用于從hPSC生成胰腺祖細胞和功能性β細胞的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于從內(nèi)胚層細胞群產(chǎn)生NKX6-1+胰腺祖細胞和/或胰島素產(chǎn)生的細胞的方法和組合物，所述方法包括使內(nèi)胚層細胞群與EGF組分、煙酰胺組分和/或Noggin組分接觸，任選地與至少一種EGF組分和至少一種煙酰胺組分的組合接觸，以誘導(dǎo)至少一個內(nèi)胚層細胞分化為NKX6-1+胰腺祖細胞，所述組合任選地還包含至少一種Noggin組分。
【專利說明】用于從hPSC生成胰腺祖細胞和功能性β細胞的方法和組 合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生ΝΚΧ6-1陽性胰腺祖細胞和功能性胰腺β細胞的方法和組合 物。

【背景技術(shù)】
[0002] 從人多能干細胞（hPSC ;包括胚胎干細胞；hESC和誘導(dǎo)性多能干細胞；hiPSC)生 成胰腺祖細胞的能力可以為以下提供人內(nèi)分泌、外分泌及導(dǎo)管細胞來源：1)預(yù)測藥物毒理 學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)，2)用于治療糖尿病的移植，和3)在體外建立正常的胰腺發(fā)育和糖尿病發(fā)展 模型。為了實現(xiàn)上述目的，要求能夠從不同的hESC和hiPSC細胞系繁殖高度富集的胰腺祖 細胞群，并能夠促進胰腺祖細胞在體外和體內(nèi)成熟為產(chǎn)生胰島素的β細胞。先前的出版物 已報道，可以從hPSC生成產(chǎn)生胰島素的細胞，然而生成的是多激素（poly-hormonal)細胞。 對這些產(chǎn)生胰島素的細胞的分析指出，所述產(chǎn)生胰島素的細胞不表達NKX6-1，這是對功能 性β細胞的發(fā)育必不可少的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。一項研究已證明從hESC生成NKX6-1 +祖細胞， 表明該NKX6-1+祖細胞被移植入免疫低下的受體后，能夠分化為功能性β細胞（Kelly等 2011)。而且，該項研究數(shù)據(jù)基于兩個具有分化為胰腺譜系傾向的hESC細胞系。當應(yīng)用于 其它細胞系時，該項研究中描述的方案并不能促使NKX6-1+祖細胞的有效發(fā)育（Kelly等， 2011)。
[0003] 發(fā)明簡沭
[0004] 本發(fā)明的一個方面包括一種從內(nèi)胚層細胞群產(chǎn)生NKX6-1+胰腺祖細胞的方法，該 方法包含使內(nèi)胚層細胞群與EGF組分、煙酰胺組分和/或Noggin組分接觸，任選為與至少 一種EGF組分和至少一種煙酰胺組分的組合接觸，所述組合的量足以誘導(dǎo)內(nèi)胚層細胞群的 至少一部分分化為NKX6-1+胰腺祖細胞。
[0005] 在一個實施例中，EGF組分包含EGF和/或其活性綴合物和/或片段；雙調(diào)蛋 白（Amphiregulin，AR)和/或其活性綴合物和/或片段；轉(zhuǎn)化生長因子a (TGFa)和 /或其活性綴合物和/或片段；Betacellulin(BTC)和/或其活性變體和/或其片段； Epiregulin(EPR)和/或其活性變體和/或片段；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白（包括例如NRG1、NRG2、 3NRG4)和/或其活性變體和/或片段；和/或其兩種或更多種的組合。
[0006] 在一個實施例中，煙酰胺組分包含煙酰胺（也被稱為尼克酰胺和尼克酸酰胺）、其 鹽、溶劑化物和其綴合物；聚（ADP-核糖）合成酶抑制劑，如苯甲酰胺和/或3-氨基苯甲 醜胺（Otonkoski 等，1993) ;Sir_2 抑制劑，如 sirtinol、Μ15、splitomicin (Bitterman 等， 2002);其它 HDAC 抑制劑，如八^9、(：1-994、？1(228、1^0-824、]^275、54祖、丙戊酸、了54、丁酸 鈉（Bitterman等，2002)，和/或其兩種或更多種的組合。
