定量多重甲基化特異性PCR方法-cMethDNA、試劑及其用途
【專利摘要】本發(fā)明的cMethDNA方法是QM-MSP方法(美國專利號8,062,849)的新穎的改進，特別地旨在以已經(jīng)報道的最低拷貝數(shù)定量檢測流體諸如血清或血漿中的腫瘤DNA(或其他循環(huán)DNA)。與任何其他基于PCR的測定相比特有的是，將少量拷貝的合成的多核苷酸標準品(STD基因)添加至等分的患者血清。在標準過程中，將用于多個感興趣的基因(TARGET基因)的標準品的混合物添加至血清樣品。純化并處理總DNA后，進行PCR(多重步驟)，其中用相同的外部引物組共擴增STD基因和TARGET基因。在第二巢式PCR步驟中，存在于第一PCR反應的稀釋物中的擴增子經(jīng)受實時PCR，并通過雙色實時PCR對一個孔中的各基因進行定量。產(chǎn)物通過用對甲基化的TARGET基因和相關的STD基因特異性的內(nèi)部引物組的絕對定量來計算。公開了制備STD基因標準品的方法及cMethDNA方法的用途以及包含其的試劑盒。
【專利說明】定量多重甲基化特異性PCR方法-cMethDNA、試劑及其用途
[0001] 相關申請的引用
[0002] 本申請要求2012年5月22日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/650, 083的權益，該 美國臨時專利申請在此通過引用并入本文用于所有目的，如同在本文中充分闡明。
[0003] 通討引用并入的電子提奪的材料
[0004] 本申請包含經(jīng)EFS-Web以ASCII格式提交并在此通過引用以其整體并入的序列 表。所述ASCII文本，創(chuàng)建日期為2013年5月13日，名稱為P12014-02_SL.txt且大小為 58, 416 字節(jié)。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 現(xiàn)在清楚的是，包括基因啟動子和基因內(nèi)部一些區(qū)域的過度甲基化的表觀遺傳改 變與腫瘤進展一致且是其中的早期事件。認為此類改變通過轉(zhuǎn)錄沉默腫瘤抑制基因表達并 通過增加基因突變的比率有助于腫瘤過程。由于DNA甲基化不改變DNA序列，其是可逆的； 然而，其是從細胞至細胞可遺傳的。如此，甲基化的基因可用作生物標志物諸如用于癌癥的 早期檢測、風險評估、預測并監(jiān)測對治療的反應、以及復發(fā)的早期檢測。
[0007] 腫瘤DNA可見于各種體液，并且這些體液可潛在地用作診斷材料。腫瘤DNA在這 些液體中的評價需要特異以及敏感的方法。已知稱為甲基化特異性PCR(MSP)的基于PCR 的技術在一千個未甲基化的基因組DNA拷貝中檢測一個拷貝的甲基化的基因組DNA。定量 實時PCR(Q-PCR)允許用最少處理的樣品在幾小時內(nèi)高度靈敏的定量感興趣的基因的轉(zhuǎn)錄 水平或DNA水平。感興趣的基因的cDNA或基因組拷貝使用光學可檢測的多核苷酸探針當 PCR產(chǎn)物積累時通過檢測PCR產(chǎn)物來定量。定量MSP (Q-MSP)允許通過實時PCR用甲基化特 異性引物探針高度靈敏的檢測基因啟動子甲基化水平。
[0008] 定量和多重MSP技術已被改進以在巢式或多重MSP測定中同時共擴增 (co-amplify)數(shù)個基因來開發(fā)定量多重甲基化特異性PCR(QM-MSP)。QM-MSP方法基于實 時PCR，其使用一個或更多個可區(qū)別的光學可檢測探針以增加測定特異性和靈敏度使得可 在100, 000個未甲基化的基因拷貝中檢測出一至十個拷貝的期望的甲基化基因。
