一種透性化谷氨酸脫羧酶工程菌及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種透性化谷氨酸脫羧酶工程菌及其制備方法，所述方法包括：將已表達(dá)谷氨酸脫羧酶的谷氨酸脫羧酶工程菌菌體懸浮于水或緩沖液中，50～70℃處理5～40min后，收集菌體，得到所述的透性化谷氨酸脫羧酶工程菌；其中，所述的谷氨酸脫羧酶工程菌包括宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的谷氨酸脫羧酶基因，所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌。本發(fā)明還提供了所述方法得到的透性化谷氨酸脫羧酶工程菌。本發(fā)明的方法，簡便、成本低，易于操作，可有效提高菌體的谷氨酸脫羧酶表觀催化活力。
【專利說明】一種透性化谷氨酸脫羧酶工程菌及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種透性化谷氨酸脫羧酶工程菌及其制備方法。
技術(shù)背景
[0002]Y-氨基丁酸(gamam -aminobutyric acid, GABA)是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、利尿、抗驚厥、預(yù)防癲癇、改善睡眠、抗抑郁、促進(jìn)激素分泌和保肝利腎等多種生理功能。因此，GABA在食品和醫(yī)藥有著廣闊的應(yīng)用價值。此外，GABA作為前體物質(zhì)可用于合成生物可降解材料聚酰胺-4和環(huán)境有好的塑料溶劑N-吡咯烷酮等化工產(chǎn)
品O
[0003]目前，GABA可以通過化學(xué)合成法和生物催化的方法進(jìn)行制備。與化學(xué)合成法相比，利用谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD; EC4.1.1.15)催化L-谷氨酸脫羧生成GABA的生物制備方法由于具有原料來源豐富、過程簡單、轉(zhuǎn)化效率高，條件溫和以及環(huán)境友好優(yōu)點，因而更具有商業(yè)化開發(fā)前景。
[0004]利用表達(dá)有GAD的微生物細(xì)胞制備GABA，可以避免酶提取與純化步驟成本，提高酶的利用率與穩(wěn)定性。通過基因工程技術(shù)克隆GAD基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，可以有效提高菌體的催化活性。但是由于菌體細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的屏障作用限制了底物及產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)外的傳遞，使菌體胞內(nèi)的GAD活力難以充分發(fā)揮，嚴(yán)重了影響了工程菌的表觀催化活力，降低了底物的轉(zhuǎn)化速率。因此，有效改善細(xì)胞壁和細(xì)胞膜對底物的傳質(zhì)阻力來提高GAD工程菌的催化活力對于制備GABA具有重要意義。
[0005]細(xì)胞透性化技術(shù)(cell permeabilization)可以在不造成細(xì)胞裂解以及不破壞細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的情況下改善細(xì)胞的通透性，使得小分子物質(zhì)和一些較大分子物質(zhì)能夠自由地進(jìn)出細(xì)胞，從而提高菌體的表觀催化活力。采用有機(jī)溶劑或者表面活性劑等透性化試劑或者超聲、反復(fù)凍融等物理方法來制備透性化細(xì)胞，雖然可以有效提高菌體表觀催化活力，但也存在著一些不利因素。如化學(xué)透性化試劑的加入往往會造成細(xì)胞的過度裂解，有機(jī)溶劑的添加會造成有毒試劑的殘留，同時由于有機(jī)溶劑的揮發(fā)性，對于工業(yè)化生產(chǎn)的安全防護(hù)要求高，而表面活性劑的加入會給下游產(chǎn)品的純化帶來不利影響。凍融法、超聲處理法等存在設(shè)備投入高，且不易放大等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種制備透性化谷氨酸脫羧酶工程菌的方法，簡便、成本低，易于操作，可有效提高菌體的谷氨酸脫羧酶表觀催化活力。
[0007]一種制備透性化谷氨酸脫羧酶工程菌的方法，包括:
[0008]將已表達(dá)谷氨酸脫羧酶的谷氨酸脫羧酶工程菌菌體懸浮于水或緩沖液中，50~70°C處理5~40min后，收集菌體，得到所述的透性化谷氨酸脫羧酶工程菌；
[0009]其中，所述的谷氨酸脫羧酶工程菌包括宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的谷氨酸脫羧酶基因，所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
