一種重組豬α干擾素的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明構(gòu)建并篩選獲得了一株可以高效分泌表達(dá)豬α干擾素的重組畢赤酵母菌株P(guān)oIFN-α/GS115，克服了以大腸桿菌表達(dá)和制備重組干擾素存在純化工藝復(fù)雜和生物學(xué)活性不高等問題，并建立了區(qū)別于傳統(tǒng)高密度發(fā)酵工藝的，適于目的基因高效表達(dá)的特有發(fā)酵工藝。該發(fā)酵工藝生產(chǎn)周期短，純化工藝簡單且成本低。
【專利說明】一種重組豬α干擾素的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種重組豬α干擾素的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬α干擾素(porcine interferon-a ,PoIFN-α )由豬白細(xì)胞產(chǎn)生的，約17個基因拷貝分布于I號染色體上，翻譯出至少20多個IFN-α亞型，迄今只有部分被克隆、測序和表達(dá)。因?yàn)镻oIFN-α具有良好的抗病毒活性，一直以來，人們嘗試著利用基因工程的方法克隆、表達(dá)重組豬 a 干擾素(recombinant porcine interferon- α , rPoIFN- α ),使其具有天然PoIFN-α的廣譜、高效的抗病毒活性。
[0003]IFN-α是一種生物蛋白，它可高效誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白(AVP)等效應(yīng)分子，AVP是一類酶類，作用無特異性，對多數(shù)病毒均有一定抑制作用。IFN-α既能在機(jī)體受感染的起始階段，中斷體內(nèi)受傳染細(xì)胞的病毒復(fù)制過程，限制病毒增殖、擴(kuò)散，在體液免疫、細(xì)胞免疫發(fā)生作用之前發(fā)揮重要的抗病毒作用，又能及時且高效地激活、協(xié)調(diào)體液免疫和細(xì)胞免疫。
[0004]rPoIFN-α是通過基因工程技術(shù)，將克隆獲得的PoIFN-α基因與載體連接，導(dǎo)入受體細(xì)胞，表達(dá)產(chǎn)生的一種PoIFN- α，它具有天然PoIFN- α抗病毒的廣譜性和高效性，已成為獸用生物制藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
[0005]基因工程菌的 密度發(fā)酵受諸多因素的影響和制約，主要表現(xiàn)在營養(yǎng)供給不適宜，生長抑制性物質(zhì)的積累，溶氧，PH值，發(fā)酵液流變學(xué)特性及培養(yǎng)方式選擇等。基因工程菌的高密度是在傳統(tǒng)發(fā)酵基礎(chǔ)上建立起來的，但卻需要有新的調(diào)控概念，而且基因工程菌的高密度培養(yǎng)并不意味著外源基因的高效表達(dá)，因而需要進(jìn)行深入的研究。以上這些因素都需要根據(jù)我們所表達(dá)的基因特性、菌種等進(jìn)行不斷的優(yōu)化，探索出一套適于目的基因高效表達(dá)的發(fā)酵工藝。
[0006]傳統(tǒng)的畢赤酵母高密度發(fā)酵工藝均為“先生長后誘導(dǎo)”的模式，即首先利用甘油為碳源，歷經(jīng)約36-48h的生長期，使得工程菌達(dá)到一個較高的密度，一般濕重可達(dá)250g/L，隨后用甲醇為誘導(dǎo)劑進(jìn)行約72-120h的誘導(dǎo)表達(dá)，最后菌體密度一般可達(dá)450g/L左右，整個發(fā)酵過程歷時108-168h。目前這種工藝為大部分人所應(yīng)用，但是它在產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的過程中卻存在中明顯的弊端，耗費(fèi)大量的人力物力。
[0007]我們在摸索適于目的基因高效發(fā)酵的發(fā)酵工藝過程中，進(jìn)行了多種方法(包括高密度發(fā)酵工藝)的嘗試，最終摸索出一套最適用本產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的不同于高密度發(fā)酵工藝流程的“邊生長邊誘導(dǎo)”的發(fā)酵模式。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種重組豬α干擾素的制備方法，該方法生產(chǎn)周期短、純化工藝簡單且成本低。
[0009]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明包括以下步驟:[0010](1)人工合成豬α干擾素基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母細(xì)胞中，獲得重組菌株；
[0011](2)發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)
[0012]a.種子培養(yǎng)；
[0013]b.將種子液接種于發(fā)酵罐中；
[0014]c.重組菌株在種子液和發(fā)酵表達(dá)培養(yǎng)基的混合液中生長2h_4h ;
[0015]d.以0.5ml/L/hr-2.5ml/L/hr的速度向發(fā)酵表達(dá)培養(yǎng)基中補(bǔ)加甲醇；
[0016]e.蛋白達(dá)到最大表達(dá)量后,收集表達(dá)液；