[0009] 來自本發(fā)明人的研宄已表明一組（a panel of)甲基化標志物可在來自導管液 (ductal fluid)的細胞中和在自發(fā)乳頭溢液中檢測100%的所有乳腺癌和95%的DCIS、 和癌癥。然而，來自血清/血漿的甲基化的DNA的可重復檢測證明是更困難的。在過去15 年中，許多研宄已報道了在血清/血漿中使用單一或一組標志物檢測乳腺癌。然而，還沒有 臨床驗證研宄遵循這些初步結果，表明這一分析中還存在待解決的技術困難：1)首先，血 清中脫落的甲基化的腫瘤DNA的量是由正常細胞脫落的總的未甲基化的DNA(匹配基因特 異性DNA或參考DNA諸如肌動蛋白）的非常小的部分。體液中未甲基化的或參考DNA與稀 有的靶甲基化的DNA的相對豐度之間存在不均衡性。由于甲基化信號被更為豐富的種類掩 蔽，這導致缺少穩(wěn)固性測定；2)正常未甲基化的DNA脫落的程度每日波動并伴隨各種臨床 狀態(tài)，諸如外科手術或感染；如果參考波動，則誤差存在于感興趣的靶基因的％甲基化的解 釋中；3)可用的最靈敏的測定利用巢式PCR(進行或不進行多重）以使用在感興趣的區(qū)域 夕卜側的外部引物預擴增靶DNA和參考DNA的擴增子，隨后進行兩輪定量PCR。但存在技術限 制使得靶DNA和參考DNA區(qū)域需要理想地使用同一對外部引物以相同效率在預擴增PCR反 應中被共擴增，以維持靶DNA與參考DNA的準確起始比。在巢式PCR中，由于非同一基因之 間引物雜交的效率差異，肌動蛋白或其他基因不能準確用作感興趣的基因的參考。因此，取 決于DNA特異性引物與靶和參考DNA的雜交的效率的相對差異，靶與參考的比隨每個循環(huán) 的預擴增而改變；4)現(xiàn)有血清MSP測定通常需要10-20ng基因組DNA/測定以一次測試一個 基因。由于癌癥患者的血清中總DNA的水平是低的[中值65. 4ng/ml ;范圍6. 3 - 268. 6ng/ ml ;Holdenrieder 等人，Ann. N. Y. Acad. Sci. 1137:162-170 (2008)]，數(shù)個基因的測定需要 大量血清，因為來自現(xiàn)有臨床研宄的檔案血清僅以小體積可用，使重復研宄成問題且難以 臨床驗證。
[0010] 發(fā)明概沐
[0011] 為了克服這些問題，本發(fā)明人現(xiàn)已開發(fā)出新穎的定量多重甲基化特異性PCR方 法，其稱為"cMethDNA"。這種方法克服了以上討論的全部限制：1)對于每個基因標志物，開 發(fā)了重組工程化的基因特異性標準品（STD基因（STDgene))作為參考DNA。為了避免遮蔽 靶DNA (TARGET基因（TARGETgene))，僅使用每300 y 1血清50個拷貝（150pg的基因組等價 物）的參考；2)不測定未甲基化或不相關的DNA，因此未甲基化的DNA中的波動將不會影響 靶基因的甲基化的定量；3)各STD基因DNA被設計具有與甲基化的感興趣的TARGET基因 同源的5'和3'末端（每個末端?20-22個堿基），并在末端之間具有相似數(shù)目的間隔核苷 酸，因此在預擴增PCR(第一輪）期間，TARGET基因和STD基因DNA兩者可用單一外部引物 組共擴增，獨立于TARGET基因的甲基化狀態(tài)；以及4)使用從300 y 1的血清分離的輸入基 因組 DNA (低至 1. 9ng)[中值 65. 4ng/ml ;范圍 6. 3 - 268. 6ng/ml ;Holdenrieder 等人，Ann. N.Y. Acad. Sci. 1137:162-170 (2008)]，在預擴增步驟期間進行多重PCR以促進具有直至12 或更多個TARGET基因DNA(以及其各自的STD基因DNA)的數(shù)以億計的擴增子的合成。綜 合考慮，將累積的和單個TARGET基因甲基化表示為針對標志物的組（marker panel)的累 積甲基化指數(shù)（CMI)，和針對單個基因的甲基化指數(shù)（MI)。CMI通過確定針對組中單個基因 的MI的和來計算。MI = [#拷貝TARGET基因/#拷貝（TARGET基因+SID基因）](100)。
