重組微生物及其用途
【專(zhuān)利摘要】將細(xì)菌遺傳改造以產(chǎn)生3-羥基丙酸鹽(3-HP)。該細(xì)菌是一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌。該細(xì)菌使用用于固定CO/CO2的Wood-Ljungdahl途徑而產(chǎn)生乙酰輔酶A。引入來(lái)自含有此類(lèi)酶的細(xì)菌的丙二酰輔酶A還原酶。另外，還可引入乙酰輔酶A羧化酶。3-HP的生產(chǎn)可通過(guò)乙酰輔酶A羧化酶的過(guò)度生產(chǎn)或通過(guò)生物素的過(guò)度生產(chǎn)得到改善。這可通過(guò)改善的啟動(dòng)子或更高的拷貝數(shù)或催化上更有效的酶來(lái)實(shí)現(xiàn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】重組微生物及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于通過(guò)對(duì)包含C0和/或C02的底物的微生物發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸 鹽[3-Hydroxypropionate, 3-HP]的重組微生物和方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 3-羥基丙酸鹽[3-HP]是平臺(tái)化學(xué)品，充當(dāng)用于生產(chǎn)聚合物材料的前體和化學(xué)原 料。聚（3-羥基丙酸）[P(3_HP)]是具有有希望的特征例如罕見(jiàn)的高熱穩(wěn)定性的生物可降 解聚合物。
[0003] 3-HP可用于獲得許多有價(jià)值的工業(yè)化學(xué)品，包括：用于制造油漆、紙張、粘合劑、 紡織品、特種涂料、油墨和超吸收性聚合物聚丙烯酸酯的丙烯酸；用作溶劑、粘合劑、化妝品 或制備地毯和紡織品中使用的聚對(duì)苯二甲酸丙二酯的1，3-丙二醇；用于制備食物、用作飼 料添加劑和營(yíng)養(yǎng)工業(yè)中的防腐劑的3-輕基丙醒（3-hydroxypropinaldehyde)。
[0004] 3-HP被美國(guó)能源部列為第三重要的可再生化學(xué)品，并且對(duì)于3-HP的全球市場(chǎng)缺 口估計(jì)為每年363萬(wàn)噸（Paster et al，2003, USD0E報(bào)告：48_ 49)。
[0005] 本發(fā)明的目的是提供用于通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)3-HP的重組微生物和方法，所述 方法可提供超過(guò)已知方法的一個(gè)或多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，或至少為公眾提供有用的選擇。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 總的來(lái)說(shuō)，本發(fā)明尤其提供了用于通過(guò)對(duì)包含C0和/或co2的底物的微生物發(fā)酵 生產(chǎn)3-HP的方法，以及在此類(lèi)方法中使用的重組微生物。它組合兩種不同的0)2固定途徑 以產(chǎn)生單一代謝產(chǎn)物。
[0007] 在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了能夠通過(guò)對(duì)包含C0和/或0)2的底物發(fā)酵產(chǎn)生3-HP 以及任選的一種或多種其他產(chǎn)物的厭氧產(chǎn)乙酸重組微生物。
[0008] 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，微生物被改造為適于表達(dá)3-HP生物合成途徑中的一種 或多種酶（或其一個(gè)或多個(gè)亞基），所述酶并非天然存在于用于獲得所述重組微生物的親 本微生物中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物被改造為適于過(guò)表達(dá)3-HP生物合成途徑中的一 種或多種酶（或其一個(gè)或多個(gè)亞基），所述酶天然存在于用于獲得所述重組微生物的親本 微生物中。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物被改造為適于表達(dá)3-HP生物合成途徑中的一種或多 種酶（或其一個(gè)或多個(gè)亞基），所述酶并非天然存在于親本微生物中，并且過(guò)表達(dá)3-HP生物 合成途徑中的一種或多種酶（或其一個(gè)或多個(gè)亞基），所述酶天然存在于親本微生物中。
[0009] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種酶選自：丙二酰輔酶A還原酶（EC 1. 2. 1. 75);乙酰輔酶A羧化酶（ACC)(EC6. 4. 1. 2);以及其中任何一種的功能等價(jià)變體。
[0010] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述親本微生物能夠發(fā)酵包含C0和/或co2的底物，以產(chǎn)生 乙酰輔酶A，但不能將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-HP，并且重組微生物被改造為適于表達(dá)涉及乙酰 輔酶A轉(zhuǎn)化為3-HP的一種或多種酶（或其一個(gè)或多個(gè)亞基）。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物包含被改造為適于增加所述親本微生物天然包含 的一種或多種核酸的表達(dá)的一種或多種外源核酸，并且所述一種或多種核酸編碼上文提及 的酶中的一種或多種（或其一個(gè)或多個(gè)亞基）。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施方案中，被改造為適于增加表達(dá)的一種或多種外源核酸是調(diào)節(jié)元件。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)元件是啟動(dòng)子。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子 選自Wood-Ljungdahl基因簇或磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/乙酸激酶操縱子啟動(dòng)子。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該微生物包含編碼并被改造為適于表達(dá)上文提及的酶中的一 種或多種（或其一個(gè)或多個(gè)亞基）的一種或多種外源核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該微生物 包含編碼并被改造為適于表達(dá)酶中的至少兩種（或其一個(gè)或多個(gè)亞基）的一種或多種外源 核酸。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種外源核酸是編碼上文提及的酶中的一種或多 種的任何組合的核酸構(gòu)建體或載體，在一個(gè)特定實(shí)施方案中，是編碼上文提及的酶中的一 種或多種的任何組合的質(zhì)粒。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述外源核酸是表達(dá)質(zhì)粒。
[0017] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述親本微生物選自厭氧產(chǎn)乙酸菌。
[0018] 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述親本微生物選自一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌， 在一個(gè)實(shí)施方案中，選自自產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridiumautoethanogenum)、揚(yáng)氏梭 菌（Clostridiumljungdahlii)、拉氏梭菌（Clostridiumragsdalei)、食撰基化物 梭菌（Clostridiumcarboxidivorans)、德氏梭菌（Clostridiumdrakei)、奠味梭 菌（Clostridiumscatologenes)、乙酸梭菌（Clostridiumaceticum)、蟻酸乙酸梭 菌（Clostridiumformicoaceticum)、大梭菌（Clostridiummagnum)、食甲基 丁酸桿 菌（Butyribacteriummethylotrophicum)、伍氏乙酸桿菌（Acetobacteriumwoodii) > 巴氏嗜喊菌（Alkalibaculumbacchii)、Blautiaproducta、游泥真桿菌（Eubacterium limosum)、熱乙酸穆?tīng)柺暇∕oorellathermoacetica)、熱自養(yǎng)穆?tīng)柺暇∕oorella thermautotrophica)、卵形鼠抱菌（Sporomusaovata) >Sporomusasilvacetica、球形鼠 抱菌（Sporomusasphaeroides)、普氏產(chǎn)醋桿菌（Oxobacterpfennigii)和凱伍熱厭氧菌 (Thermoanaerobacterkiuvi)〇
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述親本微生物是自產(chǎn)乙醇梭菌或揚(yáng)氏梭菌。在一個(gè)特定實(shí) 施方案中，所述微生物是自產(chǎn)乙醇梭菌DSM23693。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述微生物是 揚(yáng)氏梭菌DSM13528 (或ATCC55383)。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述親本微生物缺乏編碼丙二酰輔酶A還原酶和/或乙酰輔 酶A羧化酶或者其一個(gè)或多個(gè)亞基的一種或多種基因。
[0021] 在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼一種或多種酶（或其一個(gè)或多個(gè)亞基）的核酸， 當(dāng)在微生物中表達(dá)時(shí)，其允許該微生物通過(guò)對(duì)包含C0和/或C02的底物的發(fā)酵產(chǎn)生3-HP。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸編碼兩種或更多種酶（或其一個(gè)或多個(gè)亞基），當(dāng)在 微生物中表達(dá)時(shí)，其允許該微生物通過(guò)對(duì)包含⑶的底物的發(fā)酵產(chǎn)生3-HP。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述酶選自丙二酰輔酶A還原酶和乙酰輔酶A羧化酶，以及其 任何一種或多種的功能等價(jià)變體。
[0024] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸以任何次序包含編碼丙二酰輔酶A還原酶、乙酰輔 酶A羧化酶或其任何一種或多種的功能等價(jià)變體的核酸序列。
[0025] 在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼丙二酰輔酶A還原酶的核酸具有SEQIDN0:1或 GI: 163848165,Caur2614的序列，或者是其功能等價(jià)變體。
[0026] 在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼乙酰輔酶A羧化酶的核酸包含序列SEQIDN0:18、 20、22 和 24(或CLJU_c42100-40，GI:9447826-31 和GI:163847210-11，Caur_1647-48， GI: 163849262,Caur_3739,GI: 163848951，Caur_3421，GI: 163846951，Caur_1378)，或其任 何一種或多種的功能等價(jià)變體。乙酰輔酶A羧化酶可包含多個(gè)亞基。需要時(shí)，這些可在一 種或多種核酸上編碼。
[0027] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸還包含啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子 允許所述基因在其控制下的組成型表達(dá)。在特定實(shí)施方案中，使用Wood-Ljungdahl簇啟動(dòng) 子。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，使用磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/乙酸激酶操縱子啟動(dòng)子。在一個(gè)特定 實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子來(lái)自自產(chǎn)乙醇梭菌。
[0028] 在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含第二個(gè)方面的一種或多種核酸的核酸構(gòu)建體或 載體。
[0029] 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體或載體是表達(dá)構(gòu)建體或載體。在一個(gè)特 定實(shí)施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體或載體是質(zhì)粒。
