建立iPS的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種建立iPS的方法，該方法包括如下步驟：利用ficoll分離外周血單核細胞，紅系培養(yǎng)方法培養(yǎng)8天，將episomal的三個質(zhì)粒用lonza的Human?CD34+Cell?Kit電轉(zhuǎn)到單核細胞中，之后用vitrinectin處理的板子上培養(yǎng)，利用E6培養(yǎng)基培養(yǎng)12-15天后會看到克隆，20天左右將單克隆調(diào)到用vitrinectin處理的板子上用E8培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳代到10后鑒定。本發(fā)明建立在無插入的episomal技術上，無FBS，無feeder甚至是無動物源的iPS誘導和培養(yǎng)技術。
【專利說明】建立iPS的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種建立iPS細胞的方法，特別涉及一種在無插入的基礎上建立了無FBS,無Feeder無動物源的人iPS的方法。
【背景技術】
[0002]2006年，日本科學家Yamanaka的研究組將4種轉(zhuǎn)錄因子(0ct4/Sox2/Klf4/c-Myc)導入小鼠皮膚成纖維細胞，獲得了類似于胚胎干細胞的多能性干細胞，稱之為“誘導性多能性干細胞”(induced pluripotent stem cells, iPS 細胞)[1]。2007 年,Yamanaka 博士 [2]和美國Thomson博士研究組[3]分別用特定的因子誘導人類成纖維細胞，也使之成為了 iPS細胞。iPS細胞的分離培養(yǎng)成功是干細胞研究乃至生命科學領域的里程碑，它首次證明:可以用已知的幾種因子在體外逆轉(zhuǎn)已經(jīng)分化的細胞，使之成為全新的具有發(fā)育全能性的細胞，這項技術避免了干細胞研究領域的免疫排斥和倫理道德問題。
[0003]盡管近年來iPS技術不斷取得發(fā)展，各種改良技術時有出現(xiàn)。然而重編程效率低下一直都是科學家們頭疼的問題，成為了 iPS臨床轉(zhuǎn)化的重要障礙之一。經(jīng)典的利用病毒為載體將轉(zhuǎn)錄因子導入分化細胞的方法，很可能導致外源基因插入細胞的基因組中，引起插入突變，存在很大的弊端，iPS細胞的致瘤性影響其在再生醫(yī)學和臨床細胞治療中的應用[4]。轉(zhuǎn)錄因子c-Myc本身就是一種原癌基因。解析體細胞重編程過程中的分子調(diào)控機制，開發(fā)出高效安全的iPS技術成為了近年來干細胞領域研究人員的熱點。
[0004]供體細胞類型影響iPS細胞的形成效率和安全性。2008年，Yamanaka博士的研究組嘗試利用小鼠胃和肝的細胞誘導iPS細胞，發(fā)現(xiàn)由胃和肝細胞產(chǎn)生的iPS細胞的成瘤性明顯低于皮膚成纖維細胞來源的iPS細胞[5]。采集皮膚細胞重編程為iPS細胞需要六七十天時間，而從血液采集細胞制備iPS細胞只需3周左右，而且人外周血細胞來源豐富，采集方法便利，創(chuàng)傷性小，安全性好。人外周血細胞是當前最理想的供體細胞之一，具有安全、方便、數(shù)量多等優(yōu)勢[6]。
[0005]使用病毒載體轉(zhuǎn)染外源基因制備iPS細胞不僅操作過程復雜、對實驗室設備和管理要求嚴格，而且細胞有可能引發(fā)腫瘤的形成，這就阻礙了 iPS細胞技術的普及和在臨床應用的推廣。當前應用基因非整合方法建立iPS細胞主要有以下幾個方面I)腺病毒載體，2)質(zhì)?；蛘適inicircle DNA，3)蛋白直接導入，但是這三種方法重建效率均非常低，難以滿足基礎實驗需要和臨床應用研究。仙臺病毒m及改良mRNA方法M建立非整合iPS細胞的效率很高，但是費用相當高，不適用于大規(guī)模臨床治療的開展。Episomal Vectors是目前最高效最經(jīng)濟的基因非整合建立iPS細胞的方法[9]。
[0006]2013年5月張孝兵教授[1°]應用改良的表達0ct4/Sox2/Klf4/c_Myc的EV成功地將人外周血單個核細胞重編程為iPS細胞，重編程效率顯著高于以往實驗報導。
[0007]雖然我們利用印isomal技術可以獲得沒有外源基因插入的iPS技術。解決了因為外源基因的插入，誘導基因組不穩(wěn)定和成瘤性的危險，大大促進了 iPS技術臨床應用的可能性。但在體外培養(yǎng)細胞Feeder細胞以及處理板子的metrigel都是鼠源的和牛源的FBS，這些可能會造成免疫和異源病毒或蛋白造成的疾病的產(chǎn)生，增加疾病治療的風險，而且增加了 IPS的使用成本，不適合廣泛的、大規(guī)模的臨床應用，研究在無插入外源基因建立IPS的技術基礎上，無添加FBS'Feeder建立IPS的方法，具有重要的臨床價值。在發(fā)明中，我們在無插入的基礎上建立了無FBS，無Feeder無動物源的iPS建立技術。使iPS技術更符合臨床應用的需求。
