鼠表皮生長(zhǎng)因子在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)方法和純化的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鼠表皮生長(zhǎng)因子在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)方法和純化，包括以下步驟：（1）構(gòu)建重組質(zhì)粒pBSAZ2.1；（2）電轉(zhuǎn)化表達(dá)pBSAZ2.1蛋白的重組巴斯德畢赤酵母；（3）陽(yáng)性重組菌株的篩選；（4）誘導(dǎo)重組菌表達(dá)鼠表皮生長(zhǎng)因子；（5）鼠表皮生長(zhǎng)因子的純化。本發(fā)明采用基因工程的方法，將mEGF基因連接至表達(dá)載體上，在巴斯德酵母細(xì)胞中完成分泌表達(dá)，從而構(gòu)建出含mEGF目的基因的基因工程菌。能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)功能方面最接近天然的生物蛋白質(zhì)分子?？梢员苊獾鞍自诒?nèi)聚集形成包涵體，使目的蛋白的下游純化更加簡(jiǎn)單，利于大規(guī)模處理。
【專(zhuān)利說(shuō)明】鼠表皮生長(zhǎng)因子在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)方法和純化
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及鼠表皮生長(zhǎng)因子在巴斯德畢赤酵母GS115中的表達(dá)方法和純化。
【背景技術(shù)】
[0002]鼠表皮生長(zhǎng)因子(MouseEpidermal Growth Factor,簡(jiǎn)稱(chēng) mEGF)是一種含有 53個(gè)氨基酸的單鏈多肽，分子量為6054道爾頓。鼠表皮生長(zhǎng)因子能與特異的跨膜受體結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)一系列生化變化，使靜止的細(xì)胞進(jìn)入分裂周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后達(dá)到生命平衡，細(xì)胞不再無(wú)限增殖。因此，鼠表皮生長(zhǎng)因子是一種強(qiáng)有力的細(xì)胞分裂促進(jìn)劑，微量的外源鼠表皮生長(zhǎng)因子即能夠刺激細(xì)胞增殖，從而加快受損皮膚和內(nèi)上皮的再生修復(fù)，減少皮膚的畸形。所以，鼠表皮生長(zhǎng)因子對(duì)燒傷創(chuàng)傷救治、角膜或皮膚移植、外傷性潰瘍、胃腸道潰瘍和應(yīng)激性胃粘膜損傷的治療均起到重要作用。
[0003]小鼠的頜下腺是EGF的主要合成部位，EGF合成后，釋放到唾液、十二指腸、乳汁、尿液和血液等體液中。但其含量極低，采用凍干小鼠頜下腺的方法分離純化得到的純品蛋白量比較少，生物活性低，往往達(dá)不到大量制備供研究和臨床使用的標(biāo)準(zhǔn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是為了解決重組鼠表皮生長(zhǎng)因子在巴斯德畢赤酵母GSl 15中分泌表達(dá)的問(wèn)題，提供一種高效、穩(wěn)定的表達(dá)mEGF工程菌的構(gòu)建和篩選，以及分離純化目的蛋白mEGF的方法。
[0005]本發(fā)明的目的 可通過(guò)下列技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):一種鼠表皮生長(zhǎng)因子在巴斯德畢赤酵母GSl 15中的表達(dá)方法和純化，包括以下步驟:(I)構(gòu)建重組質(zhì)粒pBSAZ 2.1 ;(2)電轉(zhuǎn)化表達(dá)pBSAZ 2.1蛋白的重組巴斯德畢赤酵母；(3)陽(yáng)性重組菌株的篩選；(4)誘導(dǎo)重組菌表達(dá)鼠表皮生長(zhǎng)因子；(5)鼠表皮生長(zhǎng)因子的純化。
[0006]本發(fā)明的鼠表皮生長(zhǎng)因子在巴斯德畢赤酵母GS115中的表達(dá)方法和純化所述步驟(I)依次包括以下步驟:(a)PCR擴(kuò)增mEGF-TEV-malE-HIS6基因；(b)將步驟(a)獲得的mEGF-TEV-malE-HIS6基因片段和經(jīng)同樣限制性?xún)?nèi)切酶酶切的質(zhì)粒pPIC 9k過(guò)夜連接處理，將連接產(chǎn)物純化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)中，經(jīng)過(guò)卡納霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶I和Afoi I雙酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒pBSAZ 2.1進(jìn)一步地，。
