一種rna干擾載體及其培育高結(jié)瘤固氮植物的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用調(diào)控植物結(jié)瘤固氮能力的RNA干擾載體，包括骨架載體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)利用SEQ?ID?NO：2所示的基因片段構(gòu)建，將基因片段插入到pTCK303載體的限制性內(nèi)切酶Kpn?I/Spe?I和BamH?I/Sac?I酶切識別位點之間，得到重組RNA干擾載體。使所得RNA干擾載體轉(zhuǎn)化受體植物，沉默受體植物中的對應(yīng)基因，使受體植物的根組織具有增強(qiáng)的結(jié)瘤固氮能力。利用本發(fā)明構(gòu)建的RNA干擾載體轉(zhuǎn)化受體大豆植株獲得轉(zhuǎn)基因植物，能夠顯著提高大豆的結(jié)瘤固氮能力，對提高大豆產(chǎn)量具有重大的意義。
【專利說明】—種RNA干擾載體及其培育高結(jié)瘤固氮植物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種用于蝶形花科的RNA干擾載體及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆是非常重要的、具有特殊經(jīng)濟(jì)價值的作物。大豆根部著生的根瘤可以把空氣中的氮氣轉(zhuǎn)化為植物可以吸收利用的氨態(tài)氮，從而為大豆生長發(fā)育提供了必需的氮素養(yǎng)料。由根瘤介導(dǎo)的共生固氮不僅影響著大豆的正常生長和產(chǎn)量，還有利于節(jié)約能源，減少環(huán)境化學(xué)污染。目前，提高固氮效率已成為提高大豆產(chǎn)量及保證農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑之一。
[0003]大豆根系結(jié)瘤固氮是一個受到多個基因調(diào)控的非常復(fù)雜的生物學(xué)過程，目前越來越多的調(diào)控基因被報道。2003年Madsen等人的研究結(jié)果表明NFR1和NFR5作為結(jié)瘤因子受體參與豆科植物對結(jié)瘤因子的響應(yīng)(Madsen et al.，2003)。之后，在大豆中的研究報道指出，NFR基因的突變導(dǎo)致根系不結(jié)瘤，而過表達(dá)NFRla基因可以增加大豆的根瘤數(shù)目(Indrasumunar et al.，2010，2011)。在大豆中過表達(dá)植物凝集素核酸磷酸水解酶LNP可以顯著增加大豆根系的結(jié)瘤(Kalsi et al.，2000)。
[0004]ARF8是生長素信號通路中的重要的生長素應(yīng)答因子。ARF8調(diào)控著擬南芥花發(fā)育過程(Nagpal et al., 2005, ffu et al.，2006)。突變體arf8在光照條件下表現(xiàn)出下胚軸的伸長(Tian et al.，2004)。ARF8下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致四輪花器官出現(xiàn)了異常(Ru et al.，2006)。ARF8參與調(diào)控擬南芥根系在相應(yīng)氮營養(yǎng)缺乏時的側(cè)根生長(Gifford et al.，2008)。目前尚未見到關(guān)于ARF8調(diào)控豆科根`瘤發(fā)育的報道。大豆中ARF8基因功能鑒定將為我們闡明大豆根瘤發(fā)育的分子機(jī)制提供依據(jù)，從而為通過生物固氮提高大豆的固氮效率另辟蹊徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種RNA干擾載體及其培育高結(jié)瘤固氮植物的應(yīng)用，尤其是提供一種培育具有高固氮能力的大豆新品種的方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。
[0007]—種用于構(gòu)建RNA干擾載體的基因片段，此基因片段用于構(gòu)建RNA干擾載體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所述基因片段的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示，此片段作為正義鏈。
[0008]上述基因片段的互補(bǔ)核苷酸序列，即與正義鏈互補(bǔ)的反義鏈。
[0009]一種用于調(diào)控植物結(jié)瘤固氮能力的RNA干擾載體，包括骨架載體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)利用權(quán)利要求1或2所述的基因片段構(gòu)建。
[0010]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述骨架載體為PTCK303載體。
[0011]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)的間隔為PTCK303載體上的水稻內(nèi)含子。
