cancer Tmmunol.1mmunother.,60:457-466, 2011。
[0007]非專利文獻2:Zamai et al.，J.1mmunol.，178:4011-4016, 2007。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0008]【發(fā)明要解決的技術(shù)課題】
[0009]但是，由于僅一方面的采血(特別是成分輸血)也給患者帶來負擔，如果進行兩方的采血,對患者的身體的負擔會再增大。從而,在免疫細胞療法中需求對患者負擔少的,用于得到單核細胞及NK細胞的其他方法。
[0010]從而，鑒于這樣的課題，本發(fā)明的目的是減輕患者的負擔的同時，提供免疫細胞療法中利用可能的充分的數(shù)的免疫系細胞。
[0011]【解決課題的技術(shù)方案】
[0012]為了解決上述課題，本發(fā)明中涉及的方法是得到單核細胞或NK細胞的方法，其包括:
[0013]從末梢血，使用對于單核細胞的表面標志物特異性的抗體分離單核細胞，由此回收單核細胞樣品的工序，
[0014]將分離單核細胞之后的細胞集團作為NK細胞樣品回收的工序，以及
[0015]培養(yǎng)上述單核細胞樣品或NK細胞樣品，使單核細胞或NK細胞增殖的工序。
[0016]【發(fā)明效果】
[0017]由本發(fā)明可減輕患者的負擔的同時，提供免疫細胞療法中利用可能的充分的數(shù)的免疫系細胞。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0018]【圖1】是顯示確認單核細胞從末梢血選擇性地分離的FACS解析的結(jié)果的圖。
[0019]【圖2】是顯示確認選擇性地分離單核細胞之后的樣品中含NK細胞的FACS解析的結(jié)果的圖。
[0020]【圖3】是顯示從根據(jù)本發(fā)明中涉及的培養(yǎng)方法及以往的培養(yǎng)方法增殖的單核細胞、及所述單核細胞分化的樹突細胞的細胞數(shù)的經(jīng)時的變化的圖。
[0021]【圖4】是顯示根據(jù)本發(fā)明中涉及的培養(yǎng)方法及以往的培養(yǎng)方法增殖的NK細胞的細胞數(shù)的經(jīng)時的變化的圖。
[0022]【圖5】是顯示確認單核細胞增殖(第3天)的FACS解析的結(jié)果的圖。
[0023]【圖6】是顯示確認樹突細胞增殖的FACS解析的結(jié)果的圖。
[0024]【圖7】是顯示確認NK細胞增殖的FACS解析的結(jié)果的圖。
[0025]【實施方式】
[0026]本發(fā)明中涉及的方法是得到單核細胞或NK細胞的方法，其包括:使用對單核細胞的表面標志物特異性的抗體從末梢血分離單核細胞，由此回收單核細胞樣品的工序，將分離單核細胞之后的細胞集團作為NK細胞樣品回收的工序，以及培養(yǎng)上述單核細胞樣品或NK細胞樣品，使單核細胞或NK細胞增殖的工序。
[0027]S卩，本發(fā)明中涉及的方法使至少任何一方之后增殖作為前提，包括從末梢血分離單核細胞及NK細胞。從而，分離得到的單核細胞及NK細胞沒必要是對于免疫細胞療法的實施充分的量。由本發(fā)明中涉及的方法，使從少量的末梢血分離的單核細胞及NK細胞增殖，提供免疫細胞療法中利用可能的充分的數(shù)的免疫系細胞成為可能。
[0028]以從少量的末梢血分離必要的免疫系細胞之后，使各細胞增殖至免疫細胞療法中利用可能的數(shù)為例，以下說明本發(fā)明中涉及的方法中的處理的細節(jié)。再有，在本說明書中使用時，用語“單核細胞樣品”是指含以單核細胞為主的細胞集團的樣品。另外，在本說明書中使用時，用語“NK細胞樣品”指基本上不含單核細胞，但含NK細胞的細胞集團的樣品。
[0029]【從末梢血回收單核細胞樣品及NK細胞樣品】
[0030]如上所述，本發(fā)明中涉及的方法包括從末梢血將單核細胞樣品及NK細胞樣品的各自分開回收的工序。另外，如上所述，所述工序經(jīng)使用對單核細胞的表面標志物特異性的抗體的單核細胞的選擇性分離實施。所述抗體與磁珠等的載體結(jié)合。通過使與抗體結(jié)合的載體與含單核細胞的樣品混合之后，經(jīng)抗體回收與單核細胞結(jié)合的載體，得到單核細胞樣品。作為代替的的方法，所述抗體可由生物素標記。用所述方法可利用鏈霉親和素對標記上述抗體的生物素的相互作用而分離單核細胞。