[0012] 根據(jù)一個或更多個實施方案，本發(fā)明人開發(fā)了使用一組選擇的TARGET基因的 cMethDNA測定，發(fā)現(xiàn)通過全基因組甲基化陣列分析，以靈敏度>90%和特異性>96%檢測4 期患者（57名癌癥；55名正常）血清的訓練組和測試組中甲基化的TARGET基因DNA。在來 自診斷時三個不同的4期群體中的相同患者的原發(fā)性、遠端轉(zhuǎn)移和血清、在尸檢時收集的 復發(fā)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌、和樣品之間觀察到DNA甲基化模式的顯著一致性，表明核心甲基化 標簽隨時間推移被保留。甲基化水平顯示與治療后化療反應相關。在29例患者的初步研 宄中，顯示cMethDNA能夠監(jiān)測對治療的反應?？傊?，下文實施例中的數(shù)據(jù)顯示了本發(fā)明的 cMethDNA方法：1)可檢測脫落進入血液的腫瘤DNA，2)反映原發(fā)性腫瘤及其轉(zhuǎn)移病灶的典 型的甲基化改變，以及3)顯示評價化療干預后對治療的反應的潛力。
[0013] 本發(fā)明的cMethDNA方法是QM-MSP方法（美國專利號8, 062, 849,并通過引用以 其整體并入本文）的新穎的改進，特別地旨在以已經(jīng)報道的最低濃度（300 yl血清中50拷 貝）定量檢測流體諸如血清或血漿中的腫瘤DNA(或其他循環(huán)DNA)。與任何其他基于PCR 的測定相比特有的是，將少量拷貝的合成的多核苷酸標準品（STD基因）添加至等分的患者 血清。在標準過程中，將用于多個感興趣的基因（TARGET基因）的標準品的混合物添加至 血清樣品。純化并處理總DNA后，進行PCR(預擴增，多重步驟），其中STD基因和TARGET基 因以獨立于TARGET基因的甲基化狀態(tài)的方式用相同外部引物組共擴增。在巢式PCR的第 二步中，存在于第一PCR反應的稀釋物中的擴增子經(jīng)受實時PCR，并通過雙色實時PCR對一 個或兩個孔中的各基因進行定量。產(chǎn)物通過用對甲基化的TARGET基因和相關的STD基因 特異性的內(nèi)部引物組的絕對定量來計算。然后，基于拷貝數(shù)確定各基因的甲基化指數(shù)（MI)， 以及基因的組（gene panel)的累積甲基化（CMI)。
[0014] 根據(jù)實施方案，本發(fā)明提供了定量來自受試者的樣品中一個或更多個感興趣的基 因的甲基化的方法，該方法包括：a)向來自受試者的包含DNA的樣品中添加對待檢測的各 感興趣的TARGET基因特異性的STD基因的多個拷貝；b)分離并處理樣品中的DNA ;c)制 備（a)中的DNA用于甲基化特異性PCR;d)使用PCR在足以產(chǎn)生第一擴增產(chǎn)物的條件下 用一對或更多對外部甲基化獨立的PCR引物（external methylation-independent PCR primers)擴增（b)中的DNA，其中各單一引物對能夠僅與一個待檢測的TARGET基因以及對 該TARGET基因特異性的STD基因選擇性地雜交；e)獲得（d)的第一擴增產(chǎn)物的稀釋的樣 品；f)向（e)中添加一對對各TARGET基因特異性的內(nèi)部甲基化依賴的PCR引物（internal methylation-dependent PCR primer)、和一對對感興趣的基因的各STD基因特異性的內(nèi)部 PCR引物、與各TARGET基因的靶序列特異性雜交的一個或更多個光學可檢測的標記的DNA 探針、和與各STD基因特異性雜交的一個或更多個光學可檢測的標記的DNA探針；以及g) 使用定量RT-PCR在足以產(chǎn)生第二擴增產(chǎn)物的條件下擴增（f)中的DNA，所述第二擴增產(chǎn)物 提供各甲基化的TARGET基因的拷貝的量和各STD基因的拷貝的量的定量。
