馬鈴薯蛋白分離物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種使用特定的吸附劑獲得馬鈴薯蛋白部分的方法。具體的，本發(fā)明涉及經(jīng)適當(dāng)?shù)呐潴w官能化的載體材料，該載體材料包括特定的聚合物材料。通過使用根據(jù)本發(fā)明的官能化的支撐載體，可以以較高效率獲得馬鈴薯蛋白部分。
【專利說明】馬鈴薯蛋白分離物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食物蛋白的領(lǐng)域，具體涉及馬鈴薯蛋白部分的分離。

【背景技術(shù)】
[0002] 新鮮的馬鈴薯汁液是可溶材料和不溶材料的復(fù)雜混合物。它具有高蛋白含量，并 且進(jìn)一步包括殘余的淀粉、礦物質(zhì)、有毒的配糖生物堿，以及單體反應(yīng)性酚類和聚合的反應(yīng) 性酚類。它是馬鈴薯淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物，并且通常被當(dāng)作廢棄物。
[0003] 馬鈴薯汁液含有高達(dá)1. 5%重量的相對(duì)大量的蛋白?？梢詫ⅠR鈴薯汁液分成三組： (i) 43kDa的高度同源的酸性糖蛋白的高分子量部分（HMW)(總馬鈴薯蛋白的40?50w%)， (ii) 5?25kDa的堿性低分子量部分（LMW)(總馬鈴薯蛋白的30?40w% )，該堿性低分 子量部分是糖蛋白；以及（iii)其它蛋白（總馬鈴薯蛋白的10?20w%)。馬鈴薯糖蛋白 (Patatin)屬于糖蛋白家族，具有酯酰水解酶和轉(zhuǎn)移酶活性，并且將主要是HMW部分的一部 分。LMW部分典型地包括蛋白酶抑制劑和通常具有低分子量的其它蛋白。
[0004] 盡管馬鈴薯汁液被當(dāng)作廢棄物，但是馬鈴薯蛋白的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量高于酪蛋白的營(yíng)養(yǎng)質(zhì) 量，并且與整蛋（whole egg)的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量相當(dāng)。馬鈴薯蛋白富含賴氨酸，并且在理論上是低 賴氨酸蛋白（諸如谷物蛋白）的優(yōu)異的補(bǔ)充物。盡管馬鈴薯蛋白具有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量，但 是由于可用產(chǎn)物顯示出許多嚴(yán)重的缺點(diǎn)，馬鈴薯蛋白目前僅用作動(dòng)物飼料。
[0005] 其中一個(gè)主要缺點(diǎn)是難以分離天然形式的馬鈴薯蛋白。通常在工業(yè)規(guī)模上，通過 熱凝結(jié)進(jìn)行馬鈴薯蛋白從馬鈴薯淀粉制造廠的廢水中的回收，這樣產(chǎn)生的是變性的馬鈴薯 蛋白。處于變性形式的蛋白沒有它們期望的功能性質(zhì)，諸如乳化能力、發(fā)泡能力、熱凝膠化 能力、結(jié)合水的能力等。甚至在食品工業(yè)中應(yīng)用的最基本的要求（即在水中的溶解性）也 不能得到滿足。
[0006] 已經(jīng)證實(shí)，之前通過更加溫和的方法（諸如膜過濾和沉淀技術(shù)）從馬鈴薯汁液中 分離蛋白的嘗試，在工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)環(huán)境中效率是非常低的。這是因?yàn)閲?yán)重的膜污染，并且 伴隨著流量和分離能力的喪失。另外，這樣的方法不具有在馬鈴薯汁液中存在的各種蛋白 種類之間進(jìn)行分離的能力。例如，膜過濾不能從聚合的酚化合物或多糖中分離高分子量的 蛋白產(chǎn)物，因?yàn)槟A向于將它們都保留下來。
[0007] 之前，已經(jīng)在工業(yè)上分離了天然的馬鈴薯蛋白。Codperatie Avebe U.A.的WO 2008/069650公開了分離天然馬鈴薯蛋白分離物的方法，該天然馬鈴薯蛋白分離物具有低 配糖生物堿含量。該方法包括絮凝及后續(xù)的膨脹床吸附，以使馬鈴薯蛋白吸附至吸附劑上， 然后洗脫天然的馬鈴薯蛋白分離物。但是該方法是昂貴的，并且在膨脹床吸附中使用的混 合式配體在馬鈴薯汁液中相對(duì)不穩(wěn)定。
[0008] 名稱為先期色譜法的WO 2008/092450公開了使用配體和基于pH的分餾進(jìn)行馬鈴 薯蛋白的大規(guī)模分餾和分離的方法。但是，發(fā)現(xiàn)配體對(duì)馬鈴薯汁液中的氧化過程敏感，并且 雖然添加亞硫酸鹽緩解了這一問題，但是仍然不能完全阻止這一問題的發(fā)生。配體相對(duì)快 速的氧化降解仍然是個(gè)問題。進(jìn)一步地，沒有注意到孔隙度對(duì)吸附能力的影響，從而使得吸 附能力在不同的吸收劑之間變化很大。由于這一原因，在這一出版物中提到的很多配體根 本不適于以由成本效益的工業(yè)規(guī)模，通過穩(wěn)定的操作來分離馬鈴薯蛋白的目的。
[0009] 因此，仍然需要一種分離天然馬鈴薯蛋白部分的改進(jìn)的方法。本發(fā)明與以下發(fā)現(xiàn) 有關(guān)：在吸附材料中使用的配體的性質(zhì)、配體與該吸附材料的連接的方式以及吸附材料的 孔隙度都對(duì)馬鈴薯蛋白的吸附效率有非常大的影響。因此，提供了一種分離天然馬鈴薯蛋 白部分的優(yōu)化的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明涉及一種分離天然馬鈴薯蛋白部分的方法。具體地，討論了一種通過等電 點(diǎn)分類馬鈴薯蛋白的方法，該方法允許分離兩種部分，即高分子量部分和低分子量部分。這 些部分能夠在沒有污染的情況下，并且進(jìn)一步純化以去除不需要的有色化合物來獲得。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1 :配體流線型直接（Streamline Direct) CSTl (CSTl)、4_疏基苯甲酸官能化的 Sepabead HFA(HFA MBA)和4-巰基苯甲酸官能化的S印abead EP (EP MBA)的結(jié)構(gòu)式。支撐 載體由實(shí)心圓來表示。
