一種人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測引物和探針、試劑盒及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測引物和探針、試劑盒及其用途。所述引物為SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2的序列；所述探針為SEQ?ID?NO:4的序列，其5’端單鏈堿基序列，其為與靶序列互補(bǔ)的5-10個(gè)堿基；中間13-20個(gè)堿基；3’端序列，為5-10個(gè)堿基序列；所述5’端單鏈堿基序列與3’端序列部分匹配成頸結(jié)構(gòu)；所述探針為頸環(huán)結(jié)構(gòu)，TM值=（頸環(huán)TM值+7）±1，5’端有18-25個(gè)堿基能夠和靶基因完全匹配，共約23-32bp；其5’端和3’端分別標(biāo)記熒光和非熒光淬滅基團(tuán)。本發(fā)明的引物和探針具有穩(wěn)定的線性結(jié)構(gòu)，用于檢測人巨細(xì)胞病毒核酸定量具有較低的熒光本底值、信噪比高和檢測靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】—種人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測引物和探針、試劑盒及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及體外診斷試劑。尤其涉及一種人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測引物和探針、試劑盒及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]人巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalo virus,HCMV)屬皰疫病毒科乙組皰疫亞科?，F(xiàn)有的人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測方法有一系列的問題，比如電鏡技術(shù)雖直接、客觀，但對(duì)病毒滴度要求高，設(shè)備昂貴，并且需要熟練的技術(shù)人員，因此檢測價(jià)值較低。病毒分離由于技術(shù)要求高，分離時(shí)間長，易污染的缺點(diǎn)也不易于大量開展。用常規(guī)PCR檢測CMV-DNA，具有簡便、快捷等特點(diǎn)。但是由于擴(kuò)增后的產(chǎn)物需電泳檢測，易造成交叉污染出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。
[0003]突光定量PCR是(realtimefluores-cence quantitative PCR, RTFQ PCR)是 1996年由美國Applied Biosystems公司推出的一種新定量試驗(yàn)技術(shù),它是通過突光染料或突光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品模板的初始濃度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種具有穩(wěn)定的線性結(jié)構(gòu)的引物和探針，還在于提供一種具有較低的熒光本底值、信噪比高和檢測靈敏度高的人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述 目的，本發(fā)明提供一種人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測的引物和探針，其特征在于，所述引物為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列；所述探針的序列為--從5’端起，與靶序列互補(bǔ)的5-10個(gè)堿基的單鏈堿基序列；中間13-20個(gè)堿基的環(huán)狀結(jié)構(gòu)序列；3’端的5-10個(gè)堿基序列；所述5’端的與靶序列互補(bǔ)的5-10個(gè)堿基與3’端的5-10個(gè)堿基序列部分匹配成頸結(jié)構(gòu)；所述探針成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，同時(shí)探針TM值=(頸環(huán)TM值+7)±1，探針5’端有18-25個(gè)堿基能夠和靶基因完全匹配，探針序列約23-32bp ;所述探針5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記非熒光淬滅基團(tuán)。
[0006]所述探針序列為SEQ ID NO:4的序列。
[0007]所述探針序列5’端標(biāo)記FAM基團(tuán)，3’端標(biāo)記Dabcyl非熒光淬滅基團(tuán)。
[0008]本發(fā)明還保護(hù)一種人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，包括上述的任一引物和探針。
[0009]還包括如下成分，樣本提純?cè)噭?，PCR擴(kuò)增試劑、參考品試劑和HCMV定量標(biāo)準(zhǔn)品。