[0007] 在一個實施例中，Noggin組分包含以下中的一種或多種：Noggin和/或其活性綴 合物和/或片段；BMPRlA和/或其活性綴合物和/或片段；Dorsomorphin和/或其鹽或溶 劑化物；LDN 193189,也被稱為"DM-3189"，和/或其鹽和/或溶劑化物；CH0RDIN和/或其 活性綴合物和/或片段；和/或其兩種或更多種的任意組合。
[0008] 在一個實施例中，所述組合包含至少一種Noggin組分；至少一種EGF組分和至少 一種煙酰胺組分。
[0009] 在一個實施例中，至少一種Noggin組分；至少一種EGF組分和至少一種煙酰胺組 分的組合包含Noggin、EGF和煙酰胺（例如NENA)。
[0010] 在一個實施例中，所述方法還包括使所述細胞與Exendin-4組分接觸。
[0011] 在一個實施例中,所述方法誘導(dǎo)內(nèi)胚層細胞群的至少10%、至少15%、至少20%、 至少25 %、至少30 %、至少40 %、至少45 %、至少50 %或至少55 %分化為NKX6-1+胰腺祖 細胞。
[0012] 在一個實施例中，所述方法首先包括產(chǎn)生內(nèi)胚層細胞群。
[0013] 在一個實施例中，所述產(chǎn)生內(nèi)胚層細胞群的方法包括步驟（或者子步驟）a、b、c中 的一個或多個；和步驟d，所述步驟包括 ：
[0014] a)使多能干細胞群與以下的組合接觸：
[0015] Dnodal激動劑（任選為ActA)和wnt信號傳導(dǎo)激動劑（任選為Wnt3a或CIHR 99021)；
[0016] IDnodal激動劑（任選為Act A)、FGF激動劑（任選為bFGF)和任選的wnt信號 傳導(dǎo)激動劑（任選為fct3a CIHR 99021);和
[0017] III)nodal激動劑（任選為ActA)和FGF激動劑（任選為bFGF);
[0018] 以產(chǎn)生階段1分化的細胞；
[0019] b)使階段1分化的細胞與FGF激動劑（任選為FGF10)和任選的wnt信號傳導(dǎo)激 動劑（任選為fct3a)和/或noggin組分（任選為Dorsomorphin)接觸，以生成階段2分 化的細胞；
[0020] C)使階段2分化的細胞與Noggin組分（任選為Noggin)，維甲酸（RA)或RA類似 物和任選的環(huán)巴明-KAAD (Cyc)、FGF激動劑（任選為FGF10)和/或Exendin-4組分（任選 為Exendin-4)接觸，以提供內(nèi)胚層細胞群；和
[0021] d)使內(nèi)胚層細胞群與EGF組分、煙酰胺組分和/或Noggin組分接觸，任選地與包 含至少一種EGF組分和至少一種煙酰胺組分的組合接觸，所述組合的量足以誘發(fā)內(nèi)胚層細 胞群的至少一部分分化為NKX6-1+胰腺祖細胞。
[0022] 在一個實施例中，產(chǎn)生NKX6-1胰腺祖細胞的組合還包含至少一種Noggin組分。
[0023] 另一方面，還包括一種用于生成NKX6-1+胰島素產(chǎn)生細胞的方法，包括：
[0024] A)根據(jù)本文所述方法，產(chǎn)生包含NKX6-1陽性胰腺祖細胞的細胞群；和
[0025] b)將細胞群或者NKX6-1富集的或分離的細胞群引入受試者中。
[0026] 還有一個方面包括一種用于生成胰島素產(chǎn)生細胞的方法，包括：
[0027] A)生成包含NKX6-1陽性胰腺祖細胞的細胞群；
[0028] b)將NKX6-1陽性胰腺祖細胞與CD34+內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)一段時間，所述時間足以獲 得胰島素產(chǎn)生細胞，任選為NKX6-1陽性胰島素產(chǎn)生細胞。
[0029] 在一個實施例中，所述方法還包括富集或者分離NKX6-1陽性細胞群。
[0030] 在另一個實施例中，所述富集或者分離步驟包括使細胞群與HPx表位檢測抗體接 觸，和分離或部分純化HPxl和/或HPx2結(jié)合的細胞亞群。
[0031] 另一個方面包括根據(jù)本文所述方法產(chǎn)生的富集的和/或分離的NKX6-1陽性細胞 群和適合的稀釋劑。
[0032] 在一個實施例中，富集的或分離的NKX6-1陽性細胞群包括至少10%、至少15%、 至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至 少80%或直至約95%的^?6-1陽性細胞。