[0015] 根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明提供了診斷來自受試者的樣品中與異常DNA甲基化 相關的疾病的發(fā)展的方法，該方法包括：a)向來自受試者的包含DNA的樣品中添加針對待 檢測的各感興趣的TARGET基因的STD基因的多個拷貝；b)分離并處理（a)的樣品中的DNA 以制備用于甲基化特異性PCR的DNA ;c)使用PCR在足以產(chǎn)生第一擴增產(chǎn)物的條件下用一 對或更多對外部甲基化獨立的PCR引物擴增（b)中的DNA，其中各單一引物對能夠僅與一 個待檢測的感興趣的TARGET基因和對該相同基因特異性的STD基因選擇性地雜交；d)獲 得（c)的第一擴增產(chǎn)物的稀釋的樣品；e)向（d)添加對各TARGET基因特異性的一對內(nèi)部 甲基化依賴的PCR引物、和對TARGET基因的各STD基因特異性的一對內(nèi)部PCR引物、與感 興趣的基因的各TARGET基因特異性雜交的一個或更多個光學可檢測的標記的DNA探針、和 與感興趣的基因的各STD基因特異性雜交的一個或更多個光學可檢測的標記的DNA探針； 以及f)使用定量RT-PCR在足以產(chǎn)生第二擴增產(chǎn)物的條件下擴增（e)中的DNA，所述第二 擴增產(chǎn)物提供各甲基化的TARGET基因的拷貝的量和感興趣的基因的各STD基因的拷貝的 量的定量，其中與對照相比，從樣品獲得的一個或更多個TARGET基因的甲基化拷貝的量的 增加指示疾病的增加的風險和/或存在；以及b)診斷受試者為具有疾病的增加的風險和/ 或存在。
[0016] 根據(jù)另外的實施方案，本發(fā)明提供了用于在RT-PCR中使用的STD基因，包括具有 與內(nèi)源性感興趣的TARGET基因的5'和3'末端核苷酸序列相同的5'和3'末端核苷酸序 列的寡核苷酸，其中在5'和3'末端核苷酸序列之間的間隔寡核苷酸序列包括原核的、或非 哺乳動物的、或不相關哺乳動物的DNA序列，并且STD基因的整體大?。▔A基對的數(shù)目）與 感興趣的TARGET基因區(qū)域的擴增子大小約相同。
[0017] 根據(jù)實施方案，本發(fā)明提供了用于確定DNA樣品中多個TARGET基因DNA序列的甲 基化狀態(tài)的一個或更多個試劑盒。本發(fā)明試劑盒包括對待檢測的各感興趣的TARGET基因 特異性的STD基因的多個拷貝、和在允許產(chǎn)生包含第一擴增子的第一擴增產(chǎn)物的條件下能 夠與待檢測的一個或更多個TARGET基因的每一個選擇性雜交以及能夠與STD基因的每一 個選擇性雜交的一對或更多對外部甲基化獨立的PCR引物、對感興趣的基因特異性的一對 或更多對內(nèi)部甲基化依賴的PCR引物、對各感興趣的TARGET基因的SPS特異性的一對或更 多對內(nèi)部PCR引物、與感興趣的TARGET基因特異性雜交的一個或更多個光學可檢測的標記 的DNA探針、和與感興趣的基因的STD基因特異性雜交的一個或更多個光學可檢測的標記 的DNA探針。
[0018] 附圖簡沐
[0019] 圖1描繪了乳腺癌中全基因組血清DNA甲基化陣列。從患有乳腺癌的個 體和正常對照獲得的血清樣品使用Inf inium人甲基化27珠芯片陣列（Inf inium HumanMethylaion27BeadChip Array)來詢問。1A)對針對在個體樣品內(nèi)良好技術再現(xiàn)性選 擇的個體患者樣品（X-軸）和探針（Y-軸）進行非監(jiān)督二維層序聚類分析[探針檢測p-值 〈0. 00001 ;26789/27578陣列探針]。顯示了根據(jù)癌癥或正常樣品起源分開的兩個不同的 簇，指示陣列中基因組甲基化譜的差異。1B)用于癌癥特異性陣列探針的監(jiān)督選擇的標準方 案。1C)在癌癥（Y-軸）和正常（X-軸）的樣品組中針對血清（左圖）和組織（右圖）的 172個癌癥特異性探針（正方形）的每個的平均甲基化水平被顯示在散點圖中。實線顯示 針對單個CpG基因座探針，組間的平均甲基化（AVE_f3甲基化）水平中的±1.5倍差異的 區(qū)域。
[0020] 圖2描繪了本發(fā)明的cMethDNA測定的實施方案的示意圖。2A)使用一對引物/ 基因（正向和反向）進行多重第一 PCR反應（步驟1)以共擴增10個獨特的基因。各獨特 的引物對擴增感興趣的基因（TARGET基因）和在DNA純化前向患者的血清摻加入50個拷 貝的匹配克隆的基因特異性標準品（STD基因）。在第二PCR反應（步驟2)中，各獨特的 TARGET基因和STD基因的組的擴增子使用實時PCR用基因特異性的引物（正向和反向）和 水解探針（以雙色，識別TARGET基因或STD基因）的組在同一孔中測定。2B)驗證陣列生 物標志物組（array biomarker panel)。通過cMethDNA測試52個血清的訓練組（training set)。2〇 (2B)中數(shù)據(jù)的箱線圖顯示，癌癥血清表現(xiàn)比正常對照顯著更高的中值累積甲基化 (p〈0. 0001)。
