一組芽孢桿菌屬（Bacillus）菌種檢測(cè)探針的制作方法
【專利摘要】一組芽孢桿菌屬（Bacillus）菌種檢測(cè)探針，屬于核酸檢測(cè)領(lǐng)域。具體包括三條相互關(guān)聯(lián)的寡核苷酸探針：用于特異性結(jié)合芽孢桿菌屬的16SrRNA的分析探針、用于結(jié)合在載體上并與分析探針特異性結(jié)合的捕獲探針以及用于與分析探針特異性結(jié)合的信號(hào)探針。分析探針具有如SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列；捕獲探針具有如SEQ?ID?NO:2所示的核苷酸序列，具有生物素標(biāo)記；信號(hào)探針具有如SEQ?ID?NO:3所示的核苷酸序列，在5′端有異硫氰酸(FITC)標(biāo)記。在每毫升培養(yǎng)液B.subtilis菌體濃度在1.33×102-2.13×105范圍內(nèi)與檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度線性相關(guān)，R2=0.99741，而且特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性高、定性定量，可應(yīng)用到白酒等傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)過程中芽孢桿菌屬的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
【專利說明】—組芽孢桿菌屬(公C///M)菌種檢測(cè)探針
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明一組芽孢桿菌屬{Bacillus )菌種檢測(cè)探針，具體是針對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵(白酒、醬油、醋等發(fā)酵)中芽孢桿菌屬實(shí)現(xiàn)定性與定量檢測(cè)的特異性檢測(cè)探針，屬于核酸檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]芽孢桿菌屬細(xì)菌能在高溫下生長(zhǎng)，需氧或兼性厭氧，因此在白酒釀造過程中高溫厭氧的特殊環(huán)境中芽孢桿菌能大量繁殖，并且芽孢桿菌具有一定的水解蛋白質(zhì)和淀粉的能力，因此芽孢桿菌是白酒釀造過程中的優(yōu)勢(shì)菌種，且對(duì)于白酒獨(dú)特風(fēng)味形成有重要的貢獻(xiàn)。因此，研究芽孢桿菌屬在白酒發(fā)酵過程中的變化規(guī)律對(duì)于指導(dǎo)白酒生產(chǎn)有重要意義。由于白酒等傳統(tǒng)發(fā)酵過程是多種微生物混合發(fā)酵的結(jié)果，研究特定屬種的變化規(guī)律，需要定性定量的檢測(cè)方法，目前常用平板分離，PCR技術(shù)、變性梯度電泳、測(cè)序等技術(shù)，各個(gè)方法均具有一定的優(yōu)點(diǎn)和局限性，例如平板分離耗時(shí)耗力，僅能分析可培養(yǎng)微生物，定時(shí)定量PCR技術(shù)價(jià)格昂貴，對(duì)DNA純化效率有很高的要求，重復(fù)性難等。
[0003]國內(nèi)有報(bào)道用改進(jìn)的夾心雜交方法對(duì)海水中藻類、浸礦中功能菌進(jìn)行定性定量檢測(cè)，取得了較好的效果。如2004年上海交通大學(xué)李秀榮等根據(jù)尖刺擬菱形藻的rRNA的特異性序列設(shè)計(jì)了一組探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)該種藻的定性定量檢測(cè)。
[0004]但是由于白酒等傳統(tǒng)發(fā)酵中微生物種類繁多，大曲及酒醅取樣及處理困難，因此還未見用分子探針直接檢測(cè)樣品中芽孢桿菌屬細(xì)菌的高效檢測(cè)方法。