[0012] 圖2 :在與不穩(wěn)定的馬鈴薯果實(shí)汁液（不含亞硫酸鹽）一起孵育3x24h后，a)經(jīng)酸 性配體1?12和b)經(jīng)流線型直接（Streamline Direct)CSTl和具有4-MBA配體的Sepabead HFA官能化的支撐載體在加速污染測(cè)試中的著色。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 本發(fā)明涉及一種從馬鈴薯汁液中分離天然的馬鈴薯蛋白部分的方法，該方法包 括：a)將馬鈴薯汁液的pH調(diào)節(jié)至4. 0?6. 5 ;b)使馬鈴薯汁液與具有孔隙的官能化的支撐 載體接觸，其中，至少90%的孔隙具有IOnm至200nm之間的孔徑，并且其中載體經(jīng)疏水的混 合模式的配體官能化，該疏水的混合模式的配體具有2. 5?5、優(yōu)選4?5的pKa，該配體通 過S原子或O原子、優(yōu)選硫醚基團(tuán)與載體相連；c)通過洗脫，使馬鈴薯蛋白部分從官能化的 支撐載體上解吸附；以及d)任選地，濃縮和/或干燥馬鈴薯蛋白部分。
[0014] 對(duì)于本發(fā)明，馬鈴薯汁液應(yīng)理解為指任何種類的馬鈴薯來源的液體，其包含大量 天然馬鈴薯蛋白，并且包括通常作為淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物獲得的馬鈴薯果實(shí)汁液（PFJ)，以及 已知為馬鈴薯果實(shí)水（PFW)的稀釋的PFJ。因此，能夠以以下形式使用，其中，馬鈴薯汁液通 常被認(rèn)為是以稀釋或經(jīng)部分加工的形式，例如來自馬鈴薯淀粉生產(chǎn)或來自消耗馬鈴薯的加 工的廢物流。
[0015] 馬鈴薯汁液還能夠被去除（deplete)馬鈴薯蛋白的特定部分，例如在應(yīng)用根據(jù)本 發(fā)明的方法獲得的馬鈴薯汁液。例如，已經(jīng)清除或部分清除了蛋白酶抑制劑部分（被稱為 低分子量（LMW)部分）的馬鈴薯汁液被稱為L(zhǎng)MW去除或部分LMW去除的馬鈴薯汁液。另外， 已經(jīng)清除或部分清除了馬鈴薯糖蛋白部分（被稱為高分子量（HMW)部分）的馬鈴薯汁液被 稱為HMW去除或部分HMW去除的馬鈴薯汁液。另外，這些被認(rèn)為是用于根據(jù)本發(fā)明的方法 的馬鈴薯汁液。
[0016] 如本文所限定的，官能團(tuán)是為分子帶來重要的化學(xué)反應(yīng)性的基團(tuán)，從而使在考慮 中的分子或基團(tuán)產(chǎn)生改變。該化學(xué)反應(yīng)性主要通過在還原性水環(huán)境（諸如在馬鈴薯汁液 中發(fā)現(xiàn)的還原性水環(huán)境）中的反應(yīng)性來限定。正因如此，不將高穩(wěn)定性的基團(tuán)看作是本發(fā) 明范圍內(nèi)的官能團(tuán)，高穩(wěn)定性的基團(tuán)諸如是未經(jīng)如下基團(tuán)取代的芳香環(huán)（未經(jīng)活化的芳香 環(huán)）：使芳香環(huán)活化，足以在這樣環(huán)境中使基團(tuán)發(fā)生顯著改變。因此，不將苯環(huán)和雜環(huán)（諸 如未經(jīng)活化的吡啶衍生物）看作是本發(fā)明范圍內(nèi)的官能團(tuán)。
[0017] 如在本文中使用的，連接基團(tuán)是原子或多個(gè)原子的組，配體通過該原子或多個(gè)原 子的組與載體連接。已經(jīng)通過化學(xué)反應(yīng)形成了連接基團(tuán)，從而使配體與間隔體（spacer)或 支撐載體相連接，或使間隔體與支撐載體相連接。
[0018] 如在本文中使用，骨架是多個(gè)原子的鏈（該多個(gè)原子使配體與支撐載體相連），包 括連接基團(tuán)。更具體地，它是使配體與支撐載體直線連接的最短的原子鏈。
[0019] 馬鈴薯蛋白的高分子量（HMW)或富含馬鈴薯糖蛋白的部分具有最大的商業(yè)興趣， 因?yàn)樵摬糠直鹊头肿恿浚↙MW)部分更難以以純的和天然的形式獲得，其中低分子量（LMW) 部分富含蛋白酶抑制劑。另外，它是馬鈴薯蛋白中同質(zhì)性最高的部分。由于這一原因，本發(fā) 明的重點(diǎn)在于，以天然形式分離HMW部分中的蛋白，其中HMW部分主要包括熱和酸不穩(wěn)定的 馬鈴薯糖蛋白。這是通過同時(shí)分離馬鈴薯蛋白的LMW部分來實(shí)現(xiàn)的。因?yàn)橹灰蛛x效率高， 純的和天然形式的兩種產(chǎn)物都是商業(yè)上感興趣的，因此應(yīng)理解本發(fā)現(xiàn)還與馬鈴薯蛋白的分 離的LMW部分有關(guān)。
[0020] 粗制的馬鈴薯汁液是：還沒有經(jīng)過任何純化并且本身能被使用的馬鈴薯汁液；或 者是首先進(jìn)行無侵害性的預(yù)處理的馬鈴薯汁液，該無侵害性的預(yù)處理不影響包含在汁液中 的馬鈴薯蛋白的含量和性質(zhì)。這樣的處理例如可以是通過諸如離心、過濾、絮凝和/或吸附 進(jìn)行的PH調(diào)節(jié)、澄清（clarification)或脫色。具體地，存在用于對(duì)馬鈴薯汁液進(jìn)行預(yù)清 潔的各種方法，其目的是去除例如不想要的污染物，例如配糖生物堿、（多）酚類、果膠、月旨 類、脂肪酸和/或原花青素和其有色的衍生物（諸如表兒茶酸和花青素）。在待定的申請(qǐng) W02008/056977中記載了用于去除這些污染物中的一種或多種（具體是配糖生物堿）的方 法，其中記載了通過與分層的硅酸鹽接觸，從馬鈴薯汁液的加工流中吸附污染物?？蛇x擇 地，WO 2008/069651記載了通過與活性炭接觸，從植物加工流的水性溶液中吸附污染物。在 使用包括絮凝法的預(yù)處理時(shí)，包括在應(yīng)用本發(fā)明的方法之前預(yù)處理馬鈴薯汁液的方法可能 是特別有利的，其中絮凝法例如使用二價(jià)金屬離子（諸如鈣鹽或鎂鹽）。