[0033] 還有一個方面包括一種培養(yǎng)基補充組合物，其包含EGF組分、煙酰胺組分和/或 Noggin組分和任選的Exendin-4組分。
[0034] 另一個方面還提供一種培養(yǎng)基組合物，其包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和本文所述培養(yǎng)基補充 劑。
[0035] 進一步的一個實施例包括一種試劑盒，其包含：
[0036] a) EGF 組分，
[0037] b)煙酰胺組分；和/或
[0038] c) Noggin 組分。
[0039] 還提供包含細胞群的組合物，及所述細胞群在預(yù)測藥物毒理學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)、移植、 糖尿病治療、組織工程和/或疾病建模中的應(yīng)用。
[0040] 通過以下詳細說明，可以明顯看出本發(fā)明其它的特點和優(yōu)點。但是應(yīng)理解，雖然 所述詳細描述和具體實例盡管指示了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但是它們僅以示例的方式給 出，因為基于此詳細描述，本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種改變和變形對于本領(lǐng)域技術(shù)人員 來說均是顯而易見的。
[0041] 附圖簡沭
[0042] 以下結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中：
[0043] 圖1為胰腺分化方案的例子的示意圖；
[0044] 圖2的圖顯示用Noggin、EGF、煙酰胺（NENA)和Exendin-4處理后，從源自hESC的 細胞誘導(dǎo)得到的NKX6-1: GFP+細胞百分比；
[0045] 圖3的一系列圖顯示樣品研究中NKX6-1、PDX1、PTFlA和S0X9的mRNA表達水平；
[0046] 圖4A的圖顯示，利用NKX6-lGFP/w HESC細胞系，在Noggin、EGF、煙酰胺（含有或不 含Exendin-4)的存在下培養(yǎng)內(nèi)胚層細胞，與沒有經(jīng)過上述化合物各種組合的處理相比較， NKX6-1:GFP+細胞的百分比最高。
[0047] 圖4B的圖顯示，利用Hl (WAOl)HESC細胞系，在Noggin、EGF、煙酰胺（含有或不 含Exendin-4)的存在下培養(yǎng)內(nèi)胚層細胞，與沒有經(jīng)過上述化合物各種組合的處理相比較， NKX6-1+細胞的百分比最高。
[0048] 圖5的一系列圖顯示，利用"NENA處理"生成的NKX6-1細胞具有生成胰島素產(chǎn)生 細胞的潛力。移植Hl (WAOl)第14天分化的細胞后6周收獲的乳腺脂肪墊中的NKX6-1和 胰島素的免疫組織化學(xué)分析（A)。移植Hl (WAOl)第14天分化的細胞后6周收獲的乳腺脂 肪墊中的C-肽和胰高血糖素（GCG)的免疫組織化學(xué)分析（B)。
[0049] 圖6為一系列流式細胞術(shù)情況圖，顯示了 HPx可被用于富集NKX6-1表達細胞。經(jīng) 過含有或不含有這三種組分的培養(yǎng)在三重處理（Noggin、EGF和煙酰胺）的存在或不存在下 培養(yǎng)的NKXe-I envw hESC細胞系分化的第13天，流式細胞術(shù)分析單獨的NKX6-1:GFP (A)，并 與hPx⑶和CD142(C)作對比。
[0050] 圖7A的圖顯示，利用熒光激活細胞分選術(shù)（FACS)分離HPx2+細胞，與沒有經(jīng) 過分選的細胞（PS =分選前）相比較，富集表達更高NKX6-lmRNA水平的細胞群，這與在 ⑶142 (⑶142+)富集的細胞群中發(fā)現(xiàn)的水平類似。
[0051] 圖7B的圖顯示，利用熒光激活細胞分選術(shù)（FACS)分離HPx2+⑶142+雙陽性細胞， 與沒有經(jīng)過分選的細胞（PS =分選前）相比較，富集表達更高NKX6-lmRNA水平的細胞群。
[0052] 圖8A為中胚層第6天的一系列流式細胞術(shù)情況圖；