[0005]因此，需要提供一種芽孢桿菌檢測(cè)探針組合物，以快速定性定量檢測(cè)白酒等傳統(tǒng)發(fā)酵過程中芽孢桿菌屬細(xì)菌，且檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的主要目的就是針對(duì)以上存在的問題與不足，提供一組芽孢桿菌屬{Bacillus )菌種檢測(cè)探針，用于傳統(tǒng)發(fā)酵(白酒、醬油、醋等發(fā)酵)行業(yè)中，特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性高、定性定量。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述目的，通過對(duì)NCBI Genbank中芽孢桿菌屬{Bacillus^所有菌種的16S rRNA進(jìn)行對(duì)比，找到7段屬保守序列，將其進(jìn)行Blastn比對(duì)，在915-975區(qū)域得到了芽孢桿菌屬OfeciBm)的特異性序列。并根據(jù)這一特殊序列和夾心雜交方法設(shè)計(jì)出了一組芽孢桿菌屬菌種檢測(cè)探針，具體包括三條相互關(guān)聯(lián)的寡核苷酸探針:用于特異性結(jié)合細(xì)菌的rRNA的分析探針，用于結(jié)合在載體上并與所述分析探針特異性結(jié)合的捕獲探針，以及用于與所述分析探針特異性結(jié)合的信號(hào)探針；該檢測(cè)探針在每毫升培養(yǎng)液芽孢桿菌屬iBacillus)細(xì)菌菌體濃度在1.33X10^2.13X IO5范圍內(nèi)與檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度線性相關(guān)，R2 = 0.99741，而且特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性高、定性定量，應(yīng)用到白酒等傳統(tǒng)發(fā)酵中芽孢桿菌屬的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
[0008]分析探針具有SEQ ID N0:1所示的寡核苷酸序列，長(zhǎng)度為61nt，在進(jìn)行生物信息學(xué)比對(duì)分析時(shí)，該分析探針僅與屬細(xì)菌的16S rRNA 915-975區(qū)域核苷酸互補(bǔ)，進(jìn)行特異性結(jié)合，而與其他屬的rRNA之間存在I個(gè)或I個(gè)以上核苷酸的連續(xù)錯(cuò)配或者缺失，不能很好地配對(duì)；與其它屬無同源性，結(jié)合雙特異性核酸檢測(cè)方法，能夠分辨16Sr RNA中探針結(jié)合部分僅差一個(gè)堿基的近緣屬。
[0009]捕獲探針具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，長(zhǎng)度為24nt，該捕獲探針特異性結(jié)合于分析探針一端，在5’端標(biāo)記有生物素，并通過生物素-鏈霉親和素相互作用固定在所述載體上。
[0010]信號(hào)探針具有SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列，長(zhǎng)度為26nt，該信號(hào)探針在3'端具有分析探針互補(bǔ)區(qū)，與分析探針互補(bǔ)結(jié)合，在5'端有異硫氰酸FITC標(biāo)記。
[0011]本發(fā)明的這組探針可用于以SI酶保護(hù)分析和夾心雜交技術(shù)檢測(cè)樣品中是否存在芽孢桿菌屬(Mcillus)及其數(shù)量，所述的檢測(cè)過程包括下列步驟:
(1)將所述分析探針與所述rRNA雜交得到雜交產(chǎn)物:分析探針與rRNA分子雜交后形成DNA/RNA雜合體；
(2)在所述DNA/RNA雜合體產(chǎn)物中加入核酸SI酶消化處理得到消化產(chǎn)物:在SI酶的作用下，單鏈的DNA或RNA以及DNA/RNA雜合體的不匹配部分被消化，留下與目標(biāo)RNA分子數(shù)量上相等的DNA/RNA雜合體；
(3)對(duì)所述消化產(chǎn)物進(jìn)行變性處理得到變性產(chǎn)物:將DNA/RNA雜合體變性為DNA單鏈和RNA單鏈，變性方法可以采用該領(lǐng)域常用變性技術(shù)，例如熱變性方法，由于單鏈RNA非常不穩(wěn)定，很各易被RNA酶降 解掉；