[0021] 蛋白的等電點(diǎn)（IEP)是pH值，在該pH值時(shí)，存在于氨基酸上的正電荷與存在的負(fù) 電荷一樣多。因此，在IEP時(shí)，蛋白具有凈中性電荷（net neutral charge)。當(dāng)使蛋白處于 低于它的IEP的pH時(shí)，該蛋白具有凈正電荷，并且當(dāng)使蛋白處于高于它的IEP的pH時(shí)，蛋 白具有凈負(fù)電荷?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)步驟，諸如等電聚集法（IEF)，來確定IEP。
[0022] 在本文所描述的使用官能化的支撐載體的優(yōu)選實(shí)施方式中，可以根據(jù)等電點(diǎn)，并 且同時(shí)根據(jù)分子量來對(duì)蛋白分級(jí)。這允許分離馬鈴薯蛋白部分，例如馬鈴薯糖蛋白部分或 蛋白酶抑制劑部分。本發(fā)明的具體方面是一種或多種馬鈴薯蛋白部分可以被連接到官能 化的支撐載體上，并且被分級(jí)以獲得一種或多種天然的馬鈴薯蛋白部分。馬鈴薯蛋白與本 文所提出的官能化的支撐載體上的配體連接，且沒有有色馬鈴薯汁液組分的過多的伴隨連 接，并且，官能化的支撐載體對(duì)于由馬鈴薯汁液組分引起的劣化和/或降解是穩(wěn)定的。
[0023] 本發(fā)明的方法可以以兩種不同的方式來進(jìn)行，這兩種不同的方式稱為選擇性吸附 和選擇性洗脫。因?yàn)楸景l(fā)明應(yīng)用的兩種不同方式，本發(fā)明可以用于獲得馬鈴薯汁液中存在 的所有馬鈴薯蛋白，它們作為包括LMW部分和HMW部分的混合物。另外，本發(fā)明還可以用于 將來自馬鈴薯汁液的馬鈴薯蛋白分級(jí)成HMW部分和/或LMW部分。優(yōu)選使用水性緩沖液進(jìn) 行洗脫。
[0024] 在本發(fā)明的一種方式中，馬鈴薯蛋白部分通過選擇性吸附來獲得。在這種方式中， 在本發(fā)明的步驟a)中，將馬鈴薯汁液的pH調(diào)節(jié)到4.0至6.5之間，優(yōu)選6.0。然后，在本 發(fā)明的步驟b)中，馬鈴薯汁液與官能化的支撐載體接觸，在該官能化的支撐載體中，至少 90%的孔隙具有IOnm至200nm之間的孔徑，并且其中載體經(jīng)疏水的混合模式的配體官能 化，該疏水的混合模式的配體具有2. 5?5、優(yōu)選4?5的pKa，該配體通過S原子或O原子， 優(yōu)選硫醚基與載體相連。該方式的步驟b)發(fā)生馬鈴薯蛋白的LMW部分的選擇性吸附，并且 由此，與官能化的支撐載體接觸之后的馬鈴薯汁液被去除了馬鈴薯蛋白的LMW部分。這樣 得到LMW去除的馬鈴薯汁液。在該實(shí)施方式的步驟c)中，通過在pH小于3 (酸性洗脫）的 酸性洗脫或高于9的pH(堿性洗脫）下，使馬鈴薯蛋白的LMW部分從官能化的支撐載體上 解吸附。酸性洗脫最終得到在顏色、氣味和味道上質(zhì)量較好的蛋白產(chǎn)物。
[0025] 在本發(fā)明的另一方式中，HMW馬鈴薯蛋白和LMW馬鈴薯蛋白（如果存在的話）都 首先作為包括馬鈴薯蛋白的HMW部分和LMW部分（如果存在的話）的蛋白混合物被吸附至 官能化的支撐載體。因此，該方法涉及總馬鈴薯蛋白部分的吸附。在這種方式中，馬鈴薯 汁液可以是如上所述的粗制的或經(jīng)預(yù)處理的馬鈴薯汁液，在這種情況中，馬鈴薯蛋白的HMW 部分和LMW部分都被吸附。另外，可以方便地使用LMW去除的馬鈴薯汁液，諸如通過馬鈴薯 蛋白的LMW部分的選擇性吸附之后獲得的馬鈴薯汁液，在這種情況中，基本上僅存在馬鈴 薯蛋白的HMW部分。在這種情況中，該方式需要從LMW去除的馬鈴薯汁液中選擇性吸附馬 鈴薯蛋白的HMW部分。
[0026] 本發(fā)明的這種方式在步驟a)中包括pH-調(diào)節(jié)步驟，其中將馬鈴薯汁液的pH調(diào)節(jié) 到4. 0至6. 5之間，優(yōu)選5. 2。然后，在步驟b)中，馬鈴薯汁液與官能化的支撐載體接觸，在 該官能化的支撐載體中，至少90%的孔隙具有IOnm至200nm之間的孔徑，并且其中載體經(jīng) 疏水的混合模式的配體官能化，該疏水的混合模式的配體具有2. 5?5、優(yōu)選4?5的pKa， 該配體通過S原子或O原子、優(yōu)選硫醚基與載體相連。在這一實(shí)施方式中，步驟b)發(fā)生馬 鈴薯蛋白的HMW部分和LMW部分（如果存在的話）的同時(shí)吸附。在步驟c)中，通過pH < 3 或pH > 9的酸性洗脫或堿性洗脫，作為包括HMW部分和LMW部分的單個(gè)蛋白部分，洗脫存 在于馬鈴薯汁液中的馬鈴薯蛋白。另外，在這種情況中，酸性洗脫得到在顏色、氣味和味道 上質(zhì)量?jī)?yōu)良的蛋白產(chǎn)物。
[0027] 對(duì)于本發(fā)明的這種方式，可選擇地，在步驟c)中可以進(jìn)行選擇性洗脫。在這種情 況中，在步驟c)中，通過在pH5. 7?6. 3、優(yōu)選pH6. 0時(shí)的馬鈴薯蛋白的HMW部分的第一選 擇性洗脫，進(jìn)行使馬鈴薯蛋白部分從官能化的支撐載體上解吸附。然后，通過如上所述的PH 低于3的酸性洗脫，或pH高于9的堿性洗脫，可以發(fā)生馬鈴薯蛋白的LMW部分（如果存在 的話）的選擇性洗脫。當(dāng)在該實(shí)施方式中使用LMW去除的馬鈴薯汁液時(shí)，可以使用較高的 洗脫pH，諸如pH 5. 7?8. 9、優(yōu)選8. 0,較高的洗脫pH提高HMW部分的洗脫效率。
[0028] 通常，在本發(fā)明的步驟a)中，將馬鈴薯汁液的pH調(diào)節(jié)至4. 0?6. 5、優(yōu)選5. 2,用 于使存在于馬鈴薯汁液中的所有馬鈴薯蛋白部分都吸附至官能化的支撐載體，然后洗脫馬 鈴薯蛋白部分。可選擇地，將馬鈴薯汁液的pH調(diào)節(jié)至4. O?6. 5、優(yōu)選6. 0,用于進(jìn)行馬鈴 薯蛋白的LMW部分的選擇性吸附。