[0008][I] Takahashi K，Yamanaka S.1nduction of pluripotent stem cellsfrom mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell.2006; 126:663—76.[0009][2]Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al.1nduction of pluripotent stemcells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell.2007;131:861—72.[0010][3] Yu Jj Vodyanik MAj Smuga—Otto K，et al.1nduced pluripotent stem celllines derived from human somatic cells.Science.2007;318:1917—20.[0011][4]Okita Kj Yamakawa T，Matsumura Y，et al.An efficient nonviral method togenerate integration-free human-1nduced pluripotent stem cells from cord bloodand peripheral blood cells.Stem Cells.2013;31:458—66.[0012][5]Aoi T，Yae Kj Nakagawa M，et al.Generation of pluripotent stem cellsfrom adult mouse liver and stomach cells.Science.2008;321:699-702.[0013][6] Loh YHj Agarwal S，Park IHj et al.Generation of induced pluripotentstem cells from human blood.Blood.2009;113:5476—9.[0014][7]Seki T，Yuasa S，F(xiàn)ukuda K.Generation of induced pluripotent stem cellsfrom a small amount of human peripheral blood using a combination of activatedT cells and Sendai virus.Nat Protoc.2012;7:718-28.[0015][8] Lin T，Ambasudhan R，Yuan X，et al.A chemical platform for improvedinduction of human iPSCs.Nat Methods.2009;6:805-8.[0016][9] Yu J，Hu K，Smuga—Otto K，et al.Human induced pluripotent stem cellsfree of vector and transgene sequences.Science.2009;324:797-801.[0017][10] Su RJj Bay I ink DJ，Neises A，et al.Efficient Generation ofIntegration-Free iPS Cells from Human Adult Peripheral Blood Using BCL—XLTogether with Yamanaka Factors.PLoS One.2013;8:e64496.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0018]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種沒有基因插入，沒有FBS，沒有Feeder的利用外周血細胞建立人iPS的方法。
[0019]本發(fā)明采用的技術方案為:
[0020]一種建立iPS的方法(沒有基因插入，沒有FBS，沒有Feeder的利用外周血細胞建立iPS的方法)，包括如下步驟:
[0021]利用ficoll分離外周血單核細胞,紅系培養(yǎng)方法(無血清)培養(yǎng)8天,將episomal的三個質(zhì)粒:pEV SFFV-OS (OS), pEV SFFV-MK (MK), pEV SFFV-B (B)用 1nza 的Amaxa? HumanCD34+Cell Nucleofector? Kit電轉(zhuǎn)到單核細胞中，之后用vitrinectin (人源蛋白)處理的板子上培養(yǎng)，利用E6培養(yǎng)基(invitrogen)培養(yǎng)12-15天后會看到克隆，20天左右將單克隆調(diào)到用vitrinectin處理的板子上用E8培養(yǎng)基(invitrogen)培養(yǎng),傳代到10后鑒定。