[0010]谷氨酸脫羧酶工程菌首先進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)后，使谷氨酸脫羧酶表達(dá)，然后對谷氨酸脫羧酶工程菌菌體進(jìn)行熱處理，并控制處理溫度和時間，使菌體的細(xì)胞壁、膜的結(jié)構(gòu)、流動性發(fā)生適當(dāng)?shù)母淖儯赃_(dá)到改善細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，減小底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)限制，提高菌體表觀催化活力的目的。
[0011]所述的谷氨酸脫羧酶工程菌通過常規(guī)的基因工程技術(shù)得到，一般先將谷氨酸脫羧酶基因引入表達(dá)載體，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體，再將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。其中，表達(dá)載體可以為 pET-28a、pET-29、pET-30、pET-34、pRSET 等。
[0012]本申請中，所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌，具體可以為(E.coli) BL21、大腸桿菌(E.coli) BLR、大腸桿菌(E.coli) Origam1、大腸桿菌(E.coli) NovaBlue 或大腸桿菌(E.coli) Rosetta 等。
[0013]所述的谷氨酸脫羧酶基因源自保藏編號為CGMCC N0.1306的短乳桿菌(Lactobacillus brevis),該菌種的谷氨酸脫羧酶基因(gadB)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有較好的熱穩(wěn)定性，在70°C仍具有催化活性，采用該谷氨酸脫羧酶可減少熱處理對酶活力的不利影響。
[0014]在進(jìn)行熱處理前，先要將谷氨酸脫羧酶工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，使谷氨酸脫羧酶表達(dá)，誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法可采用常規(guī)技術(shù)，一般是將所述的谷氨酸脫羧酶工程菌接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)獲取種子液，然后將種子液接種至培養(yǎng)基中搖培至0D_0.6~0.8，加入誘導(dǎo)劑后，再培養(yǎng)一段時間即可。
[0015]水或緩沖液能夠為菌體提供溫和的環(huán)境，其中緩沖液的種類沒有嚴(yán)格要求，可以為磷酸緩沖液、醋酸緩沖液 等等。一般，所述緩沖液的濃度為0.05~0.25M，pH為4.0~
7.0，優(yōu)選的，濃度為0.2M，pH為4.8。
[0016]處理的溫度和時間至關(guān)重要，溫度過低或時間過短會導(dǎo)致處理達(dá)不到理想的效果，而溫度過高或時間過長則可能導(dǎo)致谷氨酸脫羧酶失活。優(yōu)選的，所述處理的溫度為60~70°C，所述處理的時間為10~30min。
[0017]本發(fā)明還提供了所述方法制備得到的透性化谷氨酸脫羧酶工程菌。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0019](I)本發(fā)明通過將GAD工程菌在50_70°C溫度下處理來改善菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜對底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)限制，使胞內(nèi)的GAD活性得到充分發(fā)揮，提高工程菌的表觀GAD催化活力。
[0020]與化學(xué)法相比，首先，本發(fā)明的方法不需要添加任何有機(jī)溶劑或者表面活性劑等透性化試劑，不僅操作上更簡單，同時也避免了有毒物質(zhì)的引入，不會對下游產(chǎn)品(GABA)的品質(zhì)造成影響，也簡化了透性化試劑的添加，也就降低了成本，其次，本發(fā)明的方法易于控制，通過控制適宜的溫度和時間即可，能夠避免透性化試劑對細(xì)胞的過度裂解。
[0021]本發(fā)明的方法與目前的物理法如凍融法、超聲處理法相比仍具有較好的優(yōu)勢。凍融法是將細(xì)胞反復(fù)凍融，細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高引起細(xì)胞溶脹而提高通透性，反復(fù)凍融對細(xì)胞的傷害較大，易造成胞內(nèi)酶的泄漏，同時凍融法對設(shè)備投資要求高，本申請僅通過短時的一次性加熱處理，可克服該缺陷。對設(shè)備投入要求低。
[0022]超聲法是利用短時間、低功率的超聲波處理提高細(xì)胞通透性，超聲波的強(qiáng)度不合適極易造成細(xì)胞的崩解而降低其存活率，且超聲產(chǎn)生的熱量也極易使酶失活。本發(fā)明的方法更加溫和，也更加容易控制，可克服上述超聲處理的缺陷，同時也避免超聲對人體造成的傷害。
[0023]另外，本發(fā)明的方法需要的設(shè)備簡單。