[0029] 可以使用本領(lǐng)域已知的各種酸和/或堿，以濃縮或稀釋的形式或合并以形成緩沖 液，將馬鈴薯汁液的pH調(diào)節(jié)至4. 0?6. 5。因此，可以使用各種類型的強(qiáng)酸，諸如鹽酸、硫 酸、硝酸。另外，也可以使用弱酸，諸如磷酸、甲酸、乙酸、檸檬酸、乳酸。另外，馬鈴薯汁液的 預(yù)處理可能具有需要調(diào)節(jié)至較高PH的結(jié)果。在這種情況中，優(yōu)選的強(qiáng)堿例如是氫氧化鈉、 氫氧化鉀、氫氧化鈣。優(yōu)選的弱堿例如是碳酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、亞硫酸（氫） 鹽的鈉鹽和鉀鹽。當(dāng)使用緩沖液時(shí)，使用上述或本領(lǐng)域已知的其它弱酸和弱堿的組合，將馬 鈴薯汁液調(diào)節(jié)到所需的pH。
[0030] 通常，優(yōu)選使用強(qiáng)酸和/或堿來調(diào)節(jié)pH，最優(yōu)選使用鹽酸和/或氫氧化鈉。此外， 特別是當(dāng)尋求較低的氯化物含量時(shí)，用來調(diào)節(jié)PH的非常優(yōu)選的酸是甲酸。
[0031] 在本發(fā)明的步驟b)中，馬鈴薯汁液與官能化的支撐載體接觸。支撐載體可以具 有多種形式或形狀，只要它允許與馬鈴薯汁液發(fā)生足夠的接觸以允許發(fā)生吸附。支撐載 體可以采取任何形狀，諸如球形、豆形、液滴形或橢圓形，并且其中包括珠子、顆?；蚓W(wǎng)格 (grid)，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到其它形狀。支撐載體優(yōu)選基本是球形的，并且是以顆 粒的形式。優(yōu)選的顆?；蛑樽泳哂邪霃綖?0?150 μπι的珠子尺寸。該珠子尺寸在吸附能 力（比較小的珠子尺寸高）和對(duì)方法參數(shù)（諸如壓力和成本）的敏感性之間提供了良好的 平衡。
[0032] 支撐載體的重要方面在于，它是多孔材料。但是孔隙可能會(huì)被水凝膠填充或覆蓋。 具體地，支撐載體應(yīng)包含孔隙，該孔隙的至少90 %、優(yōu)選95%、更優(yōu)選98 %且最優(yōu)選至少 99%具有IOnm的孔徑下限和200nm的孔徑上限。因此，應(yīng)理解在IOnm至200nm之間的孔 徑指所有孔隙的至少90 %、優(yōu)選95 %、更優(yōu)選98 %且最優(yōu)選至少99 %具有IOnm至200nm 之間的孔徑。優(yōu)選地，孔隙具有20nm的孔徑下限和150nm、優(yōu)選IOOnm的孔徑上限，并且甚 至更優(yōu)選的，孔隙具有30nm的孔徑下限和lOOnm、優(yōu)選75nm的孔徑上限。通過使用汞注入 的孔隙度測(cè)定法來便利地確定孔徑，使用汞注入的孔隙度測(cè)定法是技術(shù)人員公知的技術(shù)。
[0033] 另外，在此方面的多孔材料是孔隙度（被定義為直徑小于150nm的所有孔的總的 孔隙體積）在〇. 5ml/g至I. 5ml/g之間的材料。優(yōu)選地，孔隙度是0. 7?I. lml/g。對(duì)于本 發(fā)明，也通過汞注入來確定孔隙度。
[0034] 對(duì)于本發(fā)明的范圍，支撐載體的孔徑和孔隙度非常重要。但是，支撐載體可以被安 裝在適當(dāng)?shù)暮诵纳?，以使支撐載體覆蓋核心的大部分或整個(gè)核心?？蛇x擇的，支撐載體可以 用基本被多孔材料涂層覆蓋的核心材料來描述。由于多種原因，諸如為了降低所需的多孔 材料的量或?yàn)榱烁淖冾w粒的密度或重量，可以使用這樣的核心。核心可以為實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo) 的任何材料，包括聚合物材料或金屬性材料，以及無機(jī)材料（諸如金屬氧化物）。優(yōu)選的，使 用碳化鎢（WC)、鐵或磁鐵礦作為核心材料。核心與支撐載體的比率可以是任何值，只要整個(gè) 顆粒滿足足夠的孔隙度的標(biāo)準(zhǔn)，并且保留有被如下所述的適當(dāng)?shù)呐潴w官能化的可能性。根 據(jù)本發(fā)明的官能化的支撐載體通過使適當(dāng)?shù)呐潴w與支撐載體反應(yīng)來獲得，從而獲得在本發(fā) 明中使用的官能化的支撐載體。
[0035] 用于足以進(jìn)行吸附的接觸的前體是使用孔徑為10?200nm、優(yōu)選10?150nm、更 優(yōu)選20?IOOnm且甚至更優(yōu)選30?75nm的支撐載體。發(fā)現(xiàn)較小的孔徑會(huì)阻礙吸附，而較 大的孔隙產(chǎn)生較小的接觸表面，以致特別是對(duì)HMW部分具有低吸附能力。只要滿足了上述 特征，制成支撐載體的材料就是次要的。因此，該材料可以是在方法條件下穩(wěn)定的任何聚合 物或生物材料，并且可以被制備成具有如上所述孔徑的孔隙，同時(shí)經(jīng)PKa 2. 5?5的至少一 種疏水的混合模式的配體官能化，該疏水的混合模式的配體通過S原子或O原子、優(yōu)選硫醚 基與載體相連。
[0036] 配體的支撐載體可以是多孔的合成聚合物、多孔的多糖、多孔的無機(jī)材料，或它們 的任意組合。優(yōu)選的，支撐載體可以由多孔的聚合物來制成，多孔的聚合物諸如為聚甲基丙 烯酸甲酯（PMM)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯或聚苯乙烯、多孔的多糖（如纖維素、葡聚 糖或瓊脂糖）和/或多孔的氧化硅、受控多孔玻璃或羥磷灰石。但是，最優(yōu)選的，使用瓊脂 糖和/或PMMA作為支撐載體。
[0037] 還可以使用如下的支撐載體，該支撐載體包括多孔的固體材料（諸如多孔的無機(jī) 材料，諸如陶瓷）與多孔的水凝膠材料（其中例如為某些多孔的多糖，諸如瓊脂糖）的組 合。
[0038] 對(duì)于實(shí)現(xiàn)馬鈴薯蛋白至官能化的支撐載體的充分吸附，要附接至支撐載體的配體 非常重要。適當(dāng)?shù)呐潴w是疏水的混合模式的配體。這意味著，它們的表現(xiàn)是基于靜電相互 作用和疏水相互作用的組合。配體的疏水性對(duì)于馬鈴薯蛋白的HMW部分的連接很重要。疏 水配體在本領(lǐng)域中是已知的，它們可以是任何非水溶性的基團(tuán)，即非極性基團(tuán)。發(fā)現(xiàn)了如下 所述的疏水基團(tuán)允許本發(fā)明的實(shí)施。