[0021] 圖3描繪了測定驗證的步驟。3A)cMethDNA測定在摻加有0至3200個拷貝甲基化 的基因組MDA-MB-453DNA的正常血清樣品的六個重復組中的再現(xiàn)性。盒須圖顯示了各樣品 的重復（X-軸）的CMI的中值和范圍（Y-軸）。顯示了統(tǒng)計顯著性（Mann-Whitney檢驗） 和P值，且表格提供了各測試的詳細內(nèi)容和％變異系數(shù)（CV，頻率分布的標準化測量）。3B) cMethDNA和QM-MSP測定的比較。cMethDNA在各拷貝數(shù)下在重復中具有顯著更高的累積甲 基化水平（P= 〇. 0022 - 0. 005)。3C)將QM-MSP和cMethDNA方法針對來自十二個獨立的 轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者血清樣品的每個的等分的多個血清DNA直接彼此比較。與使用基因特異 性未甲基化的DNA作為參考的QM-MSP方法相比，通過使用基因特異性標準品作為qPCR參 考，cMethDNA產(chǎn)生顯著更高的RASSF1A甲基化值（p = 0. 0233,配對t-檢驗）。3D)通過在 相同實驗室的兩個獨立的研宄者針對一組十三名患者血清樣品評價用戶間（inter-user) 再現(xiàn)性。使用組內(nèi)相關系數(shù)評價10個基因的組的用戶表現(xiàn)顯示高的再現(xiàn)性（〇. 99 ;95% Cl 0. 96-1. 00)。
[0022] 圖4示出了通過cMethDNA檢測轉(zhuǎn)移性乳腺癌DNA。將來自患有復發(fā)轉(zhuǎn)移性IV期 疾病的患者的血清樣品分配到訓練組和測試組（test set) (X-軸；分別來自J0425/J0214 和J0524試驗，圖4A-4B)。將來自正常女性的血清樣品隨機分配到各組。對各組進行 cMethDNA。使用訓練組通過接受者操作者特征（Receiver Operator Characteristic)定 義實驗室閾值（CMI = 7個單位；Y-軸）。針對整個組計算CMI (Y-軸；由條高指示）。4C) 顯示了這些數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。4D)組中的單個標志物的甲基化頻率（甲基化定義為MI>1個 單位）。
[0023] 圖5描繪了治療反應的監(jiān)測。5A)對在轉(zhuǎn)移性疾病復發(fā)時（前）以及在治療 8-21天后（后）、反應的臨床評價前6-10周從乳腺癌患者（n = 28)獲得的血清樣品進行 cMethDNA。根據(jù)個體患者中的CMI繪制數(shù)據(jù)，所述患者在8-12周后根據(jù)RECIST標準判斷 為具有或不具有進展性疾病。5B)根據(jù)CMI中變化的百分比繪制相同數(shù)據(jù)。5C)(a-d):在 治療過程中的不同的時間點由cMethDNA評價的患者（ST#)血清的CMI的代表性圖。a-b : 28天化療周期，c-d :21天化療周期。C :治療的周期；PD，SD :分別為成像和RECIST標準評 價的進展性或穩(wěn)定性疾病。
[0024] 發(fā)明詳沐
[0025] 本發(fā)明的方法采用改進的兩步定量多重甲基化特異性PCR(QM-MSP)方法，其中許 多基因從先前僅用于一個基因的量的樣品中共擴增，且組合的甲基化評分可針對基因的組 生成。由于本發(fā)明的方法中加入STD基因序列、STD基因引物、和STD基因探針，本發(fā)明的 cMethDNA方法將多重靈敏性QM-MSP與增加的定量信號噪聲比組合。這些新穎的cMethDNA 方法允許多個基因的組例如從源自待測試的受試者的樣品來源的有限量的DNA共擴增，所 述基因的過度甲基化與疾病或生物學狀態(tài)諸如一種類型的癌相關。cMethDNA克服了導致缺 乏測定穩(wěn)固性的其他血清MSP方法的已知限制，如背景中所述的。