[0007]本發(fā)明的鼠表皮生長(zhǎng)因子在巴斯德畢赤酵母GS115中的表達(dá)方法和純化中所述步驟(2)依次包括以下步驟:(a)、重組質(zhì)粒pBSAZ 2.1的線(xiàn)性化；b、感受態(tài)細(xì)胞的制備；c、電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母。
[0008]本發(fā)明的鼠表皮生長(zhǎng)因子在巴斯德畢赤酵母GS115中的表達(dá)方法和純化中所述步驟(3)依次包括如下步驟:(a)利用巴斯德畢赤酵母GS115組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選整合重組菌；(b) G418抗性篩選高拷貝菌株。[0009]本發(fā)明采用基因工程的方法，將mEGF基因連接至表達(dá)載體上，在巴斯德酵母細(xì)胞中完成分泌表達(dá)，從而構(gòu)建出含mEGF目的基因的基因工程菌。巴斯德酵母表達(dá)系統(tǒng)能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)功能方面最接近天然的生物蛋白質(zhì)分子。胞外分泌型表達(dá)是目前最先進(jìn)的且適于工業(yè)化的表達(dá)方式，細(xì)胞外表達(dá)可以避免蛋白在保內(nèi)聚集形成包涵體，使目的蛋白的下游純化更加簡(jiǎn)單，利于大規(guī)模處理。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1為重組質(zhì)粒pBSAZ 2.1構(gòu)建示意圖
圖2為pBSAZ 2.1備Bgl Π酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖3純化后mEGF蛋白SDS-PAGE電泳圖。
具體實(shí)施例
[0011]實(shí)施例1:重組質(zhì)粒pBSAZ 2.1的構(gòu)建
一)試驗(yàn)材料
(1)質(zhì)粒和菌株
質(zhì)粒pPIC 9k、PMAL-P5X和大腸桿菌JM109購(gòu)自Takara生物科技有限公司。
[0012](2)試劑
限制性?xún)?nèi)切酶AcoR I和Afoi I，卡納青霉素和卡那霉素購(gòu)自NEB公司。
[0013]基因片段mEGF和引物由華大基因合成。
[0014]m-F:CGGAATTCAATAGTTATCCAGGAT
m-R:TAATGCTCCTGCTGCGAACTCCTCTAGTAACTGGAAATATAGGTTCTC
M-F:GAGAACCTATATTTCCAGTTACTAGAGGAGTTCGCAGCAGGAGCATTAAAAATAAAAACAGGT
M-R:
ATAAGAATGCGGCCGCCGCTGCTGTGATGATGATGATAGTCTGCGCGTC
二)實(shí)施方案
1.質(zhì)粒pPIC 9k的酶切
大量提取重構(gòu)質(zhì)粒pPIC 9k，純化后加入限制性?xún)?nèi)切酶I和Afoi I，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱2-3h做雙酶切處理，將酶切產(chǎn)物純化后，加去磷酸化酶做去磷酸化處理，將去磷酸化產(chǎn)物純化后置4°C冰箱保存待用。
[0015]2.mEGF基因片段的獲得
大量提取含mEGF基因片段的質(zhì)粒pMD18-T-mEGF，純化后作為PCR模板，加入引物m_F和m-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收片段，純化后置4°C冰箱保存待用。
[0016]3.malE基因片段的獲得
大量提取含malE基因片段的質(zhì)粒pMAL-p5X，純化后作為PCR模板，加入引物M-F和M-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收片段，純化后置4°C冰箱保存待用。
[0017]4.mEGF-TEV-malE-HIS6 基因的獲得將4°C冰箱保存的基因片段mEGF基因和malE基因混合物作為模板，加入引物m_F和M-R進(jìn)行Overlapping PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收片段，純化后加入限制性?xún)?nèi)切酶I和I，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱2-3h做雙酶切處理，將酶切產(chǎn)物純化后置4°C冰箱保存待用。
[0018]5.重組質(zhì)粒pBSAZ 2.1的獲得
將mEGF-TEV-malE-HIS6基因片段和經(jīng)同樣限制性?xún)?nèi)切酶酶切的質(zhì)粒pPIC 9k過(guò)夜連接處理。
