通過(guò)分批添加碳源底物和堿來(lái)制備有機(jī)酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種分批補(bǔ)料培養(yǎng)方法，包括分批添加碳源和堿的步驟，這種方式使得pH值可以保持在適合微生物生長(zhǎng)的水平，其中該微生物用于使碳源發(fā)酵。本發(fā)明還提供了一種使用分批補(bǔ)料培養(yǎng)方法來(lái)制備有機(jī)酸的方法。本發(fā)明在通過(guò)微生物發(fā)酵制備有機(jī)酸時(shí)，分批添加中和劑例如碳酸氫銨、碳酸銨或含堿金屬的弱堿以及碳源底物。因此，pH值可以保持適合用于碳源發(fā)酵的微生物存活的水平，并且注入碳源-堿即源材料的速度可以進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)。本發(fā)明可提高產(chǎn)率、得率和有機(jī)酸的濃度，并可以根據(jù)pH水平的變化自動(dòng)注入堿和碳源底物，從而提高發(fā)酵工藝操作的可靠性和便利性。
【專利說(shuō)明】通過(guò)分批添加碳源底物和堿來(lái)制備有機(jī)酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請(qǐng)涉及一種通過(guò)分批補(bǔ)料培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)有機(jī)酸的方法。更具體地，本申請(qǐng)涉及 一種通過(guò)分批補(bǔ)料的方式添加碳源和堿來(lái)生產(chǎn)有機(jī)酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 用于各種食品、食品添加劑、化學(xué)原料等中的有機(jī)酸長(zhǎng)期通過(guò)發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)。近年 來(lái)，有機(jī)酸被評(píng)價(jià)為可作為燃料和化學(xué)物質(zhì)的原材料的高可用性資源，其中所述化學(xué)物質(zhì) 可用于研發(fā)新型環(huán)?？稍偕茉春突瘜W(xué)品。
[0003] 發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸通常以分批方式進(jìn)行。通過(guò)發(fā)酵法生產(chǎn)有機(jī)酸的方法公開(kāi)在美 國(guó)專利5, 503, 750和5, 766, 439中。根據(jù)分批發(fā)酵方法，使用于生產(chǎn)目標(biāo)有機(jī)酸的微生物 在生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)，其中在該生物反應(yīng)器中同時(shí)添加了供應(yīng)量有限的用于生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物 質(zhì)，如糖、氮源、礦物質(zhì)等。由于糖的供應(yīng)量有限，因而有機(jī)酸的產(chǎn)率也有限，因此在分批培 養(yǎng)中初始采用高濃度的糖以獲得更大量的有機(jī)酸。然而，高濃度的糖作為抑制微生物生長(zhǎng) 的一個(gè)因素，會(huì)降低發(fā)酵速率。補(bǔ)料分批培養(yǎng)被建議作為解決這一問(wèn)題的替代方案。
[0004] 分批補(bǔ)料培養(yǎng)是生物技術(shù)工藝中的操作技術(shù)，其中分批培養(yǎng)初始以適當(dāng)?shù)奶菨舛?進(jìn)行，然后接著提供高濃度的糖來(lái)保持培養(yǎng)基中糖的低濃度。關(guān)于此技術(shù)，依據(jù)添加糖的時(shí) 間、方法和量，存在多種分批補(bǔ)料培養(yǎng)方法。根據(jù)每種方法的不同會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)率和 產(chǎn)率。
[0005] 迄今已知的糖控技術(shù)包括以根據(jù)微生物的生長(zhǎng)模式分析而確定的恒定速率人工 添加糖，以及響應(yīng)于DO(溶解氧）或pH(氫指數(shù)）的信息從而自動(dòng)添加糖。當(dāng)應(yīng)用前項(xiàng)技 術(shù)時(shí)，分批補(bǔ)料培養(yǎng)與分批培養(yǎng)相比可以提高產(chǎn)率和產(chǎn)量，但也可能因?yàn)樘堑奶砑硬荒芘c 微生物的生長(zhǎng)以及糖的消耗準(zhǔn)確地保持一致而效率較低。此外，操作者應(yīng)持續(xù)地觀測(cè)糖的 添加量。