[0039] 發(fā)現(xiàn)了馬鈴薯糖蛋白更喜歡稍微疏水的環(huán)境，并且因此吸附至具有一定程度的疏 水性的官能化的支撐載體。疏水配體在本領(lǐng)域中是已知的，并且可以包括芳香基或雜芳香 基，以及其它的疏水分子組分。但是，當(dāng)僅使用沒有其它功能性的疏水配體時(shí)，觀察到HMW 部分的吸附，以及污染的有色物（其中有酚類）的吸附。這對(duì)馬鈴薯蛋白的HMW部分的分 離有負(fù)面影響。因此，還期望有其它的功能性來防止污染。
[0040] 還發(fā)現(xiàn)，在支撐載體上的配體的pKa在2. 5至5之間、優(yōu)選在4至5之間，對(duì)于馬 鈴薯蛋白至官能化的支撐載體的恰當(dāng)吸附是有利的。因此，優(yōu)選在用于根據(jù)本發(fā)明的官能 化的支撐載體的配體中存在羧酸基，但可選擇的，可以使用PKa在此范圍中的其它配體和 間隔體。
[0041] 當(dāng)使用pKai 2. 5至5之間的疏水配體時(shí)，馬鈴薯蛋白的LMW部分能夠吸附至官 能化的支撐載體。該口1(3范圍的優(yōu)點(diǎn)在于使用弱酸溶液或緩沖液可以發(fā)生馬鈴薯蛋白部分 的洗脫。高PH的洗脫引起經(jīng)分離的馬鈴薯蛋白部分的著色，這優(yōu)選是要避免的。另外，pH 低于2. 5的洗脫可能需要存在強(qiáng)酸和/或大量的鹽，這會(huì)產(chǎn)生浪費(fèi)的廢物流，并且可能影響 經(jīng)分離的馬鈴薯蛋白分離物的質(zhì)量。優(yōu)選的，配體的口心在2. 5至5之間，因?yàn)樵谶@些條件 下，在上述低PH和高pH下進(jìn)行洗脫的缺點(diǎn)之間的平衡是最佳的，從而得到最佳的性能。
[0042] 進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，pKa在2. 5至5之間的官能化的支撐載體的使用，諸如攜帶有酸基的 載體，大大降低了污染物至官能化的支撐載體的吸附。
[0043] 具有恰當(dāng)?shù)膒Ka范圍和恰當(dāng)?shù)氖杷缘慕M合時(shí)，發(fā)現(xiàn)HMW和LMW部分可以吸附至 官能化的支撐載體，且不會(huì)發(fā)生污染物（諸如（聚合）酚類和其它有色物）的顯著吸附。這 與帶正電荷（混合模式）的陰離子交換和疏水作用的樹脂相比是顯著的改進(jìn)。
[0044] 具體地，配體的pKa應(yīng)優(yōu)選在2. 5?5之間，更優(yōu)選在4?5之間。配體可以是脂 肪族配體、經(jīng)取代的脂肪族或芳香族配體（包括經(jīng)取代的和/或雜芳香基），或它們的組合。 適當(dāng)?shù)姆枷慊缡墙?jīng)取代的或未經(jīng)取代的苯基、萘基、吡啶和嘧啶結(jié)構(gòu)。
[0045] 因此，可以用于官能化支撐載體的配體是具有2. 5?5的pKa的疏水的混合模式 的配體。該配體應(yīng)通過S原子或O原子、優(yōu)選硫醚基與載體相連。
[0046] 優(yōu)選的，這些配體選自經(jīng)取代的吡啶、苯甲酸、水楊酸、煙酸或萘甲酸的組，其中一 種取代是在可用環(huán)位置處經(jīng)（CH 2)n-XH基團(tuán)取代，其中n = 0?4并且X = O或S。優(yōu)選的， 這些配體選自經(jīng)（CH2)n-SH取代的吡啶、苯甲酸、水楊酸和煙酸的組，其中η = 0?4。甚至更 優(yōu)選的，這些配體選自經(jīng)巰基取代的苯甲酸、水楊酸和煙酸的組（巰基相當(dāng)于硫醇基）。但 是，最優(yōu)選的配體是4-巰基苯甲酸和2-巰基煙酸（2-巰基吡啶-3-羧酸），目前認(rèn)為4-巰 基苯甲酸是這兩種最優(yōu)選的配體中最好的。
[0047] 配體應(yīng)通過S原子或0原子與支撐載體相連，例如通過硫酯基、硫醚基、醚基或酯 基與支撐載體相連。這意味著配體通過在骨架中含S原子或0原子的連接基團(tuán)與載體相連。
[0048] 優(yōu)選的，使用含硫的連接基團(tuán)，諸如硫醚連接基團(tuán)或硫醋連接基團(tuán)。優(yōu)選的，硫醚 基（通過硫橋（sulphide bridge)，_S_)使配體與支撐載體相連。這是很重要的，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn) 通過S原子或0原子的連接，但特別是通過使用硫醚基的S原子的連接，會(huì)產(chǎn)生對(duì)例如任何 類型的馬鈴薯汁液所引起的降解的抗性。相比之下，連接基團(tuán)中存在氮雜原子，例如胺基或 氨基（"N-連接的")，會(huì)產(chǎn)生在馬鈴薯汁液存在下的官能化的支撐載體的較快降解。在使配 體和載體相連的基團(tuán)中存在多個(gè)雜原子的情況中，優(yōu)選雜原子的至少一半、更優(yōu)選至少3/4 是S原子和/或0原子，并且最優(yōu)選氮原子不存在于骨架中。雜原子包括S、0、P和N原子。
[0049] 通過含氧的基團(tuán)（諸如酯或醚，且優(yōu)選醚）連接的配體顯示出對(duì)降解（或氧化、修 飾、褪色等）的增強(qiáng)的抗性，但是盡管比胺或氨連接的配體慢，這樣的配體仍然會(huì)降解。
[0050] 但是，氧連接的配體，特別是醚，是不像硫連接的配體（優(yōu)選硫醚）那么穩(wěn)定的。硫 連接的配體，尤其是其中配體是通過硫醚基與支撐載體相連的那些配體，顯示出對(duì)由馬鈴 薯汁液引起的降解具有特別高的抗性，因此在通過吸附方法從馬鈴薯汁液中分離馬鈴薯蛋 白中使用是特別有利的。
[0051] 同時(shí)，氧連接的配體具有比硫連接的配體（尤其是硫醚）低的HMW連接能力。這 可能被解釋為硫具有與碳大約相等的負(fù)電性，以致于在支撐載體和配體之間的連接鍵僅具 有較小的極性，這對(duì)于使配體的疏水性最大化是很重要的。