[0030] 在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含第七個(gè)方面的核酸中的任何一種或多種或者第 三個(gè)方面的載體或構(gòu)建體的宿主生物。
[0031] 在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含如本發(fā)明的第三個(gè)方面中提及的表達(dá)構(gòu)建體或 載體以及甲基化構(gòu)建體或載體的組合物。
[0032] 優(yōu)選地，該組合物能夠產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的重組微生物。
[0033] 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體/載體和/或甲基化構(gòu)建體/載體是質(zhì) 粒。
[0034] 在第六個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)包括使用本發(fā)明的第一個(gè)方面的重組微生物發(fā) 酵包含C0和/或C02的底物的微生物發(fā)酵，用于生產(chǎn)3-HP以及任選的一種或多種其他產(chǎn) 物的方法。
[0035] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括下述步驟：
[0036] (a)向含有本發(fā)明的第一個(gè)方面的一種或多種微生物的培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器中提 供包含C0和/或0)2的底物；和
[0037] (b)使生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)物厭氧發(fā)酵，以產(chǎn)生3-HP。
[0038] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括下述步驟：
[0039] (a)在由工業(yè)過(guò)程產(chǎn)生的含C0和/或C02的氣體釋放到大氣中之前，捕獲所述氣 體；
[0040] (b)通過(guò)含有本發(fā)明的第一個(gè)方面的一種或多種微生物的培養(yǎng)物厭氧發(fā)酵含C0 和/或C02的氣體，以至少產(chǎn)生3-HP。
[0041] 在所述方法方面的特定實(shí)施方案中，所述微生物維持在水性培養(yǎng)基內(nèi)。
[0042] 在所述方法方面的特定實(shí)施方案中，所述底物的發(fā)酵在生物反應(yīng)器中發(fā)生。
[0043] 優(yōu)選地，所述包含C0和/或C02的底物是包含C0和/或C02的氣態(tài)底物。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述底物包含工業(yè)廢氣。在某些實(shí)施方案中，所述氣體是鋼鐵廠廢氣或合成 氣。
[0044] 在特定實(shí)施方案中，所述底物是包含⑶的底物。
[0045] 在其中所述底物包含C02但不含C0的本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述底物優(yōu)選地還包 含h2。
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述底物包含C0和C02。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述底物包含 0)2和H2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述底物包含0)、0)2和H2。
[0047] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述底物通常含有較大比例的C0,例如按體積計(jì)至少約20% 至約100%C0,按體積計(jì)20 %至70 %C0,按體積計(jì)30 %至60 %C0,以及按體積計(jì)40 %至 55%C0。在特定實(shí)施方案中，所述底物包含按體積計(jì)約25%、或約30%、或約35%、或約 40%、或約 45%、或約 50%C0、或約 55%C0、或約 60%C0。
[0048] 在某些實(shí)施方案中，該方法還包括從發(fā)酵液中回收3-HP以及任選的一種或多種 其他產(chǎn)物的步驟。
[0049] 在第七個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)第六個(gè)方面的方法產(chǎn)生的3-HP。
[0050] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明的第一個(gè)方面的微生物的方法， 所述方法包括用一種或多種外源核酸轉(zhuǎn)化親本微生物，使得該微生物能夠通過(guò)對(duì)包含C0 和/或C02的底物的發(fā)酵，產(chǎn)生3-HP以及任選的一種或多種其他產(chǎn)物，其中所述親本微生 物不能通過(guò)對(duì)包含C0和/或C02的底物的發(fā)酵產(chǎn)生3-HP。
[0051] 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，用經(jīng)改造適于表達(dá)3-HP生物合成途徑中的一種或多種 酶的一種或多種外源核酸轉(zhuǎn)化親本微生物，所述一種或多種酶并非天然存在于所述親本微 生物中。在另一個(gè)實(shí)施方案中,用經(jīng)改造適于過(guò)表達(dá)3-HP生物合成途徑中的一種或多種酶 的一種或多種核酸轉(zhuǎn)化親本微生物，所述一種或多種酶天然存在于所述親本微生物中。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，將親本微生物用經(jīng)改造適于表達(dá)3-HP生物合成途徑中的一種或多種 酶（所述一種或多種酶并非天然存在于所述親本微生物中）并且過(guò)表達(dá)3-HP生物合成途 徑中的一種或多種酶（所述一種或多種酶天然存在于親本微生物中）的一種或多種外源核 酸轉(zhuǎn)化。
[0052] 在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種酶是如本文所描述。
[0053] 在某些實(shí)施方案中，所述親本微生物是如上文所描述。
[0054] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了用于將C0或C02轉(zhuǎn)化成3-羥基丙酸鹽（3-HP) 的方法。將含C0和/或含0)2的氣態(tài)底物傳送至含有在培養(yǎng)基中的一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸 細(xì)菌的培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器，使得所述細(xì)菌將C0和/或C02轉(zhuǎn)化為3-HP。所述一氧化碳營(yíng) 養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌被遺傳改造為表達(dá)丙二酰輔酶A還原酶。它們還表達(dá)不論是天然的還是外源 的乙酰輔酶A羧化酶。將3-HP從所述生物反應(yīng)器中回收。
[0055] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了分離的、遺傳改造的一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì) 菌，其包含編碼丙二酰輔酶A還原酶的核酸。所述核酸對(duì)于所述宿主細(xì)菌而言是外源的。該 細(xì)菌表達(dá)丙二酰輔酶A還原酶，并且該細(xì)菌獲得將三個(gè)C0或0)2分子固定到一個(gè)3-羥基 丙酸鹽（3-HP)分子內(nèi)的能力。丙二酰輔酶A還原酶通常與SEQIDNO: 1的核苷酸序列編 碼的氨基酸序列至少85%相同。
[0056] 該細(xì)菌還可包含編碼乙酰輔酶A羧化酶的外源核酸。乙酰輔酶A羧化酶通常 與SEQIDN0:18-21的核苷酸序列編碼的氨基酸序列至少85%相同。核酸可與啟動(dòng)子 可操作地連接。核酸可已經(jīng)是密碼子優(yōu)化的。所述核酸或所編碼的羧化酶可來(lái)自非硫、 光合作用細(xì)菌。該細(xì)菌可選自自產(chǎn)乙醇梭菌、揚(yáng)氏梭菌、拉氏梭菌、食羰基化物梭菌、德氏 梭菌、糞味梭菌、乙酸梭菌、蟻酸乙酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸桿菌、伍氏乙酸桿菌、巴氏 嗜堿菌、Blautiaproducta、游泥真桿菌、熱乙酸穆?tīng)柺暇?、熱自養(yǎng)穆?tīng)柺暇?、卵形鼠孢菌?Sporomusasilvacetica、球形鼠孢菌、普氏產(chǎn)醋桿菌和凱伍熱厭氧菌。所述外源核酸的供 體細(xì)菌可以是非硫、光合作用細(xì)菌，例如橙色綠屈撓菌（Chloroflexusauranticus)、生金 球形菌屬（Metallosphaera)和硫化葉菌屬（Sulfolobus)種。
[0057] 遺傳改造的細(xì)菌可通過(guò)在包含氣態(tài)碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)而培養(yǎng)。所述碳源可包含 C0和/或C02，其可用作能源或碳源中的任一種或兩者。該細(xì)菌可任選地在嚴(yán)格的厭氧條 件下生長(zhǎng)。所述碳源可包含工業(yè)廢棄物或廢氣。
[0058] 本發(fā)明還可在廣義上被說(shuō)成單獨(dú)地或共同地包含在本申請(qǐng)的說(shuō)明書(shū)中個(gè)別或共 同提及或指出的部分、元素和特征，以及包含所述部分、元素或特征的兩個(gè)或更多個(gè)的任何 或所有組合，并且當(dāng)在本文中提及在本發(fā)明涉及的領(lǐng)域中具有已知等價(jià)物的特定整數(shù)時(shí)， 此類(lèi)已知等價(jià)物應(yīng)被認(rèn)為如同單獨(dú)提出一樣納入本文。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0059] 應(yīng)從其所有新穎的方面加以考慮的本發(fā)明的這些及其他方面將通過(guò)下述參考附 圖的描述變得顯而易見(jiàn)，所述描述僅作為示例給出，在所述附圖中：
[0060] 圖1 :用于由3個(gè)C0或0)2分子可持續(xù)生產(chǎn)1個(gè)3-HP分子的兩種C0 2固定途徑的 組合。

【具體實(shí)施方式】
[0061] 對(duì)優(yōu)選實(shí)施方案的下述描述是在廣義上給出的。本發(fā)明還由在本文下文的標(biāo)題 "實(shí)例"下給出的公開(kāi)內(nèi)容來(lái)進(jìn)一步闡明，所述公開(kāi)內(nèi)容提供了支持本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、本 發(fā)明的多個(gè)方面的具體實(shí)例和實(shí)施本發(fā)明的方式。
[0062] 本發(fā)明人已能夠令人驚訝地改造一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸微生物，以通過(guò)發(fā)酵包含C0 和/或C02的底物來(lái)產(chǎn)生3-羥基丙酸鹽（3-HP)。這提供了用于生產(chǎn)3-HP的可替代方式， 所述可替代方式可具有優(yōu)于當(dāng)前用于生產(chǎn)3-HP的方法的益處。此外，它提供了使用來(lái)自工 業(yè)過(guò)程的一氧化碳的方式，所述一氧化碳原本將被釋放到大氣中并污染環(huán)境。
[0063] 在改造本發(fā)明的微生物時(shí)，本發(fā)明人已能夠令人驚訝地組合兩種單獨(dú)的0)2固定 途徑，如圖1中示出的。這提供了使用包含C0的底物和/或包含C02的底物產(chǎn)生3-HP的 可持續(xù)發(fā)酵。兩種固定〇)2的途徑因此被連接起來(lái)以產(chǎn)生所需的產(chǎn)物。
[0064] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明描述了通過(guò)組合兩種單獨(dú)的0)2固定途徑（圖1)，將三 個(gè)〇)2分子固定到一個(gè)3-HP分子內(nèi)，所述兩種途徑是允許固定兩個(gè)C02分子的產(chǎn)乙酸菌的Wood-Ljungdahl途徑，以及允許固定另一個(gè)C02分子的3-HP循環(huán)的起始碳固定步驟。C02 還可替換為一氧化碳（C0)，因?yàn)閃ood-Ljungdahl途徑的關(guān)鍵酶--C0脫氫酶（C0DH)能夠 在生物水煤氣變換反應(yīng)（C0+H20〈->C02+H2)中將C0轉(zhuǎn)化成C02和能量。可使用C0和0)2的 任何混合物。當(dāng)使用單獨(dú)的(302時(shí),可能需要供應(yīng)以氫氣（Hydrogen)或電形式的能量，而 C0可充當(dāng)碳源和能源兩者。
[0065] 雖然本發(fā)明人已在自產(chǎn)乙醇梭菌中證實(shí)了本發(fā)明的效力，但本發(fā)明可應(yīng)用于更廣 泛的厭氧產(chǎn)乙酸微生物以及對(duì)包含C0和/或co2的底物的發(fā)酵，如本文上文和進(jìn)一步討論 的。
[0066] 如本文提及的，"發(fā)酵液"是至少包含營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)基。
[0067] 如本文提及的，"穿梭微生物"是在其中表達(dá)甲基轉(zhuǎn)移酶并且不同于目的微生物的 微生物。