[0022]優(yōu)選的，所述的紅系培養(yǎng)方法所使用的紅系誘導培養(yǎng)基為在SFM的基礎上進一步添加如下組分=SCF終濃度100ng/ml，IL-3終濃度10ng/ml，EPO終濃度2U/ml，IGF-1終濃度40ng/ml，地塞米松終濃度I μ Μ，轉(zhuǎn)鐵蛋白終濃度100 μ g/ml。
[0023]其中Serum free medium (SFM)組成為:
[0024]
【權(quán)利要求】
1.一種建立iPS的方法，其特征在于:包括如下步驟:利用ficoll分離外周血單核細胞，紅系培養(yǎng)方法(無血清)培養(yǎng)8天，將印isomal的三個質(zhì)粒:pEV SFFV-OS (OS)，pEVSFFV-MK(MK), pEV SFFV-B(B)電轉(zhuǎn)到單核細胞中，之后用vitrinectin (人源蛋白)處理的板子上培養(yǎng)，利用E6培養(yǎng)基培養(yǎng)12-15天后會看到克隆，20天左右將單克隆調(diào)到用vitrinectin處理的板子上用E8培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳代到10后鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述建立iPS的方法，其特征在于:所述的紅系培養(yǎng)方法所使用的紅系誘導培養(yǎng)基為在SFM的基礎上進一步添加如下組分:SCF終濃度100ng/ml，IL-3終濃度10ng/ml，EPO終濃度2U/ml，IGF-1終濃度40ng/ml，地塞米松終濃度I μ Μ，轉(zhuǎn)鐵蛋白終濃度 100 μ g/mlo 其中 Serum free medium (SFM)組成為:
IMDM (Invitrogen, cat.n0.21056023)50%
Ham’ s F-12 (Mediatech, cat.n0.10-080-CV)50%Bovine serum albumin (BSA) (Sigma, A9418)5 mg/mlAscorbic acid (Sigma, cat, n0.A8960)50 ug/ml1-Thioglycerol， 98% (Sigma, cat.n0.M6145)200 U M
L-Glutamine (Invitrogen, cat.n0.21051024)100XITS-X (Invitrogen, cat.n0.51500-056)100X
synthetic lipids (Inv`itrogen, cat.n0.11905031) 100Xo
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述建立iPS的方法，其特征在于:包括如下步驟: 利用ficoll分離外周血單核細胞,紅系培養(yǎng)方法(無血清)培養(yǎng)8天,利用Amaxa細胞核轉(zhuǎn)染儀(Amaxa Nucleofector?)進行細胞核轉(zhuǎn)染，單個核細胞培養(yǎng)8天后，計數(shù)，IxlO6細胞加入100 μ I配置好的電轉(zhuǎn)緩沖液(包含不同組合質(zhì)粒如5ug pEV SFFV-OS (OS)+2.5ugpEV SFFV-MK (MK) +2.5ug pEV SFFV-B (B))，混合均勻后轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯，放到電轉(zhuǎn)槽內(nèi)，利用U-008轉(zhuǎn)染程序進行電轉(zhuǎn)。將電轉(zhuǎn)后細胞種到預先人源蛋白處理的6孔板的一個孔中，應用紅系誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)I天，加等量的hESC培養(yǎng)基E6+bFGF100ng/ml培養(yǎng)I天后半數(shù)換液，只加hESC培養(yǎng)基E6+bFGF100ng/ml，之后隔一天完全換成hESC培養(yǎng)基E6+bFGF100ng/ml培養(yǎng)液，并隔天換液；在調(diào)單克隆之前在低氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，所述的低氧培養(yǎng)條件為5%02，5%C02，90%N2 ； 并在培養(yǎng)基中加入0.25mM NaB提高重編程效率，第10天停止，第12-15天開始可見克隆開始形成，第20天左右克隆逐漸成熟，通過機械傳代方法，在顯微鏡下分離克隆，切成3,4塊后吸出，轉(zhuǎn)入hESC培養(yǎng)基E8培養(yǎng)系統(tǒng),一周后可用化學方法消化再傳代，一直傳10代，形成穩(wěn)定的iPS細胞系。
【文檔編號】C12N5/10GK103756969SQ201410008450
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月2日
【發(fā)明者】程濤, 李彥欣, 劉淑萍, 許靜, 顧海慧, 袁衛(wèi)平, 張孝兵 申請人:中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院（血液學研究所）