[0019]將連接產(chǎn)物純化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)中，經(jīng)過(guò)卡納霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶I和Afoi I雙酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒pBSAZ
2.1。
[0020]重組質(zhì)粒pBSAZ 2.1構(gòu)建示意圖如圖1所示。
[0021]實(shí)施例2:電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母 1.重組質(zhì)粒pBSAZ 2.1的線(xiàn)性化
重組質(zhì)粒pBSAZ 2.1采用限制性?xún)?nèi)切酶ife./ Π線(xiàn)性化，純化回收后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，以確定純化回收片段的正確性。
[0022]2.感受態(tài)細(xì)胞的制備
挑取巴斯德畢赤酵母GS1 15單菌落，接種至含有50mL YETO培養(yǎng)基的搖瓶中30°C，150rpm培養(yǎng)過(guò)夜。取100 μ L的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至含有50mL新鮮YETO培養(yǎng)基的搖瓶中30°C，150rpm培養(yǎng)，檢測(cè)0D600值，待達(dá)到1.3-1.5將細(xì)胞培養(yǎng)物倒入預(yù)冷的無(wú)菌50mL離心管中，于4°C,4000rpm離心5min。在無(wú)菌條件下每管再用50mL的預(yù)冷無(wú)菌水將菌體沉淀重懸。于4°C, 4000rpm離心5min,再用25mL預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸。于4°C, 4000rpm離心5min,用2mL預(yù)冷的lmol/L的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸。于4°C, 4000rpm離心5min,用200 μ L預(yù)冷的lmol/L的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸。
[0023]3.電轉(zhuǎn)化
把電轉(zhuǎn)化杯從無(wú)水乙醇中拿出，置超凈臺(tái)中風(fēng)干，同時(shí)紫外照射20分鐘，只后把轉(zhuǎn)化杯放入冰盒預(yù)冷。取80 μ I制備的酵母感受態(tài)細(xì)胞，與5~10 μ g線(xiàn)性化的重組表達(dá)質(zhì)粒混合，移入0.2cm電轉(zhuǎn)化杯，冰浴5min。擦干水汽，置電轉(zhuǎn)儀上電擊，電擊參數(shù)為1500V，5ms。電擊后立即加入1ml冰浴的lmol/L山梨醇，轉(zhuǎn)入15ml離心管中，30°C靜置l_2h。
[0024]實(shí)施例3:陽(yáng)性重組菌株的篩選
1.利用巴斯德畢赤酵母GSl 15組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選整合重組菌將靜置培養(yǎng)的菌液1500rpm離心5min后涂布MD平板，置30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2_3天至長(zhǎng)出單菌落。
[0025]2.G418抗性篩選高拷貝菌株
將MD平板上長(zhǎng)出的菌落分別用牙簽點(diǎn)種至1.5mg/ml-2mg/ml G418的YETO平板上，置30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)三天左右，選取長(zhǎng)的比較大的菌落接種含1.5mg/ml-2mg/ml G418的YEPD液體培養(yǎng)基，置30°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)，并-80°C保存菌株。
[0026]實(shí)施例4誘導(dǎo)重組菌表達(dá)鼠表皮生長(zhǎng)因子
1.挑取單個(gè)菌落，接種50mL BMDY液體培養(yǎng)基于30°C，200r/min的搖床培養(yǎng)16_18h，直到0D600值達(dá)2左右。取ImL培養(yǎng)物離心，收集細(xì)胞作為未誘導(dǎo)對(duì)照。同時(shí)取ImL培養(yǎng)物接種于50mL BMMY液體培養(yǎng)基于30°C，200r/min的搖床培養(yǎng)，誘導(dǎo)基因表達(dá)，每隔24h取1mL，再補(bǔ)充1mL5%甲醇繼續(xù)培養(yǎng)3~5d。