[0068] 如本文提及的，"目的微生物"是在其中表達(dá)在包括表達(dá)構(gòu)建體/載體上的基因并 且不同于穿梭微生物的微生物。這也被稱(chēng)為宿主微生物。
[0069] 術(shù)語(yǔ)"主要發(fā)酵產(chǎn)物"意指以最高濃度和/或產(chǎn)率產(chǎn)生的一種發(fā)酵產(chǎn)物?？纱嬖?一種或多種發(fā)酵產(chǎn)物。最普遍的可以是或可以不是最有商業(yè)價(jià)值的。
[0070] 當(dāng)在提及發(fā)酵過(guò)程中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"增加效率"、"增加的效率"等等包括但不限于 增加下列中的一種或多種：催化發(fā)酵的微生物生長(zhǎng)速率、在升高產(chǎn)物濃度下的生長(zhǎng)和/或 產(chǎn)物生產(chǎn)率、所產(chǎn)生的所需產(chǎn)物的體積/所消耗底物的體積、所需產(chǎn)物的生產(chǎn)率或生產(chǎn)水 平、以及與發(fā)酵的其他副產(chǎn)物相比較所產(chǎn)生的所需產(chǎn)物的相對(duì)比例。
[0071] 短語(yǔ)"包含一氧化碳的底物"和相似術(shù)語(yǔ)應(yīng)理解為包括其中一氧化碳可被一種或 多種細(xì)菌菌株利用以例如用于生長(zhǎng)和/或發(fā)酵的任何底物。
[0072] 短語(yǔ)"包含一氧化碳的氣態(tài)底物"以及相似短語(yǔ)和術(shù)語(yǔ)包括含有一定水平的一氧 化碳的任何氣體。在某些實(shí)施方案中，所述底物含有按體積計(jì)至少約20 %至約100%C0,按 體積計(jì)20 %至70%C0,按體積計(jì)30 %至60%C0,以及按體積計(jì)40 %至55%C0。在特定 實(shí)施方案中，底物包含按體積計(jì)約25%、或約30%、或約35%、或約40%、或約45%、或約 50%C0、或約 55%C0、或約 60%C0。
[0073] 雖然包含C0的底物并不必須要包含任何氫，但4的存在不應(yīng)不利于依照本發(fā)明 方法的產(chǎn)物形成。在特定實(shí)施方案中，氫的存在導(dǎo)致醇生產(chǎn)的總體效率改善。例如，在特定 實(shí)施方案中，所述底物可包含大約2:1、或1:1或1:2的H2:C0比。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 底物包含按體積計(jì)約30 %或更少的H2、按體積計(jì)20 %或更少的H2、按體積計(jì)約15 %或更少 的4、或者按體積計(jì)約10%或更少的4。在其他實(shí)施方案中，所述底物流包含低濃度的H2， 例如小于5%、或小于4%、或小于3%、或小于2%、或小于1 %或基本上不含氫。所述底物 還可含有一些C02，例如按體積計(jì)約1%至約80%C02、或按體積計(jì)1%至約30%C02。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述底物包含按體積計(jì)小于或等于約20%C02。在特定實(shí)施方案中，所述底 物包含按體積計(jì)小于或等于約15%C02、按體積計(jì)小于或等于約10%C02、按體積計(jì)小于或 等于約5 %C02或基本上不含C0 2。
[0074] 短語(yǔ)"包含二氧化碳的底物"和相似術(shù)語(yǔ)應(yīng)理解為包括其中二氧化碳可被一種或 多種細(xì)菌菌株利用以例如用于生長(zhǎng)和/或發(fā)酵的任何底物。包含二氧化碳的底物還可包含 氫和/或一氧化碳。
[0075] 短語(yǔ)"包含二氧化碳的氣態(tài)底物"以及相似短語(yǔ)和術(shù)語(yǔ)包括含有一定水平的二氧 化碳的任何氣體。在某些實(shí)施方案中，底物含有按體積計(jì)至少約10%至約60%C02，按體積 計(jì)20%至50%C02，按體積計(jì)30%至60%C02，以及按體積計(jì)40%至55%C02。在特定實(shí)施 方案中，所述底物包含按體積計(jì)約20%、或約25%、或約30%、或約35%、或約40%、或約 45%、或約50%0)、或約55%0)、或約60%0) 2。
[0076] 優(yōu)選地，包含C02的底物還將包含一定水平的C0或112。在特定實(shí)施方案中，所述 底物包含至少約1:1、或至少約1:2、或至少約1:3、或至少約1:4、或至少約1:5的0)2:11 2比 例。
[0077] 在下文的描述中，以遞送并發(fā)酵"含有C0和/或0)2的氣態(tài)底物"來(lái)描述本發(fā)明的 實(shí)施方案。然而，應(yīng)當(dāng)理解氣態(tài)底物可以替代形式提供。例如，可提供溶解于液體中的含有C0和/或co2的氣態(tài)底物?；旧?，將液體用含有一氧化碳的氣體飽和，并且隨后將該液體 加入生物反應(yīng)器中。這可使用標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，可使用微泡分布發(fā)生器（Hensirisak etal,Scale-upofmicrobubbledispersiongeneratorforaerobicfermentation； AppliedBiochemistryandBiotechnology，Volume101，Number3/2002 年 10月）。又例 如，含有CO的氣態(tài)底物可吸附到固體載體上。使用術(shù)語(yǔ)"包含CO和/或C02的底物"等時(shí) 包括了此類(lèi)替代方法。
[0078] 在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，含C0氣態(tài)底物（或包含C02、或C0和co2、或〇)2和 H2以及C0的氣態(tài)底物）是工業(yè)廢氣（offgas或wastegas)。"工業(yè)廢氣"應(yīng)在廣義上理 解為為包括由工業(yè)過(guò)程產(chǎn)生的包含C0和/或C02的任何氣體，并且包括因鐵金屬產(chǎn)品制造、 非鐵產(chǎn)品制造、石油精煉過(guò)程、煤炭氣化、生物質(zhì)氣化、電力生產(chǎn)、碳黑生產(chǎn)和焦炭制造而產(chǎn) 生的氣體。進(jìn)一步的例子可在本文其他地方提供。
[0079] 除非上下文另有要求，否則如本文使用的，短語(yǔ)"發(fā)酵"、"發(fā)酵過(guò)程"或"發(fā)酵反應(yīng)" 等意欲包含所述過(guò)程的生長(zhǎng)期和產(chǎn)物生物合成期兩者。如本文進(jìn)一步描述的，在一些實(shí)施 方案中，生物反應(yīng)器可包括第一生長(zhǎng)反應(yīng)器和第二發(fā)酵反應(yīng)器。因此，向發(fā)酵反應(yīng)中添加金 屬或組合物應(yīng)理解為包括向這些反應(yīng)器中的任一或兩者中的添加。
[0080] 術(shù)語(yǔ)"生物反應(yīng)器"包括由一個(gè)或多個(gè)容器和/或塔或管道排列組成的發(fā)酵裝置， 所述發(fā)酵裝置包括連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器（CSTR)、固定化細(xì)胞反應(yīng)器（ICR)、滴流床反應(yīng)器 (TBR)、鼓泡塔、氣升式發(fā)酵罐、靜態(tài)混合器或者適合于氣體-液體接觸的其他容器或其他 裝置。在一些實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器可包括第一生長(zhǎng)反應(yīng)器和第二發(fā)酵反應(yīng)器。因此，當(dāng) 提及向生物反應(yīng)器或發(fā)酵反應(yīng)中添加底物時(shí)，應(yīng)理解為包括適當(dāng)時(shí)向這些反應(yīng)器中的任一 或兩者中的添加。
[0081] "外源核酸"是源于待將它們引入其中的微生物之外的核酸。外源核酸可源自任何 適當(dāng)來(lái)源，包括但不限于待將它們引入其中的微生物，與待將它們引入其中的生物不同的 微生物菌株或物種，或者它們可以是人工或重組方法制備的。當(dāng)生物是遺傳改造的或重組 體時(shí)，它含有與不同于天然存在于微生物中的序列的序列鄰近的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中， 外源核酸代表天然存在于待將它們引入其中的微生物中的核酸序列，并且將它們引入以增 加特定基因的表達(dá)或過(guò)表達(dá)特定基因（例如，通過(guò)增加所述序列（例如基因）的拷貝數(shù)，或 引入強(qiáng)啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子以增加表達(dá)）。在另一個(gè)實(shí)施方案中，外源核酸代表并非天然 存在于待將它們引入其中的微生物中的核酸序列，并且所述外源核酸允許表達(dá)并非天然存 在于微生物內(nèi)的產(chǎn)物或增加微生物中天然基因的表達(dá)（例如在引入調(diào)節(jié)元件例如啟動(dòng)子 的情況下）。外源核酸可被改造為適于整合到待將它引入其中的微生物的基因組內(nèi)，或保持 染色體外的狀態(tài)。外源序列可來(lái)自異源來(lái)源，例如另一個(gè)種、屬、科或界。在任何情況下，如 此產(chǎn)生的細(xì)菌是非天然存在的，具有例如因序列差異或因拷貝數(shù)差異而不同于天然存在的 細(xì)菌的遺傳互補(bǔ)。
[0082] 應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明可使用其序列不同于本文具體示例的序列的核酸來(lái)實(shí)施，條件是 它們執(zhí)行基本上相同的功能。對(duì)于編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸序列，這意指所編碼的蛋白質(zhì)或 肽具有基本上相同的功能。對(duì)于代表啟動(dòng)子序列的核酸序列，變體序列將具有促進(jìn)一種或 多種基因表達(dá)的能力。此類(lèi)核酸在本文中可被稱(chēng)為"功能等價(jià)變體"。例如，核酸的功能等 價(jià)變體包括等位基因變體、基因的片段、包括突變（缺失、插入、核苷酸置換等）和/或多態(tài) 性的基因等。來(lái)自其他微生物的同源基因也可視為本文具體示例的序列的功能等價(jià)變體的 實(shí)例。
[0083] 這些包括在諸如揚(yáng)氏梭菌、橙色綠屈撓菌、生金球形菌屬或硫化葉菌屬種的物種 中的同源基因，其細(xì)節(jié)在網(wǎng)站例如Genbank或NCBI上可公開(kāi)獲得。短語(yǔ)"功能等價(jià)變體"還 應(yīng)視為包括其序列因針對(duì)特定生物的密碼子優(yōu)化而改變的核酸。本文中核酸的"功能等價(jià) 變體"優(yōu)選與經(jīng)鑒定的核酸具有至少大約70%、優(yōu)選大約80%、更優(yōu)選大約85%、優(yōu)選大約 90%、優(yōu)選大約95%或更高的核酸序列同一性。
[0084] 還應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明可使用其序列不同于本文具體示例的氨基酸序列的多肽實(shí)施。 這些變體在本文中可被稱(chēng)為"功能等價(jià)變體"。蛋白質(zhì)或肽的功能等價(jià)變體包括這樣的蛋白 質(zhì)或肽，即所述蛋白質(zhì)或肽與經(jīng)鑒定的蛋白質(zhì)或肽享有至少40%、優(yōu)選50%、優(yōu)選60%、優(yōu) 選70%、優(yōu)選75%、優(yōu)選80%、優(yōu)選85%、優(yōu)選90%、優(yōu)選95%或更高的氨基酸同一性并且 具有與目的肽或蛋白質(zhì)基本上相同的功能。此類(lèi)變體在它們的范圍內(nèi)包括蛋白質(zhì)或肽的片 段，其中所述片段包含截短形式的多肽，其中缺失可以是1至5、至10、至15、至20、至25個(gè) 氨基酸，并且可在多肽的任一末端處從1位殘基延伸到25位殘基，并且其中缺失可為所述 區(qū)域內(nèi)的任何長(zhǎng)度；或可在內(nèi)部位置處。本文中具體多肽的功能等價(jià)變體還應(yīng)視為包括由 其他細(xì)菌菌種中的同源基因表達(dá)的多肽，例如如先前段落中示例的。
[0085] 如本文使用的"基本上相同的功能"意指核酸或多肽能夠進(jìn)行它是其變體的核酸 或多肽的功能。例如，本發(fā)明的酶的變體將能夠與該酶一樣催化相同的反應(yīng)。然而，它不應(yīng) 視為意指變體具有與它是其變體的多肽或核酸相同的活性水平。
[0086] 可使用很多已知方法評(píng)價(jià)功能等價(jià)變體是否具有與它是其變體的核酸或多肽基 本上相同的功能。然而，例如，由ffligler等人（2002,J.Bacteriol. 184:2404 - 2410)或Kroeger等人（2011，Anal.Biochem. 411:100-5)概述的方法可分別用于測(cè)量丙二酰輔酶A 還原酶和乙酰輔酶A羧化酶的活性。
[0087] 當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，"過(guò)表達(dá)"以及相似術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)應(yīng)在廣義上視為包括在相同條件 下與親本微生物的蛋白質(zhì)表達(dá)水平相比較，一種或多種蛋白質(zhì)表達(dá)的任何增加。它不應(yīng)視 為意指蛋白質(zhì)以任何特定水平表達(dá)。
[0088] "親本微生物"是用于生成本發(fā)明的重組微生物的微生物。親本微生物可以是在自 然界中存在的微生物（即，野生型微生物），或已被預(yù)先修飾但不表達(dá)或不過(guò)表達(dá)本發(fā)明中 題述酶中的一種或多種的微生物。因此，本發(fā)明的重組微生物已被修飾，以表達(dá)或過(guò)表達(dá)在 親本微生物中不表達(dá)或不過(guò)表達(dá)的一種或多種酶。