[0026] 本發(fā)明方法還可廣泛應用于評價來自源自但不限于人或非人哺乳動物、植物、和 昆蟲的基因組DNA的過度甲基化的區(qū)域的任何數(shù)以百計的基因。例如，在哺乳動物諸如人 中，樣品可源自體液，包括，例如，選自以下的一種或更多種：來自待測試的受試者的血液、 血清、血漿、導管灌洗液、乳頭抽吸液、淋巴液、腦脊液（CSF)、和/或羊水。在哺乳動物中，可 被檢測或監(jiān)測的與基因的異常甲基化相關的狀況，包括，但不限于，全部種類的癌和肉瘤， 包括一種或更多種特定類型的癌癥，例如，乳腺癌、消化道或胃腸道癌諸如結腸癌、食道癌 和胰腺癌、肝癌、皮膚癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、淋巴瘤、造血腫瘤諸如白血病、腎 癌、肺癌、支氣管癌、肌肉癌（muscle cancer)、骨癌、膀胱癌或腦癌諸如星形細胞瘤、間變性 星形細胞瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、髓母細胞瘤、以及神經(jīng)母細胞瘤、及它們的轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的方法 可用于測定任何哺乳動物受試者包括例如人、寵物（例如，狗、貓、白鼬（ferret))、家畜（肉 用和產(chǎn)乳用）、和競賽馬的DNA。
[0027] 從其他的多細胞生物體諸如昆蟲和植物的液體獲得的樣品也可使用本發(fā)明的方 法進行基因甲基化狀態(tài)評價。例如，基因的甲基化狀態(tài)可用作在此類受試者中表觀遺傳狀 態(tài)的可遺傳性和靈活性的指示物。因此，基因甲基化與生物體中不同特征的獲得相關聯(lián)。
[0028] 本發(fā)明的方法將定量多重甲基化特異性PCR(QM-MSP)的原理與針對感興趣的 TARGET基因特異性工程化的STD基因標準品的添加組合。本文描述的研宄已顯示QM-MSP 靈敏度是1:100, 〇〇〇且程序的這種組合（cMethDNA)可檢測少至50個甲基化的DNA拷貝。 這一結果與具有1:10, 〇〇〇靈敏度的Q-MSP和具有1:1000靈敏度的常規(guī)MSP相比是有利 的。此外，由于在TARGET基因和STD基因引物之間甚至在由多于10 5倍過量的一種或另一 種DNA組成的混合物中未觀察到交叉反應性，反應是特異性的。
[0029] cMethDNA的引物和探針設計。在本發(fā)明的方法的實踐中，QM-MSP方法被調(diào)整以 作為通過以下進行的cMethDNA :在第一輪（預擴增）PCR中以獨立于TARGET基因的甲基化 狀態(tài)的方式利用與單個感興趣的靶基因（TARGET基因）以及與TARGET基因的各自的STD 基因雜交的外部引物對的單個組，且在第二輪PCR(實時MSP)中利用與TARGET基因雜交的 內(nèi)部引物/探針的甲基化狀態(tài)特異性的組，以及與STD基因DNA雜交的內(nèi)部引物/探針的 TARGET基因特異性標準品（即STD基因）的組。因此，各感興趣的TARGET基因具有一對外 部引物和兩組內(nèi)部引物/探針，各內(nèi)部組被特別地設計以檢測并定量感興趣的TARGET基因 區(qū)域或針對各感興趣的TARGET基因的匹配的STD基因（圖2A)。
[0030] 多個基因特異性外部引物對可用于在被稱為多重PCR中共擴增多個TARGET基因。 在本發(fā)明的方法中使用的多個外部引物對在一個反應中可共擴增TARGET基因和它們各自 的STD基因的混合物，使用本發(fā)明的方法，每一對都與待研宄的TARGET基因的組的成員及 它們各自的STD基因選擇性雜交。外部引物對被設計使DNA擴增獨立于DNA序列的甲基化 狀態(tài)。因此，對于任何給定的基因，通過對TARGET基因特異性的外部引物的單一組共擴增 在外部引物的結合位點內(nèi)部的該甲基化的TARGET基因和STD基因DNA序列（并隨后使用 內(nèi)部引物通過實時PCR進行定量）。例如，以下表1和所附序列表中列出的與本發(fā)明的方法 一起使用的引物的序列，是與原發(fā)性乳腺癌相關的TARGET基因。