[0052] 因?yàn)檫@些原因，配體至支撐載體的硫連接或氧連接是優(yōu)選的，并且配體至支撐載 體的氮連接是不優(yōu)選的。在硫連接和氧連接之間，硫連接是優(yōu)選的。最優(yōu)選的，配體至支撐 載體的硫醚連接比氧連接更優(yōu)選。
[0053] 任選的，配體可以通過使用間隔體被附接至支撐載體。間隔體應(yīng)適于通過O原子 或S原子與聚合的支撐載體共價(jià)連接，并且通過O原子或S原子與配體共價(jià)連接。用于使配 體與聚合的支撐載體相連的間隔體優(yōu)選在骨架中不包括很多氮原子。在間隔體的骨架中存 在更多雜原子的情況中，雜原子的至少一半、優(yōu)選至少3/4是S原子或O原子。最優(yōu)選的， 用于使配體與聚合的支撐載體相連的間隔體在骨架中不包括氮原子。
[0054] 間隔體基團(tuán)優(yōu)選對(duì)酸性和堿性環(huán)境是足夠穩(wěn)定的，并且對(duì)在通過添加亞硫酸鹽獲 得的馬鈴薯汁液中的還原性條件是有耐受性的。這樣的間隔體對(duì)通常包含在馬鈴薯汁液或 加工流中的組分是高度穩(wěn)定的?？捎糜谶B接本發(fā)明的配體的間隔體包括：含環(huán)氧化物和環(huán) 硫乙烷的那些間隔體、鹵代乙?；屯榛u化物衍生物、丙烯酰氧基衍生物和/或芳基化 劑。優(yōu)選的，不包括許多附加極性的間隔體用于連接，諸如環(huán)氧化物和環(huán)硫乙烷。技術(shù)人員 能夠想到將在配體和聚合的支撐載體之間產(chǎn)生O連接或S連接的更多的間隔體，其中這些 連接中的至少一種受到硫醚基的影響，并且這樣的間隔體不會(huì)被排除在本發(fā)明之外。
[0055] 配體應(yīng)以足夠的量被附接至支撐載體，以實(shí)現(xiàn)高蛋白連接能力。這意味著，通常適 當(dāng)?shù)呐潴w以10?200meq/l，優(yōu)選10?120meq/l，并且更優(yōu)選30?80meq/l的量被附接至 支撐載體。這可以通過用于確定交換能力的公知的方法來確定，下面將描述其中的一個(gè)實(shí) 例。
[0056] 在本發(fā)明的又一方面，官能化的支撐載體吸附馬鈴薯蛋白的連接能力應(yīng)足夠高， 以允許對(duì)馬鈴薯蛋白進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的分離。因此，官能化的支撐載體的吸附能力應(yīng)為來自 PFJ的總蛋白至少為25g/l，優(yōu)選至少30g/l。另外，官能化的支撐載體應(yīng)能夠從LMW去除 的PFJ中吸附至少20g/l的HMW馬鈴薯蛋白，優(yōu)選至少25g/l的HMW馬鈴薯蛋白。官能化 的支撐載體的連接能力通過交換能力的確定來確定。
[0057] 在本發(fā)明的步驟c)中，蛋白部分通過洗脫從官能化的支撐載體上解吸附。這優(yōu)選 通過使用具有固定PH的水性緩沖液來進(jìn)行，該具有固定pH的水性緩沖液可以基于蛋白的 等電點(diǎn)（IEP)來（任選地，選擇性）洗脫蛋白部分。在本發(fā)明中使用的緩沖液可以包括任 何弱酸或弱堿化合物，以及與強(qiáng)酸的組合。LMW馬鈴薯蛋白的酸性洗脫比堿性洗脫更優(yōu)選， 以避免使蛋白發(fā)生褐變和脫酰胺化。進(jìn)一步的，通過高鹽含量的緩沖液進(jìn)行LMW馬鈴薯蛋 白的洗脫是不優(yōu)選的，因?yàn)闀?huì)有浪費(fèi)水或緩沖液再循環(huán)的問題。優(yōu)選的，用于HMW部分的洗 脫的緩沖液包括檸檬酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽或磷酸鹽緩沖液。用于LMW部分的洗脫的緩沖液 可以包括甲酸、乙酸、乳酸、馬來酸、丙二酸、蘋果酸、檸檬酸和/或磷酸，或弱酸緩沖液與強(qiáng) 酸（如鹽酸或硫酸）的組合。但是，優(yōu)選的，使用磷酸緩沖液，或甲酸和鹽酸的混合物洗脫 LMW部分和HMW部分以及它們的組合。
[0058] 當(dāng)在加工過程中需要調(diào)節(jié)馬鈴薯汁液的pH時(shí)，例如需要調(diào)節(jié)至較低pH或較高的 PH時(shí)，使用酸或堿調(diào)節(jié)pH。這樣的用于馬鈴薯汁液的pH調(diào)節(jié)的酸和堿可以有利地是弱酸， 例如是檸檬酸、乳酸、甲酸、乙酸或磷酸，或強(qiáng)酸，如硝酸、鹽酸和/或硫酸。另外，在馬鈴薯 汁液加工的過程中可能需要調(diào)節(jié)到較高的pH。在這種情況中，優(yōu)選的強(qiáng)堿例如是氫氧化鈉、 氫氧化鉀或氫氧化鈣。優(yōu)選的弱堿例如是碳酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽和亞硫酸（氫） 鹽的鈉鹽和鉀鹽。當(dāng)使用緩沖液時(shí)，使用上述或本領(lǐng)域已知的其它弱酸和弱堿的組合，將馬 鈴薯汁液調(diào)節(jié)到所需的pH。
[0059] 在本發(fā)明的步驟d)中，通過例如（超）過濾、離心、沉降、微孔過濾、沉淀和各種形 式的色譜法（例如交換色譜法、凝膠過濾、親和色譜法、疏水作用色譜法和反相色譜法），如 上所述的經(jīng)洗脫的蛋白部分可以在下游進(jìn)行進(jìn)一步的純化。進(jìn)一步的，可以使用不同的配 體實(shí)施吸附色譜法，以進(jìn)一步純化獲得的蛋白部分。
[0060] 優(yōu)選的，通過超過濾來濃縮天然的馬鈴薯蛋白部分。超過濾膜材料的選擇可以強(qiáng) 有力地影響選擇性。優(yōu)選的，超過濾膜包括纖維素、聚醚砜（PES)和聚砜（PS)?？梢允褂?基于PES或PS的膜，濃縮蛋白酶抑制劑分離物，其中PES基或PS基的膜的分子截留為2? 20kDa并且在一定程度上為30kDa?？梢允褂没赑ES或PS的膜或基于再生的纖維素的 膜，濃縮馬鈴薯糖蛋白分離物，其中基于PES或PS的膜的分子截留為5?30kDa，基于再生 的纖維素的膜的分子截留為5?30kDa。這些膜可以作為管狀、螺旋纏繞、中空的纖維、盤 和框架，或作為交叉轉(zhuǎn)動(dòng)感應(yīng)的剪切過濾裝置（cross-rotational induced shear filter unit)來實(shí)施。