[0012]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，正義鏈位于pTCK303載體中水稻內(nèi)含子的上游，反義鏈位于水稻內(nèi)含子的下游，整體構(gòu)成了以水稻內(nèi)含子為間隔的可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA干擾載體。將基因片段插入到PTCK303的限制性內(nèi)切酶Kpn I/Spe I和BamH 1/Sac I酶切識別位點之間，得到重組表達(dá)載體。
[0013]上述RNA干擾載體的用途，用于培育具有高結(jié)瘤固氮能力的植物。
[0014]上述RNA干擾載體的用途，使RNA干擾載體轉(zhuǎn)化受體植物，沉默受體植物中的對應(yīng)基因，使受體植物的根組織具有增強(qiáng)的結(jié)瘤固氮能力。
[0015]上述RNA干擾載體的用途，所述轉(zhuǎn)化受體植物的方法為利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛狀根轉(zhuǎn)化法；所述被沉默的基因為SEQ ID N0:1所示的基因。
[0016]上述RNA干擾載體的用途，所述受體植物為蝶形花科植物。
[0017]采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于:參看下述實施例3，利用本發(fā)明構(gòu)建的RNA干擾載體轉(zhuǎn)化受體大豆植株獲得轉(zhuǎn)基因植物，能夠顯著提高大豆的結(jié)瘤固氮能力，對提高大豆產(chǎn)量具有重大的意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為GmARFSLl基因響應(yīng)短期根瘤菌侵染的表達(dá)模式分析，可見在根瘤菌侵染早期的大豆根中，GmARFSLl基因的表達(dá)受到顯著抑制，該結(jié)果說明GmARFSLl基因參與了大豆根系結(jié)瘤早期對根瘤菌的響應(yīng)過程。
[0019]圖2為GmARF8Ll響應(yīng)長期根瘤菌侵染的表達(dá)模式分析，可見在根瘤菌侵染的較長時間，即根瘤發(fā)生發(fā)育的過程中，GmARFSLl基因的表達(dá)水平也出現(xiàn)了明顯的下調(diào)，結(jié)果表明，GmARFSLl參與調(diào)控大豆根系在根瘤菌侵染后的發(fā)生發(fā)育過程。
[0020]圖3為下調(diào)表達(dá)GmARFSLl后對大豆結(jié)瘤的表型分析，在完全相同的實驗環(huán)境下，下調(diào)表達(dá)GmARFSLl的轉(zhuǎn)基因根同空載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因根系(EV)相比，根瘤數(shù)量顯著增多(圖3A和3B)，圖3C為對轉(zhuǎn)基因根系中GmARF8Ll的表達(dá)水平分析，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)基因根系中GmARF8Ll的表達(dá)是顯著下調(diào)的。
【具體實施方式】
[0021]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑公司購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。
[0022]本發(fā)明構(gòu)建的RNA干擾載體能夠特異的沉默大豆中的GmARF8Ll基因。此基因?qū)儆贏RF8基因家族，其定位在大豆2號染色體上，實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，GmARF8Ll基因在大豆根中的表達(dá)受到根瘤菌侵染的抑制；通過毛狀根轉(zhuǎn)化嵌合苗的結(jié)瘤分析顯示，GmARFSLl的下調(diào)表達(dá)可以顯著促進(jìn)大豆根系結(jié)瘤數(shù)目的增加，表明GmARFSLl基因在大豆根瘤發(fā)育中具有重要的作用。
[0023]實施例1、GmARF8Ll基因早期響應(yīng)根瘤菌侵染的表達(dá)模式分析
[0024]1)材料獲取: 實驗所用材料為威廉姆斯82 (簡稱W82);材料按照以下流程進(jìn)行:大豆種子用70%的灑精滅菌30S，播種于低氮營養(yǎng)液浸泡的蛭石珍珠巖(3:1)混合基質(zhì)中，于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，16h光/8h暗，光強(qiáng)7000LUX，溫度26°C，相對濕度為70%。播種后7天，每株接種慢生型根瘤菌USDA110菌液(OD600:0.08 )30ml，分別在接菌后0、1、3、6、12及24小時取大豆的根；
[0025]2)mRNA的分離:采用Trizol法提取大豆總RNA，①先將組織放入研磨中用液氮研磨3次，將研磨好的組織50-100mg加入1.5mL離心管中然后加入1ml RNAVzol,裂解產(chǎn)物應(yīng)呈澄清的透明粘稠液體.室溫放置5分鐘；②加200 μ 1氯仿，振蕩混勻，室溫靜置5min，12，000r/min，4°C離心lOmin ;③取500 μ 1上清于另一離心管，加等體積異丙醇，室溫放置 lOmin, 12，000r/min,4°C離心 lOmin ;④加入 lml75% 乙醇洗沉淀,8，000r/min,4°C離心5min，重復(fù)兩次；室溫風(fēng)干lOmin左右，加20 μ 1左右DEPC處理過的RNase Free水(DEPC水)溶解沉淀；