[0031]其中，作為上述抗體的例，可舉出抗CD14抗體及抗CD16抗體等。其中舉的抗體是一例，本領(lǐng)域公知的對單核細胞的表面標志物特異性的各種抗體可用于本發(fā)明中涉及的方法。
[0032]如上所述利用抗體及載體，作為選擇性地分離單核細胞的方法，可舉出將StemCell Technologies公司提供的RoboSep裝置和RoboSep人CD14陽性試劑盒或RoboSep陰性人單核細胞試劑盒等組合的方法。所述方法由于可大致不經(jīng)人手而自動地實施從血液樣品選擇性分離單核細胞，從而對本發(fā)明中涉及的方法適宜。Stem Cell Technologies公司，除上述試劑盒之外，提供使用者選擇使用的抗體而與試劑組合的試劑盒。從而，通過組合例舉的抗體和所述試劑盒，利用RoboSep裝置從血液樣品分離單核細胞是可能的。
[0033]再有，通過組合RoboS印陰性人NK細胞試劑盒或RoboS印人CD56陽性試劑盒等和RoboS印裝置，可從血液樣品分離NK細胞。
[0034]優(yōu)選在使用抗體選擇性分離單核細胞之前，部分分離末梢血。優(yōu)選由從末梢血分離單核細胞級分的使用Ficoll溶液的密度梯度離心分離來預先分離末梢血。由于使用Ficoll溶液的這樣的密度梯度離心分離是用于得到免疫細胞療法中使用的NK細胞的一般方法，從而不特別說明其詳細。
[0035]再有，所述密度梯度離心分離是以在分離單核細胞級分之后，與適宜的抗體及細胞因子一同培養(yǎng)此單核細胞級分，由此得到活化的T淋巴細胞及NK細胞作為目的的一般方法。即，在如本發(fā)明中涉及的方法一樣分離單核細胞，并使其增殖之前通常不進行實施所述密度梯度離心分離。
[0036]在本發(fā)明中涉及的方法中，優(yōu)選確認如上所述得到的單核細胞樣品中含何種程度的單核細胞?？深A先知對于使得到的單核細胞樣品中的單核細胞增殖至希望得到的細胞數(shù)而言必要的培養(yǎng)的天數(shù)、及根據(jù)需要分化為樹突細胞的培養(yǎng)開始起的天數(shù)。單核細胞樣品中所含的單核細胞的程度可由使用公知的流式細胞儀及熒光標記的抗CD14抗體的FACS解析確認。使用的抗體是對單核細胞的表面標志物特異性的抗體即可。從而，例如，用于分離單核細胞的上述的抗體在熒光標記之后可用于FACS解析。
[0037]如后述，本發(fā)明中涉及的方法培養(yǎng)得到的單核細胞樣品及NK細胞樣品，使單核細胞及NK細胞各自選擇性地獨立增殖。從而，得到的單核細胞樣品及NK細胞樣品的各自只要含相比對于免疫細胞療法必要的數(shù)遠更少的數(shù)的希望得到的細胞(單核細胞及NK細胞的各自)即可。從而，本發(fā)明中涉及的方法僅需要微少的量(例如25mL)的末梢血。即，在單核細胞的分離中不實施一般性的大量(例如數(shù)百mL?數(shù)L)的采血。因此，本發(fā)明中涉及的方法，在免疫細胞療法中，使由采血導致的時間及身體負擔大幅地減輕。
[0038]在本說明書中，少量的末梢血是指例如10mL以下，優(yōu)選為75mL以下，更優(yōu)選為50mL以下，最優(yōu)選為25mL以下的末梢血。采集的血液越少，對個體的負擔也越減輕。但是，末梢血中的單核細胞及NK細胞的數(shù)依賴于個體的身體的狀態(tài)而不大同，所以根據(jù)采集的個體的狀態(tài)及必要的細胞數(shù)，采集的末梢血的量可適宜變更。
[0039]分離單核細胞及NK細胞的末梢血可為單次采集的末梢血、或者分多次采集的末梢血的混合物。如上所述，由于必要的量少，在本發(fā)明中涉及的方法中，末梢血通常單次采集。
[0040]【單核細胞的增殖】
[0041]本發(fā)明中涉及的方法優(yōu)選使回收的單核細胞樣品中所含的單核細胞選擇性地增殖。在本發(fā)明中涉及的方法中，單核細胞樣品使用補充作為干細胞的生長因子已知的Flt-3L的單核細胞增殖用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。通過使用所述培養(yǎng)基，如后述的實施例所示，一般而言不進行的單核細胞的增殖變得可能。