[0053] 圖8B為CD34+細胞的相圖；
[0054] 圖8C-D為顯示乙?；疞DL攝入的細胞圖像；
[0055] 圖8E為顯示vWF免疫組織化學(xué)的圖像；
[0056] 圖9A為一系列繪制圖，上部的圖為：在來自第14天培養(yǎng)物的活細胞中，F(xiàn)ACS分析 GFP，其中：對照單層細胞（Ctrl)，膠原上的聚集體（Col)和與源自ES的內(nèi)皮細胞的共培養(yǎng) 物（ES-E)。下部的圖：細胞內(nèi)FACS分析在來自每個培養(yǎng)條件的GFP+細胞群的C-肽。
[0057] 圖9B的圖顯示，在不同的培養(yǎng)條件下，實時QPCR分析胰島素（INS)和胰高血糖素 (GCG)。數(shù)字為相對于F0XA2。
[0058] 圖10的圖顯示，利用熒光激活細胞分選術(shù)（FACS)分離HPxl+細胞，與HPxl-細胞 相比較，富集表達更高NKX6-1、S0X9和PTFla mRNA水平的細胞群。
[0059] 圖11的圖顯示，利用"NENA"處理生成的NKX6-1細胞具有生成產(chǎn)生胰島素的功能 性細胞的潛力。將Hl (WAOl)第13天分化的細胞移植入免疫功能低下小鼠后第6、12和18 周，通過ELISA測量響應(yīng)于葡萄糖攻擊的人C-肽分泌。
[0060] 詳細說明
[0061] 本文描述了用于從人多能干細胞（hPSC)有效產(chǎn)生ΝΚΧ6-Γ胰腺祖細胞的強大、可 靠平臺，其中使用包括BMP抑制劑（例如Noggin)、煙酰胺和EGF信號傳導(dǎo)通路激動劑的因 子的限定組合。類似于本文所述產(chǎn)生的細胞，產(chǎn)生單激素（Monohormonal)胰島素的β細 胞為ΝΚΧ6-1陽性的。本文利用小鼠移植實驗，證實了根據(jù)所述方法產(chǎn)生的細胞為單激素和 功能性的。
[0062] 本文還證實，可以從不同的人多能干細胞（hPSC)群分化得到ΝΚΧ6-1+胰腺內(nèi)分泌 祖細胞。
[0063] 本發(fā)明的一個方面包括一種從內(nèi)胚層細胞群產(chǎn)生NKX6-1+胰腺祖細胞的方法，所 述方法包括使內(nèi)胚層細胞群與EGF組分、煙酰胺組分和/或Noggin組分接觸，任選地與至 少一種EGF組分和至少一種煙酰胺組分的組合接觸，以誘導(dǎo)內(nèi)胚層細胞群的至少一部分分 化為NKX6-1+胰腺祖細胞。
[0064] 在一個實施例中，所述組合還包括至少一種Noggin組分。
[0065] 術(shù)語"接觸"（例如使內(nèi)胚層細胞群與一種或多種組分接觸）意在包括：將一種或 多種組分與細胞在體外一起孵育（例如在培養(yǎng)的細胞中加入所述化合物），所述接觸的步 驟可以以任何合適的方式進行。例如，細胞可以貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)處理，在時間上，基本 上同時（例如一起存在于混合物中）或順序（例如從添加第一組分的1個小時內(nèi)）加入所 述組分。所述細胞還可以與另一試劑例如生長因子或其它分化劑或環(huán)境接觸，以穩(wěn)定細胞 或者使細胞進一步分化，并且包括在本領(lǐng)域已知的條件下培養(yǎng)細胞，所述條件例如實施例 中進一步所描述的用于培養(yǎng)多能（和/或分化的）細胞群。
[0066] 本文使用的"內(nèi)胚層細胞群"是指包括至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、 至少60%、至少70%、至少80%、至少90%的對應(yīng)于圖1階段3內(nèi)胚層細胞的細胞群。例 如，內(nèi)胚層細胞對應(yīng)于胚胎后前腸細胞群，其至少表達F0XA2,可以呈roxi陰性或陽性。還 可以表達其它因子。所述細胞群可以是NKX6-1陰性的（NKX6-1-)或者表達低水平NKX6-1。 例如，可以采用流式細胞術(shù)和分子分析測定所述內(nèi)胚層細胞群的一個或多個標志物例如 F0XA2。例如所述內(nèi)胚層細胞群可以為2D(單層）或3D(類胚體或其它聚集體）格式。 [0067] 本文使用的術(shù)語"內(nèi)胚層"是指在非常早期的胚胎中的三個主要的胚芽細胞層中 的一個（其它兩個胚芽細胞層為中胚層和外胚層）。所述內(nèi)胚層為三個細胞層的最內(nèi)層。 內(nèi)胚層細胞首先分化產(chǎn)生胚胎腸，而后產(chǎn)生腸道（食管、胃、腸、直腸、結(jié)腸）襯里，咽囊衍生 物（扁桃體、甲狀腺、胸腺、甲狀旁腺），肺，肝，膽囊和胰腺。