[0026]3)反轉(zhuǎn)錄為cDNA:將提取的mRNA用Promega公司的反轉(zhuǎn)錄酶AMV反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；
[0027]4)實時熒光定量PCR分析:使用TaKaRa公司出品的SYBR Premix Ex TagTM進(jìn)行定量PCR分析；在20 μ 1體系中加入上步所得cDNA模板2 μ 1、正反向引物各0.4 μ 1、SYBRPrimix Ex taqTM(2X) 10 μ 1、R0X Reference Dye II (50 X) 0.4 μ 1、ddH20 6.8μ1;擴(kuò)增程序為:95V 30s ；95°C 5s，60。。34s,45cycles ；95°C 15s，60。。lmin,95°C 15s ;其中，
[0028]正向引物為:GTATTCGTCGACAGGGAGAAC(SEQ ID NO:3);
[0029]反向引物為:TCAGTATTCAAGGGAGCCAATT(SEQ ID NO:4)；
[0030]5)結(jié)果:如圖1所示，在根瘤菌侵染早期的大豆根中，GmARFSLl基因的表達(dá)受到顯著抑制，該結(jié)果說明GmARFSLl基因參與了大豆根系結(jié)瘤早期對根瘤菌的響應(yīng)過程。
[0031]實施例2、GmARF8Ll在根瘤發(fā)育不同階段的表達(dá)模式分析
[0032]1)材料獲取:實驗所用材料為威廉姆斯82 (簡稱W82);材料按照以下流程進(jìn)行:大豆種子用70%的灑精滅菌30S，播種于低氮營養(yǎng)液浸泡的蛭石珍珠巖(3:1)混合基質(zhì)中，于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，16h光/8h暗，光強(qiáng)7000LUX，溫度26°C，相對濕度為70%。播種后7天，每株接種慢生型根瘤菌USDA110菌液(0D6CIC1:0.08) 30ml，分別在接菌后0、1、3、5、10天取大豆根及葉組織；
[0033]2)mRNA的分離:采用Trizol法提取大豆總RNA，①先將組織放入研磨中用液氮研磨3次，將研磨好的組織50-100mg加入1.5mL離心管中然后加入lml RNAVzol,裂解產(chǎn)物應(yīng)呈澄清的透明粘稠液體.室溫放置5分鐘；②加200 μ 1氯仿，振蕩混勻，室溫靜置5min，12，000r/min,4C離心lOmin ;③取500 μ 1上清于另一離心管，加等體積異丙醇，室溫放置lOmin, 12，000r/min, 4 °C 離心 lOmin ;④加入 lml 75% 乙醇洗沉淀,8，000r/min,4°C 離心5min，重復(fù)兩次；室溫風(fēng)干lOmin左右，加20 μ 1左右DEPC處理過的RNase Free水(DEPC水)溶解沉淀；
[0034]3)反轉(zhuǎn)錄為cDNA:將提取的mRNA用Promega公司的反轉(zhuǎn)錄酶AMV反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；
[0035]4)實時熒光定量PCR分析:使用TaKaRa公司出品的SYBR Premix Ex TagTM進(jìn)行定量PCR分析；在20 μ 1體系中加入上步所得cDNA模板2 μ 1、正反向引物各0.4 μ 1、SYBRPrimix Ex taqTM(2X) 10 μ 1、R0X Reference Dye II (50 X) 0.4 μ 1、ddH20 6.8μ1;擴(kuò)增程序為:95V 30s ；95°C 5s，60。。34s,45cycles ；95°C 15s，60。。lmin,95°C 15s ;其中，
[0036]正向引物為:GTATTCGTCGACAGGGAGAAC(SEQ ID NO:3);
[0037]反向引物為:TCAGTATTCAAGGGAGCCAATT(SEQ ID NO:4)；
[0038]5)結(jié)果:如圖2所示，在根瘤菌侵染的較長時間，即根瘤發(fā)生發(fā)育的過程中，GmARF8Ll基因的表達(dá)水平也出現(xiàn)了明顯的下調(diào)，結(jié)果表明，GmARF8Ll參與調(diào)控大豆根系在根瘤菌侵染后的發(fā)生發(fā)育過程。
[0039]實施例3、利用RNA干擾載體下調(diào)GmARF8Ll基因，培育具有高結(jié)瘤固氮能力的轉(zhuǎn)基因大豆。
[0040]1) Wilimas82大豆功能葉組織中總RNA的提取
[0041]研缽經(jīng)180°C高溫處理8小時或經(jīng)燃燒處理以消除RNA酶污染；氯仿、異丙醇，乙醇等試劑使用新開封未被污染的；其它器材如槍頭、離心管和試劑如超純水、NaAc，均經(jīng)P/^DEPC水處理過夜后121°高溫濕熱滅菌30分鐘，槍頭，離心管65°烘干備用；采用Trizol法提取大豆總RNA:
[0042](1)取50mg材料(葉片)用液氮研磨材料，加入lml redzol試劑，充分勻楽;后，將勻漿液吸入1.5ml離心管，室溫放置5min ；
[0043](2)加 200 μ 1 氯仿，震蕩混勻，靜置 2-3min, 12000g4°C離心 lOmin ；
[0044](3)取上清于另一離心管，加等體積異丙醇，-20°放置30min，12000g4°C離心lOmin ；
[0045](4) lml 75%乙醇洗沉淀，7500g離心5min,兩次重復(fù)；室溫風(fēng)干lOmin左右，加20 μ 1左右DEPC處理過的無菌水溶解沉淀。