[0042]上述單核細胞增殖用培養(yǎng)基是將單核細胞的維持中使用的公知的培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基使用。上述基本培養(yǎng)基是，如實施例所示，由寶生物公司等市售，部分改變市售的制品的培養(yǎng)基，或者與市售的制品有類似的組成。上述單核細胞增殖用培養(yǎng)基可含單核細胞的刺激(增殖、活化及分化的促進)中使用的公知的細胞因子(例如GM-CSF)。另外，上述單核細胞增殖用培養(yǎng)基可補充適宜的公知的抗生物質(zhì)。另外，上述單核細胞增殖用培養(yǎng)基可再含從回收單核細胞樣品的末梢血分離的血漿(自身血漿)。對上述單核細胞增殖用培養(yǎng)基的適宜的其他添加物由于是用于單核細胞的維持及向樹突細胞的分化的各種的添加物，所以由本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。
[0043]Flt-3L 以例如，500 ?5000IU/mL、更優(yōu)選為 1000 ?4000IU/mL、最優(yōu)選為 2000IU/HiL的濃度含在上述單核細胞增殖用培養(yǎng)基中。GM-CSF以例如，500?5000IU/mL、更優(yōu)選為1000?2500IU/mL、最優(yōu)選為1000IU/mL的濃度含在上述單核細胞增殖用培養(yǎng)基中。
[0044]上述單核細胞樣品使用上述單核細胞增殖用培養(yǎng)基培養(yǎng)任意的期間(至得到希望得到的量的單核細胞)。上述期間根據(jù)得到的單核細胞樣品中所含的單核細胞的數(shù)而變更。以后述的實施例的情況為例，上述期間，例如，從25mL的末梢血回收單核細胞樣品時是約14天。上述情況的單核細胞樣品中的單核細胞由約14天的培養(yǎng)例如可能增殖至約IXlO7細胞。
[0045]如從以上的記載得知，本發(fā)明中涉及的Flt-3L是向上述單核細胞增殖用培養(yǎng)基加的添加劑(例如單核細胞的增殖促進劑)。另外，本發(fā)明涉及Flt-3L作為向上述單核細胞增殖用培養(yǎng)基加的添加劑的用途。
[0046]如后述，在本發(fā)明中涉及的方法中，在培養(yǎng)途中(例如培養(yǎng)的第3天)，可向培養(yǎng)物加使單核細胞分化為樹突細胞的因子。即，沒必要非得使僅單核細胞增殖至例如約IXlO7細胞。從而此時，僅將單核細胞選擇性地培養(yǎng)的期間是約3天，培養(yǎng)全體的期間是約14天。免疫細胞療法中實際上使用的是單核細胞來源的樹突細胞。從而，在本發(fā)明中涉及的方法中，優(yōu)選在使單核細胞增殖的同時分化為實際上使用的樹突細胞。在以下的項目中，對使單核細胞增殖的同時分化為樹突細胞進行說明。
[0047]【單核細胞向樹突細胞的分化】
[0048]在本發(fā)明中涉及的方法中，單核細胞向樹突細胞的分化使用再補充細胞因子等的上述單核細胞增殖用培養(yǎng)基實施。在從單核細胞向未成熟樹突細胞的分化中，再補充到上述單核細胞增殖用培養(yǎng)基的細胞因子一般而言是IL-4及GM-CSF?？捎糜趩魏思毎蛭闯墒鞓渫患毎姆只腎L-4及GM-CSF是市售的，或者通過使編碼IL-4或GM-CSF的(重組)人基因表達得到。
[0049]然后，未成熟樹突細胞使用含抗原的生物學材料(例如，腫瘤細胞(含其的組織片)、腫瘤標志物、特定的疾病的病巢部片及病毒感染細胞等)、或者形成抗原的生物學材料(例如，抗原肽、蛋白質(zhì)(長鏈肽)或其片段、及抗原核酸等)進行脈沖。受脈沖之后的未成熟樹突細胞通過在再加細胞因子、生理活性物質(zhì)及免疫賦活劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，成熟為成熟樹突細胞。
[0050]用于向成熟樹突細胞的分化的細胞因子、生理活性物質(zhì)及免疫賦活劑是例如IL-1 β、IL-6、TNFa、PGE2及氯化畢西巴尼(0K432)等，這些均可作為市售品得到，或者通過使編碼這些細胞因子的(重組)人基因表達而得到。再有，其中舉對于未成熟樹突細胞向成熟樹突細胞的分化最適的細胞因子、生理活性物質(zhì)及免疫賦活劑的組合。對于所述分化必須的組合是例如，PGE2及0K432。