[0006] 至于后一技術(shù)，pH-stat或OD-stat分批補(bǔ)料發(fā)酵廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)需氧微生物，如 大腸桿菌，因?yàn)榇朔椒ㄊ古囵B(yǎng)物中的糖濃度的波動(dòng)小，并且符合微生物生長(zhǎng)曲線。具體地， pH-stat分批補(bǔ)料培養(yǎng)是針對(duì)需氧微生物諸如大腸桿菌代謝糖時(shí)的pH值下降現(xiàn)象而開(kāi)發(fā) 的，其目的是以最小的濃度來(lái)添加糖而不降低微生物的活性。在pH-stat分批補(bǔ)料模式中， 設(shè)定所需PH值，并且，當(dāng)培養(yǎng)物的pH值超過(guò)設(shè)定值的許可時(shí)則添加少量的糖。當(dāng)少量的糖 被代謝時(shí)，PH值略微降低。如果糖被完全消耗，則培養(yǎng)物的pH再次增加，因此添加糖。持 續(xù)進(jìn)行此循環(huán)，直到獲得滿意量的產(chǎn)品。然而，在發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸時(shí)，培養(yǎng)物沒(méi)有發(fā)生由糖 消耗引起的PH值的輕微增加，卻隨著有機(jī)酸的生成pH值不斷降低。因此，傳統(tǒng)的分批補(bǔ)料 培養(yǎng)，如pH-stat法，不能適用于發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 技術(shù)問(wèn)題
[0008] 本發(fā)明的發(fā)明人牢記此問(wèn)題，即隨著有機(jī)酸的生成，培養(yǎng)物PH值持續(xù)降低，因此 傳統(tǒng)的分批補(bǔ)料培養(yǎng)不適合應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸，從而構(gòu)思了一種生產(chǎn)有機(jī)酸的方法， 其中以分批補(bǔ)料的模式添加碳源底物（糖）和堿，由此為生產(chǎn)有機(jī)酸的厭氧微生物的生長(zhǎng) 創(chuàng)造了最適條件。
[0009] 本發(fā)明一方面涉及一種生產(chǎn)有機(jī)酸的方法，其通過(guò)以分批補(bǔ)料方式簡(jiǎn)單且可靠地 添加碳源，從而能夠以高產(chǎn)率和產(chǎn)量獲得高濃度有機(jī)酸。
[0010] 技術(shù)方案
[0011] 根據(jù)其一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)有機(jī)酸的方法，其通過(guò)分批補(bǔ)料方式將 i)碳源底物和ii)至少一種選自碳酸氫銨或含堿金屬的弱堿（例如，碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、 碳酸鈉、碳酸鉀）的堿組成的混合物添加至包含產(chǎn)有機(jī)酸的微生物菌株的生物反應(yīng)器中， 由此可以同時(shí)對(duì)培養(yǎng)物的PH值和碳源底物濃度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)，從而抵抗發(fā)酵進(jìn)行過(guò)程中 PH值和碳源底物（例如，糖）濃度的變化。
[0012] 在其另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種通過(guò)本發(fā)明的分批補(bǔ)料培養(yǎng)方法生產(chǎn)丁酸的 方法。
[0013] 有益效果