[0089] 術(shù)語(yǔ)核酸"構(gòu)建體"或"載體"和相似術(shù)語(yǔ)應(yīng)在廣義上視為包括適合用作載體 (vehicle)以將遺傳材料轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的任何核酸（包括DNA和RNA)。該術(shù)語(yǔ)應(yīng)視為包括 質(zhì)粒、病毒（包括細(xì)菌噬菌體）、粘粒和人工染色體。構(gòu)建體或載體可包括一種或多種調(diào)節(jié) 元件、復(fù)制起點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)和/或可選擇標(biāo)記。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，構(gòu)建體或載體被 改造為適于允許表達(dá)由該構(gòu)建體或載體編碼的一種或多種基因。核酸構(gòu)建體或載體包括裸 核酸以及用一種或多種試劑配制的核酸，以促進(jìn)向細(xì)胞的遞送（例如脂質(zhì)體綴合的核酸， 包含所述核酸的生物）。
[0090] "3-HP生物合成途徑"是允許下列轉(zhuǎn)化的酶促途徑：乙酰輔酶A至丙二酰輔酶A至 丙二酸半醛至3-HP的轉(zhuǎn)化。除非上下文另有明確要求，否則提及3-HP生物合成途徑中的 酶應(yīng)視為包括提及該酶的任何一個(gè)或多個(gè)亞基。僅作為實(shí)例，乙酰輔酶A羧化酶可包含四 個(gè)亞基。
[0091] 微牛物
[0092] 如本文上文討論的，本發(fā)明提供了能夠通過(guò)發(fā)酵包含C0和/或C02的底物，產(chǎn)生 3-HP以及任選的一種或多種其他產(chǎn)物的重組微生物。
[0093] 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述微生物被改造為適于表達(dá)3-HP生物合成途徑中的 一種或多種酶（或其一個(gè)或多個(gè)亞基），所述一種或多種酶并非天然存在于用于獲得該微 生物的親本微生物中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物被改造為適于過(guò)表達(dá)3-HP生物合 成途徑中的一種或多種酶（或其一個(gè)或多個(gè)亞基），所述一種或多種酶天然存在于親本微 生物中。
[0094] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述親本微生物能夠發(fā)酵包含C0的底物，以產(chǎn)生乙酰輔酶A， 但不能將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-HP，并且所述重組微生物被改造為適于表達(dá)參與乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)化為3-HP的一種或多種酶（或其一個(gè)或多個(gè)亞基）。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述親本微生 物能夠?qū)⒁阴］o酶A轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A，但不能將丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-HP。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，所述親本微生物能夠?qū)⒈］o酶A轉(zhuǎn)化為3-HP，但不能將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為 丙二酰輔酶A。
[0095] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述3-HP生物合成中的一種或多種酶選自：丙二酰輔酶A還 原酶、乙酰輔酶A羧化酶以及其任何一種或多種的功能等價(jià)變體。
[0096] 所述微生物可被改造為適于通過(guò)很多重組方法表達(dá)或過(guò)表達(dá)一種或多種酶（或 其一個(gè)或多個(gè)亞基），所述重組方法包括例如，增加該微生物內(nèi)的天然基因的表達(dá)（例如通 過(guò)引入更強(qiáng)的啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子以驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)），通過(guò)引入編碼并被改造為適于 表達(dá)該酶的外源核酸來(lái)增加編碼特定酶的基因拷貝數(shù)，引入編碼并被改造為適于表達(dá)并非 天然存在于親本微生物內(nèi)的酶的外源核酸。
[0097] 在某些實(shí)施方案中，可轉(zhuǎn)化所述親本微生物，以提供所述親本微生物天然包含的 一種或多種基因的表達(dá)增加或過(guò)表達(dá)與引入非親本微生物天然包含的一種或多種基因的 組合。例如，編碼3-HP生物合成途徑中的一種或多種酶的一種或多種基因是所述親本微 生物天然包含的，但它可能不包括編碼該途徑中的一種或多種其他酶的一種或多種其他基 因。所述微生物可例如被改造，以過(guò)表達(dá)天然的乙酰輔酶A羧化酶，并且引入編碼用于將 丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-HP的酶（例如丙二酰輔酶A還原酶）的丙二酰輔酶A還原酶基因。 或者，所述微生物可被改造，以過(guò)表達(dá)天然的丙二酰輔酶A還原酶，并且引入編碼乙酰輔酶 A羧化酶的基因。技術(shù)人員將知道在本發(fā)明中使用的多種其他組合。
[0098] 僅作為例子，丙二酰輔酶A還原酶的示例性序列信息在本文中以SEQIDNO: 1的 形式提供，并且還使用登錄號(hào)YP_001636209. 1/Caur_2614,GI: 163848165在公共數(shù)據(jù)庫(kù)上 提供。作為另外的例子，乙酰輔酶A羧化酶的示例性序列信息在本文中以SEQIDN0:18-21 的形式提供，并且還使用登錄號(hào)NC_014328. 1-33. l/CLJU_c42100-40，GI:9447826-31和GI:163847210-11，Caur_1647-48，YP_001635254. 1-55. 1 ;GI:163849262,Caur_3739, YP_001637306. 1；GI:163848951, Caur_3421, YP_001636995. 1；GI:163846951, Caur_1378, YP_001634995. 1在公共數(shù)據(jù)庫(kù)上提供。可使用天然存在的酶或合成的酶。通常，該酶與由 根據(jù)SEQ ID NO: 1或18-21的核酸編碼的序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少 88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
[0099] 在本發(fā)明的微生物中使用的酶（以及編碼它們的任何相應(yīng)基因）可源自任何適當(dāng) 來(lái)源，包括細(xì)菌的不同屬和種或其他生物。然而，在一個(gè)實(shí)施方案中，丙二酰輔酶A還原酶 是源自橙色綠屈撓菌、揚(yáng)氏梭菌、生金球形菌屬或硫化葉菌屬種的酶。在一個(gè)實(shí)施方案中， 丙二酰輔酶A還原酶具有上文示例的氨基酸序列，或它是其功能等價(jià)變體。在一個(gè)實(shí)施方 案中，乙酰輔酶A羧化酶是源自揚(yáng)氏梭菌、橙色綠屈撓菌、生金球形菌屬或硫化葉菌屬種的 酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，乙酰輔酶A羧化酶具有上文示例的氨基酸序列，或它是其功能等價(jià) 變體。
[0100] 丙二酰輔酶A還原酶（EC 1.2. 1.75)屬于短鏈還原酶（SDR)組，并且可得自細(xì) 菌如綠色非硫光養(yǎng)細(xì)菌（綠彎菌門(mén)（Chloroflexi))橙色綠屈撓菌（YP_001636209. 1 ; AAS20429.1)、聚集綠曲撓絲狀菌（Chloroflexus aggregans)(YP_002462600. 1)、 毛樣顫綠菌（Oscillochloris trichoides) (WP_006561105. 1)、卡斯特玫瑰彎菌 (Roseiflexus castenholzii)(YP_001433009.1)或玫瑰彎菌屬種（Roseiflexus sp. )(YP_001277512. 1)，以及a變形菌綱（alpha-proteobacteria)如赤桿菌屬 種（Erythrobacter sp.)(WP_0〇7l6368〇)和如Y變形菌綱（WP_0〇9〇l9528.l、 WP_007234918. 1、WP_009021869. 1、WP_009470571. 1)，并且可得自嗜熱嗜酸古細(xì)菌如泉古 頭寇硫化葉菌（Crenarchaeotes Sulfolobus tokodaii)(NP_378167.1)、好客嗜酸兩面 菌（Acidianus hospitalis) (YP_004459517. 1)、銅生金球形菌（Metallosphaera cuprina) (YP_004410014. 1)、勤奮生金球形菌（Metallosphaera sedula)(YP_001190808. 1)、 硫橫礦硫化葉菌（Sulfolobus solfataricus) (NP_343563. 1)、黃石生金球形菌 (Metallosphaera yellowstonensis)(WP_009071519. 1)、冰島硫化葉菌（Sulfolobus islandicus)(YP_002844727.1;YP_002833533.1;YP_002830795.1)、嗜酸熱硫化葉 菌（Sulfolobus acidocaldarius) (YP_256941. 1 ;YP_256733. 1)，以及如深處古生球菌 (Archaeoglobus profundus)(YP_003401535. 1),和Candidatus Chloracidobacterium thermophilum(YP_004863680. 1)或Caldiarchaeum subterraneum(BAJ47902. 1)。
[0101] 乙酰輔酶A羧化酶（EC1.2. 1.75)屬于生物素依賴(lài)性羧化酶組，并且可得 自細(xì)菌如綠色非硫光養(yǎng)細(xì)菌（綠彎菌門(mén)）如橙色綠屈撓菌（YP_001635254. 1-55. 1 ; YP_001637306. 1 ;YP_001636995. 1 ;YP_001634995. 1)，或一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸菌如揚(yáng)氏梭 菌（NC_014328. 1-33.1)。
[0102] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該微生物包含被改造為適于增加所述親本微生物天然包含的 一種或多種核酸的表達(dá)的一種或多種外源核酸，并且所述一種或多種核酸編碼上文提及的 酶中的一種或多種（或其一個(gè)或多個(gè)亞基）。在一個(gè)實(shí)施方案中，被改造為適于增加表達(dá)的 一種或多種外源核酸是調(diào)節(jié)元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)元件是啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí) 施方案中，啟動(dòng)子是優(yōu)選在適當(dāng)發(fā)酵條件下具有高度活性的組成型啟動(dòng)子。還可使用誘導(dǎo) 型啟動(dòng)子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子選自Wood-Ljungdahl基因簇或磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/ 乙酸激酶操縱子啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可指導(dǎo)表達(dá)（優(yōu)選在適當(dāng)發(fā)酵條件下高 水平表達(dá)）的其他啟動(dòng)子可有效作為示例實(shí)施方案的替代物。當(dāng)啟動(dòng)子處于使得它驅(qū)動(dòng)下 游編碼序列表達(dá)的位置時(shí)，它被稱(chēng)為可操作地連接的。
[0103]在一個(gè)實(shí)施方案中，該微生物包含編碼并被改造為適于表達(dá)上文提及的酶中的一 種或多種（或其一種或多種亞基）的一種或多種外源核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該微生物 包含編碼并被改造為適于表達(dá)所述酶中的至少兩種（或其一個(gè)或多個(gè)亞基）的一種或多種 外源核酸。
[0104]在一個(gè)特定實(shí)施方案中，該微生物包含編碼丙二酰輔酶A還原酶或其功能等價(jià)變 體的一種或多種外源核酸。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，該微生物包含編碼乙酰輔酶A羧化酶 或其功能等價(jià)變體的一種或多種外源核酸。乙酰輔酶A羧化酶可由4個(gè)亞基組成，其中每 個(gè)亞基由不同基因編碼。這些基因可被組合在單一核酸中或者一起編碼完整酶的兩種或更 多種核酸中。此外，特定親本微生物可含有針對(duì)這些亞基中的僅一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)的基因。 因此，本發(fā)明包含使用一種或多種外源核酸改造所述微生物，以?xún)H表達(dá)所述亞基中的一個(gè)、 兩個(gè)或三個(gè)。類(lèi)似地，它包含改造微生物以過(guò)表達(dá)所述亞基中的一個(gè)或多個(gè)，如果所述基因 是所述微生物天然包含的。還設(shè)想了天然亞基基因的過(guò)表達(dá)和任何缺失亞基基因的引入的 組合。