[0051]IL-1 β以例如，在2?100ng/mL、更優(yōu)選為5?50ng/mL、最優(yōu)選為10ng/mL的濃度含在用于使單核細胞分化為樹突細胞的上述單核細胞增殖用培養(yǎng)基中。IL-6以例如，在200?6000IU/mL、更優(yōu)選為500?4000IU/mL、最優(yōu)選為1000IU/mL的濃度含在用于使單核細胞分化為樹突細胞的上述單核細胞增殖用培養(yǎng)基中。TNFa以例如，在2?100ng/mL、更優(yōu)選為10?50ng/mL、最優(yōu)選為20ng/mL的濃度含在用于使單核細胞分化為樹突細胞的上述單核細胞增殖用培養(yǎng)基中。PGE2以例如，在0.05?5μ g/mL、更優(yōu)選為0.5?2 μ g/mL、最優(yōu)選為I μ g/mL的濃度含在用于使單核細胞分化為樹突細胞的上述單核細胞增殖用培養(yǎng)基中。氯化畢西巴尼以例如，在0.005?10KE、更優(yōu)選為0.05?5KE、最優(yōu)選為0.1KE的濃度含在用于使單核細胞分化為樹突細胞的上述單核細胞增殖用培養(yǎng)基中。
[0052]在本發(fā)明中涉及的方法中，從25mL的末梢血得到單核細胞樣品時，如上所述，單核細胞樣品的培養(yǎng)經(jīng)約14天實施。此時，使單核細胞分化為未成熟樹突細胞的細胞因子例如在培養(yǎng)的第3天向培養(yǎng)基加。上述脈沖例如在培養(yǎng)的第11天實施。脈沖之后，向培養(yǎng)基加誘導向成熟樹突細胞的分化的細胞因子及免疫賦活劑。在培養(yǎng)的第14天，得到希望得到的數(shù)(例如I X 17細胞)的樹突細胞(參照實施例2-1.)。
[0053]從以上的記載可知，本發(fā)明中涉及的Flt-3L是向用于得到樹突細胞的培養(yǎng)基加的添加劑(例如樹突細胞的增殖促進劑)。另外，本發(fā)明涉及作為向用于得到樹突細胞的培養(yǎng)基加的添加劑而使用Flt-3L。
[0054]以從25 μ mL的末梢血得到單核細胞樣品時作為一例，對單核細胞的增殖及分化的期間進行說明。但是，如上所述，根據(jù)得到的單核細胞樣品中所含的單核細胞的數(shù)，培養(yǎng)的期間可延長或縮短。這樣的培養(yǎng)的期間的設定是本領(lǐng)域技術(shù)人員依經(jīng)驗知道的事項。
[0055]細胞數(shù)，在任意的時間點，可例如使用錐蟲藍計數(shù)。另外，計數(shù)的細胞集團中所含的單核細胞及樹突細胞的比例可由使用熒光標記的抗CD14抗體(單核細胞)及抗CD83抗體(樹突細胞)的FACS解析確定。從而，在確定細胞數(shù)及細胞種類的各時間點，可任意地分別變更培養(yǎng)及分化的期間。
[0056]樹突細胞將體內(nèi)的異物(例如病毒及細菌以及這些的片段)攝取到細胞內(nèi)。由此，樹突細胞通過將抗原(上述異物或所述異物的處理物)呈遞到其他免疫系統(tǒng)的細胞而使對所述異物特異性的免疫應答活化。從而，通常通過對樹突細胞使用對不被識別為異物的疾病(例如腫瘤)特異性的疾病標志物(例如對于腫瘤的WTl)，脈沖單核細胞來源的樹突細胞，可得到可處置各種疾病的樹突細胞。
[0057]【NK細胞的增殖】
[0058]本發(fā)明中涉及的方法優(yōu)選使回收的NK細胞樣品中所含的NK細胞選擇性地增殖。在本發(fā)明中涉及的方法中，NK細胞樣品使用補充識別NK細胞的表面標志物的抗CD56抗體的NK細胞增殖用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。通過使用所述培養(yǎng)基，如后述的實施例所示，可使NK細胞樣品(分離單核細胞的其余的細胞集團)中的NK細胞選擇性地增殖。
[0059]—般而言,用于免疫細胞療法的NK細胞通過使用含誘導NK細胞的分化、成熟、活化及增殖的細胞因子(IL-2、IL-12及IL-15)的培養(yǎng)基培養(yǎng)末梢血來源的單核細胞級分來增殖。但是，使用這樣的培養(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明中涉及的NK細胞樣品時，NK細胞不增殖至充分的數(shù)(參照實施例的2-6.)。從而，至今已知的使NK細胞增殖的條件及方法無法適用于本發(fā)明中涉及的方法。