[0014] 本發(fā)明的方法被設(shè)置為以一定速率添加碳源，該速率取決于堿的添加速率，其中 堿是依據(jù)PH值的變化而添加的。在生產(chǎn)有機(jī)酸的發(fā)酵體系中，根據(jù)本發(fā)明，將碳源與堿以 分批補(bǔ)料方式一同添加，以保持碳源在培養(yǎng)基中的恒定濃度。相比于常規(guī)的方法中操作者 在直接測(cè)量碳源濃度或培養(yǎng)基的pH值或以小時(shí)計(jì)分析微生物生長(zhǎng)情況后確定糖的添加速 率，本發(fā)明的方法除了更簡(jiǎn)單和更具可重復(fù)性外，還具有更優(yōu)異的產(chǎn)率和產(chǎn)量。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的方法，發(fā)酵可以進(jìn)一步地持續(xù)直到碳源完全耗盡，這樣能夠獲得最 大產(chǎn)率，并且伴隨產(chǎn)生的副產(chǎn)物如乙酸的產(chǎn)生程度更小。此外，消除或減少了對(duì)用于菌種培 養(yǎng)的昂貴培養(yǎng)基的需求。因此，本發(fā)明的方法提供了一種減少發(fā)酵過(guò)程成本的經(jīng)濟(jì)策略。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案通過(guò)分批補(bǔ)料培養(yǎng)生產(chǎn)有機(jī)酸的示意圖。
[0017] 圖2顯示了產(chǎn)品丁酸和副產(chǎn)物乙酸的生成曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 本發(fā)明是基于這樣的事實(shí)，即通過(guò)微生物消耗的碳源和生成的有機(jī)酸的量（例 如，降低的pH值）之間存在直接的關(guān)聯(lián)。隨著有機(jī)酸的生成，用于生產(chǎn)有機(jī)酸的培養(yǎng)物中 碳源含量和PH值變低。在本發(fā)明中，以分批補(bǔ)料的形式提供由碳源和至少一種選自碳酸氫 銨和含堿金屬的弱堿的堿組成的底物-堿混合物，以此補(bǔ)充含量降低的碳源以及由于有機(jī) 酸的生成而降低的PH值，因此提高了有機(jī)酸的產(chǎn)率。
[0019] 強(qiáng)堿如NaOH、KOH和Ca (OH) 2可用來(lái)中和在培養(yǎng)物中產(chǎn)生的有機(jī)酸，但這些強(qiáng)堿， 尤其含鈣（Ca)的堿，非常容易使蛋白質(zhì)變性并沉淀。如此強(qiáng)堿進(jìn)入培養(yǎng)基，會(huì)使氮源變性， 從而抑制氮源被微生物利用，導(dǎo)致發(fā)酵效率降低。因此，弱堿，尤其是碳酸氫銨、或含堿金屬 的弱堿（如碳酸氫鈉、碳酸氫鉀等）、或這兩者被用于中和本發(fā)明中的有機(jī)酸。碳酸氫銨是 有利的，這是因?yàn)樗部梢猿洚?dāng)微生物生長(zhǎng)必需的銨離子營(yíng)養(yǎng)源。
[0020] 以下是本發(fā)明的詳述。
[0021] 本發(fā)明一個(gè)方面涉及通過(guò)碳源底物發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸的方法，包括以分批補(bǔ)料方式 添加底物-堿混合物至包含碳源底物和產(chǎn)有機(jī)酸的菌株的生物反應(yīng)器中，以維持適合于發(fā) 酵碳源底物的微生物生長(zhǎng)的PH值，所述混合物包含：i)碳源底物；和ii)至少一種選自碳 酸氫銨、碳酸銨、和含堿金屬的堿中的堿。
[0022] 根據(jù)其中的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一種通過(guò)分批補(bǔ)料培養(yǎng)生產(chǎn)有機(jī)酸的方 法，包括：
[0023] 制備包含有碳源底物、產(chǎn)有機(jī)酸的菌株、以及菌株生長(zhǎng)的必要成分（菌株生長(zhǎng)成 分）的培養(yǎng)基；
[0024] 通過(guò)以分批補(bǔ)料方式將底物-堿混合物添加至培養(yǎng)基來(lái)創(chuàng)建最適條件，并在該最 適條件下發(fā)酵碳源底物，從而使培養(yǎng)基具有最適合產(chǎn)有機(jī)酸的菌株生長(zhǎng)的PH值，其中所述 底物-堿混合物由碳源底物和至少一種選自碳酸氫銨、碳酸銨、和含堿金屬的弱堿中的堿 組成；和
[0025] 從培養(yǎng)基中回收有機(jī)酸，該有機(jī)酸是通過(guò)碳源底物的發(fā)酵而生成的。
[0026] 術(shù)語(yǔ)"弱堿"是指含有元素周期表的1族中的堿金屬的堿，例如碳酸氫鈉和碳酸氫 鉀。
[0027] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，碳源底物可以是糖，其可以為單糖、二糖、多糖及其 組合的形式。實(shí)例包括但不限于：葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、甘 蔗、糖蜜以及淀粉水合物。