[0105]在一個(gè)實(shí)施方案中，丙二酰輔酶A還原酶是由包含SEQIDNO: 1的核酸或其功能 等價(jià)變體編碼。在一個(gè)實(shí)施方案中，乙酰輔酶A羧化酶是由包含SEQIDN0:18、19、20和21 的一種或多種核酸或者其中任何一種或多種的功能等價(jià)變體編碼?；蛘?，該酶可由如可公 開(kāi)獲得的數(shù)據(jù)庫(kù)中所述的核酸序列編碼，例如上文所列出的。
[0106]該微生物可包含一種或多種外源核酸。當(dāng)希望用兩種或更多種遺傳元件（例如基 因或調(diào)節(jié)元件（例如啟動(dòng)子））轉(zhuǎn)化親本微生物時(shí)，它們可被包含在一種或多種外源核酸 上。
[0107]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種外源核酸是編碼上文提及的酶中的一種或多 種的任何組合的核酸構(gòu)建體或載體（在一個(gè)特定實(shí)施方案中，是質(zhì)粒）。
[0108]所述外源核酸在轉(zhuǎn)化親本微生物后可保留在染色體外或可整合到親本微生物的 基因組內(nèi)。因此，它們可包括另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸序列被改造為適于協(xié)助 整合（例如，允許同源重組和靶向整合到宿主基因組內(nèi)的區(qū)域）或染色體外構(gòu)建體的表達(dá) 和復(fù)制（例如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子和其他調(diào)節(jié)元件或序列）。
[0109]在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼如本文上文提及的一種或多種酶（或其一個(gè)或多個(gè)亞 基）的外源核酸還將包含被改造為適于促進(jìn)由外源核酸編碼的一種或多種酶的表達(dá)的啟 動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是優(yōu)選在適當(dāng)發(fā)酵條件下具有高度活性的組成型啟 動(dòng)子。還可使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子選自Wood-Ljungdahl基因 簇和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/乙酸激酶啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可指導(dǎo)表達(dá)（優(yōu)選在適當(dāng) 發(fā)酵條件下高水平表達(dá)）的其他啟動(dòng)子有效作為示例實(shí)施方案的替代物。
[0110] 在一個(gè)實(shí)施方案中，外源核酸是表達(dá)質(zhì)粒。
[0111] 在一個(gè)實(shí)施方案中，親本微生物選自厭氧產(chǎn)乙酸菌。
[0112] 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述親本微生物選自一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌。在某 些實(shí)施方案中，該微生物選自自產(chǎn)乙醇梭菌、揚(yáng)氏梭菌、拉氏梭菌、食羰基化物梭菌、德氏 梭菌、糞味梭菌、乙酸梭菌、蟻酸乙酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸桿菌、伍氏乙酸桿菌、巴氏 嗜堿菌、Blautiaproducta、游泥真桿菌、熱乙酸穆?tīng)柺暇?、熱自養(yǎng)穆?tīng)柺暇?、卵形鼠孢菌?Sporomusasilvacetica、球形鼠孢菌、普氏產(chǎn)醋桿菌和凱伍熱厭氧菌。
[0113] 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述親本微生物選自產(chǎn)乙醇、產(chǎn)乙酸梭菌，包括以 下種：自產(chǎn)乙醇梭菌、楊氏梭菌和拉氏梭菌以及相關(guān)分離物。這些包括但不限于下述 菌株：自產(chǎn)乙醇梭菌JAI_1T(DSM10061)[AbriniJ，NaveauH，NynsE-J:Clostridium autoethanogenum,sp.nov. ,ananaerobicbacteriumthatproducesethanolfrom carbonmonoxide.ArchMicrobiol1994, 4:345-351]，自產(chǎn)乙醇梭菌LBS1560 (DSM19630) [SimpsonSD，F(xiàn)orsterRL，TranPT,RoweMJ,WarnerIL:Novelbacteriaandmethods thereof.國(guó)際專(zhuān)利 2009,W0/2009/064200]，自產(chǎn)乙醇梭菌LBS1561 (DSM23693)，楊氏梭菌 PETCt(DSM13528 =ATCC55383)[TannerRS,MillerLM,YangD:Clostridium. 1jungdahlii sp.nov.,anAcetogenicSpeciesinClostridialrRNAHomologyGroupI.IntJSyst Bacteriol1993,43:232-236]，楊氏梭菌ERI-2(ATCC55380)[GaddyJL:Clostridium stainwhichproducesaceticacidfromwastegases.美國(guó)專(zhuān)利 1997, 5, 593, 886]， 楊氏梭菌C_01(ATCC55988)[GaddyJL，ClausenEC，KoC_W:Microbialprocessfor thepreparationofaceticacidaswellassolventforitsextractionfrom thefermentationbroth?美國(guó)專(zhuān)利，2002,6,368,819]，楊氏梭菌 0-52(ATCC55989) [GaddyJL，ClausenEC,KoC-W:Microbialprocessforthepreparationofacetic acidaswellassolventforitsextractionfromthefermentationbroth.美 國(guó)專(zhuān)利，2002,6,368,819]，拉氏梭菌P11t(ATCCBAA-622)[HuhnkeRL，LewisRS，Tanner RS:IsolationandCharacterizationofnovelClostridialSpecies.國(guó)際專(zhuān)利 2008， TO2008/028055]，相關(guān)分離物例如 "C.coskatii"[Zahnetal-Novelethanologenic speciesClostridiumcoskatii(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朥S20110229947)]和"梭菌屬種"(Tyurin etal.，2012,J.BiotechRes. 4:1-12)，或突變株例如拉氏梭菌 0TA-1 (Tirado-Acevedo 0.ProductionofBioethanolfromSynthesisGasUsingClostridium1jungdahlii. PhDthesis，北卡羅萊納州立大學(xué)，2010)。這些菌株在梭菌rRNA簇I內(nèi)形成亞簇，并且它 們的16SrRNA基因超過(guò)99%相同，具有相似的約30%的低GC含量。然而，DNA-DNA重新組 合和DNA指紋實(shí)驗(yàn)顯不這些菌株屬于種[HuhnkeRL，LewisRS，TannerRS:Isolationand CharacterizationofnovelClostridialSpecies?國(guó)際專(zhuān)利 2008,TO2008/028055]。
[0114] 該簇的所有種均具有相似的形態(tài)和大?。▽?duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞為0.5-0. 7x3-5um)， 是嗜溫的（最適生長(zhǎng)溫度為30-37 °C)和嚴(yán)格厭氧菌[TannerRS^illerLM，Yang D:Clostridium1jungdahliisp.nov. ,anAcetogenicSpeciesinClostridialrRNA HomologyGroupI.IntJSystBacteriol1993, 43:232-236；AbriniJ,NaveauH,Nyns E-J:Clostridiumautoethanogenum,sp.nov. ,ananaerobicbacteriumthatproduces ethanolfromcarbonmonoxide.ArchMicrobiol1994,4:345-351;HuhnkeRL,Lewis RS，TannerRS:IsolationandCharacterizationofnovelClostridialSpecies. 國(guó)際專(zhuān)利2008,W0 2008/028055]。此外，它們均共享相同的主要的系統(tǒng)發(fā)育性狀，例 如相同的pH范圍（pH4-7. 5,最適起始pH為5. 5-6)，以含CO氣體的強(qiáng)自養(yǎng)生長(zhǎng)并伴 隨相似的生長(zhǎng)速率，和以乙醇和乙酸作為主要發(fā)酵終產(chǎn)物的相似的代謝譜，以及在某些 條件下形成少量的2,3-丁二醇和乳酸。[131111611^，]\1；[1161'111，￥31^0:(]1〇81：1'1(1；[11111 1jungdahliisp.nov. ,anAcetogenicSpeciesinClostridialrRNAHomologyGroup I.IntJSystBacteriol1993, 43:232-236；AbriniJ,NaveauH,NynsE-J:Clostridium autoethanogenum,sp.nov. ,ananaerobicbacteriumthatproducesethanolfrom carbonmonoxide.ArchMicrobiol1994, 4:345-351;HuhnkeRL,LewisRS,Tanner RS:IsolationandCharacterizationofnovelClostridialSpecies.國(guó)際專(zhuān)利 2008, W02008/028055]。對(duì)于所有三個(gè)種還觀察到吲哚產(chǎn)生。然而，所述種的區(qū)別在于多種糖（例 如鼠李糖、阿拉伯糖）、酸（例如葡糖酸、檸檬酸）、氨基酸（例如精氨酸、組氨酸）或其他底 物（例如甜菜堿、丁醇）的底物利用。此外，發(fā)現(xiàn)一些種對(duì)于某些維生素（例如硫胺素、生 物素）是營(yíng)養(yǎng)缺陷型的，而其他種則不是。
[0115] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述親本菌株使用C0作為其唯一碳源和能源。
[0116] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述親本微生物是自產(chǎn)乙醇梭菌或揚(yáng)氏梭菌。在一個(gè)特定實(shí) 施方案中，所述微生物是自產(chǎn)乙醇梭菌DSM23693。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述微生物是 揚(yáng)氏梭菌DSM13528 (或ATCC55383)。
[0117] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述親本微生物缺乏編碼丙二酰輔酶A還原酶或乙酰輔酶A 羧化酶（或其一個(gè)或多個(gè)亞基）的一種或多種基因。
[0118] 核酸
[0119] 本發(fā)明還提供了用于生成本發(fā)明的重組微生物的核酸和核酸構(gòu)建體。
[0120] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含編碼3-HP生物合成途徑中的一種或多種酶（或 其一個(gè)或多個(gè)亞基）的一種或多種序列，當(dāng)在微生物中表達(dá)時(shí)，其允許該微生物通過(guò)發(fā)酵 包含C0和/或C02的底物產(chǎn)生3-HP。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼兩種或更 多種酶（或其一個(gè)或多個(gè)亞基）的核酸，當(dāng)在微生物中表達(dá)時(shí)，其允許該微生物通過(guò)發(fā)酵包 含C0和/或C02的底物產(chǎn)生3-HP。
[0121] 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，該酶選自丙二酰輔酶A還原酶、乙酰輔酶A羧化酶以及其 中任何一種或多種的功能等價(jià)變體。
[0122] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸以任何次序包含編碼丙二酰輔酶A還原酶、乙 酰輔酶A羧化酶或其中任何一種或多種的功能等價(jià)變體的一種或多種核酸序列。
[0123] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸以任何次序包含編碼乙酰輔酶A羧化酶的一個(gè) 或多個(gè)亞基或其中任何一種或多種的功能等價(jià)變體的一種或多種核酸序列。