[0017](3)檢測重組豬α干擾素的活性。
[0018]進(jìn)一步地，所述人工合成的豬α干擾素基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0019]進(jìn)一步地，種子培養(yǎng)的具體方法為:將菌株接種于YB)培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，獲得一級種子液；取一級種子液，以1:100-1:200比例接種于BMGY培養(yǎng)基，培養(yǎng)至0D600達(dá)到25-30左右，獲得二級種子液。
[0020]進(jìn)一步地，步驟(2) b中，接種量為5%_10%。
[0021]進(jìn)一步地，步驟(2)d中，補(bǔ)加甲醇的優(yōu)選方法為:第I小時，以0.5ml/L/hr的速度補(bǔ)加甲醇；第2小時，以0.75ml/L/hr的速度補(bǔ)加甲醇?’第3小時，以1-1.5ml/L/hr的速度補(bǔ)加甲醇；第4小時，以1-1.5ml/L/hr的速度補(bǔ)加甲醇；第5小時，以1.5-1.8ml/L/hr的速度補(bǔ)加甲醇；第6小時，以1.5-1.8ml/L/hr的速度補(bǔ)加甲醇?’第7小時，以2_2.5ml/L/hr的速度補(bǔ)加甲醇；然后保持2ml/L/hr的速度直至達(dá)到蛋白最大表達(dá)量。
[0022]本發(fā)明采用“邊生長邊誘導(dǎo)”的發(fā)酵模式，相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下效果:
[0023]1、生產(chǎn)周期短。本發(fā)明是在蛋白表達(dá)與菌體生產(chǎn)之間尋找一個平衡點(diǎn)，并不要求菌體一定要達(dá)到很高的密度后再進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，同時省略補(bǔ)料生長期，因此整個生產(chǎn)周期較短，約為30-50h，而傳統(tǒng)的高密度發(fā)酵工藝一般需要108-168h連續(xù)不間斷的發(fā)酵，耗費(fèi)較大的人力物力；
[0024]2、純化工藝簡化。高密度發(fā)酵后發(fā)酵液中的菌體密度很高，需要經(jīng)過多次反復(fù)離心才能得到較為純凈的上清，而本發(fā)明的工藝流程，最終的菌體密度只有高密度發(fā)酵工藝的1/3左右，一般經(jīng)過一次離心即可獲得較為澄清的上清；
[0025]3、通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，縮短生產(chǎn)周期，簡化純化工藝，產(chǎn)品的成本相比高密度發(fā)酵工藝而言，可以下降20%-30%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為分泌型表達(dá)菌株P(guān)oIFN-a/GS115分別在0h、9h、20h、33h、44h、50h所得的蛋白上清的SDS PAGE圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。
[0028]本發(fā)明使用的真核酵母表達(dá)載體pPIC9K為商品化試劑,購于Invitrogen公司。
[0029]本發(fā)明使用的限制性內(nèi)切酶EcoRl、SnaBl、Sail、Pfu DNA聚合酶、DNA MarkerDL2000/15000、T4DNA 連接酶，RNA 酶抑制劑(Ribonuclease Inhibitor)等，均購自大連寶生物工程公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自上海博彩生物工程有限公司。分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白購自上海升正生物技術(shù)有限公司，IPTG、尿素等購自上海生工生物技術(shù)有限公司；酶聯(lián)葡萄球菌A蛋白(SPA)購自德國Calbiochem公司；蛋白胨和酵母提取物(OXID);YNB(Amresco公司)；生物素Biotin(BBI公司)；其余試劑為國產(chǎn)分析純。
[0030]本發(fā)明使用的培養(yǎng)基包括:(I)菌株保藏培養(yǎng)基(YPD):1%酵母浸出物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，1.5%瓊脂粉；(2)生長培養(yǎng)基(BMGY):1 %酵母浸出物，2%蛋白胨，1.34%YNB，4X10_5%生物素，1%甘油，IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH6.0) ;(3)發(fā)酵表達(dá)培養(yǎng)基(即改良的BMMY培養(yǎng)基):1 %酵母浸出物,2%蛋白胨，0.67%YNB，4 X 10、生物素，0.5-1.0 %甲醇，IOOmM磷酸鹽緩沖液(PH6.0)。
[0031]實(shí)施例1豬α干擾素基因的改造和人工合成
[0032]根據(jù)已測定的豬α干擾素基因序列和表達(dá)載體PPIC9K的多克隆位點(diǎn)(MCS)序列，人工合成豬α干擾素基因序列。使合成的豬α干擾素基因序列以酵母喜好密碼子為主。其序列如SEQ ID N0.1所示。