[0060]上述NK細胞增殖用培養(yǎng)基將NK細胞的增殖中使用的公知的培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基使用。上述基本培養(yǎng)基，如實施例所示，由KohjinB1公司等市售，是部分改變市售的制品的培養(yǎng)基，或者與市售的制品有類似的組成。上述NK細胞增殖用培養(yǎng)基可含通常的NK細胞的增殖及活化中使用的IL-2、IL-12及IL-15。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過如上述一樣的至今已知的使NK細胞增殖的條件及方法公知在至此所舉的添加物以外的對上述NK細胞增殖用培養(yǎng)基的添加物。
[0061]抗CD56抗體以例如，I?200 μ g/mL、更優(yōu)選為10?150 μ g/mL、最優(yōu)選為80 μ g/mL的濃度含在用于使NK細胞增殖活化的上述NK增殖用培養(yǎng)基中。再有，以上對將抗CD56抗體直接添加到培養(yǎng)基進行了說明，但可使用固定于任意的支持體(例如塑料瓶及皿)的抗CD56抗體(固相化的抗CD56抗體)。固相化時，上述濃度范圍表示相對于使用的培養(yǎng)基的量的抗CD56抗體的使用量。IL-2以例如，100?3000IU/mL、更優(yōu)選為1000?2000IU/mL、最優(yōu)選為1750IU/mL的濃度含在用于使NK細胞增殖活化的上述NK增殖用培養(yǎng)基中。IL-12以例如，100?5000IU/mL、更優(yōu)選為500?3000IU/mL、最優(yōu)選為2000IU/mL的濃度含在用于使NK細胞增殖活化的上述NK增殖用培養(yǎng)基中。IL-15以例如，100?5000IU/mL、更優(yōu)選為500?3000IU/mL、最優(yōu)選為2000IU/mL的濃度含在用于使NK細胞增殖活化的上述NK增殖用培養(yǎng)基中。
[0062]NK細胞樣品可經(jīng)與上述的單核細胞樣品同樣的期間培養(yǎng)。例如，本發(fā)明中涉及的NK細胞樣品使用上述NK細胞增殖用培養(yǎng)基，經(jīng)約14天培養(yǎng)。由經(jīng)約14天的培養(yǎng)，例如NK細胞可增殖至I X 19細胞(參照實施例的2-3.)。
[0063]從以上的記載可知，本發(fā)明中涉及的抗CD56抗體是向NK細胞增殖用培養(yǎng)基加的添加劑(例如NK細胞的增殖促進劑)。另外，本發(fā)明涉及抗CD56抗體作為向NK細胞增殖用培養(yǎng)基加的添加劑的用途。
[0064]培養(yǎng)物中的細胞數(shù)與單核細胞同樣地在使用錐蟲藍培養(yǎng)之間的任意的時間點實施。此時，培養(yǎng)物的細胞集團中的NK細胞的比例可由使用熒光標記的抗CD56抗體的FACS解析確定。
[0065]NK細胞的通常的作用主要是攻擊腫瘤細胞及感染細胞。從而，活化的NK細胞對于癌及感染癥的處置有用。從而，由使用腫瘤標志物的脈沖使樹突細胞成熟，與NK細胞一同使用，則預期對于癌特別優(yōu)良的治療效果。
[0066]另外，如至今說明，由本發(fā)明中涉及的方法，從少量的末梢血得到對免疫細胞療法充分的數(shù)的NK細胞及樹突細胞是可能的。從而，可大幅地減輕由對患者的采血導致的時間及身體負擔。特別是，在由免疫細胞療法的癌的治療中，多需要達長期的多次的免疫細胞的施用。此時，大量的采血不僅對患者而言是非常的負擔，隨患者的狀態(tài)，無法采血而變得不得不延期或中止治療行為本身。如此，本發(fā)明中涉及的方法可容易地實現(xiàn)減輕患者的負擔地實施繼續(xù)的免疫細胞療法。
[0067]本發(fā)明中涉及的方法是分離從個體(例如人)采集的血液中所含的有用的免疫系統(tǒng)細胞，并使其增殖的方法。根據(jù)本發(fā)明得到的單核細胞，通過分化是制作免疫細胞療法中使用的樹突細胞的材料。另外，根據(jù)本發(fā)明得到的NK細胞及樹突細胞是在免疫細胞療法中直接使用的細胞(藥品)。
[0068]〔結(jié)論〕
[0069]本發(fā)明中涉及的方法是得到單核細胞或NK細胞的方法，其包括:
[0070]使用對單核細胞的表面標志物特異性的抗體從末梢血分離單核細胞，由此回收單核細胞樣品的工序，