[0068] 本文使用的術(shù)語"多能干細胞"是指具有在不同條件下分化為超過一種分化的細 胞類型的能力的細胞，例如，分化三個胚芽細胞層的特征性細胞類型的能力，包括胚胎干細 胞和誘導(dǎo)性多能干細胞。例如通過裸鼠畸胎瘤形成實驗來表征多能干細胞具有分化為超過 一個細胞類型的能力。通過胚胎干細胞（ES)標志物的表達，可以證實多能性。
[0069] 本文使用的術(shù)語"祖細胞"是指具有這樣細胞表型的細胞，相對于其能分化產(chǎn)生的 細胞，所述細胞表型相比于完全分化的細胞處于發(fā)育途徑或進展中較早期步驟。取決于發(fā) 育途徑和其中細胞發(fā)育及分化的環(huán)境，祖細胞能產(chǎn)生多個明顯不同的分化細胞類型或單一 的分化細胞類型。
[0070] 術(shù)語"胰腺祖細胞"是指能夠形成以下任意種的細胞：胰腺內(nèi)分泌細胞（例如產(chǎn)生 胰高血糖素的α -細胞或產(chǎn)生胰島素的β細胞），或胰腺外分泌細胞（如淀粉酶+和/或 胰蛋白酶+胰腺細胞）或胰腺管細胞。通過添加組分例如EGF組分和煙酰胺組分的組合和 /或由于祖細胞發(fā)育的環(huán)境，可誘導(dǎo)胰腺內(nèi)分泌細胞、胰腺外分泌細胞或胰腺管細胞中的一 種或多種的形成或發(fā)育。例如，在包括內(nèi)皮接觸的條件下，"ΝΚΧ6-1陽性胰腺多能祖細胞" 能夠產(chǎn)生功能性β細胞。同樣地，體內(nèi)注射ΝΚΧ6-1胰腺祖細胞，能夠?qū)е麓祟惣毎l(fā)育。 還經(jīng)證實的是，如實施例中所述，ΝΚΧ6-1胰腺祖細胞產(chǎn)生胰島素產(chǎn)生ΝΚΧ6-1陽性β細胞 和CK-19陽性導(dǎo)管細胞。
[0071] 本文使用的術(shù)語"功能性β細胞"是指一種胰腺細胞，其在胰腺中位于成為胰島 的區(qū)域中，為ΝΚΧ6-1陽性和/或roxi陽性的，制造和釋放胰島素。
[0072] 本文使用的術(shù)語"干細胞"是指未分化的細胞，其能夠增殖、自我更新和產(chǎn)生更多 祖細胞，這些祖細胞具有生成大量的母細胞而母細胞依次能夠產(chǎn)生分化子細胞或可分化子 細胞的能力。例如，子細胞能夠被誘導(dǎo)增殖并產(chǎn)生后代，其后代隨后分化為一個或多個成熟 的細胞類型，而同時還保留一個或多個具有親本發(fā)育潛力的細胞。
[0073] 在細胞的上下文中，術(shù)語"分化的（differentiated) "或者"分化 (differentiating)"是相對的術(shù)語，"分化的細胞"是指比相比較的細胞進展到沿著發(fā)育途 徑更進一步的細胞。因此，干細胞可以分化為譜系限制性的前體細胞（如內(nèi)胚層祖細胞）， 該譜系限制性的前體細胞依次可以分化為其它類型的前體細胞，沿著途徑更進一步，進而 再分化為終末分化的細胞，所述終末分化的細胞在某個組織類型中發(fā)揮特征性功能，其可 能或不能保留進一步增殖的能力。
[0074] 本文使用的"胚胎干細胞"是指胚胎囊胚內(nèi)細胞團的多能干細胞（例如見美國專 利No. 5, 843, 780、No. 6, 200, 806)。這些細胞還可以從源自體細胞核轉(zhuǎn)移的囊胚內(nèi)細胞團 獲得（例如見美國專利No. 5, 945, 577、No. 5, 994, 619、No. 6, 235, 970)。胚胎干細胞的區(qū)別 特征決定了胚胎干細胞表型。因此，如果細胞具有一個或多個胚胎干細胞的獨特特征，其 就擁有胚胎干細胞的表型，使得可以將其與其它細胞區(qū)別開來。胚胎干細胞的示例性區(qū)別 特征包括但不限于：基因表達譜，增殖能力，分化能力，染色體核型，對特定培養(yǎng)條件的反應(yīng) 性，諸如此類。
[0075] 術(shù)語"表達"是指涉及產(chǎn)生RNA和蛋白質(zhì)以及當適當時分泌蛋白的細胞過程，當適 當時包括但不限于，例如轉(zhuǎn)錄，翻譯，折疊，修飾和加工。"表達產(chǎn)物"包括從基因轉(zhuǎn)錄的RNA 和通過從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的翻譯獲得的多肽。