[0028] 可根據(jù)發(fā)酵特性來(lái)調(diào)整在發(fā)酵期間提供的底物-堿混合物中碳源底物和堿的含 量比例，其中發(fā)酵特性與堿的溶解度和有機(jī)酸的產(chǎn)率有關(guān)。假定碳源底物和堿保持為無(wú)菌， 碳源底物和堿之間的含量比例甚至可以在發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行時(shí)進(jìn)行調(diào)整。
[0029] 以分批補(bǔ)料方式添加的碳源底物可以與最初包含在生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基中的碳 源底物相同或不同。
[0030] 除了碳源底物外，氮源、維生素、無(wú)機(jī)鹽和/或碳源分解酶（如轉(zhuǎn)化酶）都可能落 在微生物菌株生長(zhǎng)的必要成分的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)菌株從而容易地確定生 長(zhǎng)所需成分。
[0031] 在能以本發(fā)明的分批補(bǔ)料培養(yǎng)方法生產(chǎn)的有機(jī)酸范圍內(nèi)的有：丁酸，乳酸，乙酸， 甲酸，檸檬酸，己二酸，琥珀酸，富馬酸，蘋果酸，3-羥基丙酸，谷氨酸，戊二酸，葡糖二酸，衣 康酸，丙烯酸，和己二烯二酸，這些均已知可應(yīng)用于生物燃料和生物化學(xué)。
[0032] 任何微生物均可作為本發(fā)明中的產(chǎn)有機(jī)酸的菌株，只要其可以生產(chǎn)有機(jī)酸 即可。產(chǎn)有機(jī)酸的菌株可以選自梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium spp.)、假單胞菌屬 (Pseudomonas spp.)、根霉屬（Rhizopus spp.)、曲霉屬（Aspergillus spp.)、棒狀桿菌屬 (Corynebacterium spp·)、放線菌屬（Actinobacillus spp·)、酵母、假絲酵母屬（Candida spp.)、畢赤酵母屬（Pichia spp.)、大腸桿菌、和乳酸菌。產(chǎn)有機(jī)酸的菌株的具體實(shí)例包 括酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum)、丁酸梭菌（C.butyricum)、乙酰丁酸梭菌 (C. acetobutyricum)、綠胺桿菌（Pseudomonas aeruginosa)、惡臭假單胞菌（P. putida)、焚 光假單胞菌（P.fluorescens)、少根根霉（Rhizopus arrhizus)、米根霉（R.oryzae)、米曲 霉（Aspergillus oryzae)、谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum)、和嗜酸乳桿 菌（Lactobacillus acidophilus)〇
[0033] 適于單一菌株的發(fā)酵條件是本領(lǐng)域公知的。
[0034] 本文中所使用的涉及菌株生長(zhǎng)的術(shù)語(yǔ)"最適條件"是指包括厭氧條件、溫度范圍和 pH范圍的環(huán)境，在此環(huán)境下微生物菌株生長(zhǎng)，并且伴隨著有機(jī)酸實(shí)現(xiàn)最大生產(chǎn)量。最適條件 可依據(jù)所使用的菌株而調(diào)節(jié)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可依據(jù)微生物菌株的生長(zhǎng)階段調(diào)節(jié)生物反應(yīng) 器的環(huán)境至最適條件。例如，生物反應(yīng)器可以被設(shè)置為加熱或冷卻到20°C至50°C的溫度， 同時(shí)培養(yǎng)基具有4至7的pH值。
[0035] 此外，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案預(yù)期是一種在梭狀芽胞桿菌菌株的存在下，以分批 補(bǔ)料方式提供糖類以及至少一種選自碳酸氫鈉和碳酸氫鉀的堿，從而通過(guò)使糖發(fā)酵來(lái)生產(chǎn) 丁酸的方法。作為發(fā)酵所需，碳源底物、氮源、維生素和礦物質(zhì)和/或酶例如轉(zhuǎn)化酶可加入 到培養(yǎng)基中。