[0027]2.將取出的1mL培養(yǎng)物12000rpm離心3min，分離細(xì)胞和上清液。細(xì)胞沉淀無(wú)菌水水洗后12000r/min離心Imin,棄上清液,置超聲波破碎儀破碎細(xì)胞，12000r/min離心Imin分離胞內(nèi)液和細(xì)胞殘?jiān)Ｈ?0 μ L上清液和胞內(nèi)液用10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析蛋白是否分泌至胞外。
[0028]實(shí)施例5:鼠表皮生長(zhǎng)因子的純化
收集含有分泌的目的蛋白培養(yǎng)基，離心去除不容性的雜質(zhì)，取上清。
[0029]通過(guò)Amylose Resin親和色譜柱,使MBP融合蛋白結(jié)合到Amylose Resin上,再用含有10mmol/L麥芽糖的column buffer洗脫，即得到純化的MBP融合蛋白。
[0030]利用AKTA purifier 100 系統(tǒng)經(jīng)過(guò) His TrapTM FF crude 親和層析，用 Washbuffer (20mmol/L 咪唑，300mmol/L NaC, 150 mmol/L NaH2PO4, ρΗ8.0)洗去雜蛋白，再用Elution buffer (250mmol/L 咪唑,300mmol/L NaCl, 150 mmol/L NaH2PO4, ρΗ8.0)洗脫，收集唯一的洗脫峰即為目的蛋白。含有目的蛋白的樣品緩慢加入N1-NTA柱，使蛋白更好地與柱子結(jié)合。上樣完畢，先用破菌緩沖液洗5個(gè)柱體積，在用PBS(pH7.3，140 mM NaCl, 2.7mMNaCl，50 mM NaH2PO4)洗 3 個(gè)柱體積。
[0031]向結(jié)合有mEGF-TEV-MBP-HIS6蛋白的N1-NTA柱中加入0.1mg的特異性切割酶TEV室溫反應(yīng)1-3小時(shí)。酶切下來(lái)的mEGF用PBS洗脫下來(lái)，收集流出液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。
[0032]實(shí)施例6 MTT法測(cè)定mEGF蛋白的活性 一)試驗(yàn)材料
1.小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Balb/c 3t3細(xì)胞)購(gòu)自ATCC。
[0033]2.試劑:
(1)RPMI 1640培養(yǎng)基1000rnl加青霉素105IU和鏈霉素105IU，再加NaHC03 2.lg，溶解后，混勻，除菌過(guò)濾，4度保存；
(2)維持培養(yǎng)液牛血清4ml加RPMI16401000rnl ；
(3)完全培養(yǎng)液牛血清100mL加RPMI16401000rnl ；
(4)PBS NaCl 8g KCl 0.2g Na2HP03 1.44g KH2P03 0.24g 加水至 1000ml 經(jīng)121度15分鐘滅菌。
[0034](5)噻唑藍(lán)(MTT)溶液取MTT粉末0.1g加PBS20ml溶解，經(jīng)0.22 μ m濾膜過(guò)濾除菌，4度避光保存。
[0035]二)實(shí)施方案
1.取重組鼠表皮生長(zhǎng)因子標(biāo)準(zhǔn)品按說(shuō)明書(shū)復(fù)溶后，用維持培養(yǎng)液稀釋至每1ml含50IU。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，做4倍系列稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋度，每個(gè)濃度做2個(gè)控。無(wú)菌操作；
2.取樣品復(fù)溶后，用維持培養(yǎng)液稀釋。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，做4倍系列稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋度，每個(gè)濃度做2個(gè)控。無(wú)菌操作；
3.Balb/c 3t3細(xì)胞株用完全培養(yǎng)液于37度，5%C02培養(yǎng)，控制細(xì)胞濃度為每1ml含1.0X105~5.0X 1O5個(gè)細(xì)胞，傳代后24~36h用于生物活性測(cè)定。棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，消化和收集細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液配成每1ml含5.0 X IO4~8.0 X IO4個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μ I。在37度，5%0)2培養(yǎng)培養(yǎng)24h。制備的細(xì)胞培養(yǎng)板棄去維持液，加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液，每孔100 μ I。于37度，5% CO2培養(yǎng)64~72h。每孔加入MTT溶液20 μ 1，于37度，5% CO2培養(yǎng)5h。以上操作在無(wú)菌條件下進(jìn)行。棄去培養(yǎng)液中的液體后，向每孔中加入二甲基亞諷(DMSO) 100 μ I，混勾后在酶標(biāo)僅上，以630nm為參比波長(zhǎng)，于波長(zhǎng)570nm處測(cè)定吸光度，記錄測(cè)定結(jié)果。