(4)將所述變性產(chǎn)物與固定在載體上的所述捕獲探針雜交，然后洗滌；雜交后形成DNA/DNA雜合體，洗滌是為了除去非特異性吸附；
(5)加入所述信號(hào)探針與所述分析探針雜交，然后洗滌；雜交后形成夾心雜交復(fù)合體，洗滌同樣是為了除去非特異性吸附；
(6)加入帶酶標(biāo)記的抗所述蛋白標(biāo)記的抗體與所述蛋白標(biāo)記進(jìn)行雜交，然后洗滌；
(7)加入所述酶標(biāo)記的底物以顯色。
[0012]本發(fā)明的有益效果:該芽孢桿菌屬菌種檢測(cè)探針設(shè)計(jì)巧妙，可以快速定性定量檢測(cè)芽孢桿菌屬OfeciBm)細(xì)菌，且檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
[0013](I)特異性好:由于傳統(tǒng)發(fā)酵過程是多種微生物混合發(fā)酵的過程，對(duì)于特定菌種的檢測(cè)就較為困難。本發(fā)明根據(jù)芽孢桿菌屬(&ci77m)的16S rRNA序列中的特異序列作為革巴序列，設(shè)計(jì)的一組探針，特異性聞，對(duì)芽抱桿菌屬(ifedJJiAs)細(xì)菌的DNA相關(guān)序列具有聞度專一性而對(duì)其他屬細(xì)菌不具有同源性。
[0014](2)靈敏度好:本發(fā)明采用分析探針可以特異性識(shí)別靶序列，最后通過一系列反應(yīng)顯色，建立吸光度與菌濃之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確度可達(dá)90%以上，大大提高了檢測(cè)精準(zhǔn)度。最低檢測(cè)限可達(dá)133個(gè)/mL。
[0015](3)穩(wěn)定性高:由于檢測(cè)過程中設(shè)計(jì)的分析探針會(huì)將菌體內(nèi)不穩(wěn)定的RNA信號(hào)轉(zhuǎn)化為等量的DNA信號(hào)，將保證RNA分子在整個(gè)過程不被降解，其他步驟均是針對(duì)DNA進(jìn)行的，從而大大提聞了檢測(cè)的穩(wěn)定性。
[0016](4)定性定量:本探針對(duì)芽孢桿菌屬OfeciBm)高度專一，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到對(duì)芽孢桿菌屬iMcillus)細(xì)菌的定量檢測(cè)，打破傳統(tǒng)方法的局限性，真正做到了對(duì)芽孢桿菌屬(Mcillus、細(xì)菌的定性定量檢測(cè)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1用本發(fā)明的檢測(cè)探針檢測(cè)白酒發(fā)酵中其他屬細(xì)菌的檢測(cè)結(jié)果比較。
[0018]圖2用本發(fā)明的檢測(cè)探針檢測(cè)芽孢桿菌屬細(xì)菌漢subtilis的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0019]為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說明，目的在于更好理解本發(fā)明的內(nèi)容而非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在本實(shí)施例中，采用特異性探針對(duì)芽孢桿菌屬iBacillus)細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，制作其標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)其特異性進(jìn)行驗(yàn)證。
[0020]1.1芽孢桿菌屬16S rRNA特定區(qū)域探針的設(shè)計(jì)與合成
將Genbank中已有的芽孢桿菌屬所有菌種的16S rRNA保守序列進(jìn)行比對(duì)，找到芽孢桿菌屬的保守序列，將其進(jìn)行Blastn分析，確定915-975區(qū)域?yàn)檠挎邨U菌屬特異序列，而與其他屬核苷酸無同源性，確定為特征區(qū)域，設(shè)計(jì)分析探針為:5’-AACGCTTGCC ACCTACGTATTACCGCGGCT GCTGGCACGT