[0036] 更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了一種通過(guò)分批補(bǔ)料培養(yǎng)生產(chǎn)丁酸的方法，包括：
[0037] 制備包含碳源底物、產(chǎn)丁酸的微生物菌株、以及菌株生長(zhǎng)的必要成分（生長(zhǎng)必要 成分）的培養(yǎng)基；
[0038] 通過(guò)以分批補(bǔ)料方式添加底物-堿混合物至培養(yǎng)基，以使培養(yǎng)基具有4. 5至7的 PH值，從而建立最適條件，在該最適條件下發(fā)酵碳源底物，其中所述底物-堿混合物由碳源 底物和至少一種選自碳酸氫銨、碳酸氫鈉和碳酸氫鉀中的堿構(gòu)成；和
[0039] 從培養(yǎng)基中回收丁酸，該丁酸是隨著碳源底物的發(fā)酵而生成的。
[0040] 產(chǎn)丁酸的微生物菌株可以是梭狀芽孢桿菌屬，并且可以選自酪丁酸梭菌、丁酸梭 菌和乙酰丁酸梭菌組成的組。
[0041] 參考圖1，解釋本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式。
[0042] 本發(fā)明設(shè)置為以分批補(bǔ)料方式將進(jìn)料罐中的含有碳源底物和堿（例如，碳酸氫 銨）的中和溶液加入至發(fā)酵罐，在該發(fā)酵罐中，碳源底物在微生物存在下發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸。
[0043] 發(fā)酵罐可以安裝有pH控制傳感器和/或氣量計(jì)。
[0044] pH控制傳感器旨在在發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中建立對(duì)產(chǎn)有機(jī)酸的微生物生長(zhǎng)的最適pH 值。在發(fā)酵罐內(nèi)，對(duì)于微生物生長(zhǎng)所必需的的典型成分，例如氮源，可以與碳源底物一同存 在。當(dāng)培養(yǎng)基的PH值隨著發(fā)酵的進(jìn)行而偏離預(yù)定范圍時(shí)，系統(tǒng)設(shè)定自動(dòng)添加碳源底物和堿 (例如，碳酸氫銨）的混合物。適合單一產(chǎn)有機(jī)酸微生物生長(zhǎng)的pH值是本領(lǐng)域已知的。例 如，當(dāng)生產(chǎn)丁酸時(shí)，對(duì)于產(chǎn)丁酸的微生物生長(zhǎng)的最適pH值在4. 5-7的范圍內(nèi)。
[0045] 氣量計(jì)可以與pH控制傳感器一起或單獨(dú)安裝在發(fā)酵罐中，來(lái)測(cè)定氣體在發(fā)酵罐 中的生成量和生成速率。氣體的生成速率提供了關(guān)于底物-堿混合物的添加速率或終止添 加時(shí)機(jī)的信息。
[0046] 如上所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)氣體的生成速率和混合物的添加量，可以容易地 確定底物-堿混合物添加終止的時(shí)機(jī)。
[0047] 一個(gè)規(guī)則是，發(fā)酵會(huì)被它的終產(chǎn)物抑制（產(chǎn)物抑制）。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，有機(jī)酸產(chǎn) 物使得微生物菌株的活性降低。通常情況下，甚至當(dāng)碳源底物沒(méi)有完全消耗完發(fā)酵就停止。 這種情況下，碳源底物被浪費(fèi)。在本發(fā)明中，弱堿如碳酸氫銨被使用作為中和劑，避免了微 生物菌株受到高PH值影響。伴隨二氧化碳（CO 2)和氫氣（H2)的產(chǎn)生，所述堿中和了有機(jī) 酸，如丁酸。氣體的生成速率可用于監(jiān)測(cè)微生物菌株的活性，其提供了關(guān)于碳源底物適當(dāng)添 加時(shí)機(jī)的信息。因此在本發(fā)明中，發(fā)酵可以進(jìn)行至碳源底物完全消耗。因此，由于碳源底物 的供給可以在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)停止，以避免剩余碳源底物的損失，因此發(fā)酵過(guò)程可以保持微 生物的最佳活性而有效進(jìn)行。碳源底物和堿添加完成后，發(fā)酵罐的pH值可以以本領(lǐng)域公知 的方法進(jìn)行調(diào)節(jié)，例如，通過(guò)以恒定速率添加 pH調(diào)節(jié)劑，如氨水、堿金屬氫氧化物溶液、堿 土金屬氫氧化物溶液、它們的混合物，例如氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鉀等。