[0124] 編碼上述酶中每一種的示例性氨基酸序列和核酸序列在本文中提供，或者可獲自 如上文提及的GenBank。然而，考慮到在本文中、在GenBank及其他數(shù)據(jù)庫(kù)中所含有的信息 和遺傳密碼，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)容易地知道編碼所述酶或其功能等價(jià)變體的可替代核酸序列。
[0125] 在一個(gè)實(shí)施方案中，丙二酰輔酶A還原酶具有如上文描述的序列或是其功能等價(jià) 變體。
[0126] 在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼乙酰輔酶A羧化酶的核酸序列具有如上文描述的序列或 是其功能等價(jià)變體。
[0127] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸還包含啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子 允許所述基因在其控制下的組成型表達(dá)。然而，還可采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)容易 地知道用于本發(fā)明的啟動(dòng)子。優(yōu)選地，啟動(dòng)子可指導(dǎo)在適當(dāng)發(fā)酵條件下的高水平表達(dá)。在 特定實(shí)施方案中，使用Wood-Ljungdahl簇啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用磷酸轉(zhuǎn)乙酰 酶/乙酸激酶啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用丙酮酸鹽：鐵氧還蛋白氧化還原酶啟動(dòng) 子、Rnf復(fù)合體操縱子啟動(dòng)子或ATP合酶操縱子啟動(dòng)子。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述啟動(dòng) 子來(lái)自自產(chǎn)乙醇梭菌。
[0128] 本發(fā)明的核酸在轉(zhuǎn)化親本微生物后可保留在染色體外或可被改造為適于整合到 所述微生物的基因組內(nèi)。因此，本發(fā)明的核酸可包括另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸 序列被改造為適于協(xié)助整合（例如，允許同源重組和靶向整合到宿主基因組內(nèi)的區(qū)域）或 染色體外構(gòu)建體的穩(wěn)定表達(dá)和復(fù)制（例如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子和其他調(diào)節(jié)序列）。
[0129] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸是核酸構(gòu)建體或載體。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述 核酸構(gòu)建體或載體是表達(dá)構(gòu)建體或載體，然而，本發(fā)明包含其他構(gòu)建體和載體例如用于克 隆的那些。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體或載體是質(zhì)粒。
[0130] 應(yīng)當(dāng)理解，出所述啟動(dòng)子外，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體/載體還可包含任意數(shù)目的調(diào) 節(jié)元件，以及需要時(shí)適合于表達(dá)其他蛋白質(zhì)的另外的基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)構(gòu) 建體/載體包括一個(gè)啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體/載體包括兩個(gè)或更 多個(gè)啟動(dòng)子。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，對(duì)于待表達(dá)的每種基因，所述表達(dá)構(gòu)建體/載體包括 一個(gè)啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體/載體包括一個(gè)或多個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)， 優(yōu)選用于每種待表達(dá)基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。
[0131] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解本文描述的核酸序列和構(gòu)建體/載體序列可含有標(biāo)準(zhǔn) 接頭核苷酸，例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)和/或限制性位點(diǎn)所需的那些接頭核苷酸。此類(lèi)接頭序 列不應(yīng)解釋為是必需的并且不對(duì)所定義的序列產(chǎn)生限制。
[0132] 本發(fā)明的核酸和核酸構(gòu)建體，包括表達(dá)構(gòu)建體/載體，可使用任意數(shù)目的本領(lǐng)域 中已知的技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建。例如，可使用化學(xué)合成或重組技術(shù)。此類(lèi)技術(shù)記載于例如Sambrook etal(MolecularCloning:Alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratory Press,ColdSpringHarbor,NY, 1989)。進(jìn)一步的示例性技術(shù)記載于在下文實(shí)施例部分中。 基本上，各個(gè)基因和調(diào)節(jié)元件彼此可操作地連接，使得可表達(dá)所述基因以形成所需蛋白質(zhì)。 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解用于本發(fā)明的合適載體。然而，例如，下述載體可以是合適 的：PMTL80000載體、pMPl、pJIR750以及下文實(shí)施例部分中示例的質(zhì)粒。
[0133] 應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的核酸可采取任何適當(dāng)?shù)男问?，包括RNA、DNA或cDNA。
[0134] 本發(fā)明還提供了包含本文描述的核酸中的任何一種或多種的宿主生物，特別是微 生物，并且包括病毒、細(xì)菌和酵母。
[0135] 所述一種或多種外源核酸可作為裸核酸遞送至親本微生物，或可用一種或多種試 劑配制以促進(jìn)轉(zhuǎn)化過(guò)程（例如脂質(zhì)體綴合的核酸，其中包含核酸的生物）。適當(dāng)時(shí)，所述一 種或多種核酸可以是DNA、RNA或其組合。限制性抑制劑可用于某些實(shí)施方案中；參見(jiàn)例如 Murray,N.E.etal. (2000)Microbial.Molec.Biol.Rev. 64, 412. ) 〇
[0136] 可使用任何數(shù)目的本領(lǐng)域中已知的用于產(chǎn)生重組微生物的技術(shù)，由親本微生物和 一種或多種外源核酸制備本發(fā)明的微生物。僅作為實(shí)例，轉(zhuǎn)化（包括轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染）可通過(guò) 電穿孔、超聲處理、聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、化學(xué)或天然感受態(tài)或者綴合來(lái)實(shí)現(xiàn)。合適的轉(zhuǎn)化 技術(shù)記載于例如SambrookJ，F(xiàn)ritschEF，ManiatisT:MolecularCloning:Alaboratory Manual,ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour, 1989 中。
[0137] 在某些實(shí)施方案中，由于待轉(zhuǎn)化的微生物中有活性的限制系統(tǒng)，必須甲基化待引 入微生物內(nèi)的核酸。這可使用多種技術(shù)包括下文描述的技術(shù)來(lái)完成，并且在下文實(shí)施例部 分中進(jìn)一步示例。
[0138] 例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組微生物是通過(guò)包括下述步驟的方法產(chǎn)生： 將下述引入穿梭微生物內(nèi)：（i)如本文描述的表達(dá)構(gòu)建體/載體，和（ii)包含甲基轉(zhuǎn)移酶 基因的甲基化構(gòu)建體/載體；表達(dá)甲基轉(zhuǎn)移酶基因；從穿梭微生物中分離一種或多種構(gòu)建 體/載體；以及將一種或多種構(gòu)建體/載體引入目的微生物內(nèi)。
[0139] 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟B的甲基轉(zhuǎn)移酶基因是組成型地表達(dá)的。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，步驟B的甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)是被誘導(dǎo)的。
[0140] 所述穿梭微生物是促進(jìn)對(duì)構(gòu)成所述表達(dá)構(gòu)建體/載體的核酸序列的甲基化的微 生物，優(yōu)選是限制性陰性微生物。在特定實(shí)施方案中，所述穿梭微生物是限制性陰性大腸桿 菌（E.coli)、枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis)或乳酸乳球菌（Lactococcuslactis)。
[0141] 甲基化構(gòu)建體/載體包含編碼甲基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。
[0142] -旦將表達(dá)構(gòu)建體/載體和甲基化構(gòu)建體/載體引入穿梭微生物內(nèi)，就誘導(dǎo)甲基 化構(gòu)建體/載體上存在的甲基轉(zhuǎn)移酶基因。誘導(dǎo)可以是通過(guò)任何合適的啟動(dòng)子系統(tǒng)，盡管 在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，甲基化構(gòu)建體/載體包含誘導(dǎo)型lac啟動(dòng)子，并且是通過(guò) 添加乳糖或其類(lèi)似物，更優(yōu)選異丙基-P-D-硫代半乳糖苷（IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)。其他合適的 啟動(dòng)子包括ara、tet或17系統(tǒng)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，甲基化構(gòu)建體/載體啟動(dòng) 子是組成型啟動(dòng)子。
[0143] 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述甲基化構(gòu)建體/載體具有特異性針對(duì)所述穿梭微生 物的種類(lèi)的復(fù)制起點(diǎn)，使得所述甲基化構(gòu)建體/載體上存在的任何基因在所述穿梭微生物 中表達(dá)。優(yōu)選地，所述表達(dá)構(gòu)建體/載體具有特異性針對(duì)目的微生物的種類(lèi)的復(fù)制起點(diǎn)，使 得所述表達(dá)構(gòu)建體/載體上存在的任何基因在目的微生物中表達(dá)。
[0144] 甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)導(dǎo)致所述表達(dá)構(gòu)建體/載體上存在的基因的甲基化。根據(jù)許多 已知方法中的任何一種，隨后可從所述穿梭微生物中分離所述表達(dá)構(gòu)建體/載體。僅作為 實(shí)例，下文描述的實(shí)施例部分中所述的方法可用于分離表達(dá)構(gòu)建體/載體。
[0145] 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，兩種構(gòu)建體/載體被同時(shí)分離。
[0146] 可使用任意數(shù)目的已知方法將所述表達(dá)構(gòu)建體/載體引入所述目的微生物內(nèi)。然 而，例如，可使用下文實(shí)施例部分中所述的方法。因?yàn)樗霰磉_(dá)構(gòu)建體/載體是甲基化的， 所以所述表達(dá)構(gòu)建體/載體上存在的核酸序列能夠被納入目的微生物內(nèi)并成功表達(dá)。
[0147] 應(yīng)想到可將甲基轉(zhuǎn)移酶基因引入穿梭微生物內(nèi)并過(guò)表達(dá)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案 中，所得的甲基轉(zhuǎn)移酶可使用已知方法收集，并且在體外用于甲基化表達(dá)質(zhì)粒。隨后可將 所述表達(dá)構(gòu)建體/載體引入目的微生物內(nèi)用于表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將所述甲基轉(zhuǎn) 移酶基因引入穿梭微生物的基因組內(nèi)，隨后將所述表達(dá)構(gòu)建體/載體引入所述穿梭微生物 內(nèi)，從所述穿梭微生物中分離一種或多種構(gòu)建體/載體,并且隨后將所述表達(dá)構(gòu)建體/載體 引入所述目的微生物內(nèi)。