[0024]因此，與現(xiàn)有的方法相比，本發(fā)明的方法更加簡單、環(huán)保、易于控制和操作，成本也更低，更加易于工業(yè)化應(yīng)用。
[0025](2)本發(fā)明的方法能夠有效提高菌體的谷氨酸脫羧酶表觀催化活力，與未經(jīng)過透性化處理的GAD工程菌相比，透性化GAD工程菌菌體的表觀催化活力可提高13倍，且未發(fā)生酶泄漏情況。這為工業(yè)化生產(chǎn)GABA提高一種高活力、廉價的生物催化劑，有助于降低GABA大規(guī)模生物制備的生產(chǎn)成本。
[0026](3)透性化GAD工程菌可以看作是一種不溶性GAD酶源，與傳統(tǒng)方法固定化酶有相似用途，透性化GAD工程菌甚至可以用已知的各種固定化完整細(xì)胞的方法進(jìn)行固定化。本發(fā)明的方法得到的透性化GAD工程菌經(jīng)固定化后能更好地保持穩(wěn)定性。
【具體實施方式】
[0027]下面結(jié)合【具體實施方式】進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。
[0028]實施例1
[0029]菌種:工程菌E.coli BL2I (DE3)/pET28a_gadB(可參見“Cloning, sequencing andexpression of a glutamate decarboxylase gene from the GABA—producing strainLactobacillus brevis CGMCC1306, Annals of microbiology, 2012，62(2):689-698”)，其中，谷氨酸脫羧酶基因(gadB)源自保藏編號為CGMCC N0.1306的短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)。
[0030]從活化的LB固體培養(yǎng)基上挑取谷氨酸脫羧酶的工程菌(E.coli BL21(DE3)/pET28a-gadB)單克隆菌體接入含50 μ g.mL—1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，得種子液。將種子液按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種到含有卡那霉素(50μ g.mL-1)的LB液體培養(yǎng)基中，置于37°C，200r/min培養(yǎng)至OD6000.6-0.8時加入IPTG，使IPTG終濃度為0.5 μ M，30°C，150r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)6h。
[0031]實施例2
[0032]取Img (細(xì)胞干重)實施例1誘導(dǎo)培養(yǎng)后的工程菌，于4°C，1000Og離心5min收集菌體，用醋酸緩沖液(0.2M，pH4.8)清洗菌體1次，再用醋酸緩沖液(0.2M，pH4.8)懸浮菌體，在50°C下震蕩30min，在1000OXg下離心lmin，收集菌體，即為細(xì)胞壁和細(xì)胞膜透性改善的GAD工程菌(透性化GAD工程菌)。
[0033]一個酶活力單位定義為在37°C條件下，Imin生成I μ mo I GABA (IU=I μ mo I GABAinlmin at37°C )所需的酶量。GAD的比活力定義為每毫克干重細(xì)胞所具備的酶活力單位(U *mg_1cells, dry weight)。經(jīng)測定,透性化GAD工程菌菌體的表觀催化活力為1.59U/mg,與相同培養(yǎng)條件下未經(jīng)透性化處理的GAD工程菌菌體的表觀催化活力相比提高2.49倍(未經(jīng)透性化處理的GAD工程菌菌體的表觀催化活力為0.64U/mg),并且在透性化GAD工程菌菌體GAD活性測定中沒有發(fā)現(xiàn)酶泄漏情況。
[0034]實施例3
[0035]取Img (細(xì)胞干重)實施例1誘導(dǎo)培養(yǎng)后的工程菌，于4°C，1000Og離心5min收集菌體，用醋酸緩沖液(0.2M，pH4.8)清洗菌體I次，用醋酸緩沖液(0.2M，pH4.8)懸浮菌體，在70°C下震蕩lOmin，在1000O X g下離心lmin，收集菌體，即為細(xì)胞壁和細(xì)胞膜透性改善的GAD工程菌。
[0036]酶活力單位定義和比活力定義同實施例2。經(jīng)測定，透性化GAD工程菌菌體的表觀催化活力為6.37U/mg,與相同培養(yǎng)條件下未經(jīng)透性化處理的GAD工程菌菌體表觀催化活力相比提高9.96倍(未經(jīng)透性化處理的GAD工程菌菌體的表觀催化活力為0.64U/mg),并且在透性化GAD工程菌菌體GAD活性測定中沒有發(fā)現(xiàn)酶泄漏情況。
[0037]實施例4
[0038]取Img (細(xì)胞干重)實施例1誘導(dǎo)培養(yǎng)后的工程菌，于4°C，1000Og離心5min收集菌體，用醋酸緩沖液(0.2M，pH4.8)清洗菌體I次，用醋酸緩沖液(0.2M，pH4.8)懸浮菌體，在70°C下震蕩30min，在10000 X g下離心lmin，收集菌體，即為細(xì)胞壁和細(xì)胞膜透性改善的GAD工程菌。