[0031] 表1 :用于cMethDNA測定的實施方案的引物序列
[0032]
【權利要求】
1. 一種定量來自受試者的樣品中一個或更多個感興趣的基因（TARGET基因）的甲基化 的方法，所述方法包括： a) 向來自所述受試者的包含DNA的所述樣品中添加對待檢測的各感興趣的TARGET基 因特異性的STD基因的多個拷貝； b) 分離并處理所述樣品中的DNA ; c) 制備（a)中的DNA用于甲基化特異性PCR ; d) 使用PCR在足以產(chǎn)生第一擴增產(chǎn)物的條件下用一對或更多對外部甲基化獨立的PCR 引物擴增（b)中的DNA，其中各單一引物對能夠僅與一個待檢測的感興趣的TARGET基因和 對該TARGET基因特異性的STD基因選擇性地雜交； e) 獲得（d)的第一擴增產(chǎn)物的稀釋的樣品； f) 向（e)中添加對各感興趣的TARGET基因特異性的一對內(nèi)部甲基化依賴的PCR引 物、和對所述感興趣的TARGET基因的STD基因特異性的一對內(nèi)部PCR引物、與各感興趣的 TARGET基因特異性雜交的一個或更多個光學可檢測的標記的DNA探針、和與所述感興趣的 TARGET基因的各STD基因特異性雜交的一個或更多個光學可檢測的標記的DNA探針；以及 g) 在足以產(chǎn)生第二擴增產(chǎn)物的條件下使用定量RT-PCR擴增（f)中的DNA，所述第二擴 增產(chǎn)物提供甲基化的感興趣的TARGET基因的拷貝的量和所述感興趣的TARGET基因的STD 基因的拷貝的量的定量。
2. 如權利要求1所述的方法，其中所述定量被用于使用下式計算感興趣的基因的甲基 化的程度： (甲基化的感興趣的TARGET基因的拷貝數(shù)V (甲基化的感興趣的TARGET基因的拷貝 數(shù)+感興趣的TARGET基因的STD基因的拷貝數(shù)）XlOO。
3. 如權利要求1所述的方法，其中所述定量被用于使用下式計算感興趣的TARGET基因 的基因比： (甲基化的感興趣的TARGET基因的拷貝數(shù)）八感興趣的了八1^^1'基因的5了0基因的拷 貝數(shù)）X 100。
4. 如權利要求1至3的任一項所述的方法，所述方法還包括以下的步驟： g)將來自所述樣品的甲基化的感興趣的基因的拷貝的量與已知對照樣品的甲基化的 基因的拷貝的量進行比較。
5. 如權利要求1至4的任一項所述的方法，其中所述一個或更多個光學可檢測的標記 的DNA探針是包含熒光部分、具有或不具有猝滅劑部分的分子信標或寡核苷酸探針。
6. 如權利要求1至5的任一項所述的方法，其中連續(xù)地和/或同時地檢測來自f)的信 號強度。
7. 如權利要求1至6的任一項所述的方法，其中所述受試者是哺乳動物。
8. 如權利要求1至7的任一項所述的方法，其中所述受試者是人。
9. 如權利要求1至8的任一項所述的方法，其中所述感興趣的TARGET基因選自由以 下組成的組：AKR1B1、ARHGEF7、COL6A2、GPX7、HIST1H3C、H0XB4、MAL、RASGRF2、RASSF1A、 TM6SF1、TMEFF2、TWIST1、ALX1、DAB1、DAB2IP、GAS7C、GSTP1、HIN1、HICUPRARB2。
10. 如權利要求9所述的方法，其中所述引物和探針選自由SEQ ID NO: 1-240組成的 組。