[0046]2)反轉(zhuǎn)錄 PCR
[0047](1)在用DEPC處理過的的200 μ 1 PCR管中順序加入5 μ L RNA和3 μ Loligo(dt) 18 ;4μ L dNTPs，65°C溫育5min后迅速置于冰上冷卻；
[0048](3)按以下順序加入以下溶液:5XM_MLV buffer (invitrogen公司出品)4 μ 1,RNase inhibitor 1 μ 1, M-MLV 1 μ 1,0.1MDTT 2μ 1 ；
[0049](4)將上述反應(yīng)液混勻，37°C反應(yīng)1.5小時；
[0050](5)反應(yīng)結(jié)束后，70°C處理lOmin滅活逆轉(zhuǎn)錄酶活性；反應(yīng)合成的cDNA第一條鏈可用作PCR反應(yīng)模板。
[0051]3)構(gòu)建重組表達(dá)載體
[0052](l)GmARF8Ll基因片段的克隆
[0053]根據(jù)GmARF8Ll的編碼序列(SEQ ID NO:1)設(shè)計引物對用于基因沉默(RNAi )的載體構(gòu)建，根據(jù)載體PTCK303上的多克隆位點，引物末端分別引入Kpn I/Spe I和BamH I/SacI酶切識別位點；以大豆測序品種W82的cDNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增GmARF8Ll長為435bp的基因片段(SEQ ID NO:2);引物序列為:
[0054]正向引物:GGGGTACCACTAGTTTGTAACTCGGACACCCA(SEQ ID NO:5);
[0055]反向引物:CGGGATCCGAGCTCGATTCCCACGGATCGTCT(SEQ ID N0:6)；
[0056]擴(kuò)增程序為:95°C5 分鐘；95°C 30 秒，57°C 30 秒，72°C 40 秒，26 個循環(huán)；72°C 70秒；
[0057]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，采用上海生工膠回收試劑盒回收純化435bp左右的條帶；
[0058]回收的DNA片段與pMD19_T載體(Takara公司)連接，10 μ 1體系中加入T vector1 μ 1，solution I 5μ 1，回收片段4μ 1，混勻混合液，16°C連接過夜，熱擊法轉(zhuǎn)入E.coli大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)，挑陽性克隆，送交invitrogen公司測序。[0059](2)重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0060]a.提取含有正確測序的GmARF8Ll 435bp基因序列的T載體質(zhì)粒，用Spe I和SacI酶切獲得正義的核苷酸序列，同一種PCR產(chǎn)物通過BamH I和Kpn I酶切后獲得反義的核苷酸序列；
[0061]b.將正義片段先克隆到PTCK303載體中水稻內(nèi)含子的上游；
[0062]c.然后將反義片段克隆到已含有正義片段的重組PTCK303載體中水稻內(nèi)含子的下游，最終構(gòu)成了以水稻內(nèi)含子為間隔的可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的dsRNA干擾載體；
[0063]d.將步驟3的連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α菌株，37 °C過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆進(jìn)行測序；測序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒GmARF8Ll-RNAi。
[0064]4)農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)的毛狀根轉(zhuǎn)化:
[0065]( 1)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化，采用液氮凍溶法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，具體操作為:
[0066]a.取出凍存的200 μ 1感受態(tài)細(xì)胞，融化后加入5_10 μ 1質(zhì)粒DNA，輕彈管壁混勻，冰上放20-30min ；
[0067]b.放入液氮中5min后取出，將管轉(zhuǎn)入37°C (5min)融化后，加入800μ1 LB(無抗性)液體培養(yǎng)基，28°C低速振蕩(150rpm)4-5h ；
[0068]c.lOOOOrpm, 30sec,去上清，加ΙΟΟμΙ LB液體培養(yǎng)基，懸浮菌體后涂板(含50mg/ml卡那霉素);
[0069]d.置28°C培養(yǎng)至白色轉(zhuǎn)化子`長出，用于毛狀根的轉(zhuǎn)化；
[0070](2)農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)的毛狀根轉(zhuǎn)化