[0148] 應(yīng)想到可組合如上定義的所述表達(dá)構(gòu)建體/載體和所述甲基化構(gòu)建體/載體，以 提供物質(zhì)的組合物。此類(lèi)組合物在避開(kāi)限制性障礙機(jī)制以產(chǎn)生本發(fā)明的重組微生物中特別 有用。
[0149] 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體/載體和/或所述甲基化構(gòu)建體/載體 是質(zhì)粒。
[0150] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解用于產(chǎn)生本發(fā)明的微生物的許多合適的甲基轉(zhuǎn)移 酶。然而，例如，可使用枯草芽孢桿菌噬菌體OT1甲基轉(zhuǎn)移酶和下文實(shí)施例中所述的甲基 轉(zhuǎn)移酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述甲基轉(zhuǎn)移酶具有SEQIDN0:6的氨基酸序列，或是其功能 等價(jià)變體。考慮到所需甲基轉(zhuǎn)移酶的序列和遺傳密碼，編碼合適甲基轉(zhuǎn)移酶的核酸是容易 想到的。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼甲基轉(zhuǎn)移酶的核酸是如下文實(shí)施例中所述（例如SEQID NO:26的核酸，或它是其功能等價(jià)變體）。
[0151] 被改造為適于允許甲基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的任意數(shù)目的構(gòu)建體/載體均可用于生 成所述甲基化構(gòu)建體/載體。然而，例如，可使用下文實(shí)施例部分中所述的質(zhì)粒（例如，SEQ IDN0:7)。
[0152] 牛產(chǎn)方法
[0153] 本發(fā)明提供了通過(guò)包括使用本發(fā)明的重組微生物發(fā)酵包含C0和/或C02的底物 的微生物發(fā)酵，用于生產(chǎn)3-HP以及任選的一種或多種其他產(chǎn)物的方法。優(yōu)選地，3-HP是主 要發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明的方法可用于減少來(lái)自工業(yè)過(guò)程的總大氣碳排放。
[0154] 優(yōu)選地，所述發(fā)酵包括使用本發(fā)明的重組微生物厭氧發(fā)酵生物反應(yīng)器中的底物以 至少產(chǎn)生3-HP的步驟。
[0155] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括下述步驟：
[0156] (a)向含有本發(fā)明的一種或多種微生物的培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器中提供包含C0和/ 或〇)2的底物；和
[0157] (b)厭氧發(fā)酵生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)物，以至少產(chǎn)生3-HP。
[0158] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括下述步驟：
[0159] (a)在因工業(yè)過(guò)程產(chǎn)生的含C0和/或0)2氣體釋放到大氣中之前，捕獲所述氣體；
[0160] (b)通過(guò)含有本發(fā)明的一種或多種微生物的培養(yǎng)物厭氧發(fā)酵所述含C0和/或C02 氣體，以至少產(chǎn)生3-HP。
[0161] 在一個(gè)實(shí)施方案中，底物包含C0。在一個(gè)實(shí)施方案中，底物包含C0和C02。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，底物包含〇)2和h2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，底物包含〇)2和C0以及h2。
[0162] 在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，由微生物發(fā)酵的氣態(tài)底物是含有C0的氣態(tài)底 物。所述氣態(tài)底物可以是作為工業(yè)過(guò)程的副產(chǎn)物而獲得的含C0廢氣，或來(lái)自一些其他來(lái)源 例如來(lái)自汽車(chē)尾氣。在某些實(shí)施方案中，所述工業(yè)過(guò)程選自鐵金屬產(chǎn)品制造例如鋼鐵廠、非 鐵產(chǎn)品制造、石油精煉過(guò)程、煤炭氣化、電力生產(chǎn)、碳黑生產(chǎn)、氨生產(chǎn)、甲醇生產(chǎn)和焦炭制造。 在這些實(shí)施方案中，可在含C0氣體被排放到大氣中之前，使用任何方便的方法從所述工業(yè) 過(guò)程中將其捕獲。C0可以是合成氣（包含一氧化碳和氫的氣體）的組分。由工業(yè)過(guò)程產(chǎn)生 的C0通常被燃燒掉以產(chǎn)生co2，因此本發(fā)明可特別用于減少co2溫室氣體排放并產(chǎn)生用作 生物燃料的丁醇。取決于含C0的氣態(tài)底物的組成，可能還需要在將其引入發(fā)酵之前對(duì)其進(jìn) 行處理，以去除任何不需要的雜質(zhì)例如塵粒。例如，可使用已知方法對(duì)氣態(tài)底物進(jìn)行過(guò)濾或 洗漆。
[0163] 在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，由微生物發(fā)酵的氣態(tài)底物是包含0)2和112的氣態(tài)底 物。所述含co2/H2底物可以是作為工業(yè)過(guò)程的副產(chǎn)物而獲得的廢氣。在某些實(shí)施方案中，所 述工業(yè)過(guò)程選自氫生產(chǎn)。在某些實(shí)施方案中，所述包含(30 2和H2的氣態(tài)底物可以是混合氣 流，其中將源自一種或多種工業(yè)過(guò)程的氣流的至少一部分與至少一部分〇) 2或112混合，以?xún)?yōu) 化所述氣態(tài)底物的co2:H2比例。這對(duì)于富含〇)2或112的工業(yè)氣流而言可以是特別有益的。 產(chǎn)生可以用作〇) 2和h2底物或〇)2和112混合底物的來(lái)源的副產(chǎn)物氣流的工業(yè)過(guò)程的實(shí)例包 括焦炭制造、精煉過(guò)程、氨生產(chǎn)過(guò)程、甲醇生產(chǎn)過(guò)程、乙酸生產(chǎn)、天然氣精煉廠和發(fā)電廠。
[0164] 應(yīng)當(dāng)理解，為了發(fā)生細(xì)菌生長(zhǎng)以及氣體至包含3-HP的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，需要將合適的 液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基與含C0和/或〇)2的底物氣體進(jìn)料給生物反應(yīng)器。所述底物和培養(yǎng)基可 以連續(xù)、分批或分批補(bǔ)料的形式進(jìn)料給生物反應(yīng)器。營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基含有足以允許使所用的微 生物生長(zhǎng)的維生素和礦物質(zhì)。適合于使用C0和/或co2發(fā)酵以產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物的厭 氧培養(yǎng)基是本領(lǐng)域中已知的。例如，合適的培養(yǎng)基記載于Biebel(2001)中。在本發(fā)明的一 個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基是如下文實(shí)施例部分中所述。
[0165] 需要在發(fā)生支持所述氣體至包含3-HP的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化的發(fā)酵的適當(dāng)條件下進(jìn)行發(fā) 酵。應(yīng)考慮的反應(yīng)條件包括壓力、溫度、氣體流速、液體流速、培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)基氧化還原電 位、攪拌速度（如果使用連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器）、接種物水平、確保液相中的C0和/或C02 不變成限制性的最大氣體底物濃度以及避免產(chǎn)物抑制的最大產(chǎn)物濃度。
[0166] 此外，通常需要增加底物流的C0和/或C02濃度（或氣態(tài)底物中的C0和/或C02 分壓），并且因此增加其中C0和/或co2是底物的發(fā)酵反應(yīng)的效率。在增加的壓力下的操 作允許C0和/或C02從氣相轉(zhuǎn)移至液相的速率得到顯著提高，其中C0和/或C0 2可被微生 物作為碳源攝取，以生產(chǎn)包含3-HP的產(chǎn)物。這又意味著當(dāng)將生物反應(yīng)器保持在高壓而不是 大氣壓力下時(shí)，可減少保留時(shí)間（被定義為生物反應(yīng)器中的液體體積除以輸入氣體流速）。 最佳反應(yīng)條件將部分取決于所用的本發(fā)明的具體微生物。然而，一般而言，優(yōu)選在高于大氣 壓的壓力下進(jìn)行發(fā)酵。同樣，因?yàn)榻o定的C0和/或C02到至少3-HP的轉(zhuǎn)化率在某種程度上 是底物保留時(shí)間的函數(shù)，而且實(shí)現(xiàn)所需的保留時(shí)間又決定了所需的生物反應(yīng)器體積，所以 加壓系統(tǒng)的使用可極大地減少所需的生物反應(yīng)器體積，從而減少發(fā)酵設(shè)備的資金成本。根 據(jù)美國(guó)專(zhuān)利第5, 593, 886號(hào)中給出的實(shí)施例，反應(yīng)器體積可與反應(yīng)器操作壓力的增加成線(xiàn) 性比例地減小，即在10個(gè)大氣壓下操作的生物反應(yīng)器只需為在1個(gè)大氣壓下操作的生物反 應(yīng)器體積的十分之一。
[0167] 例如，在高壓下進(jìn)行氣體至乙醇發(fā)酵的益處已有記載。例如，W002/08438描述了 在30psig和75psig的壓力下進(jìn)行的氣體至乙醇的發(fā)酵，分別提供150g/l/天和369g/l/ 天的乙醇生產(chǎn)率。然而，發(fā)現(xiàn)在大氣壓下使用類(lèi)似的培養(yǎng)基和輸入氣體組合物進(jìn)行的示例 發(fā)酵每天每升產(chǎn)生1/10至1/20的乙醇。
[0168] 還期望含C0和/或C02氣態(tài)底物的引入速率能夠確保液相中的C0和/或C0 2濃 度不變成限制性的。這是因?yàn)镃0和/或〇)2受限的條件的后果可能是一種或多種產(chǎn)物被 培養(yǎng)物消耗。
[0169] 用于進(jìn)料給發(fā)酵反應(yīng)的氣流的組成可對(duì)該反應(yīng)的效率和/或成本具有顯著影響。 例如，〇 2可降低厭氧發(fā)酵過(guò)程的效率。在發(fā)酵前或發(fā)酵后的發(fā)酵過(guò)程各階段中處理不需要 或不必要的氣體可增加對(duì)此類(lèi)階段的負(fù)擔(dān)（對(duì)于包含其中氣流在進(jìn)入生物反應(yīng)器前被壓 縮的產(chǎn)物，不必要的能量被用于壓縮在發(fā)酵中不需要的氣體）。因此，可能需要處理底物流， 特別是源自工業(yè)源的底物流，以去除不需要的組分并增加所需組分的濃度。
[0170] 在某些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的細(xì)菌培養(yǎng)物維持在水性培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，水性培 養(yǎng)基是最低厭氧微生物生長(zhǎng)培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域已知的，并且例如在美國(guó)專(zhuān)利 第5, 173, 429號(hào)和第5, 593, 886號(hào)以及W0 02/08438中有描述，以及如本文下文實(shí)施例部 分中所述。
[0171] 3-HP，或含有3-HP和/或一種或多種其他產(chǎn)物的混合流，可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的 方法從發(fā)酵液中回收，所述方法例如分餾或蒸發(fā)、滲透蒸發(fā)、汽提和萃取發(fā)酵，包括例如液 液萃取。
[0172] 在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，3-HP和一種或多種產(chǎn)物通過(guò)下述方法從發(fā)酵液 中回收：從生物反應(yīng)器中連續(xù)移出發(fā)酵液的一部分，從發(fā)酵液中分離微生物細(xì)胞（方便地 通過(guò)過(guò)濾），并且從發(fā)酵液中回收一種或多種產(chǎn)物。醇類(lèi)可方便地例如通過(guò)蒸餾進(jìn)行回收。 丙酮可例如通過(guò)蒸餾進(jìn)行回收。所產(chǎn)生的任何酸類(lèi)均可例如通過(guò)吸附在活性炭上進(jìn)行回 收。優(yōu)選地將分離的微生物細(xì)胞送回至發(fā)酵生物反應(yīng)器。還優(yōu)選地將已移出任何醇和酸后 剩余的無(wú)細(xì)胞滲透物送回至發(fā)酵生物反應(yīng)器?？上驘o(wú)細(xì)胞滲透物中添加另外的營(yíng)養(yǎng)素（例 如B族維生素），以在將營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基送回至生物反應(yīng)器之前補(bǔ)充所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。