[0033]實(shí)施例2重組質(zhì)粒pPIC9K-PoIFN_ α的構(gòu)建及鑒定表達(dá)
[0034]1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0035]以人工合成的豬α干擾素基因?yàn)槟０?，以IFN-a -Pl和IFN-α -Ρ2為引物，利用Pfu DNA聚合酶擴(kuò)增得到的豬α干擾素基因，DNA產(chǎn)物為兩端不帶T的平端，以EcoR I酶切PCR產(chǎn)物使3'形成粘端。以SnaBl/EcoR I雙酶切表達(dá)載體pPIC9K，同樣形成5'端為平端，而3'形成粘端。將酶切后的豬α干擾素DNA片段和表達(dá)載體pPIC9K進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收并純化。
[0036]其中，引物IFN-`a-Pl序列如SEQ ID N0.2所示；引物IFN-α-Ρ2序列為如SEQ IDN0.3所示。
[0037]將豬α干擾素基因片段與表達(dá)載體pPIC9K連接，連接體系如下:豬α干擾素基因片段 5yL，表達(dá)載體 pPIC9K2.0yL，T4DNA Ligase0.5 μ L, IOXLigase buffer2.0 μ L，50%聚乙二醇40002.0 μ L，ddH20至20μ L，于14°C連接過夜或10h。用CaCl2法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，涂于含羧芐青霉素的培養(yǎng)基板上，37°C過夜。選取生長良好的轉(zhuǎn)化菌落，采用堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA，獲得重組質(zhì)粒。
[0038]2、重組質(zhì)粒的鑒定
[0039]采用pPIC9K質(zhì)粒載體特異性鑒定引物(5' a-factor,3; A0X1)，以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)立空質(zhì)粒PPIC9K的PCR擴(kuò)增體系為陰性對照。pPIC9K質(zhì)粒載體特異性鑒定引物如下:
[0040]上游通用引物5' a -factor: 5' -TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3'
[0041]下游通用引物3' AOXl:5, -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'
[0042]擴(kuò)增大小約為700bp，質(zhì)粒載體pPIC9K a-factor和:V AOX引物擴(kuò)增出的DNA條帶分子量較大(約多170bp)，這是由于載體特異性引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物除了目的基因外，還含有載體的基因片段。將該重組質(zhì)粒送IvotiOgen公司測序。結(jié)果表明目的DNA已正確插入載體PPIC9K中，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-PoIFN_a。
[0043]3、電轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞
[0044]將pPIC9K-PoIFN_a經(jīng)Sal I單酶切線性化后，電穿孔法轉(zhuǎn)化到畢赤酵母細(xì)胞P.pastoris GSl 15，取500 μ L轉(zhuǎn)化物涂布于MD平板上，置30°C溫箱中培養(yǎng)2_3d，直至菌落出現(xiàn)。將轉(zhuǎn)化后的重組菌株命名為PoIFN-a /GSl 15，_80°C保存。
[0045]4、重組菌株P(guān)oIFN-a/GSl 15的誘導(dǎo)表達(dá)
[0046]將PoIFN- a /GS115接種于YPD培養(yǎng)基，200r/min30°C搖床培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)24h的PoIFN-a /GS115菌液按1:50接種于裝有20mL BMGY培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，200r/min30°C振動培養(yǎng)36h。測定菌液0D600值，取適量菌液室溫2000r/min離心5min，收獲酵母細(xì)胞，接種于盛有25mL BMMY培養(yǎng)液250mL三角瓶中，最后使瓶中菌液0D600=1.0。每隔24h加入100%甲醇至終濃度為0.5%。分別于24、48、72、96、120h取樣lmL，_80°C保存，用于SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明PoIFN-a /GS115獲得表達(dá)，表達(dá)蛋白大小為15kD。
[0047]實(shí)施例3發(fā)酵培養(yǎng)
[0048](一)種子培養(yǎng)
[0049]1、一級種子:取_80°C保存的PoIFN_a/GS115菌，以1:250的比例接種，取200μ I左右接種于50mlYPD的500mL三角瓶中，220r/min30°C振動過夜培養(yǎng)；
[0050]2、二級種子:取一級種子液，以1:100-1:200的比例接種于BMGY培養(yǎng)液中，30°C，220rpm培養(yǎng)24h至0D600達(dá)到25-30左右。