[0010]所述樣本提純?cè)噭榱呀庖骸⑾礈煲汉椭貜?fù)洗滌液；所述裂解液成分為Trizirn*HC1、二氧化娃、Triton X_100、EDTA.2Na、異硫氰酸胍；所述洗漆液為Trizma?.HCl、TritonX-100、EDTA *2Na、異硫氰酸胍；所述重復(fù)洗滌液為TH HCl、Triton X_100、EDTA.2Na ；所述PCR擴(kuò)增試劑為HCMV PCR反應(yīng)管和HCMV反應(yīng)緩沖液；所述參考品試劑為HCMV陰性對(duì)照、HCMV臨界陽性對(duì)照，HCMV強(qiáng)陽性對(duì)照；優(yōu)選的，所述裂解液為10mMPH7.0 Trizma^;HCl,I重量％。二氧化硅、I體積％。Triton X-1OOUOmM EDTA *2Na、2M異硫氰酸胍；所述洗滌液為10mMPH7.0 TrizieaS HClU體積％。Triton X-1OOUmM EDTA *2Na、2M異硫氰酸胍；所述重復(fù)洗滌液為 10mMPH7.0 Trizma* HCl、I 體積％。Triton X-1OOUmM EDTA.2Na ;所述 HCMV PCR反應(yīng)管含有2U Taq酶、0.01U UNG酶、0.1mM EDTA.2Na、25微升石蠟油；HCMV反應(yīng)緩沖液為 IOpM HCMV 引物，5pM HCMV 探針、20mMPH9.0 Trizma?丨 HCl、50mM KCl、1.5mM MgC12、0.1mMEDTA.2Na、0.2mM dNtps。
[0011]本發(fā)明還提供一種應(yīng)用所述引物和探針或所述試劑盒進(jìn)行人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測方法，其特征在于，包括如下步驟，
[0012]樣品制備；制備得到純化的核酸；
[0013]PCR擴(kuò)增和熒光值讀取，采用權(quán)利要求1-3任一引物和探針或權(quán)利要求4的試劑盒;
[0014]結(jié)果判定。
[0015]所述樣品制備為取0.5mL離心管加入裂解液100 μ L然后加入待測樣本50 μ L，混懸，室溫靜置10分鐘進(jìn)行裂解；10000g離心25秒，去上清；加入150 μ L洗滌液對(duì)所得到的沉淀進(jìn)行洗滌，混懸，1000Og離心25秒，去上清；加入150 μ L重復(fù)洗滌液，混懸，1000Og離心25秒，去上清備用，純化得到的沉淀即為核酸；所述裂解液為10mMPH7.0TriziieflHClU重量％。二氧化硅、I體積％。Triton X-1OOUOmM EDTA.2Na、2M異硫氰酸胍；所述洗滌液為10mMPH7.0 Trizma?:HCl、l 體積％。Triton X-1OOUmM EDTA.2Na、2M 異硫氰酸胍；所述重復(fù)洗滌液為 10mMPH7.0 Trizma?: HClU 體積％。Triton X-1OOUmM EDTA.2Na。
[0016]所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 °C 5分鐘，95 °C 10分鐘；進(jìn)入以下循環(huán):95 °C 15秒，580C 50秒，共40循環(huán)；所述熒光值讀取為在PCR擴(kuò)增每個(gè)循環(huán)的58°C，30秒時(shí)。
`[0017]所述結(jié)果判定為:
[0018]如果檢測樣本中病毒載量為5.0X 102Copies/mL ( HCMV DNA ( 5.0 X IO8Copies/HiL判斷為陽性，直接報(bào)告定量結(jié)果；
[0019]如果檢測樣本中病毒載量為> 5.0X 108Copies/mL,判斷為陽性，報(bào)告為>5.0X 108Copies/mL ；
[0020]如果檢測樣本中病毒載量為OCopies/ml,判斷為陰性,報(bào)告為0.0Copies/ml ；
[0021]如果檢測樣本中病毒載量為< 5.0X102Copies/mL，Copies數(shù)僅供參考，建議重新檢測。
[0022]樣本提純?cè)噭┯糜谔崛∪司藜?xì)胞病毒樣本中的核酸，所提取的核酸可以直接用于熒光定量PCR。
[0023]制備的核酸分別用反應(yīng)緩沖液30 μ L融解，取25 μ L依次加入反應(yīng)管中，混勻，稍微離心，置入熒光PCR擴(kuò)增儀內(nèi)。擴(kuò)增曲線通過連接于PCR擴(kuò)增儀的終端電腦獲取，用于分析是否感染人巨細(xì)胞病毒。
[0024]參考品用于檢測核酸提取過程和PCR擴(kuò)增過程是否正常進(jìn)行。
[0025]本發(fā)明的試劑盒具體可以包括:
[0026]樣本提純?cè)噭?br> [0027]裂解液1.1mL/支，2支；[0028]洗滌液1.6mL/支，2支；
[0029]重復(fù)洗滌液，1.6mL/支，2支；
[0030]PCR擴(kuò)增試劑:
[0031 ] HCMV PCR 反應(yīng)管，2 μ L/ 支，20 支；
[0032]HCMV反應(yīng)緩沖液，350 μ L/支，2支；
[0033]參考品試劑:
[0034]HCMV 陰性對(duì)照，165 μ L/ 支，I 支；
[0035]HCMV臨界陽性對(duì)照，165 μ L/支，I支；
[0036]HCMV強(qiáng)陽性對(duì)照，165 μ L/支，I支。
[0037]HCMV定量標(biāo)準(zhǔn)品，165 μ L/支，共5支。
[0038]具體的:
[0039]HCMV陰性對(duì)照:生理鹽水；
[0040]HCMV臨界陽性對(duì)照:生理鹽水、5.0 X 103copies/mL的HCMV質(zhì)粒；
[0041]HCMV強(qiáng)陽性對(duì)照:生理鹽水、5.0X 107copies/mL的HCMV質(zhì)粒。
[0042]HCMV定量標(biāo)準(zhǔn)品見表2
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測的引物和探針，其特征在于，所述引物為SEQ IDNO:1和SEQ ID NO: 2的序列；所述探針的序列從5’端起，與靶序列互補(bǔ)的5_10個(gè)堿基的單鏈堿基序列；中間13-20個(gè)堿基的環(huán)狀結(jié)構(gòu)序列；3’端的5-10個(gè)堿基序列；所述5’端的與靶序列互補(bǔ)的5-10個(gè)堿基的單鏈堿基序列與3’端的5-10個(gè)堿基序列部分匹配成頸結(jié)構(gòu)；所述探針成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，同時(shí)探針TM值=(頸環(huán)TM值+7)±1，探針5’端有18-25個(gè)堿基能夠和靶基因完全匹配，探針序列約23-32bp ;所述探針5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記非熒光淬滅基團(tuán)。