AGTTAGCCGT GGCTTTCTGG T-3’ (見 SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列)；
根據(jù)上述探針設(shè)計(jì)合成檢測(cè)所需其他探針:
捕獲探針為 5’-ACCAGAAAGC CACGGCTAAC TACG-3’(見 SEQ ID NO:2 所示的核苷酸序列)，與分析探針的3’端互補(bǔ)`，在5’端有生物素(Biotin)標(biāo)記；
信號(hào)探針為 5’ -GCGGTAATAC GTAGGTGGCA AGCGTT-3’(見 SEQ ID NO:3 所示的核苷酸序列)，與分析探針的5’端互補(bǔ)，在3’端有異硫氰酸(FITC)標(biāo)記。
[0021]1.2準(zhǔn)備階段
1.2.1鏈霉親和素包被板制備:
鏈霉親和素用包被液配成5μ g/mL,向微孔板各孔內(nèi)加入IOOpL,用封口膜封好后于4°C過夜，次日取出，用PBST洗滌液洗滌3次，再用0.1%BSA(0.01mol/L PBS pH7.2)250yL,在37°C下封閉60min，最后用PBST洗滌液洗滌3次，干燥后封好于4°C下保存待用，可保存2月。
[0022]1.2.2捕獲探針固定化:
IOOyL (500nM溶于pH7.2 PBS)捕獲探針加入鏈霉素包被微孔板，于37°C下保溫2h，并用洗滌液PBST沖洗3次，隨后儲(chǔ)存于4°C下。
[0023]1.2.3菌株胞內(nèi)物質(zhì)獲取:
取對(duì)數(shù)期裂解枯草芽孢桿菌(漢subtilis)顯微鏡計(jì)數(shù)計(jì)算菌濃，取2mL離心(2000r/min,2min),取上清液離心(12000r/min, IOmin),除去上清液,加2mL裂解緩沖液(80%甲酞月安，450mM NaCl, 5mM Na2EDTA, lmg/mL yeast tRNA, 1% SDS，pH6.4)并超聲破碎(50% 占空比，共8min)，收集濾液待用。
[0024]進(jìn)行枯草芽孢桿菌的檢測(cè)曲線分析時(shí)，將過濾收集到的枯草芽孢桿菌樣品用含有SI酶保護(hù)分析探針的裂解液2倍逐級(jí)稀釋11次共獲得12個(gè)樣品。[0025]進(jìn)行芽孢桿菌的特異性驗(yàn)證時(shí)，將其他白酒發(fā)酵中細(xì)菌:葡萄球菌，假單胞菌、醋桿菌屬細(xì)菌分別進(jìn)行上述處理作為對(duì)照。
[0026]1.3 RNA信號(hào)轉(zhuǎn)化階段
1.3.1分析探針與目標(biāo)序列結(jié)合
加入100 μ L枯草芽孢桿菌樣品，50 μ L礦物油，15 μ L 500nmol/L的分析探針(采用上述裂解緩沖液稀釋)，95°C水浴處理15min，37°C水浴處理lh。
[0027]1.3.2核酸SI酶消化處理
加入 100μ L 的核酸 SI 酶(100U 于 1.4M NaCl, 22.5mM ZnS04、250mM CH3COONa^pH 4.5)，40°C水浴處理30 min。
[0028]1.3.3 DNA/RNA 變性反應(yīng)
加入 500 μ L 終止緩沖液(62.5mM Na0H、30mM EDTA、0.5M PBS、ρΗ7.2)，95 °C 處理 15min, DNA-RNA雜合體變性形成單鏈DNA和單鏈RNA。與此同時(shí)，單鏈RNA被降解，因此溶液中僅含結(jié)合于靶序列的分析探針。
[0029]1.4夾心雜交階段
1.4.1捕獲探針捕獲分析探針
將100 μ L上述反應(yīng)混合液分別移入到預(yù)固定有捕獲探針的酶標(biāo)板微孔中，50°C雜交I小時(shí)，然后用PH7.2,0.01mol/L的PBS緩沖液洗滌三次。
`[0030]1.4.2形成夾心雜交
每孔加入含有100 μ L 500ηΜ連接探針的雜交緩沖液(4XSSC、10%甲酞胺、0.02%SDS、ρΗ7.2)，于 50°C雜交 30 min，用 0.lmol/L, pH7.2 PBS 洗滌三次。
[0031]1.5信號(hào)檢測(cè)階段
1.5.1抗熒光素抗體結(jié)合信號(hào)探針