[0061] 在pH值為4.0?8.0,優(yōu)選pH為6.0?7. 5時(shí)，超過濾馬鈴薯糖蛋白分離物。對(duì) 于蛋白酶抑制劑分離物，使用的pH值為3?7,優(yōu)選3. 2?4. 5。在去除雜質(zhì)后，可以使pH 升高至pH 7?10,以能夠得到通過膜的高流量。優(yōu)選在低pH 3. 0?5. 0下對(duì)蛋白酶抑制 劑進(jìn)行加工。
[0062] 除了純化步驟之外，通過使用二氧化碳的蒸發(fā)、冷凍濃縮或等電點(diǎn)沉淀可以使通 過本發(fā)明的方法獲得的天然的馬鈴薯蛋白分離物濃縮至含高達(dá)超過20%的干物質(zhì)?；诘?的水平（凱氏氮含量倍數(shù)（Kjeldahl nitrogen content times) 6. 25)，這些濃縮物的干物 質(zhì)可以含有超過85 %的蛋白，優(yōu)選超過90 %的蛋白。經(jīng)干燥的產(chǎn)物可以含有超過90 %，優(yōu) 選超過92 %的蛋白，同時(shí)水分水平為4?9 %。
[0063] 在又一方面，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明的方法可獲得的天然馬鈴薯蛋白部分。該天 然的馬鈴薯蛋白部分可以是總的天然馬鈴薯蛋白部分，天然馬鈴薯蛋白的馬鈴薯糖蛋白部 分，或天然馬鈴薯蛋白的蛋白酶抑制劑部分，或它們的任意組合或亞部分。這些馬鈴薯蛋白 部分的特征是它們的高純度和高穩(wěn)定性。本發(fā)明的總天然馬鈴薯蛋白部分可以具有4. 5以 上的等電點(diǎn)，超過4kDa的分子量。馬鈴薯蛋白部分優(yōu)選基本沒有馬鈴薯來源的有機(jī)酸和氨 基酸。
[0064] 本發(fā)明的天然馬鈴薯蛋白的馬鈴薯糖蛋白部分可以具有5. 8以下、優(yōu)選4. 8?5. 5 的等電點(diǎn)，超過30kDa、優(yōu)選超過35kDa的分子量。
[0065] 本發(fā)明的天然馬鈴薯蛋白的蛋白酶抑制劑部分可以具有5. 5以上、優(yōu)選5. 8以上 的等電點(diǎn)，35kDa以下、優(yōu)選4?30kDa的分子量。
[0066] 可以通過噴霧干燥、急驟干燥（flash drying)或冷凍干燥來獲得干燥的天然馬鈴 薯蛋白。馬鈴薯糖蛋白部分、蛋白酶抑制劑部分和總馬鈴薯蛋白部分被設(shè)定為適當(dāng)?shù)腜H，以 確保有良好的水溶性。濃縮物的pH被設(shè)定為7.0?9.0,優(yōu)選為7.0?8.0。可以使用低 pH值（3. 0?4. 0)以及高pH值（7. 0?9. 0)，來噴霧干燥蛋白酶抑制劑的濃縮物。由此獲 得的天然馬鈴薯蛋白在7. 0的pH及25°C的溫度下，具有超過90%，優(yōu)選超過95 %的水溶 性。水溶性被表示為在對(duì)溶液進(jìn)行離心之后，蛋白在上清液中的百分比。
[0067] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在超過濾濃縮之后獲得的天然馬鈴薯蛋白分離物具有干物 質(zhì)含量超過75%的蛋白含量。在此，蛋白含量被限定為凱氏氮含量倍數(shù)6. 25。優(yōu)選的，天然 馬鈴薯蛋白分離物中的蛋白含量超過80 %，更優(yōu)選超過90 %，并且甚至更優(yōu)選超過95 %。
[0068] 可以通過二維凝膠電泳分析，與使用MALDI-T0F質(zhì)譜分析對(duì)分離物中的關(guān)鍵蛋白 的鑒定相組合，來描述本發(fā)明的天然馬鈴薯蛋白分離物的特征?？梢栽谑褂肞H梯度為3至 8,并且分子量為5?IOOkDa的二維凝膠電泳中，分離蛋白。
[0069] 為了使用本發(fā)明，通過例如將官能化的支撐載體安裝在柱子、膠管或管狀物中固 定該官能化的支撐載體，同時(shí)馬鈴薯汁液流過或通過該官能化的支撐載體。在這樣的實(shí)施 方式中，吸附最可能通過連續(xù)或半連續(xù)的方法來實(shí)現(xiàn)，例如填充床色譜法、擴(kuò)展床色譜法、 膜吸附器或磁性穩(wěn)定的床色譜法。另外，官能化的支撐載體可以以網(wǎng)格形式被安裝在這種 管狀物中，馬鈴薯汁液流通過網(wǎng)格與官能化的支撐載體接觸。其它方式是本領(lǐng)域技術(shù)人員 容易想到的，也并不被排除在外。
[0070] 在本發(fā)明的另一方面中，通過將馬鈴薯汁液和支撐載體組合在單個(gè)容器中，使官 能化的支撐載體與馬鈴薯汁液接觸，在這種情況中，可以攪拌、搖動(dòng)或其它物理地混合這樣 的混合物，以增加支撐載體和馬鈴薯汁液之間的接觸。在這樣的實(shí)施方式中，馬鈴薯蛋白的 吸附最可能是分批過程，這在使用高粘性的蛋白溶液時(shí)是有利的。
[0071] 但是，能夠?qū)嵤┦柜R鈴薯汁液與官能化的支撐載體接觸的任何方式，前提是接觸 足夠強(qiáng)以使馬鈴薯蛋白能夠吸附至官能化的支撐載體，該支撐載體具有如上所述的孔隙度 并且允許附接至少一種PKa 2. 5?5的疏水的混合模式的配體，該疏水的混合模式的配體 通過S原子或O原子、優(yōu)選硫醚基與載體相連。
[0072] 現(xiàn)在，將通過以下的非限制性實(shí)例來例示本發(fā)明。
[0073] 方法
[0074] 支撐載體的官能化
[0075] 原理
[0076] 在等于或高于8. 5的pH(依賴于連接基團(tuán)），發(fā)生配體對(duì)經(jīng)環(huán)氧化物活化的 Sepabead EP (或 HFA)支撐載體（獲自 Resindion, Binasco (比納斯科），Italy (意大利）） 的官能化。將用于支撐載體的官能化的配體溶液如下設(shè)定至固定的PH :巰基官能化的配體 溶液的pH被設(shè)定為8. 5,氨基官能化的配體溶液的pH被設(shè)定為9. 5,并且羥基官能化的配 體溶液的PH被設(shè)定為等于或高于11。如果配體在期望的pH下不溶解，則升高pH，直至配 體完全溶解。
[0077] 方法