[0048] 此外，當(dāng)將根據(jù)本發(fā)明的分批補(bǔ)料培養(yǎng)方法應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸時(shí)，可使用記 載于本發(fā)明中的培養(yǎng)基取代用于細(xì)菌發(fā)酵的菌種培養(yǎng)的昂貴培養(yǎng)基，并將其用在菌種培養(yǎng) 的最后培養(yǎng)階段，因此極大提高了發(fā)酵的經(jīng)濟(jì)性。常規(guī)丁酸發(fā)酵采用RCM(強(qiáng)化梭菌培養(yǎng) 基）或類似的用于菌種培養(yǎng)的富含營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基以提高主培養(yǎng)物的效率。然而，這種昂貴 的菌種培養(yǎng)基增加了生產(chǎn)成本，降低了發(fā)酵的經(jīng)濟(jì)性。與此相反，根據(jù)本發(fā)明的補(bǔ)料分批培 養(yǎng)允許在主培養(yǎng)物中采用這種用于菌種培養(yǎng)的最后階段的培養(yǎng)基，而不會(huì)降低微生物的活 性。
[0049] 通過(guò)下述實(shí)施例的說(shuō)明可以更好的理解本發(fā)明，但其不視為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0050] 實(shí)施例
[0051] 比較例1 :分批培養(yǎng)
[0052] 甘鹿液和礦物質(zhì)（糖濃度150?200g/L，30L)置于被氮?dú)庵脫Q的50L厭氧發(fā)酵罐 中。在此厭氧條件下，酪丁酸梭菌接種于培養(yǎng)液中，其中酪丁酸梭菌為培養(yǎng)液體積的1%? 20%，然后向培養(yǎng)液中加入氨水以將pH值調(diào)節(jié)至6.0。隨著發(fā)酵在37°C下進(jìn)行，二氧化碳 (CO 2)和氫氣（H2)產(chǎn)生，保持此厭氧條件。
[0053] 實(shí)施例1 :分批補(bǔ)料培養(yǎng)
[0054] 在50L的厭氧發(fā)酵罐中，與比較例1相同的微生物接種到甘蔗液和礦物質(zhì)中（糖 濃度20?40g/L，10?15L)，然后在37°C培養(yǎng)，同時(shí)添加碳酸氫銨和甘蔗液的混合物（碳 酸氫銨80?120g/L，糖濃度200?300g/L，15?20L)，使培養(yǎng)液保持在pH為6. 0。與分批 培養(yǎng)相比，補(bǔ)料分批培養(yǎng)從較小體積的培養(yǎng)基開(kāi)始，但培養(yǎng)基的最終體積相同?？蛇x地，這 一最終體積可以進(jìn)行調(diào)整。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，產(chǎn)生COjPH 2氣體。當(dāng)氣體的生成速度經(jīng)監(jiān) 測(cè)達(dá)到1. 5?2. 5L/L(發(fā)酵罐）/小時(shí)的時(shí)候，終止添加碳酸氫銨和甘蔗液的混合物，以便 發(fā)酵進(jìn)行直至將此前所添加的糖完全耗盡。
[0055] 對(duì)比例1和實(shí)施例1的兩種培養(yǎng)方法生產(chǎn)的丁酸濃度均為6%或更高。為了進(jìn)行 比較，當(dāng)獲得相同丁酸濃度時(shí)，檢測(cè)了兩種方法在此時(shí)間點(diǎn)的效率。比較例1(分批培養(yǎng)） 和實(shí)施例1(分批補(bǔ)料培養(yǎng)）的細(xì)胞濃度（〇D__ mx)、丁酸產(chǎn)率（Pba)、丁酸的得率（Yba)以及 乙酸的得率（Y aa)的測(cè)定結(jié)果列于如下的表1中。
[0056] 表 1
[0057]

【權(quán)利要求】
1. 一種通過(guò)分批補(bǔ)料培養(yǎng)發(fā)酵碳源底物以生產(chǎn)有機(jī)酸的方法，包括以分批補(bǔ)料方式將 底物-堿混合物添加至包含碳源底物和產(chǎn)有機(jī)酸的菌株的反應(yīng)器中，其中所述底物-堿混 合物包含碳源底物和至少一種選自碳酸氫按、碳酸按和包含堿金屬的弱堿中的堿。