[0173] 此外，如果如上所述調(diào)整發(fā)酵液的pH以增強(qiáng)乙酸至活性炭的吸附，則在將所述發(fā) 酵液送回生物反應(yīng)器前，應(yīng)將pH重新調(diào)整至與發(fā)酵生物反應(yīng)器中的發(fā)酵液相似的pH。
[0174] 可使用任何適當(dāng)?shù)姆椒òǖ幌抻跐B透蒸發(fā)、反滲透和液液萃取技術(shù)，在發(fā)酵 后回收3-HP。
[0175]實(shí)施例
[0176] 現(xiàn)在將參考下述非限制性實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0177] 實(shí)施例1
[0178] 組合兩種(1)2固定途徑，產(chǎn)乙酸菌的線(xiàn)性Wood-Ljungdahl途徑以及在綠色非硫細(xì) 菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的3-HP循環(huán)（Thauer，2007,Science, 318:1732-33)，以獲得朝向平臺(tái)化 學(xué)品3-羥基丙酸鹽（3-HP)的可持續(xù)途徑。該途徑允許將3個(gè)C0或0)2分子固定到一個(gè) 3-HP分子內(nèi)。選擇一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸生物自產(chǎn)乙醇梭菌，并且用來(lái)自非硫光合作用菌橙 色綠屈撓菌的執(zhí)行起始〇) 2固定步驟的基因進(jìn)行代謝改造（圖1)。
[0179] -氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸菌例如自產(chǎn)乙醇梭菌或揚(yáng)氏梭菌能夠通過(guò)固定兩個(gè)C0或C02 分子并且使它們?nèi)诤弦孕纬梢阴］o酶A來(lái)自養(yǎng)生長(zhǎng)。非硫光合作用細(xì)菌例如橙色綠屈撓菌 能夠在循環(huán)過(guò)程中固定C02。它們使用乙酰輔酶A作為起點(diǎn)，并將其融合到通過(guò)乙酰輔酶A 羧化酶(EC. 6. 4. 1. 2)催化的ATP依賴(lài)性步驟中以形成丙二酰輔酶A，所述丙二酰輔酶A隨 后可通過(guò)丙二酰輔酶A還原酶（EC1. 2. 1. 75)的作用被還原為3-HP，即該循環(huán)的中心中間 產(chǎn)物（Huegleretal，2002，J.Bacteriol.l84:2404-10)。將丙二酰輔酶A還原酶基因，酶 (GI: 163848165,Caur_2614 ;YP_001636209. 1)引入一氧化碳營(yíng)養(yǎng)生物內(nèi)，以形成將三個(gè)C0 或C02分子固定到3-HP內(nèi)的新代謝途徑。經(jīng)鑒定，乙酰輔酶A羧化酶已作為脂肪酸生物合成 的一部分存在于宿主生物內(nèi)（自產(chǎn)乙醇梭菌：SEQIDN0:18-21 ;揚(yáng)氏梭菌：CLJU_c42100-4 0,GI: 9447826-31，NC_014328. 1-33. 1)，但除必需的丙二酰輔酶A還原酶之外，還可引入橙 色綠屈撓菌乙酰輔酶A羧化酶（GI: 163847210-11，Caur_1647-48，YP_001635254. 1-55. 1 ; GI:163849262,Caur_3739,YP_001637306. 1 ；GI:163848951,Caur_3421,YP_001636995. 1 ；GI: 163846951,Caur_1378,YP_001634995. 1) 〇
[0180]材料與方法
[0181] 微牛物和牛長(zhǎng)備件
[0182] 自產(chǎn)乙醇梭菌DSM23693是源自DSMZ(德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心（The GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures),Inhoffenstra旦e7 B, 38124Braunschweig，德國(guó)）的自產(chǎn)乙醇梭菌DSM10061的衍生物。
[0183]大腸桿菌XLl-BlueMRF'Kan購(gòu)自Stratagene(SantaClara，CA95051_7201，USA)。
[0184] 將大腸桿菌在好氧條件下培養(yǎng)，而所有其他菌株均在血清瓶中的50ml液體培養(yǎng) 基中以果糖（異養(yǎng)生長(zhǎng)）或在頂空中以30psi含C0鋼鐵廠氣體（收集自Glenbrook，NZ的 NewZealandSteel場(chǎng)所；組成：44%C0、32%N2、22%C02、2%H2)(自養(yǎng)生長(zhǎng)）嚴(yán)格厭氧地 生長(zhǎng)。
[0185] 根據(jù)表1-3中給出的配方，使用標(biāo)準(zhǔn)厭氧技術(shù)（HungateRE:Arolltubemethod forcultivationofstrictanaerobes,inNorrisJRandRibbonsDff(eds. ),Methods inMicrobiology,vol. 3B.AcademicPress,NewYork, 1969:117-132；ffolfeRS:Microbial formationofmethane.AdvMicrobPhysiol1971,6:107-146)制備培養(yǎng)基。對(duì)于固體培 養(yǎng)基，加入 1. 2%Bacto瓊脂（BD,FranktonLakes,NJ07417,USA)。
[0186] 除非另有說(shuō)明，所有菌株均在37°C下生長(zhǎng)。
[0187] 表1 :PETC_MES培養(yǎng)基（自產(chǎn)乙醇梭菌pH5. 6)

【權(quán)利要求】
1. 一種用于將CO和/或CO 2轉(zhuǎn)化成3-羥基丙酸鹽（3-HP)的方法，所述方法包括： 將含C0和/或含C02的氣態(tài)底物傳送至含有在培養(yǎng)基中的一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌 的培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器，使得所述細(xì)菌將C0和/或C02轉(zhuǎn)化為3-HP，和 從所述生物反應(yīng)器中回收3-HP， 其中所述一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌被遺傳改造為表達(dá)丙二酰輔酶A還原酶。
2. 經(jīng)分離的、遺傳改造的一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌，其包含編碼丙二酰輔酶A還原酶 的核酸，由此所述細(xì)菌表達(dá)丙二酰輔酶A還原酶，并且所述細(xì)菌能夠?qū)⑷齻€(gè)C0或0)2分子 固定到一個(gè)3-羥基丙酸鹽（3-HP)分子內(nèi)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的經(jīng)分離的、遺傳改造的一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌，其還包含 編碼來(lái)自非硫、光合作用細(xì)菌的乙酰輔酶A羧化酶的核酸，其中所述核酸與啟動(dòng)子可操作 地連接。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的經(jīng)分離的、遺傳改造的一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌，其選自自 產(chǎn)乙酉享梭菌（Clostridium autoethanogenum)、揚(yáng)氏梭菌（Clostridium 1 jungdahlii)、拉 氏梭菌（Clostridium ragsdalei)、食撰基化物梭菌（Clostridium carboxidivorans)、 德氏梭菌（Clostridium drakei)、奠味梭菌（Clostridium scatologenes)、乙酸梭 菌(Clostridium aceticum)、蟲(chóng)義酸乙酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、大梭 菌（Clostridium magnum)、食甲基丁酸桿菌(Butyribacterium methylotrophicum) > 伍氏乙酸桿菌（Acetobacterium woodii)、巴氏嗜喊菌（Alkalibaculum bacchii)、 Blautia producta、游泥真桿菌（Eubacterium limosum)、熱乙酸穆?tīng)柺暇∕oorella thermoacetica)、熱自養(yǎng)穆?tīng)柺暇∕oorella thermautotrophica)、卵形鼠抱菌 (Sporomusa ovata)、Sporomusa silvacetica、球形鼠抱菌（Sporomusa sphaeroides)、普 氏產(chǎn)醋桿菌（Oxobacter pfennigii)和凱伍熱厭氧菌（Thermoanaerobacter kiuvi)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的經(jīng)分離的、遺傳改造的一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌，其為選自 揚(yáng)氏梭菌和自產(chǎn)乙醇梭菌的梭菌屬種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的經(jīng)分離的、遺傳改造的一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌，其中所 述非硫、光合作用細(xì)菌選自揚(yáng)氏梭菌、生金球形菌屬（Metallosphaera)和硫化葉菌屬 (Sulfolobus)種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的經(jīng)分離的、遺傳改造的一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌，其中所述 非硫、光合作用細(xì)菌是橙色綠屈撓菌（Chloroflexus auranticus)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的經(jīng)分離的、遺傳改造的一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌，其中所述 編碼丙二酰輔酶A還原酶的核酸已進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。
9. 一種培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求2所述的經(jīng)分離的、遺傳改造的一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌 的方法，其包括使所述細(xì)菌在包含氣態(tài)碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中所述碳源包含C0和/或 C02。
10. -種培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求2所述的經(jīng)分離的、遺傳改造的一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌 的方法，其包括使所述細(xì)菌在包含能源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中所述能源包含C0和/或C02。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述培養(yǎng)是嚴(yán)格厭氧的。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述碳源包含工業(yè)廢棄產(chǎn)物或廢氣。
13. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述細(xì)菌還包含編碼來(lái)自非硫、光合作用細(xì) 菌的乙酰輔酶A羧化酶的外源核酸，其中所述核酸與啟動(dòng)子可操作地連接。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述丙二酰輔酶A還原酶來(lái)自非硫、光合作用細(xì) 菌。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述丙二酰輔酶A還原酶來(lái)自橙色綠屈撓菌。
16. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的經(jīng)分離的、遺傳改造的一氧化碳營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌，其中所述 丙二酰輔酶A還原酶與由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列編碼的氨基酸序列至少85%相同。
【文檔編號(hào)】C12N15/53GK104508136SQ201380040793
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2013年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月30日
【發(fā)明者】陳銥婷, M·科普克 申請(qǐng)人:新西蘭郎澤科技公司