[0076] 本文使用的術(shù)語"NKX6-1陽性胰腺祖細胞"是指例如源自胰腺內(nèi)胚層細胞的細胞， 其具有至少分化為產(chǎn)生胰島素的細胞例如胰腺β細胞的能力。NKX6-1陽性胰腺祖細胞表 達標志物ΝΚΧ6-1，并且與多能干細胞（PSC)相比，其可以表達例如增加水平的roXl、PTFlA 和 S0X9。
[0077] 本文使用的術(shù)語"NKX6-1"是指"NK6同源盒1"基因（基因 ID:4825)的mRNA (和 /或任選為cDNA)或蛋白產(chǎn)品，序列，包括蛋白質(zhì)和mRNA序列（和/或任選為cDNA)，所述 序列通過引用并入本文。
[0078] 如本文所示，使用EGF和煙酰胺處理產(chǎn)生NKX6-1+細胞，通過添加 Noggin (圖4) 增加所述NKX6-1+細胞。
[0079] 相應(yīng)地，在另一個實施例中，所述組合還包含Noggin組分。
[0080] 本文使用的術(shù)語"Noggin組分"意為任意的多肽或BMP化合物激動劑，所述多肽或 BMP化合物激動劑通過結(jié)合TGF β家族配體抑制TGF- β /BMP家族信號傳導(dǎo)，包括但不限于 實施例10中提供的試劑，例如包括Noggin (NOG)如具有基因識別編碼（基因 ID :9241)的 人Noggin以及其活性綴合物和片段，包括自然存在的活性綴合物和片段；骨形態(tài)發(fā)生蛋白 IA型受體（BMPRlA)，例如具有如基因識別編碼（基因 ID :657)的人BMPRlA以及其活性綴合 物和片段，包括自然存在的活性綴合物和片段；骨形態(tài)發(fā)生蛋白IB型受體（BMPRlB)，例如 具有如基因識別編碼（基因 ID :658)的人BMPRlB以及其活性綴合物和片段，包括自然存在 的活性綴合物和片段；小分子化學(xué)抑制劑Dorsomorphin和其鹽、溶劑化物和組合；小分子 化學(xué)抑制劑LDN 193189,也被稱為"DM-3189"，和/或其鹽和/或溶劑化物；和CH0RDIN，例 如具有如基因識別編碼（基因 ID :8646)的人CH0RDIN(CHRD)以及其活性綴合物和片段，包 括自然存在的活性綴合物和片段；和/或上述兩種或更多種的組合，例如包括包含Noggin 的組合。每一個（例如由基因 ID鑒定的每一個組分）的序列，包括蛋白質(zhì)和mRNA序列，通 過引用并入此處。
[0081] 本文使用的術(shù)語"Noggin"是指具有基因識別編碼（基因 ID :9241)的骨形態(tài)發(fā)生 蛋白拮抗劑，其序列，包括蛋白質(zhì)和mRNA序列，所述序列通過引用并入本文。
[0082] 所述化合物"Dorsomorphin"包括通式表示的化合物：
[0083]

【權(quán)利要求】
1. 一種從內(nèi)胚層細胞群產(chǎn)生NKX6-1+胰腺祖細胞的方法，所述方法包括使所述內(nèi)胚層 細胞群與EGF組分、煙酰胺組分和/或Noggin組分接觸，任選地與至少一種EGF組分和至 少一種煙酰胺組分的組合接觸，以誘導(dǎo)所述內(nèi)胚層細胞群的至少一部分分化為NKX6-1+胰 腺祖細胞，所述組合任選地還包含至少一種Noggin組分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述Noggin組分包含以下中的一種或多種： Noggin和/或其活性綴合物和/或片段；BMPR1A和/或其活性綴合物和/或片段；BMPR1B 和/或其活性綴合物和/或片段；Dorsomorphin和/或其鹽或溶劑化物；LDN 193189,也被 稱為"DM-3189"，和/或其鹽或/或溶劑化物；CH0RDIN和/或其活性綴合物和/或片段；和 /或其兩種或更多種的任意組合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述Noggin組分為Noggin。