11. 一種診斷與來自受試者的樣品中異常DNA甲基化相關的疾病的發(fā)展的方法，所述 方法包括： a) 向來自所述受試者的包含DNA的所述樣品添加對待檢測的各感興趣的TARGET基因 特異性的STD基因的多個拷貝； b) 分離并處理a)的樣品中的DNA以制備用于甲基化特異性PCR的DNA ; c) 使用PCR在足以產(chǎn)生第一擴增產(chǎn)物的條件下用一對或更多對外部甲基化獨立的PCR 引物擴增b)中的DNA，其中各單一引物對能夠僅與一個待檢測的感興趣的TARGET基因以及 對該一個TARGET基因特異性的STD基因選擇性地雜交； d) 獲得c)的第一擴增產(chǎn)物的稀釋的樣品； e) 向d)中添加對感興趣的TARGET基因特異性的一對內(nèi)部甲基化依賴的PCR引物、和 對感興趣的TARGET基因的STD基因特異性的一對內(nèi)部PCR引物、與感興趣的TARGET基因特 異性雜交的一個或更多個光學可檢測的標記的DNA探針、和與感興趣的TARGET基因的STD 基因特異性雜交的一個或更多個光學可檢測的標記的DNA探針；以及 f) 使用定量RT-PCR在足以產(chǎn)生第二擴增產(chǎn)物的條件下擴增e)中的DNA，所述第二擴 增產(chǎn)物提供甲基化的感興趣的TARGET基因的拷貝的量和感興趣的TARGET基因的STD基因 的拷貝的量的定量，其中與對照相比，從所述樣品獲得的一個或更多個感興趣的TARGET基 因的甲基化拷貝的量的增加指示所述疾病的增加的風險和/或存在；以及 g) 診斷所述受試者為具有所述疾病的增加的風險和/或存在。
12. 如權利要求11所述的方法，其中所述疾病是癌癥，并且與對照相比從所述樣品獲 得的一個或更多個感興趣的基因的甲基化拷貝的量的增加指示所述受試者的組織中的致 癌、癌性、癌變前或化生變化。
13. 如權利要求11或12的任一項所述的方法，其中從所述受試者獲得的所述樣品選自 由以下組成的組：血液、血清和血漿。
14. 一種用于在RT-PCR中使用的合成的多核苷酸標準品（STD基因），所述合成的多核 苷酸標準品（STD基因）包括具有與內(nèi)源性感興趣的TARGET基因的5'和3'末端核苷酸序 列相同的5'和3'末端核苷酸序列的寡核苷酸，其中在5'和3'末端核苷酸序列之間的間隔 寡核苷酸序列包括原核DNA序列，并且所述寡核苷酸的整體長度與內(nèi)源性感興趣的TARGET 基因的整體長度相同。
13.如權利要求14所述的STD基因，其中所述間隔寡核苷酸序列包括λ噬菌體DNA序 列。
15. -種用于確定DNA樣品中的多個DNA序列的甲基化狀態(tài)的試劑盒，所述試劑盒包 括： a) 對待檢測的各感興趣的TARGET基因特異性的STD基因的多個拷貝，和在允許生成包 含第一擴增子的第一擴增產(chǎn)物的條件下能夠與待檢測的一個或更多個感興趣的TARGET基 因的每一個選擇性雜交并能夠與所述感興趣的TARGET基因的STD基因的每一個選擇性雜 交的一對或更多對外部甲基化獨立的PCR引物；以及 b) 對感興趣的TARGET基因特異性的一對或更多對內(nèi)部甲基化依賴的PCR引物、對所述 感興趣的TARGET基因的STD基因特異性的一對或更多對內(nèi)部PCR引物、與感興趣的TARGET 基因特異性雜交的一個或更個光學可檢測的標記的DNA探針、和與所述感興趣的TARGET基 因的STD基因特異性雜交的一個或更多個光學可檢測的標記的DNA探針。
16. 如權利要求15所述的試劑盒，其中所述DNA序列選自AKR1B1、ARHGEF7、C0L6A2、 GPX7、HIST1H3C、H0XB4、MAL、RASGRF2、RASSF1A、TM6SF1、TMEFF2、TWIST1、ALX1、DAB1、 0八821卩、6六57(：、65了？1、!1預1、!11(：1、和狀1?2啟動子。
17. 如權利要求15或16的任一項所述的試劑盒，所述試劑盒包括選自由SEQ ID NO: 1-240組成的組的一個或更多個寡核苷酸。
【文檔編號】C12N15/11GK104520442SQ201380039009
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年5月22日 優(yōu)先權日:2012年5月22日
【發(fā)明者】S·蘇庫馬爾, 瑪麗·喬·法克勒, 維·文·泰奧, 索伊拉·阿雷利·洛佩斯布讓達 申請人:約翰霍普金斯大學