[0036]綜上所述結(jié)果如下:
1.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pBSAZ 2.1
重組質(zhì)粒pBSAZ 2.1經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶汝./ Π酶切驗(yàn)證電泳圖如圖2所示。
[0037]2.mEGF蛋白純化SDS-PAGE蛋白電泳
將酶切后采用PBS緩沖液洗脫，過(guò)柱純化的mEGF蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，最后在凝膠成像儀上成像，得到結(jié)果如圖3所示
3.mEGF蛋白的活性測(cè)定
Balb/c 3t3細(xì)胞的活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)顯示與標(biāo)準(zhǔn)品相比mEGF樣品具有較高生物學(xué)活性，檢測(cè)到mEGF樣品的活性為1.3*105U/mg。
【權(quán)利要求】
1.一種鼠表皮生長(zhǎng)因子在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)方法和純化，其特征在于，包括以下步驟: (1)構(gòu)建重組質(zhì)粒pBSAZ2.1 ； (2)電轉(zhuǎn)化表達(dá)pBSAZ2.1蛋白的重組巴斯德畢赤酵母； (3)陽(yáng)性重組菌株的篩選； (4)誘導(dǎo)重組菌表達(dá)鼠表皮生長(zhǎng)因子； (5)鼠表皮生長(zhǎng)因子的純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鼠表皮生長(zhǎng)因子在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)方法和純化，其特征在于，所述步驟(1)依次包括以下步驟:(a)PCR擴(kuò)增mEGF-TEV-malE-HIS6基因；(b)將步驟(a)獲得的mEGF-TEV-malE-HIS6基因片段和經(jīng)同樣限制性?xún)?nèi)切酶酶切的質(zhì)粒pPIC 9k過(guò)夜連接處理，將連接產(chǎn)物純化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)中，經(jīng)過(guò)卡納霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶I和Afoi I雙酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒pBSAZ 2.1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鼠表皮生長(zhǎng)因子在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)方法和純化，其特征在于，所述步驟(2)依次包括以下步驟:(a)、重組質(zhì)粒pBSAZ 2.1的線(xiàn)性化；b、感受態(tài)細(xì)胞的制備；c、電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鼠表皮生長(zhǎng)因子在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)方法和純化，其特征在于，所述步驟(3)依次包括如下步驟:(a)利用巴斯德畢赤酵母GS115組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選整合重組菌；(b) G418抗性篩選高拷貝菌株。
【文檔編號(hào)】C12R1/84GK103882050SQ201410000614
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年1月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月2日
【發(fā)明者】王喆明 申請(qǐng)人:杭州璞題生物科技有限公司