[0071]將分離單核細胞之后的細胞集團作為NK細胞樣品回收的工序，以及
[0072]培養(yǎng)上述單核細胞樣品或NK細胞樣品，使單核細胞或NK細胞增殖的工序。
[0073]另外，在本發(fā)明中涉及的方法中，使單核細胞或NK細胞增殖的上述工序優(yōu)選是將上述單核細胞樣品使用含F(xiàn)lt-3L的第I培養(yǎng)基培養(yǎng)，從而使單核細胞增殖的工序。
[0074]另外，本發(fā)明中涉及的方法優(yōu)選還包括:通過向上述第I培養(yǎng)基加GM-CSF及IL-4，一邊使單核細胞增殖，一邊使單核細胞分化為樹突細胞的工序。
[0075]另外，在本發(fā)明中涉及的方法中，使單核細胞或NK細胞增殖的上述工序優(yōu)選是將上述NK細胞樣品使用含抗CD56抗體或IFN- Y的第2培養(yǎng)基培養(yǎng)，從而使NK細胞增殖的工序。
[0076]另外，本發(fā)明中涉及的方法優(yōu)選在使單核細胞或NK細胞增殖的上述工序中，將上述NK細胞樣品使用含抗CD56抗體或IFN- Y的第2培養(yǎng)基培養(yǎng)，從而使NK細胞再增殖。
[0077]另外，在本發(fā)明中涉及的方法中，上述第2培養(yǎng)基優(yōu)選含抗CD56抗體。
[0078]另外，在本發(fā)明中涉及的方法中，上述第2培養(yǎng)基優(yōu)選還含IL-2、IL_12及IL-15。
[0079]另外，在本發(fā)明中涉及的方法中，上述末梢血優(yōu)選從個體單次采集。
【實施例】
[0080]〔1.從單次采集的末梢血分離單核細胞及NK細胞〕
[0081]【1-1.單核細胞的選擇性的分離及其確認】
[0082]由使用Ficoll溶液(GE HEALTHCARE公司)的密度梯度離心分離(30分鐘、900g、20°C )，從自健康者采集的25mL的末梢血分離單核細胞級分。使用RoboSep裝置(StemCell Technologies公司)，從得到的單核細胞級分再分離單核細胞。在從此單核細胞級分的單核細胞的分離中，作為選擇性地分離單核細胞的試劑，使用RoboSep人CD14陽性試劑盒(Stem Cell Technologies公司)。單核細胞的選擇性的分離中的順序及必要的其他試劑的全部則依據(jù)對應于上述試劑的RoboSep裝置的運行程序、及隨附的使用者手冊。
[0083]將根據(jù)以上的操作得到的樣品之一部分與熒光標記的抗⑶14抗體(B1Legend公司、針對單核細胞的細胞表面標志物的抗體)混合。然后，由BD FACSCalibur (注冊商標)流式細胞儀(日本BD公司)研究此混合物中所含的單核細胞的程度。此FACS解析的結(jié)果示于圖1。圖1是顯示對CD14陽性細胞進行FACS解析的象限區(qū)的直方圖的圖。如圖1所示，可確認，在上述樣品中主要含在表面表達CD14的單核細胞。
[0084]【1-2.NK細胞的存在的確認】
[0085]將1-1.中得到的單核細胞的余下的細胞集團之一部分與熒光標記的抗CD56抗體(B1Legend公司、針對NK細胞的細胞表面標志物的抗體)混合。然后，由BDFACSCalibur (注冊商標)流式細胞儀研究此混合物中所含的NK細胞的程度。此FACS解析的結(jié)果示于圖2。圖2是顯示對CD56陽性細胞進行FACS解析的象限區(qū)的直方圖的圖。如圖2所示，得知在以往廢棄的細胞集團中含有用的NK細胞。
[0086]如上所述，得知，除了僅分離單核細胞的以往的方法之外，通過再回收至今廢棄的細胞集團，可從由單次的采血得到的少量的末梢血將單核細胞及NK細胞各自分開得到。
[0087]〔2.單核細胞及NK細胞的增殖〕
[0088]【2-1.本發(fā)明中涉及的，單核細胞的增殖及向樹突細胞的分化】