2.權(quán)利要求1的人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測的引物和探針，其特征在于，所述探針序列為SEQ ID NO:4的序列。
3.權(quán)利要求1或2的人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測的引物和探針，其特征在于，所述探針序列5’端標(biāo)記FAM基團(tuán)，3’端標(biāo)記Dabcyl非熒光淬滅基團(tuán)。
4.一種人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1-3的任一引物和探針。
5.權(quán)利要求4的人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，還包括如下成分，樣本提純?cè)噭琍CR擴(kuò)增試劑、參考品試劑。
6.權(quán)利要求5的人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，所述樣本提純?cè)噭榱呀庖?、洗滌液和重?fù)洗滌液；所述裂解液成分為TrizmafflHCl、二氧化硅、TritonX-100、EDTA *2Na、異硫氰酸胍；所述洗滌液為 TrimaP HCl、Triton X-100、EDTA.2Na、異硫氰酸胍；所述重復(fù)洗滌液為Triz!ua?: HC1、Triton X-100、EDTA.2Na ;所述PCR擴(kuò)增試劑為HCMV PCR反應(yīng)管和HCMV反應(yīng)緩沖液；所述參考品試劑為HCMV陰性對(duì)照、HCMV臨界陽性對(duì)照，HCMV強(qiáng)陽性對(duì)照和HCMV定量標(biāo)準(zhǔn)品；優(yōu)選的，所述裂解液為10mMPH7.0 Trizim^iHCl,I重量％。二氧化硅、I體積％。Triton X-1OOUOmM EDTA *2Na、2M異硫氰酸胍；所述洗滌液為10mMPH7.0 Trizma?iHCl 、l 體積％。Triton X-1OOUmM EDTA *2Na、2M 異硫氰酸胍；所述重復(fù)洗滌液為 10mMPH7.0 T rizma*: HCl、I 體積％。Triton X-1OOUmM EDTA.2Na ;所述 HCMV PCR反應(yīng)管含有2U Taq酶、0.01U UNG酶、0.1mM EDTA.2Na、25微升石蠟油；HCMV反應(yīng)緩沖液為 IOpM HCMV 引物，5pM HCMV 探針、20mMPH9.0 Trizma*]HC1,5OmM KC1、1.5mM MgC12、0.1mMEDTA.2Na、0.2mM dNtps。
7.一種應(yīng)用權(quán)利要求1-3任一引物和探針或權(quán)利要求4的試劑盒進(jìn)行人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測方法，其特征在于，包括如下步驟， 樣品制備；制備得到純化的核酸； PCR擴(kuò)增和熒光值讀取，采用權(quán)利要求1-3任一引物和探針或權(quán)利要求4的試劑盒； 結(jié)果判定。
8.權(quán)利要求7的人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測方法，其特征在于，所述樣品制備為取，0.5mL離心管加入裂解液100 μ L，然后加入待測樣本50 μ L，混懸，室溫靜置10分鐘進(jìn)行裂解；10000g離心25秒，去上清；加入150 μ L洗滌液對(duì)所得到的沉淀進(jìn)行洗滌，混懸，1000Og離心25秒，去上清；加入150 μ L重復(fù)洗滌液，混懸，1000Og離心25秒，去上清備用，純化得到的沉淀即為核酸；所述裂解液為10mMPH7.0 Tii zma* HCl、I重量％。二氧化硅、I體積％。Triton X-1OOUOmM EDTA.2Na、2M 異硫氰酸胍;所述洗滌液為 10mMPH7.0 Triznia*HClU體積％。Triton X-1OOUmM EDTA.2Na、2M異硫氰酸胍；所述重復(fù)洗滌液為.10mMPH7.0 Trizma*] HCl、I 體積％? Triton X-1OOUmM EDTA.2Na。
9.權(quán)利要求8的人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?80C 5分鐘，95°C 10分鐘；進(jìn)入以下循環(huán):95°C 15秒，58°C 50秒，共40循環(huán)；所述熒光值讀取為在PCR擴(kuò)增每個(gè)循環(huán)的58°C，30秒時(shí)。
10.權(quán)利要求8的人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測方法，其特征在于，所述結(jié)果判定為: 如果檢測樣本中病毒載量為 5.0X 102Copies/mL ≤ HCMV DNA ≤ 5.0 X 108Copies/mL 判斷為陽性，直接報(bào)告定量結(jié)果； 如果檢測樣本中病毒載量為> 5.0X 108CopieS/mL，判斷為陽性，報(bào)告為>.5.0X 108Copies/mL ； 如果檢測樣本中病毒載量為OCopies/ml,判斷為陰性,報(bào)告為0.0Copies/ml ；如果檢測樣本中病毒載量為< 5.0X102Copies/mL，Copies數(shù)僅供參考，建議重新檢測。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103805713SQ201410007284
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年1月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月8日
【發(fā)明者】魏超, 林家旺, 魏劭 申請(qǐng)人:廈門安普利生物工程有限公司