[0071]以大豆品種W82為材料，取種子材料用氯氣消毒10小時后，在B5培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方:2 % 鹿糖，0.8 瓊月旨粉(sigma), 1 XGAMB0RG B-5BASAL (Phyto TechnologyLaboratories,貨號:G398), pH調(diào)至5.7左右；)上萌發(fā)5天，待子葉剛要張開時切下子葉，在子葉下端十字交叉切割，浸在活化的農(nóng)桿菌K599中侵染30min (OD600: 0.6左右)后，將外植體轉(zhuǎn)至1/2MS培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方:2 %蔗糖，0.8瓊脂粉(sigma)，0.5XMURASHIGE&SK00G BASAL MED10M w/VITAMINS(Phyto Technology Laboratories，貨號:G519)，pH調(diào)至5.7左右；)上共培生長3天后，再轉(zhuǎn)至1/2MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)毛狀根，7天后，毛狀根長出，待大豆真葉長出，毛狀根達(dá)到7-8cm后，選擇發(fā)育階段接近的毛狀根復(fù)合苗移入無土基質(zhì)(蛭石:珍珠巖=3:1)中，培養(yǎng)1周后接種根瘤菌USDA110 (OD600:0.08) 20ml/株，培養(yǎng)28天后收取根瘤，統(tǒng)計根瘤數(shù)量。
[0072]5.結(jié)果觀察
[0073]結(jié)果如圖3所示，表明在完全相同的實驗環(huán)境下，下調(diào)表達(dá)GmARFSLl的轉(zhuǎn)基因根同空載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因根系(EV)相比，根瘤數(shù)量顯著增多(圖3A和3B)，圖3C為對轉(zhuǎn)基因根系中GmARFSLl的表達(dá)水平分析，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)基因根系中GmARFSLl的表達(dá)是顯著下調(diào)的。
[0074]上述描述僅作為本發(fā)明可實施的技術(shù)方案提出，不作為對其技術(shù)方案本身的單一限制條件。
【權(quán)利要求】
1.一種用于構(gòu)建RNA干擾載體的基因片段，此基因片段用于構(gòu)建RNA干擾載體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述基因片段的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0:2所示。
2.權(quán)利要求1所述基因片段的互補(bǔ)核苷酸序列。
3.一種用于調(diào)控植物結(jié)瘤固氮能力的RNA干擾載體，包括骨架載體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)利用權(quán)利要求1或2所述的基因片段構(gòu)建。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的RNA干擾載體，其特征在于:所述骨架載體為PTCK303載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的RNA干擾載體，其特征在于:所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)的間隔為PTCK303載體上的水稻內(nèi)含子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的RNA干擾載體，其特征在于:正義鏈位于PTCK303載體中水稻內(nèi)含子的上游，反義鏈位于水稻內(nèi)含子的下游，整體構(gòu)成了以水稻內(nèi)含子為間隔的可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA干擾載體。
7.權(quán)利要求3-6任一項所述的RNA干擾載體的用途，用于培育具有高結(jié)瘤固氮能力的植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于:使RNA干擾載體轉(zhuǎn)化受體植物，沉默受體植物中的對應(yīng)基因，使受體植物的根組織具有增強(qiáng)的結(jié)瘤固氮能力。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于:所述轉(zhuǎn)化受體植物的方法為利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛狀根轉(zhuǎn)化法；所述被沉默的基因為SEQ ID NO:1所示的基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的·用途，其特征在于:所述受體植物為蝶形花科植物。
【文檔編號】C12N15/113GK103710346SQ201410005361
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】李霞, 王幼寧, 陳亮, 李科學(xué), 鄒艷敏, 王蕊 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所農(nóng)業(yè)資源研究中心