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述EGF組分包含EGF和/或其活性綴合物 和/或片段；雙調(diào)蛋白（AR)和/或其活性綴合物和/或片段；轉(zhuǎn)化生長因子a (TGF a) 和/或其活性綴合物和/或片段；BetaCellulin(BTC)和/或其活性變體和/或片段； Epiregulin(EPR)和/或其活性變體和/或片段；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白（包括例如NRG1、NRG2、 3NRG4)和/或其活性變體和/或片段；和/或其兩種或更多種的組合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述EGF組分為EGF和/或其活性綴合物和/或 片段。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述EGF綴合物為肝素結(jié)合EGF (HB-EGF)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述煙酰胺組分包含煙酰胺（也被稱為尼克酰胺 和尼克酸酰胺）、其鹽、溶劑化物和綴合物；聚（ADP-核糖）合成酶抑制劑，例如苯甲酰胺和 /或3-氨基苯甲酰胺；Sir-2抑制劑，例如Sirtinol、M15、splitomicin ;HDAC抑制劑，例如 AN-9、CI-994、FK228、LAQ-824、MS275、SAHA、丙戊酸、TSA、丁酸鈉，和/或其兩種或更多種的 組合。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述煙酰胺組分為煙酰胺和/或其鹽、溶劑化物 和/或綴合物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述至少一種Noggin組分、至少一種EGF組分和 至少一種煙酰胺組分的組合包含Noggin、EGF和煙酰胺（例如NENA)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，還包含Exendin-4組分。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述Exendin-4組分為Exendin-4。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的方法，其中，所述內(nèi)胚層細胞群分化自多能干 細胞（PSC)，例如胚胎干細胞（ESC)或誘導(dǎo)性多能干細胞（iPSC)。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述多能干細胞為人ESC(hESC)或人 iPSC(hiPSC)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項所述的方法，首先包括產(chǎn)生內(nèi)胚層細胞群。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述產(chǎn)生內(nèi)胚層細胞群的方法包括步驟（或子 步驟）a、b和c中的一個或多個；和步驟d，所述步驟包括： a)使多能干細胞群與以下的組合接觸： I) nodal激動劑（任選為ActA)和wnt信號傳導(dǎo)激動劑（任選為Wnt3a或CIHR 99021)， II) nodal激動劑（任選為Act A)、FGF激動劑（任選為bFGF)和任選的wnt信號傳導(dǎo) 激動劑（任選為Wnt3a CIHR 99021);和 111)11〇(1&1激動劑（任選為4(^4)和？6?激動劑（任選為&?6?);以產(chǎn)生階段1分化的 細胞； b) 使所述階段1分化的細胞與FGF激動劑（任選為FGF10)、和任選的wnt信號傳導(dǎo)激 動劑（任選為fct3a)和/或noggin組分（任選為Dorsomorphin)接觸，以產(chǎn)生階段2分 化的細胞； c) 使所述階段2分化的細胞與Noggin組分（任選為Noggin)、維甲酸（RA)或RA類似 物、和任選的環(huán)巴胺-KAAD (Cyc)、FGF激動劑（任選為FGF10)和/或Exendin-4組分（任 選為Exendin-4)接觸，以提供內(nèi)胚層細胞群；和 d) 使所述內(nèi)胚層細胞群與EGF組分、煙酰胺組分和/或Noggin組分接觸，任選地與包 含至少一種EGF組分和至少一種煙酰胺組分的組合接觸，所述組合的量足以誘導(dǎo)所述內(nèi)胚 層細胞群的至少一部分分化為NKX6-1+胰腺祖細胞。