2. -種通過(guò)分批補(bǔ)料培養(yǎng)生產(chǎn)有機(jī)酸的方法，包括： 制備包含碳源底物、產(chǎn)有機(jī)酸的菌株和菌株生長(zhǎng)成分的培養(yǎng)基； 發(fā)酵所述碳源底物，同時(shí)以分批補(bǔ)料方式添加底物-堿混合物至所述培養(yǎng)基中，以使 所述培養(yǎng)基具有所述產(chǎn)有機(jī)酸的菌株生長(zhǎng)的最適pH值，其中所述底物-堿混合物由碳源底 物和至少一種選自碳酸氫銨、碳酸銨和包含堿金屬的弱堿中的堿組成；和 從所述培養(yǎng)基中回收所述有機(jī)酸，所述有機(jī)酸是通過(guò)發(fā)酵所述碳源底物生產(chǎn)的。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述包含堿金屬的弱堿是碳酸氫鈉、碳酸鈉、碳 酸氫鉀、碳酸鉀或它們的組合。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述碳源底物是一種或多種選自葡萄糖、果糖、 蔗糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘蔗、糖蜜和淀粉水解物組成的組中的糖。
5. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述有機(jī)酸是至少一種選自由丁酸、乳酸、乙酸、 甲酸、檸檬酸、己二酸、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸、3-羥基丙酸、谷氨酸、戊二酸、葡糖二酸、衣 康酸、丙烯酸、和己二烯二酸組成的組中的有機(jī)酸。
6. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述產(chǎn)有機(jī)酸的菌株選自梭狀芽孢桿菌屬、假單 胞菌屬、根霉屬、曲霉屬、棒狀桿菌屬、放線菌屬、酵母、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、大腸桿菌、 和乳酸菌。
7. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述發(fā)酵是在安裝有pH控制傳感器或氣量計(jì)、 或者同時(shí)安裝有這兩者的發(fā)酵罐中進(jìn)行的。
8. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述底物-堿混合物添加完成后，氨水、堿金屬氫氧 化物溶液、堿土金屬氫氧化物溶液、或它們的組合被添加到發(fā)酵罐，以使上述培養(yǎng)基具有所 述產(chǎn)有機(jī)酸的菌株生長(zhǎng)的最適pH值，直至所述碳源底物發(fā)酵完全。
9. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述生長(zhǎng)成分為選自由氮源、維生素、礦物質(zhì)和碳源 分解酶組成的組中的至少一者。
10. -種通過(guò)分批補(bǔ)料培養(yǎng)生產(chǎn)丁酸的方法，包括： 制備含有碳源底物、產(chǎn)丁酸的菌株、和所述菌株的生長(zhǎng)成分的培養(yǎng)基； 發(fā)酵所述碳源底物，同時(shí)以分批補(bǔ)料方式添加底物-堿混合物至所述培養(yǎng)基中，以使 所述培養(yǎng)基具有4. 5-7的pH值，其中所述底物-堿混合物由碳源底物和至少一種選自碳酸 氫銨、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸銨、碳酸鈉、碳酸鉀及其混合物組成的組中的堿組成；和 從所述培養(yǎng)基中回收丁酸，所述丁酸是通過(guò)所述碳源底物的發(fā)酵產(chǎn)生的。
11. 如權(quán)利要求10所述方法，其中所述產(chǎn)丁酸的菌株是梭狀芽孢桿菌屬微生物。
【文檔編號(hào)】C12P7/40GK104487582SQ201380039027
【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2013年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月23日
【發(fā)明者】樸宰演, 姜信榮, 樸佑贊, 具玟秀, 趙仁鎬, 樸重玟, 李承燁, 金佟炫 申請(qǐng)人:Sk新技術(shù)株式會(huì)社, Sk能源株式會(huì)社