每孔加入100 μ L含有標(biāo)記了辣根過氧化物酶的抗熒光素抗體(1:5000稀釋于PBS，
0.1%牛血清白蛋白)，37°C保溫30 min，然后用PBS洗4次。
[0032]1.5.2 顯色
每孔加入TMB顯色液(用無水乙醇，將TMB配成1%濃度，4 V保存半年以內(nèi)使用。使用前，用pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖液9.9mL加入0.1mL 1% TMB液，再按每毫升TMB加入30 %的H2O2 14 1^，混勻后立即使用)10(^1^，371:處理15 min后，每孔加入100 μ L 2mol/L硫酸終止反應(yīng)。將酶標(biāo)板置于讀板機(jī)上于450nm和630nm測(cè)定光吸收值。
[0033]1.6 結(jié)果
檢側(cè)結(jié)果如圖1和圖2所示。
[0034]圖1顯示了用針對(duì)芽孢桿菌屬的檢測(cè)探針組合物探測(cè)各種白酒發(fā)酵中細(xì)菌的檢測(cè)結(jié)果，證明了本發(fā)明方法具有極高的可行性和特異性。本實(shí)驗(yàn)所用菌種的探針對(duì)應(yīng)序列比較見表1:
表1.NPA探針及各菌種16S rRNA目標(biāo)片段序列
【權(quán)利要求】
1.一組芽孢桿菌屬)菌種檢測(cè)探針，其特征在于包括三條相互關(guān)聯(lián)的寡核苷酸探針:用于特異性結(jié)合芽孢桿菌屬的16S rRNA的分析探針SEQ ID NO: 1，用于結(jié)合在載體上并與所述分析探針特異性結(jié)合的捕獲探針SEQ ID NO:2，以及用于與所述分析探針特異性結(jié)合的信號(hào)探針SEQ ID NO: 3 ;該檢測(cè)探針在每毫升培養(yǎng)液屬細(xì)菌菌體濃度在1.33X 102-2.13 X IO5范圍內(nèi)與檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度線性相關(guān)，R2 = 0.99741，而且特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性高、定性定量，可應(yīng)用到白酒傳統(tǒng)發(fā)酵過程中芽孢桿菌屬的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌屬OfeciBM)菌種檢測(cè)探針，其特征在于分析探針具有SEQ ID Ν0:1所示的核苷酸序列，長(zhǎng)度為61 nt，在進(jìn)行生物信息學(xué)比對(duì)分析時(shí)，該分析探針僅與屬的保守區(qū)域16S rRNA 915-975區(qū)域核苷酸互補(bǔ)，而與其它屬無同源性，結(jié)合雙特異性核酸檢測(cè)方法，能夠分辨16S rRNA中探針結(jié)合部分僅差一個(gè)堿基的近緣屬。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌屬OfeciBM)菌種檢測(cè)探針，其特征在于捕獲探針具有SEQ ID Ν0:2所示的核苷酸序列，長(zhǎng)度為24nt，該捕獲探針特異性結(jié)合于分析探針一端，在5’端標(biāo)記有生物素，并通過生物素-鏈霉親和素相互作用固定在所述載體上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌屬OfeciBM)菌種檢測(cè)探針，其特征在于信號(hào)探針具有SEQ ID Ν0:3所示的核苷酸序列，長(zhǎng)度為26 nt，該信號(hào)探針在3'端具有分析探針互補(bǔ)區(qū)，與分析探針互補(bǔ)結(jié)合，在5'端有`異硫氰酸FITC標(biāo)記。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103757107SQ201410007446
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月8日
【發(fā)明者】楊海麟, 王武, 辛瑜, 夏小樂, 張玲, 劉婷 申請(qǐng)人:江南大學(xué)