16. -種用于生成NKX6-1+胰島素產(chǎn)生細胞群的方法，所述方法包括： a. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的方法產(chǎn)生包含NKX6-1陽性胰腺祖細胞的細胞 群； b. 將所述細胞群或NKX6-1富集的或分離的細胞群引入受試者中。
17. -種用于生成胰島素產(chǎn)生細胞的方法，所述方法包括： a. 生成包含NKX6-1陽性胰腺祖細胞的細胞群； b. 將所述NKX6-1陽性胰腺祖細胞與⑶34+內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的方法產(chǎn) 生所述包含NKX6-1陽性胰腺祖細胞的細胞群。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項所述的方法，所述方法包括富集或分離NKX6-1陽性 細胞群。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述富集或分離步驟包括使所述細胞群與HPx 表位檢測抗體接觸，和分離或部分地純化HPxl和/或HPx2結(jié)合的細胞亞群。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述HPx表位檢測抗體為HPxl和/或HPx2。
22. -種根據(jù)權(quán)利要求19至21中任一項所述方法產(chǎn)生的富集的和/或分離的NKX6-1 陽性細胞群和/或包含所述細胞群和適合的稀釋劑的組合物。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的富集的NKX6-1陽性細胞群，其包含至少10%、至少15%、 至少20%、至少25%，至少30%、至少35%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%，至 少80%或直至約95%的^?6-1陽性細胞。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的分離的NKX6-1陽性細胞群，其包含至少30%、35%、40% 或至少50%的NKX6-1陽性胰腺祖細胞。
25. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的富集的/分離的NKX6-1陽性細胞群，其包含至少15%、至 少20%、至少25%、至少30%，、至少35%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至 少80%或直至約95%的NKX6-1陽性胰島素產(chǎn)生細胞。
26. -種培養(yǎng)基補充組合物，其包含EGF組分、煙酰胺組分和任選的Noggin和/或 Exendin-4 組分。
27. -種培養(yǎng)基培養(yǎng)組合物，其包含適合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、EGF組分、煙酰胺組分和任選 的Noggin組分和/或Exendin-4組分。
28. -種試劑盒，其包含： EGF組分， 煙酰胺組分，和/或 Noggin組分，和/或 任選的Exendin-4組分。
29. 根據(jù)權(quán)利要求22至25中任一項所述的細胞群的用途，其用于預(yù)測藥物毒理學(xué)、藥 物發(fā)現(xiàn)、移植組織工程和/或疾病建模。
【文檔編號】C12N5/02GK104411815SQ201380035022
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2013年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月30日
【發(fā)明者】凱勒·G, 諾斯特羅·M·C, 霍爾特辛格爾·A, 薩蘭奇·F 申請人:大學(xué)健康網(wǎng)絡(luò)