[0039]酶活力單位定義和比活力定義同實施例2。經(jīng)測定，透性化GAD工程菌菌體的表觀催化活力為8.35U/mg,與相同培養(yǎng)條件下未處理的GAD工程菌菌體的表觀催化活力相比提高13.05倍(未經(jīng)透性化處理的GAD工程菌菌體的表觀催化活力為0.64U/mg),并且在透性化GAD工程菌菌體的GAD活性測定中沒有發(fā)現(xiàn)酶泄漏情況。
[0040]實施例5
[0041]取Img (細(xì)胞干重)實施例1誘導(dǎo)培養(yǎng)后的工程菌，于4°C，1000Og離心5min收集菌體，用醋酸緩沖液(0.2M，pH4.8)清洗菌體I次，用醋酸緩沖液(0.2M，pH4.8)懸浮菌體，在60°C下震蕩30min，在 10000 X g下離心lmin，收集菌體，即為細(xì)胞壁和細(xì)胞膜透性改善的GAD工程菌。
[0042]酶活力單位定義和比活力定義同實施例2。經(jīng)測定，透性化GAD工程菌菌體的表觀催化活力為6.37U/mg,與相同培養(yǎng)條件下未處理的GAD工程菌菌體的表觀催化活力相比提高9.96倍(未經(jīng)透性化處理的GAD工程菌菌體的表觀催化活力為0.64U/mg),并且在透性化GAD工程菌菌體的GAD活性測定中沒有發(fā)現(xiàn)酶泄漏情況。
[0043]對比例I
[0044]取Img (細(xì)胞干重)實施例1誘導(dǎo)培養(yǎng)后的工程菌，于4°C，1000Og離心5min收集菌體，用醋酸緩沖液(0.2M，pH4.8)清洗菌體I次，用醋酸緩沖液(0.2M，pH4.8)懸浮菌體，在80°C下震蕩30min，在10000 X g下離心lmin，收集菌體，即為細(xì)胞壁和細(xì)胞膜透性改善的GAD工程菌。
[0045]酶活力單位定義和比活力定義同實施例2。經(jīng)測定，透性化GAD工程菌菌體的表觀催化活力為0.62U/mg,與相同培養(yǎng)條件下未處理的GAD工程菌菌體的表觀催化活力相比反而降低(未經(jīng)透性化處理的GAD工程菌菌體的表觀催化活力為0.64U/mg)，其原因主要是GAD在80°C處理下失活。
[0046]對比例2
[0047]取Img (細(xì)胞干重)實施例1誘導(dǎo)培養(yǎng)后的工程菌，于4°C，1000Og離心5min收集菌體，用醋酸緩沖液(0.2M，pH4.8)清洗菌體I次，用醋酸緩沖液(0.2M，pH4.8)懸浮菌體，在37°C下震蕩30min，在10000 X g下離心lmin，收集菌體，即為細(xì)胞壁和細(xì)胞膜透性改善的GAD工程菌。[0048] 酶活力單位定義和比活力定義同實施例2。經(jīng)測定，透性化GAD工程菌菌體的表觀催化活力為0.60U/mg,與相同培養(yǎng)條件下未處理的GAD工程菌菌體的表觀催化活力沒有明顯變化(未經(jīng)透性化處理的GAD工程菌菌體的表觀催化活力為0.64U/mg)，其原因主要是該溫度下不能使大腸桿菌細(xì)胞被膜的透性發(fā)生變化。
【權(quán)利要求】
1.一種制備透性化谷氨酸脫羧酶工程菌的方法，其特征在于，包括: 將已表達(dá)谷氨酸脫羧酶的谷氨酸脫羧酶工程菌菌體懸浮于水或緩沖液中，50~70°C處理5~40min后，收集菌體，得到所述的透性化谷氨酸脫羧酶工程菌； 其中，所述的谷氨酸脫羧酶工程菌包括宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的谷氨酸脫羧酶基因，所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌(E.coli)BL21、大腸桿菌(E.coli) BLR、大腸桿菌(E.coli) Origam1、大腸桿菌(E.coli) NovaBlue或大腸桿菌(E.coli) Rosetta。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的谷氨酸脫羧酶基因源自短乳桿菌(Lactobacillus brevis)CGMCC1306。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的緩沖液為醋酸緩沖液或磷酸緩沖液。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的緩沖液的濃度為0.05~0.25M。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述處理的溫度為60~70°C。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述處理的時間為10~30min。
8.如權(quán)利要求1~7任一 項所述方法制備得到的透性化谷氨酸脫羧酶工程菌。
【文檔編號】C12N1/21GK103789246SQ201410005932
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】梅樂和, 趙偉睿, 胡升, 黃 俊, 雷引林, 姚善涇 申請人:浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院