[0078] 通過添加5M氫氧化鉀，直至達(dá)到期望的pH，使配體（1M, Sigma Aldrich (西格瑪奧 瑞奇），Zwijndrecht (茲韋恩德雷赫特），Netherlands (荷蘭））溶解在250mL除礦物質(zhì)的 水中。使用IOOmM硼酸鹽，對(duì)巰基或氨基取代的配體溶液進(jìn)行緩沖處理。在PH為11時(shí)，實(shí) 施羥基官能化配體的連接反應(yīng)，不需要添加緩沖液。在配體的溶解過程中，調(diào)節(jié)PH并且添 加除礦物質(zhì)的水，直至在期望的PH且體積為300mL時(shí)，配體完全溶解。允許在添加支撐載 體之前，使配體溶液達(dá)到室溫。
[0079] 在玻璃濾器中，使用除礦物質(zhì)的水清洗經(jīng)環(huán)氧化物活化的S印abead EP支撐載體 (100mL，Resindion,比納斯科，意大利），直至電導(dǎo)率低于10yS/cm，并且通過在真空條件 下運(yùn)行支撐載體來去除過量的水。然后，將支撐載體轉(zhuǎn)移到具有配體溶液的500mL的燒瓶 中，使用磨口塞封閉燒瓶并且在175rpm下孵育過夜。在1小時(shí)后及第二天清晨檢驗(yàn)pH。
[0080] 在使用IOOmM氫氧化鈉沖洗過量的配體后，通過使官能化的支撐載體在50°C的IM 氫氧化鈉中孵育2小時(shí)，使剩余的環(huán)氧基水解。將官能化的支撐載體儲(chǔ)存在4°C的50mM的 氫氧化鈉中。
[0081] 在實(shí)例2中使用的PMMA和瓊脂糖支撐載體經(jīng)環(huán)氧活化，并且因此能夠根據(jù)上面的 Sepabead EP和HFA中所述的相同的原理和方法，使用4MBA對(duì)它們進(jìn)行官能化。
[0082] 根據(jù)開發(fā)商的說明書（Sartorius Stedim Biotech(賽多利斯生物技術(shù)公 司），Goettingen(哥廷根），Germany (德國(guó)）），對(duì)Sartobind的經(jīng)環(huán)氧活化的膜裝置進(jìn)行官 能化。
[0083] 計(jì)算
[0084] 使用ChemAxon的MarvinSketch (2011) 5· 4. I. 1軟件計(jì)算經(jīng)標(biāo)記的配體的pKa，其 中pKa選項(xiàng)列在表1中。通過使用官能化的支撐載體的環(huán)氧基計(jì)算pKa，考慮到由標(biāo)記（可 能影響陰離子基團(tuán)的PKa)導(dǎo)致的電子分布的可能改變。
[0085] 表I :MarvinSketch中計(jì)算口1^的選定的pK a選項(xiàng)
[0086]
[0087] 總交換能力

【權(quán)利要求】
1. 一種用于從馬鈴馨汁液分離天然的馬鈴馨蛋白部分的方法，包括w下步驟： a)將所述馬鈴馨汁液的抑調(diào)節(jié)至4. 0?6. 5 ; b) 使所述馬鈴馨汁液與具有孔隙的官能化的支撐載體接觸，其中，至少90%的所述孔 隙具有l(wèi)Onm至200nm之間的孔徑，并且其中，所述支撐載體經(jīng)地a為2. 5?5的疏水的混 合模式的配體官能化，該配體通過S原子或0原子與所述支撐載體相連； C)通過洗脫，使所述馬鈴馨蛋白部分從官能化的所述支撐載體解吸附；W及 d)任選地濃縮和/或干燥所述馬鈴馨蛋白部分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，洗脫在5. 7至8. 9之間的抑下進(jìn)行。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述馬鈴馨蛋白部分是馬鈴馨糖蛋白部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，洗脫在9 W上或3 W下的抑下進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述馬鈴馨蛋白部分是蛋白酶抑制劑部分。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，使用水性緩沖液進(jìn)行洗脫。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述混合模式的配體選自經(jīng)取代的 苯甲酸、水楊酸、煙酸和蒙甲酸的組，其中取代是在可用的環(huán)位置處經(jīng)（CH2)"-XH基團(tuán)的取 代，（CH2)n-XH 中，n = 0 ?4 并且 X = S。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述支撐載體是多孔的合成聚合物、 多孔的多糖、多孔的無機(jī)材料，或它們的任意組合。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述疏水的混合模式的配體通過間 隔體被附接至所述支撐載體，所述間隔體通過0原子或S原子與所述支撐載體連接，并且所 述間隔體不包括含氮的官能團(tuán)。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，使用酸和/或堿調(diào)節(jié)所述馬鈴馨汁 液的抑。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述馬鈴馨汁液已經(jīng)經(jīng)過了預(yù)處 理，所述預(yù)處理包括將污染物吸附至分層的娃酸鹽和/或活性炭，和/或絮凝。
12. -種通過根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法獲得的天然的馬鈴馨蛋白部分。
【文檔編號(hào)】A23J1/00GK104470368SQ201380037257
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月11日
【發(fā)明者】馬爾克·路易吉·費(fèi)代里科·朱塞平, 馬克·克里斯蒂安·勞斯, 揚(yáng)·斯赫伊浦爾 申請(qǐng)人:艾維貝合作公司