[0089]使1-1.中分離的單核細胞增殖，從其分化為樹突細胞。至培養(yǎng)的O?第3天，使用向X-VIV0-15培養(yǎng)基(寶生物公司)補充1000IU/mL的GM-CSF(Miltenyi B1tec公司)、2000IU/mL的Flt_3L(Cellgenix公司)、50ng/mL的慶大霉素、及5%的自身血漿的培養(yǎng)基Al，使單核細胞選擇性地增殖。在第3天，向培養(yǎng)基Al加1000IU/mL的IL_4 (MiltenyiB1tec公司)(培養(yǎng)基A2)。然后，通過持續(xù)培養(yǎng)至第11天，使單核細胞分化為未成熟樹突細胞。在第11天，將未成熟樹突細胞使用MUCl肽(ThermoFisher公司)、或者封入脂質(zhì)小胞的WTl等進行脈沖。然后，使用將10ng/mL的IL-1 β (Miltenyi B1tec公司)UOOOIU/mL 的 IL-6 (Miltenyi B1tec 公司)、I μ g/mL 的 PGE2 (Cayman Chemical 公司)、20ng/mL 的TNF-a (Miltenyi B1tec公司)、及0.1KE的氯化畢西巴尼(中外制藥)加到培養(yǎng)基A2而得到的培養(yǎng)基A3，使未成熟樹突細胞分化為成熟樹突細胞。以上中的全部的培養(yǎng)在5% CO2存在下的37°C實施。培養(yǎng)的第0、3、6、8、11及14天的各自中的細胞數(shù)(細胞數(shù)/mL)由錐蟲藍染色確定。確定的細胞數(shù)的經(jīng)時的變化示于圖3。
[0090]如圖3(添加Flt-3L)所示，在培養(yǎng)的14天后可確認，在第O天是7.4X 15細胞的細胞增殖至1.05X 17細胞。以上中，從單核細胞分化，增殖的樹突細胞的數(shù)是1.05X 17細胞。從而，可從單次采集的25mL的末梢血得到對于免疫細胞療法充分的數(shù)的樹突細胞。
[0091]【2-2.增殖的細胞種類的確認】
[0092]在2-1.的培養(yǎng)的第3及14天的各自中，由FACS解析確認增殖的細胞的種類。使用突光標記的⑶14抗體(B1Legend公司)研究第3天的培養(yǎng)物之一部分。使用突光標記的抗⑶IIc抗體(BD公司)及突光標記的抗⑶83抗體(eB1science公司)研究第14天的培養(yǎng)物之一部分。使用BD FACSCalibur (注冊商標)流式細胞儀(日本BD公司)實施全部的FACS解析。這些的FACS解析的結(jié)果示于圖5及6。
[0093]如圖5所示，得知，在第3天的培養(yǎng)物中基本上僅含單核細胞。如圖6所示，得知，在第14天的培養(yǎng)物中基本上僅含成熟樹突細胞。從而確認，2-1.中的增殖及分化如所希望地進行。
[0094]【2-3.使用刺激單核細胞的公知的因子培養(yǎng)單核細胞】
[0095]與2-1.不同地再次進行1-1.的操作，分離單核細胞。將此單核細胞，除未將Flt-3L添加到培養(yǎng)基的點之外，在與2-1.相同的條件下培養(yǎng)。此培養(yǎng)的各時間點的細胞數(shù)示于圖3。如圖3(非添加Flt-3L)所示，用誘導單核細胞的分化的一般的此方法，在培養(yǎng)的第14天，細胞僅增殖至2.8 X 106/mL。
[0096]如上所述，本發(fā)明中涉及的方法通過使用至今未知作用于單核細胞的增殖的因子，可得到對于醫(yī)療用途充分的數(shù)的成熟樹突細胞。
[0097]【2-4.NK細胞的選擇的增殖】
[0098]如以下一樣培養(yǎng)1-1.中得到的細胞集團。在培養(yǎng)的第O天中，使用向KBM502培養(yǎng)基(Kohjin B1 公司)(預先含 1750IU/mL 的 IL-2)補充 200IU/mL 的 IL-12 (MiltenyiB1tec 公司)、2000IU/mL 的 IL-15 (Cellgenix 公司)>80 μ g/mL 的抗 CD56 抗體(B1legend公司)、及5%的自身血漿的培養(yǎng)基，在5% CO2存在下的38°C，經(jīng)24小時使淋巴細胞活化。然后，將培養(yǎng)條件變更為5% CO2存在下的37°C，將細胞培養(yǎng)至第14天。培養(yǎng)的第0、3、6、
8、11及14天的各自中的細胞數(shù)(細胞數(shù)/mL)由錐蟲藍染色確定。確定的細胞數(shù)的經(jīng)時的變化示于圖4。
[0099]如圖4(IL_2，抗-⑶56，IL-12, IL-15)所示，培養(yǎng)的14天后可確認，在第O天是
9.6 X 16細胞的細胞數(shù)增加至8.8 X 18細胞。在以上中，增殖的NK細胞的數(shù)是大概19細胞。從而，可從單次采集的25mL的末梢血得到對免疫細胞療法充分的數(shù)的NK細胞。