[0051](二)上罐培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)
[0052]1、接種
[0053]按5%_10%比例將二級種子全部接入罐中，設(shè)定溶氧為30%，溶氧、攪拌、通氣關(guān)聯(lián)。
[0054]本階段所采用的發(fā)酵表達(dá)培養(yǎng)基為改良的BMMY培養(yǎng)基。改良后的ILBMMY的配方具體如下:
[0055]1% 酵母浸出物(Yeast extract) IOg
[0056]2% 胰蛋白胨(Tryptone) 20g
[0057]IOOmM 磷酸鉀緩沖液 PH6.0 100ml
[0058]加去離子水800ml，攪拌溶解后加入發(fā)酵罐中，加適量消泡劑，原位115°C高壓滅菌20min。冷卻至30°C后，無菌加入10 X YNB50ml，500 X生物素2ml，甲醇5ml。
[0059]由于BMMY中的碳源是甲醇，不適用于傳統(tǒng)的產(chǎn)業(yè)化的高密度發(fā)酵工藝中，而本發(fā)明基于“邊生長邊誘導(dǎo)”式發(fā)酵工藝可采用BMMY作為產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)基，同時對其進(jìn)行改良，減少YNB為原來濃度的50%，對于酵母菌的生長并不會產(chǎn)生影響，既可以節(jié)約成本同時不影響蛋白的表達(dá)。
[0060]2、過程控制
[0061]2.1甲醇甘油混合生長期
[0062]接種后，因種子液中含有少量的甘油，發(fā)酵培養(yǎng)基中含有一定量的甲醇，因此工程菌在此期間，會在含有甘油和甲醇兩種碳源的混合培養(yǎng)基中生長，此過程大約為2-4h。
[0063]2.2甲醇誘導(dǎo)
[0064]待發(fā)酵培養(yǎng)基中的甘油和甲醇消耗殆盡，表現(xiàn)為溶氧呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，或陡然上升至100%，開始補(bǔ)加甲醇，補(bǔ)加策略見表1:
[0065]表1甲醇補(bǔ)加速度
【權(quán)利要求】
1.一種重組豬α干擾素的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)人工合成豬α干擾素基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母細(xì)胞中，獲得重組菌株； (2)發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá) a.種子培養(yǎng)； b.將種子液接種于發(fā)酵罐中； c.重組菌株在種子液和發(fā)酵表達(dá)培養(yǎng)基的混合液中生長2h-4h； d.以0.5ml/L/hr-2.5ml/L/hr的速度向發(fā)酵表達(dá)培養(yǎng)基中補(bǔ)加甲醇； e.蛋白達(dá)到最大表達(dá)量后,收集表達(dá)液； (3)檢測重組豬α干擾素的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組豬α干擾素的制備方法，其特征在于，所述人工合成的豬α干擾素基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組豬α干擾素的制備方法，其特征在于，種子培養(yǎng)的具體方法為:將重組菌株接種于YPD培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，獲得一級種子液；取一級種子液，以I: 100-1:200比例接種于BMGY培養(yǎng)基，培養(yǎng)至0D600達(dá)到25-30左右，獲得二級種子液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組豬α干擾素的制備方法，其特征在于，步驟(2)b中，接種量為5%_10%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組豬α干擾素的制備方法，其特征在于，步驟(2)d中，補(bǔ)加甲醇的優(yōu)選方法為:第I小時，以0.5ml/L/hr的速度補(bǔ)加甲醇；第2小時，以.0.75ml/L/hr的速度補(bǔ)加甲醇；第3小時，以1_1.5ml/L/hr的速度補(bǔ)加甲醇；第4小時，以1-1.5ml/L/hr的速度補(bǔ)加甲醇；第5小時，以1.5-1.8ml/L/hr的速度補(bǔ)加甲醇；第6小時，以1.5-1.8ml/L/hr的速度補(bǔ)加甲醇?’第7小時，以2_2.5ml/L/hr的速度補(bǔ)加甲醇；然后保持2ml/L/hr的速度直至達(dá)到蛋白最大表達(dá)量。
【文檔編號】C12R1/84GK103695457SQ201410007650
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2014年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月7日
【發(fā)明者】王一成, 李寶臣, 袁秀芳, 藍(lán)勝芝, 張存, 李軍星, 徐麗華 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院