[0100]【2-5.增殖的細胞種類的確認】
[0101]在2-4.的培養(yǎng)的第14天，由FACS解析確認增殖的細胞的種類。使用熒光標記的抗CD56抗體(B1Legend公司)研究各培養(yǎng)物之一部分。使用BD FACSCalibur (注冊商標)流式細胞儀(日本BD公司)實施FACS解析。此FACS解析的結(jié)果示于圖7。
[0102]如圖7所示，確認最終得到基本上僅含NK細胞的培養(yǎng)物。
[0103]【2-6.作為生長因子僅使用IL-2的NK細胞的增殖】
[0104]與2-4.不同地再次進行1-1.的操作，得到含NK細胞的細胞集團。將此細胞集團，除作為生長因子僅使用IL-2的點之外，在與2-4.相同的條件下培養(yǎng)。此培養(yǎng)的各時間點的細胞數(shù)示于圖4。如圖4(IL-2)所示，用此方法，在培養(yǎng)的第14天，細胞數(shù)僅增加至4.6 X 17細胞，未得到充分的細胞。
[0105]從以上得知，為了使從末梢血分離的NK細胞選擇性地增殖，得到希望程度的數(shù)，僅用IL-2是不充分的，至少必要IL-12、IL-15及抗⑶56抗體之任何。
[0106]如從本實施例得知，可從微少25mL的單次采集的末梢血，分別得到對于免疫細胞療法充分的量的樹突細胞及NK細胞。從而，可從以檢查作為目的的程度的量的末梢血大量地得到2種有用的免疫系細胞。即，本發(fā)明中涉及的方法可提高使用樹突細胞及NK細胞的免疫細胞療法的有用性(使對受采血的對象的時間及身體負擔大幅地降低)。
[0107]本發(fā)明不限于上述的各實施方式及實施例，專利權(quán)利要求中所示的范圍內(nèi)的各種變更是可能的，適宜組合不同的實施方式及實施例中各自公開的技術(shù)的方案而得到的實施方式也包括在本發(fā)明的技術(shù)的范圍內(nèi)。
[0108]【工業(yè)實用性】
[0109]本發(fā)明可用于對各種疾病的免疫細胞療法。
【權(quán)利要求】
1.得到單核細胞或NK細胞的方法,其包括: 使用對單核細胞的表面標志物特異性的抗體從末梢血分離單核細胞，由此回收單核細胞樣品的工序， 將分離單核細胞之后的細胞集團作為NK細胞樣品回收的工序，以及 培養(yǎng)上述單核細胞樣品及NK細胞樣品之中的至少一方而使單核細胞或NK細胞增殖的工序。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中使單核細胞或NK細胞增殖的上述工序是將上述單核細胞樣品使用含F(xiàn)lt-3L的第I培養(yǎng)基培養(yǎng)，從而使單核細胞增殖的工序。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其還包括通過向上述第I培養(yǎng)基加入單核細胞的刺激因子，一邊使單核細胞增殖，一邊使單核細胞分化為樹突細胞的工序。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中使單核細胞或NK細胞增殖的上述工序是將上述NK細胞樣品使用含抗CD56抗體或IFN- Y的第2培養(yǎng)基培養(yǎng)，從而使NK細胞增殖的工序。
5.權(quán)利要求2或3所述的方法，其中在使單核細胞或NK細胞增殖的上述工序中，將上述NK細胞樣品使用含抗CD56抗體或IFN- Y的第2培養(yǎng)基培養(yǎng)，從而使NK細胞再增殖。
6.權(quán)利要求4或5所述的方法，其中所述第2培養(yǎng)基含抗CD56抗體。
7.權(quán)利要求4?6之任一項所述的方法，其中所述第2培養(yǎng)基還含IL-2、IL-12及IL-15。
8.權(quán)利要求1?7之任一項所述的方法，其中所述末梢血從個體單次采集。
【文檔編號】C12N5/0783GK104395461SQ201380034962
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2013年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月2日
【發(fā)明者】阿部博幸, 川崎廣明 申請人:阿部博幸, 川崎廣明